Abstract
מערכת ביטוי coli Escherichia היא כלי רב עוצמה לייצור חלבונים רקומביננטיים האיקריוטים. אנחנו משתמשים בו כדי לייצר Shadoo, חלבון השייך למשפחת הפריון. שיטת chromatographic לטיהור 6 -tagged Shadoo רקומביננטי (שלו) הביעה כגופי הכללה מתואר. גופי הכללתם בsolubilized 8 M אוריאה ומחויב לטור Ni 2 + -charged לבצע כרומטוגרפיה זיקת יון. חלבוני Bound הם eluted על ידי שיפוע של imidazole. שברים המכילים חלבון Shadoo נתונים לכרומטוגרפיה הדרת הגודל להשיג חלבון נקי במיוחד. בShadoo הצעד מטוהר הסופי desalted להסיר מלחים, אוריאה וimidazole. חלבון Shadoo רקומביננטי הוא מגיב חשוב למחקרים ביו-פיסיקליים וביוכימיים של הפרעות קונפורמציה חלבון המתרחשות במחלות הפריון. דיווחים רבים הראו כי מחלות ניווניות הפריון מקורן בתצהיר של דקירהle, הורה סיבי עמילואיד. פרוטוקולי מדגם מתארים כיצד לרעוד Shadoo לסיבי עמילואיד בחומץ וניטראלי / PHS הבסיסי מוצגים. השיטות על איך לייצר ולרעוד Shadoo יכול להקל על מחקר במעבדות עובדות על מחלות הפריון, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבון באופן מהיר ועלות נמוך.
Introduction
מחלות ניווניות הפריון, הכוללות אנצפלופתיה שור ספגת בבקר, כבשים ומרוסקים במחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם, הן קטלניות וחשוכות מרפא. מחלות הפריון מתאפיינות בשינויי קונפורמציה חלבון הפריון הסלולרי של בעיקר מורכבים מα-סלילים, ל- β גיליון הצלב מועשר עמילואיד קונפורמיסט 1,2. צלב-β-מבנים מכילים צפופים וβ גליונות כמו גבישים-הורה מאוד התייצבו עם קשרי מימן 3,4. amyloids הפריון יכול לשכפל את עצמו בשל β-הגדילים בקצה הגובר המספקים תבנית לגיוס והמרת יחידת חלבון monomeric.
על פי "חלבון רק" ההשערה, קונפורמיסט עמילואיד חלבון הפריון שלו הגורם המדבק הבלעדי. עם זאת, כמה מולקולות ביולוגיות אחרות הוצעו להיות חיוני להפרעות הפריון. למשל, קרום תא נחשב למקום שבו conversiבמתרחש וכמה שומנים טעונים שלילי הוכחו כדי לשפר את 5,6 תהליך הגיור. בנוסף, חלק מהחלבונים יכולים להיות גם מעורבים בפתולוגיות הפריון. באופן ספציפי, יש שני חברים אחרים במשפחת חלבון הפריון: דופל וShadoo 7,8. יש דופל מבנה קשיח יחסית התייצב עם גשרים די-גופרי ולא מצליח לפלמר עצמי ומצטבר לסיבי עמילואיד 9. לעומת זאת, דומה לחלבון הפריון, Shadoo יכול לאמץ מבנה מועשר-β גיליון ולשייך עצמי למבני ליפון עמילואיד. זה היה הראה כי Shadoo יכול לרעוד בתנאים מקומיים או על כריכת קרומים טעונים שלילי 10,11. המרה של Shadoo לתוך סיבים כמו עמילואיד-עשויה להיות קשורה לפתולוגיות. ואכן, המנגנונים שבאמצעותם מבנים דמויים-עמילואיד לגרום למחלות הם הבינו היטב.
