Abstract
Der Escherichia-coli-Expressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Herstellung von rekombinanten eukaryotischen Proteinen. Wir verwenden es, um Shadoo, ein Protein, an das Prion-Familie gehören, zu erzeugen. Ein chromatographisches Verfahren zur Reinigung von (His) 6 -markierten rekombinanten Shadoo ausgedrückt als Einschlußkörper beschrieben. Die Einschlusskörper in 8 M Harnstoff solubilisiert und auf eine Ni 2+ -charged Säule gebunden zu Ionen-Affinitätschromatographie durchzuführen. Gebundenen Proteine werden mit einem Gradienten von Imidazol eluiert. Fraktionen Shadoo Protein enthalten, werden Größenausschlußchromatographie unterzogen wird, eine hoch gereinigte Protein zu erhalten. Im letzten Schritt gereinigt Shadoo entsalzt, um Salze, Harnstoff und Imidazol zu entfernen. Rekombinante Shadoo Protein ist ein wichtiges Reagenz zur biophysikalischen und biochemischen Studien der Proteinkonformation Störungen bei Prionenerkrankungen auftreten. Viele Berichte gezeigt, dass neurodegenerative Erkrankungen Prion stammen aus der Ablagerung von Stichle, bestellt Amyloidfibrillen. Musterprotokolle beschreiben, wie Shadoo in Amyloidfibrillen bei sauren und neutralen fibrillieren / basischen pH-Werten dargestellt. Die Methoden, wie man produzieren und fibrillieren Shadoo kann Forschung in Labors arbeiten an Prionenerkrankungen zu erleichtern, da es für die Produktion von großen Mengen an Protein in eine schnelle und kostengünstige Weise.
Introduction
Prion neurodegenerativen Erkrankungen, die bovine spongiforme Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Creutzfeldt-Jakob-Krankheit beim Menschen, sind tödlich und unheilbar. Prion-Krankheiten durch Konformationsänderungen des zellulären Prionproteins im Wesentlichen aus α-Helices in die Quer β-Faltblatt gekennzeichnet angereichert Amyloid Konformer 1,2. Cross-β-Strukturen enthalten dicht gepackt und hochgeordnete kristalline artigen β-sheets stabilisiert mit 3,4-Wasserstoffbrücken. Prion Amyloide sich selbst replizieren aufgrund der β-Stränge an die wachsende Kante, die eine Vorlage für die Rekrutierung geben und Umwandeln eines monomeren Proteineinheit.
Nach Angaben der "Nur-Protein-Hypothese", die Amyloid-Konformer des Prionprotein der einzige Infektionserreger. Jedoch einige andere Biomoleküle wurden vorgeschlagen wesentlich, Prion-Erkrankungen sein. Zum Beispiel werden die Zellmembranen gedacht, ein Ort, wo conversi seinauf erfolgt und einige negativ geladene Lipide sind gezeigt worden, um die Konvertierung zu 5,6 zu erhöhen. Darüber hinaus können einige Proteine auch im Prion-Erkrankungen beteiligt. Insbesondere gibt es zwei weitere Mitglieder des Prionproteinfamilie: Doppel und Shadoo 7,8. Doppel weist eine relativ steife Struktur mit Di-Sulfidbrücken stabilisiert zu werden, keine spontan polymerisieren und Aggregat an Amyloidfibrillen 9. Im Gegensatz dazu, ähnlich wie bei Prion-Protein, Shadoo eine β-Faltblatt-angereicherten Struktur und Selbstassoziation in Amyloidfibrillen Strukturen erlassen. Es konnte gezeigt werden, dass Shadoo kann unter nativen Bedingungen oder bei der Bindung negativ geladenen Membranen 10,11 fibrillieren. Umwandlung von Shadoo in amyloidartigen Fasern können mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Tatsächlich sind die Mechanismen, durch die Amyloid-ähnliche Strukturen Krankheiten verursachen kaum verstanden.
Shadoo trägt eine hydrophobe Domäne (HD) und eine Reihe von Tandem Arg / Gly wiederholt ähnliche to den N-terminalen Teil des Prion-Proteins (1A). Als die N-terminalen Teil des Prionproteins wird Shadoo stark positiv und scheint eine nativ unstrukturierte Protein 11,12 sein. Shadoo scheint funktionell auf Prionen-Erkrankungen sein, da es direkt binden Prionprotein. Zusätzlich ist seine Expression unten während Prion Pathologie 13,14 geregelt. Jedoch ist die Rolle von Shadoo Prionenerkrankungen noch nicht etabliert.