Shadoo נושא תחום הידרופובי (HD) וסדרה של טנדם Arg / גלאי חוזר לא דומהo חלק N- מסוף חלבון הפריון (איור 1 א) של. כחלק N- מסוף חלבון הפריון של, Shadoo הוא מאוד טעון חיובי ונראה כי חלבון מקורי לא מובנה 11,12. נראה Shadoo להיות פונקציונלי קשור להפרעות הפריון מאז אותו ישירות יכול להיקשר חלבון הפריון. בנוסף, הביטוי שלה מוסדר נחלש במהלך פתולוגיה הפריון 13,14. עם זאת, התפקיד של Shadoo במחלת הפריון עדיין לא הוקם.
פיתחנו פלסמיד שנשא את רצף הקידוד של גן Shadoo העכבר. פלסמיד שימש להפוך E. coli לייצור חלבון Shadoo N-מסופו 6 היתוך של. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו ומשמשת בדרך כלל בפרויקטים המתמשכים שלנו 6,15,16. נושא חשוב לביטוי של Shadoo הוא הבחירה של א ' זן coli. בעוד זן חיידקי BL21 המוסמך משמש בדרך כלל לביטוי של פרו רקומביננטיחלבוני Shadoo בא לידי הביטוי בהצלחה וטיהר רק מזן החיידקים הפך SoluBL21. SoluBL21 א המוסמך coli הוא מוטציה משופרת של זן מארח BL21 פיתחה לייצור חלבוני ביטויו בBL21 ההורה לא נתן שום מוצר מסיס לזיהוי. ביטוי ברמה גבוהה של Shadoo בSoluBL21 E. coli מוביל להצטברות של החלבון בגוף הכללה. כתכונה כללית, כאשר חלבון שאינו ילידי הארץ באה לידי הביטוי ביותר בE. coli, חלבון זה נוטה להצטבר בגוף הכללה מסיס. Shadoo כנראה צובר באמצעות אינטראקציות שאינן קוולנטיים הידרופובי או יוניות (או שילוב של שניהם) למבנים דינמיים מועשרים שהוקמו על ידי החלבון המקופל לדרגות שונות. כתוצאה מכך, הטיהור כוללת לפחות שני שלבים: (i) הפרדה סלקטיבית של החלבון ממולקולות ביולוגיות אחרות במדיום denaturation, וכן (ii) renaturation של החלבון המטוהר באמצעות בקיפול מבחנהטכניקות.
ההפרדה סלקטיבית של Shadoo הושגה בפתרון מאגר המכיל אוריאה 8M (או לחלופין 6M guanidine-HCl). הסרת האוריאה וrenaturation של החלבון יכולים להיעשות על ידי יישום פרוטוקולים שונים: renaturation (i) בפתרון ה- pH חומצי לקבל חלבון בלתי מובנה monomeric Shadoo, או (ii) renaturation בפתרון של pH ≥ 7 להשיג polymerized Shadoo לסיבי עמילואיד יציבים עם מוטיבים-β גיליון צלב אופייניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של ביטוי פלסמיד וShadoo
הערה: חלבון Shadoo עכברי גן המקודד (Shadoo 25-122), היה subcloned לתוך וקטור ביטוי PET-28 11. שיבוט זה הפך לE. coli SoluBL21 זן חיידקים, להביע חלבון Shadoo עם תג N-מסוף hexahistidine, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) כפי שהוסבר בעבר 11. פלסמיד ניתן לבקש מהמחברים. המשקל המולקולרי של Shadoo מחושב מרצף חומצות אמינו שלה הוא 12,243.2 Da.
הערה: בצע את כל המניפולציות עם חיידקים מתחת למכסת מנוע לזרום laminal או קרובה ללהבה בונזן.
- להפוך חיידקי SoluBL21 המוסמכים עם PET-28-פלסמיד -Shadoo 6, באמצעות פרוטוקול הלם חום סטנדרטי. לשם כך לערבב 1 עד 5 μl של פלסמיד (בדרך כלל 10 עמ '100ng) לתוך 50 μl של החיידקים בצינור. בצע את הלם החום על 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות.
- תרבות הפכה חיידקים על 37 מעלות צלזיוס עד 600 של 0.5-0.7 במדיום לוריא-Bertani בתוספת 40 מ"ג / מיליליטר kanamycin (איור 1).
- לגרום O ביטוי Shadoo / N על ידי הוספת 240 מיקרוגרם איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside / מיליליטר, ITPG, לתרבות. חיידקי תרבות תחת הרועד בסל"ד 150 על 37 מעלות צלזיוס. הערה: בדרך כלל, תרבות חיידקים מגיעה 600 של 3 O / N.
ניתן לאחסן חיידקים שינה ב -80 ° C לייצור חלבון עתיד: הערה. לשם כך, להוסיף 10% -50% (V / V) גליצרול סטרילי לaliquots תרבות חיידקים ולהקפיא אותם ב -80 ° C.
תכנית איור 1. מבנה של ביטוי, שינוי Shadoo חיידקים ואינדוקציה של ביטוי Shadoo (כמתואר בשלב 1). PET-28-6 -Shadoo פלסמיד (B) הופך לחיידקי SoluBL21 על ידי הלם חום במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס. חיידקים הפכו הם מצופים על אגר סלקטיבי המכיל 40 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin. מושבה אחת מהצלחת משמשת לחסן תרבות בבקבוק שייקר 1,000-3,000 מיליליטר. ביטוי של חלבון רקומביננטי מושרה עם IPTG 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. טיהור של חלבון Shadoo ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ נמוך (LPLC)
- תמוגה תא ובהכנת גופי clusion
- אסוף את ההשעיה החיידקים ולהעביר אותו לתוך צינורות צנטריפוגה (איור 2).
- ספין ב2,500 XG, במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant באמצעות אחסון וכדורים גלולים ב 15 מיליליטר חיץ (50 מ"מ טריס, 10 mM EDTA, pH 8 עם קוקטייל אנטי-פרוטאז) לכל גלולה הנגזרת מ500 מיליליטר של תרבית תאים.
הערה: אפשר להקפיא כדורי Resuspended ומאוחסנים ב -20 ° C במשך כמה ימים. הקפאה מאפשרת תמוגה תאי חיידקים. - בדוק את ביטוי היתר של חלבון רקומביננטי באמצעות כדורי חיידקים גולמיים על ידי ניתוח SDS-PAGE וצביעת Coomassie.
- לשם כך, מיליליטר צנטריפוגות 1 של תרבות חיידקים לגלולת תאים. הוספת 100 פתרון μl Laemmli denaturation (277.8 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 4.4% SDS, 44.4% w / v גליצרול, bromophenol 0.02% הכחולים) לגלולה וחום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- עומס 10 μl של המדגם לג'ל acrylamide 12%, SDS-PAGE וVisu לרוץAlize מופרד חלבונים על ידי צביעת Coomassie.
- להוסיף Triton X-100 0.5% ריכוז סופי לגלולה המושעית לחלוטין מ2.1.2).
- דגירה ההשעיה באמבט מים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- Sonicate ההשעיה של 5 דקות ב6-12 מיקרון משרעת שיא-לשיא במים קר כקרח לlyse תאי חיידקים.
- העברת sonicated השעיה לתוך 50 מיליליטר צינורות צנטריפוגה נקיים.
- צינורות צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר supernatant באמצעות אחסון ולהוסיף 5 מיליליטר של החיץ המחייב (20 מ"מ טריס החיץ-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M אוריאה, 5 מ"מ Imidazole) לכל צינור.
- מקום צינורות על O גלגל / N מסתובב לresuspend לחלוטין חלבונים מגופי הכללה.
תכנית איור 2. טיהור ההכללהגופים (כמתואר בשלב 2.1). שינה חיידקים להביע Shadoo נקצרים על ידי צנטריפוגה וresuspended במאגר תמוגה. ההשעיה היא טופחה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן sonicated לשבור מכאני תאי חיידקים. Sonication נעשה על קרח כדי למנוע חימום מדגם. תאים שבורים נקצרים על ידי צנטריפוגה וresuspended במאגר המכיל 8 M אוריאה לsolubilize חלבונים מגופי הכללה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. - כרומטוגרפיה -affinity Ni 2 +
הערה: כרומטוגרפיה מבוצעת על מערכת FPLC באמצעות 2 + Ni -charged, 5 מיליליטר עמודת chelating Sepharose (איור 3 א). כל הפתרונות מועמסים על העמודה עם קצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה.- הזרק 10 מיליליטר של 0.2 פתרון 4 מים M Niso לטור Sepharose כדי לחייב אותועם -ions 2 + Ni.