Wir entwickelten ein Plasmid, das die codierende Sequenz der Maus Shadoo Gens. Das Plasmid wurde verwendet, um E.-Transformation coli zur Herstellung von N-terminalen His-6-Fusionsprotein Shadoo. Dieses Expressionssystem ist in unserem Labor etabliert und wird häufig in unserer laufenden Projekte 6,15,16 verwendet. Ein wichtiges Thema für die Expression von Shadoo ist die Wahl des E. coli-Stamm. Während kompetente BL21 Bakterienstamm wird häufig für die Expression von rekombinanten Pro verwendetProteine Shadoo wurde erfolgreich exprimiert und nur aus der transformierten SoluBL21 Bakterienstamm gereinigt. SoluBL21 kompetente E. coli ist eine verbesserte Mutante BL21 Wirtsstamm für die Produktion von Proteinen, deren Expression in der Mutter BL21 gab keinen nachweisbaren löslichen Produkt entwickelt. High-Level-Expression Shadoo in SoluBL21 E. coli führt zu einer Akkumulation des Proteins in Einschlusskörpern. Als eine allgemeine Funktion, wenn ein nicht-native Protein ist stark in E. ausgedrückt coli neigt dieses Protein in unlöslicher Einschlußkörper akkumulieren. Shadoo Aggregate vermutlich durch nicht-kovalente oder ionische Wechselwirkungen hydrophobe (oder einer Kombination von beiden), um hoch angereichertes dynamischen Strukturen durch das Protein in unterschiedlichem Maße gefaltet ist. Folglich umfasst die Reinigung wenigstens zwei Schritte: (i) eine selektive Trennung des Proteins von anderen Biomolekülen in einer Denaturierung Medium und (ii) eine Renaturierung des gereinigten Proteins mit in vitro FaltungsTechniken.
Die selektive Abtrennung von Shadoo wurde in einer Pufferlösung, enthaltend 8 M Harnstoff (oder alternativ 6 M Guanidin-HCl) gelöst. (I) die Renaturierung in einem sauren pH-Lösung eine unstrukturierte monomeren Shadoo Protein oder (ii) die Renaturierung in einer Lösung mit pH ≥ 7 bis Shadoo polymerisierten erhalten: Die Harnstoffentfernung und die Renaturierung des Proteins kann durch Anwendung verschiedener Protokolle durchgeführt werden in stabile Amyloidfasern mit charakteristischen Quer β-Blatt-Motive.
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Protocol
1. Erzeugung von Plasmid und Expression Shadoo
Hinweis: Das Gen, das murine Shadoo Protein (Shadoo 25-122), wurde in den Expressionsvektor pET-28 11 subkloniert. Dieser Klon wurde in den E. transformierten coli SoluBL21 Bakterienstamm, um Shadoo Protein mit einem N-terminalen Hexahistidin-Tag, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) zum Ausdruck bringen, wie zuvor 11 erläutert. Das Plasmid kann von den Autoren angefragt werden. Das Molekulargewicht des Shadoo aus seiner Aminosäuresequenz berechneten 12,243.2 Da.
Hinweis: Führen Sie alle Manipulationen mit Bakterien unter dem laminal Flow-Haube oder in der Nähe Bunsenflamme.
- Transformieren kompetenter SoluBL21 Bakterien mit dem pET-28-His 6 -Shadoo Plasmid, mit einem Standard-Hitzeschockprotokoll. Für diese Mischung 1 bis 5 & mgr; l der Plasmid (typischerweise 10 bis 100 pgng) in 50 & mgr; l der Bakterien in einem Rohr. Führen Sie den Hitzeschock bei 42 ° C für 45 sec.
- Kultur transformierter Bakterien bei 37 ° C, bis ein 600 0,5-0,7 in Luria-Bertani-Medium mit 40 mg / ml Kanamycin (1B) ergänzt.
- Induzieren Shadoo Expression O / N durch Zugabe von 240 & mgr; g / ml Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, ITPG, zu der Kultur. Kultur des Bakteriums unter Schütteln bei 150 Upm bei 37 ° C. Anmerkung: In der Regel reicht von 3 A 600 O / N-Bakterienkultur.
Anmerkung: Die transformierten Bakterien können bei -80 ° C für zukünftige Proteinproduktion gespeichert werden. Dazu fügen Sie 10% -50% (v / v) steriles Glycerin in Bakterienkultur Aliquots und frieren Sie sie bei -80 ° C.