- לאזן את העמודה טעונה עם -ions Ni 2 + על ידי הזרקת 30-50 מיליליטר של חיץ המחייב המכיל ריכוז נמוך של imidazole (20 מ"מ טריס חיץ-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M אוריאה, 5 מ"מ Imidazole).
- טען את החלבונים-solubilized אוריאה עם הזרקת לולאת 50 מיליליטר.
- לשחזר את חלק הזרימה דרך על ידי שטיפה יסודית הטור עם 10 מיליליטר חיץ imidazole הנמוך מחייב (20 מ"מ טריס חיץ-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M אוריאה, 5 מ"מ Imidazole) כדי להסיר את מקסימום של חלבונים מאוגד מהטור.
- לשטוף את העמודה עם 50-100 מיליליטר של חיץ הכביסה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M אוריאה, 80 מ"מ imidazole) לelute חלבונים שאינם קשורים באופן ספציפי לעמודה.
- החל שיפוע ליניארית 15 דקות של 80-800 מ"מ Imidazole במאגר המכיל 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M אוריאה. לאסוף 1 מיליליטר שברים במהלך היישום ההדרגתי. הערה: מתויגים-חלבונים eluted שנינותשיפוע דונם של מאגר המכיל imidazole (המשמש כמתחרה).
- קח aliquot 8 μl של כל חלק ולהוסיף פתרון denaturation 4 μl 4x Laemmli (ראה 2.1.3.1). פתרונות חום של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- עומס 10 μl של סמן גודל חלבון ו -10 μl של כל דגימה לג'ל acrylamide 12%, SDS-PAGE לרוץ ולדמיין חלבונים מופרדים על ידי צביעת Coomassie. הערה: המשקל המולקולרי של Shadoo מחושב ליצור רצף חומצות אמינו הוא 12,243.2 Da.
- בריכה כל השברים המכילים Shadoo.
איור 3. הליך טיהור (כפי שמתואר בשלבים 2.2-2.4). יכול להיות מתואם 2 + -ions () ניקל על ידי שאריות היסטידין, המאפשרת טיהור סלקטיבית של חלבונים מתויג polyhistidine. Imidazole משמש לelute החלבון, דרךיכולתה לתאם עם -ion Ni 2 + ולעקור את החלבון הקשור. (ב) חלבונים של רדיוס הידרודינמית שונה שנשמרו בNi 2 + -column מופרדים על עמודת הדרת גודל. חלבונים eluted מהגדולים ביותר לקטן ביותר. (ג) לפני השימוש, שברים המכילים Shadoo הם אספו וdesalted להסיר אוריאה, imidazole ומלחים. מבחני בקרת איכות כוללים SDS-PAGE / הכתמת Coomassie, מערבי סופג. ניתן להקפיא-מיובש המטוהר Shadoo. Lyophilized Shadoo יציב במשך חודשים כאשר מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. - כרומטוגרפיה הדרת גודל
הערה: צעד טיהור שני מורכב בכרומטוגרפיה הדרת גודל שמפרידה בין חלבון Shadoo מחלבונים האחרים לשתף eluted במהלך שלב הטיהור הראשון(איור 3).- לאזן טור Superdex של 120 מיליליטר הכולל מיטה נפח ידי הזרקת 250 מיליליטר של חיץ 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M אוריאה בקצב הזרימה של 1.5 מיליליטר / דקה.
- ברי עומס נקוו מכילים Shadoo מ2.2.9 על עמודת equilibrated. לאסוף 1 מיליליטר שברים אחרי הטור-חלל הנפח של 40 מיליליטר על הזרימה המתמדת של המאגר לעיל.
- קח aliquot 10 μl של כל חלק ולבצע ניתוח SDS-PAGE וצביעת Coomassie כפי שתואר לעיל כדי לגלות שברים להכיל Shadoo.
- שברים בריכה המכילים Shadoo.
- Desalting
הערה: הליך desalting מסיר מלחים, imidazole ואוריאה להשיג חלבון Shadoo רקומביננטי במאגר מתאים למחקרים נוספים biophysical וביוכימיים (איור 3 ג). ניתן להשיג אותה התוצאה על ידי dialyzing דגימות נגד המאגר.- לאזן טור desalting של 53 מיליליטר עם 150 מיליליטרשל חיץ 10 מ"מ אמוניום אצטט, pH 5, בקצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה.
- עומס אספו שברים Shadoo על העמודה. עם ההזרקה של חיץ אמוניום אצטט לאסוף ידני שברים שמצביעים על עלייה של האות ב 280 ננומטר במוצא של גלאי UV.
- להקפיא-ייבוש Shadoo desalted ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
- ממיסים Shadoo lyophilized בחיץ הולם, כגון 10 חיץ נתרן אצטט מ"מ, pH 5, לפני שימוש.
הערה: תג polyhistidine ניתן להסיר עם enterokinase.
3. במבחנה הרכבה של Shadoo לעמילואיד סיבים בפיזיולוגי pH
הערה: אגרגטים חלבון Shadoo וספונטני יוצרים סיבים ב- pH ≥ 7 11.
איור 4. תכנית של Shadoo מקפל לסיבי עמילואיד (כdescriהמיטה בשלב 3). מזוקק Shadoo ספונטנית ממירה לסיבי עמילואיד כאשר מומסים במאגר של ≥ pH 7. בתמיסה חומצית, Shadoo ממיר לסיבי עמילואיד על דגירה עם 1 M GDN-HCl תוך רעד. מבחני בקרת איכות כוללים מיקרוסקופיה אלקטרונית וצביעת tht. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לדלל Shadoo לריכוז סופי של 2 מיקרומטר במאגר 20 מ"מ טריס- HCl, pH 7.4. למדוד את הריכוז על ידי מדידת הצפיפות האופטית של הפתרון ב 280 ננומטר ובאמצעות מקדם ההכחדה להסיק מרכב חומצות אמינו Shadoo של 20970.
- דגירה 500 μl של הפתרון בצינור פלסטיק חרוטי על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות, כדי לאפשר המרת חלבון ספונטנית למבני עמילואיד (איור 4).
- הוסף מוכן טרי thioflavin T (THT) לconce סופיntration של 10 מיקרומטר לaliquot 100 μl של פתרון Shadoo. דגירה הפתרון למשך 5 דקות על RT. למדוד פליטת הקרינה 460-520 ננומטר באמצעות גל עירור של 435 ננומטר כדי לאמת את נוכחותם של מבני עמילואיד 17.
4. במבחנה הרכבה של Shadoo לעמילואיד סיבים בחומציים PHS
- לדלל Shadoo ב 1 M GdnHCl, חיץ 20 מ"מ Na-אצטט, pH 5 לריכוז סופי של 2 מיקרומטר.
- דגירה 500 μl של פתרון זה בצינור חרוטי עם רעד מתמשך על 37 מעלות צלזיוס, ל3-7 ימים.
- לבדוק הנוכחות של סיבי עמילואיד על ידי הוספת tht לaliquot של הפתרון כמו ב3.3.
- Dialyze השעיה התקבלה נגד 10 חיץ מ"מ Na-אצטט, pH 5.0, לטהר סיבי עמילואיד Shadoo.
- אחסן סיבים מטוהרים ב+4 מעלות צלזיוס.