Abbildung 1. Schema der Shadoo Expressionskonstrukt, Bakterien Transformation und Induktion von Shadoo Ausdruck (wie in Schritt 1 beschrieben). (A) Das Expressionskonstrukt für Shadoo codiert ein Hexahistidin-Tag an den N-Terminus des Proteins, Nt fusioniert. Das Schema zeigt, dass Shadoo Protein enthält grundlegende Arginin / Glycin-Repeats (grünen Zylinder), eine hydrophobe Domäne (HD) und eine einzige N-Glykosylierungsstelle (CHO), gefolgt von einem C-Terminus (Ct). (B) pET-28-His 6 -Shadoo Plasmid in SoluBL21 Bakterien durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C umgesetzt. Transformierten Bakterien werden auf selektivem Agar, der 40 ug / ml Kanamycin ausplattiert. Eine einzelne Kolonie von der Platte verwendet, um eine Kultur in einem 1000-3000 ml-Schüttelkolben zu inokulieren. Die Expression des rekombinanten Proteins ist mit 1 mM IPTG induziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Reinigung von Shadoo Protein durch Niederdruck-Flüssigchromatographie (LPLC)
- Zell-Lyse und Inschluss Gremien Vorbereitung
- Sammeln Sie die Bakteriensuspension und übertragen sie in Zentrifugenröhrchen (Abbildung 2).
- Schleudern bei 2.500 xg für 20 min bei 4 ° C. Überstand durch Dekantieren zu entfernen und resuspendieren Pellets in 15 ml Puffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 mit Anti-Protease-Cocktail) für jeden Pellets aus 500 ml Zellkultur abgeleitet ist.
Anmerkung: Die resuspendierten Pellets können eingefroren und bei -20 ° C für mehrere Tage gelagert werden. Freezing erleichtert Bakterienzellen-Lyse. - Überprüfen Sie die Überexpression des rekombinanten Proteins mit rohen Bakterien Pellets durch SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung.
- Hierzu Zentrifugen 1 ml Bakterienkultur pelleZellen. 100 ul Laemmli Denaturierungslösung (277,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% w / v Glycerol, 0,02% Bromphenolblau) pelletiert und Wärme bei 100 ° C für 5 min.
- Last 10 ul der Probe auf einem 12% Acrylamidgel laufen SDS-PAGE und visualize getrennten Proteine durch Coomassie-Färbung.
- Hinzufügen Triton X-100 auf 0,5% Endkonzentration in die vollständig resuspendierten Pellets 2.1.2).
- Inkubieren der Suspension in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min.
- Beschallen der Suspension für 5 min bei 6-12 & mgr; m Spitze-zu-Spitze-Amplitude in eiskaltem Wasser, um bakterielle Zellen zu lysieren.
- Transfer beschallte Suspension in sauberen 50 ml Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugenröhrchen bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
- Überstand entfernen durch Dekantieren und 5 ml des Bindungspuffers (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol) pro Röhrchen.
- Die Röhrchen auf dem sich drehenden Rad O / N komplett resuspendieren Proteine aus Einschlusskörpern.
Abbildung 2. Schema der Reinigung von EinschlussKörpern (wie in Schritt 2.1 beschrieben). Die transformierten Bakterien exprimiert Shadoo werden durch Zentrifugation geerntet und in Lysepuffer resuspendiert. Die Suspension wird bei 37 ° C für 30 min inkubiert und dann beschallt, um Bakterienzellen mechanisch zu brechen. Beschallung auf Eis durchgeführt, um Probenerwärmung zu verhindern. Gebrochenen Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in einem Puffer, der 8 M Harnstoff, um Proteine aus Einschlusskörper solubilisiert resuspendiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. - Ni 2+ -Affinitätschromatographie
Anmerkung: Die Chromatographie an FPLC-System unter Verwendung einer Ni 2+ -charged, 5 ml Sepharose chelatbildende Säule (3A) durchgeführt. Alle Lösungen werden auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min geladen.- Injizieren von 10 ml 0,2 M NiSO 4 Wasserlösung in die Säule Sepharose, um sie aufzuladenmit Ni 2+ -Ionen.
- Äquilibrieren der Säule mit Ni 2+ -Ionen geladenen durch Injektion von 30-50 ml des Bindungspuffers, der eine niedrige Konzentration an Imidazol (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol).
- Laden Sie die Harnstoff solubilisiert Proteine mit einer 50 ml Injektionsschleife.
- Wiederherstellung der Durchflussfraktion durch gründliches Waschen der Säule mit 10 ml niedrig Imidazol Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol), um ein Maximum von ungebundenen Proteine zu entfernen von der Säule.
- Mit 50-100 ml des Waschpuffers (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 80 mM Imidazol), Proteine unspezifisch an die Säule gebunden eluieren Die Säule wird.