איור 5. נציגי תוצאות. שברי חלבון eluted מNi 2 + -charged עמודת chelating () ועמודה הדרת גודל (ב ') נותחו באמצעות SDS-PAGE וצביעת Coomassie. זיהוי של Shadoo המטוהר הוערך באמצעות נוגדן SPRN אנטי Shadoo (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על 5-10 מ"ג חלבון Shadoo מטוהר של מתקבל לליטר תרבות חיידקים. יש צורך בטיהור שני שלבים כדי להשיג Shadoo רקומביננטי של טוהר גבוה. הצעד הראשון מתבצע על ידי כרומטוגרפיה זיקה עם טור -charged Ni 2 + ששומרת עליו-מתוייגים חלבונים. שברי eluted נתונים לSDS-PAGE ומוכתם בכחול מבריק Coomassie (איור 5 א). שברים המכילים חלבון Shadoo הם אספו ומטוהרים יותר על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרה שמפרידה חלבונים על פי גודלם (משקל מולקולרי Shadoo הוא כ -12 KDA). שברים שנאספו על elution הם דמיינו ידי SDS-PAGE / ניתוח Coomassie (איור 5). בנוסף, Shadoo עדות למערב-כתם באמצעות נוגדן ספציפי נגד Shadoo, SPRN שנקשר לאפיטופ רגיש בין 76-105 חומצות אמינו מאזור C-מסוף החלבון (איור 5 ג).
Shadoo מקפל לסיבי myloid מאומתים על ידי צביעת tht (איור 6 א) ועל ידי מיקרוסקופי אלקטרונים מכתים שלילי (איור 6). Tht הוא צבע ניאון אשר נקשר מבני רבעוני-β גיליון צלב אופייניים למכלולי עמילואיד. עלייה בעוצמת tht באיור 6 א מצביעה על כך שShadoo מומר למבני amyloidal.
6. תוצאות איור נציג. סיבי Shadoo (א) לריכוז שווה ערך מונומר 2 מיקרומטר היו preincubated עם tht (10 מיקרומטר ריכוז סופי) עבור 5 דקות ב RT. עוצמות פליטת פלורסנט נרשמות עבור כל דגימה באמצעות גל עירור ב435 ננומטר. שים לב לעלייה משמעותית בעוצמת הקרינה tht בתמיסה המכילה Shadoo polymerized לסיבי עמילואיד בהשוואה לשל השליטהolution של Shadoo monomeric. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (B) של Shadoo פירפר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול קל ויעיל לשני ביטוי וטיהור של כמות גדולה של חלבון Shadoo עכבר רקומביננטי מוצג. השיטה המתוארת מאפשרת solubilization וטיהור (6) -tagged חלבון רקומביננטי Shadoo מוצלחים. חשוב, כפי שציינו בכותרת, שכאשר באו לידי ביטוי בחיידק E. פרוקריוטים coli Shadoo מצטבר בגופי הכללה. לפני טיהור Shadoo, חיידקים צריכים להיות lysed ידי sonication במאגר המכיל טריטון X-100. בהמשך לכך יכולים להיות solubilized גופי הכללה בפתרון denaturing 8 M אוריאה. יתר על כן, כל תהליך הטיהור צריכה להתבצע בפתרון 8 חיץ M אוריאה מאז Shadoo נוטה פלמר ומצטבר. לאחר solubilization והבהרה של גופי הכללה, supernatant המכיל חלבונים מפוגלים הוא נתון להליך בן שני שלבים לטיהור: כרומטוגרפיה זיקה וכרומטוגרפיה גודל הדרה. Chromatog הזיקהצעד רפי מורכב במחייב Shadoo באמצעות -tag (6) ל2+ Ni -charged עמודת chelating. ב 8 M חלבוני פתרון אוריאה הם מפוגלים ושאריות היסטידין משטח חשוף. בנוסף, אוריאה מקדמת שלמות מבנית Shadoo ידי מניעת proteolysis במקרה של זיהום פרוטאזות. בשלב הטיהור השני, Shadoo eluted מעם השיפוע של imidazole נתונה כרומטוגרפיה גודל הדרה על מנת להפריד חלבונים מזהמים. במהלך השלב השני, חלבונים גדולים eluted ראשון, כפי שהם לא הצליחו להיכנס לנקבוביות של המטריצה, ולכן, יש לי נתיב ישיר דרך העמודה. חלבונים קטנים יותר, כמו Shadoo, ייקחו זמן רב יותר לelute מהעמודה שכן הם יכולים להיכנס לנקבוביות ויש נתיב מפותל יותר. לבסוף, הכנת חלבון desalted להסיר אוריאה, imidazole ומלחים. בקרת איכות מציינת כי בעקבות Shadoo רקומביננטי הליך זה מטוהר לטוהר גבוה. זה יכול להיות מנוצל בנמחקרים ביולוגיים ויוטכנולוגיים arious.
א מערכת ביטוי coli היא כלי מאוד שימושי לביטוי של חלבונים רקומביננטי. העלות הנמוכה, מניפולציה קלה, המהירות ונוחות של להביע חלבונים יונקים בE. coli להפוך של מארח זה כלי הבחירה הראשון עבור יישומים בתחום מדעי חיים. עם זאת, לא ניתן לבטא את כל החלבונים היונקים בצורה מסיסה ו / או בכמות מספקת בזה חיידקים. לפעמים, ניתן להתגבר על מכשולים על ידי אסטרטגיות שונות כמו הורדת טמפרטורת ביטוי, שינוי יזמים, הוספת תגי טיהור, באמצעות תקשורת אלטרנטיבית 18-20. עם זאת, במקרים מסוימים, מציאת מצב ביטוי אופטימלי עשויה להיות עלות גבוהה בזמן ובמאמצים. קשיים לייצר Shadoo רקומביננטי היו להתגבר עם א המוסמך SoluBL21 זן coli. זן מארח מוטציה זו שיפר באופן משמעותי את התשואה של ייצור Shadoo ואיפשר לנו להשיג מסיס באופן מלאShadoo. תשואות שהשיגו היו בתרבות / L 5-10 מ"ג הטווח.
רקומביננטי Shadoo הוצג להיות חלבון מקורי לא מובנה נותן תכונה אקראי-ידי סליל ספקטרוסקופיה dichroism המעגלי 11,12. להיות חלבון מאוד טעון חיובי (PI ~ 10.44) Shadoo נוטה לצבור בpH הפיזיולוגי. עם זאת, Shadoo הוא מסיס באופן מלא בפתרונות מאגר של PHS חומצי. הצגנו כאן פרוטוקולים פשוטים ויעילים לפלמר Shadoo לסיבי עמילואיד בPHS השונים. Polymerized Shadoo מייצג כלי רב ערך כדי ללמוד foldings חלבון פתולוגי המאפיינים כמה מחלות ניווניות. Shadoo רקומביננטי מטוהר באמצעות ההליך שלנו יכול לשמש לאפיונים ביוכימיים ומבניים נוספים של תהליך המעבר קונפורמציה.
בהתבסס על המבנה הראשוני שלה, Shadoo היה צפוי שתהיה לי פפטידים אתר אחד glycosylation N צמוד ואות להתקשרות של glycosylphosphatidylinositol עוגן (GPI) ליד C-הסופית (איור 1 א) שלה. Shadoo רקומביננטי מטוהר מגופי הכללה הוא משולל הפחמימות מאז מערכת ביטוי E.coli היא לא מסוגלת לבצע לאחר translational שינויים. כתוצאה מכך, אינטראקציות של Shadoo רקומביננטי עם חלבונים, שומנים או חומצות גרעין עשויות להיות שונה בהשוואה לחלבון הילידים. לדוגמא, את החשיבות של glycosylation Shadoo הוצעה לאחרונה לשפלת פרוטאזום Shadoo לאחר שינוי חלבון על ידי ubiquitination 21. התפקיד של עוגן GPI במחלת הפריון אינו ידוע, אך מחקרים רבים מצביעים על כך שעוגן GPI עשוי לשחק תפקיד בפתוגנזה של מחלות הפריון 22,23. כך, חיידקים הביעו Shadoo יכול לשמש למחקרים במבחנה תוך לקיחה בחשבון מגבלות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
References
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
- Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
- Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
- Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
- Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
- Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
- Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
- Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
- Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
- Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
- Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
- Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
- Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
- Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
- Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
- Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
- Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
- Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
- Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).