- Anwenden eines 15 min Gradienten von 80-800 linearen mM Imidazol in Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff. Sammeln Sie 1-ml-Fraktionen während der Gradienten-Anwendung. Hinweis: His-Tag-Proteine eluiert witha Gradienten von Imidazol enthaltenden Puffer (als Konkurrent verwendet).
- Werfen Sie einen 8-ul-Aliquot jeder Fraktion und fügen Sie 4 ul 4x Laemmli Denaturierungslösung (siehe 2.1.3.1). Hitzelösungen bei 100 ° C für 5 min.
- Last 10 ul Proteingrößenmarker und 10 ul jeder Probe auf den 12% igen Acrylamidgel laufen SDS-PAGE und sichtbar getrennten Proteine durch Coomassie-Färbung. Hinweis: Das Molekulargewicht Shadoo berechnet bilden seine Aminosäuresequenz ist 12,243.2 Da.
- Pool alle Fraktionen, die Shadoo.
Abbildung 3. Reinigungsverfahren (wie in den Schritten 2.2-2.4 beschrieben). (A) Ni 2+ -Ionen durch Histidinreste, die die selektive Reinigung von Polyhistidin-markierte Proteine können koordiniert werden. Imidazol wird verwendet, um das Protein zu eluieren, durchseine Fähigkeit, mit der Ni 2+ -Ionen koordinieren und verdrängen das gebundene Protein. (B) Proteine mit unterschiedlichen hydrodynamischen Radius, der auf der Ni 2+ -Säule auf einer Größenausschluss-Säule zurückgehalten wurden. Proteine werden von der größten bis zur kleinsten, eluiert. (C) Vor dem Gebrauch enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und Shadoo entsalzt Harnstoff, Imidazol und Salze zu entfernen. Qualitätskontrolle Tests umfassen SDS-PAGE / Coomassie-Färbung, Western-Blot. Gereinigtes Shadoo kann gefriergetrocknet werden. Lyophilisierte Shadoo ist über Monate stabil, wenn sie bei -20 ° C gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. - Größenausschlusschromatographie
Hinweis: Eine zweite Reinigungsschritt besteht in der Größenausschluß-Chromatographie, die Shadoo Proteins von anderen Proteinen in der ersten Reinigungsstufe coeluierte trennt(3B).- Äquilibrieren Superdex-Säule von 120 ml gesamten Bettvolumens durch die Injektion 250 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml / min.
- Last vereinigten Fraktionen, Shadoo von 2.2.9 auf die äquilibrierte Säule. Sammeln 1 ml-Fraktionen nach der Säule-Hohlraumvolumen von 40 ml auf die konstante Strömung des obigen Puffers.
- Nehmen Sie ein 10 ul-Aliquot jeder Fraktion und führen Sie eine SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung wie oben beschrieben, um herauszufinden, welche Fraktionen enthalten Shadoo.
- Pool Fraktionen, Shadoo.
- Entsalzung
Anmerkung: Entsalzungsverfahren entfernt Salze, Imidazol und Harnstoff rekombinante Shadoo Protein in einer für die weitere biophysikalische und biochemische Untersuchungen (3C) Puffer erhalten. Das gleiche Ergebnis kann durch Dialysieren Proben gegen den Puffer erhalten werden.- Äquilibrieren eine Entsalzungssäule von 53 ml mit 150 mlvon 10 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 5, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min.
- Last gepoolt Shadoo Fraktionen auf die Säule. Bei Injektion des Ammoniumacetatpuffer sammeln manuell Fraktionen, die eine Erhöhung des Signals bei 280 nm am Ausgang des UV-Detektors zeigen.
- Gefrierzutrocknen der entsalzten Shadoo und speichern Sie sie bei -20 ° C.
- Aufzulösen lyophilisierten Shadoo in ausreichender Puffer, wie 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, vor der Verwendung.
Hinweis: Die Polyhistidin-Tag kann mit Enterokinase entfernt werden.
3. In-vitro-Montage von Shadoo in Amyloidfibrillen bei physiologischen pH-
Hinweis: Die Shadoo Proteinaggregate und Fibrillen bildet spontan bei pH ≥ 7 11.
Abbildung 4. Schema der Shadoo Rückfaltung an Amyloidfibrillen (wie beschrieBett im Schritt 3). Gereinigtes Shadoo wandelt spontan an Amyloidfibrillen als in Puffer pH ≥ 7, gelöst in einer sauren Lösung, wandelt Shadoo an Amyloidfibrillen bei Inkubation mit 1 M Gdn-HCl unter Schütteln. Qualitätskontrolle Tests umfassen Elektronenmikroskopie und THT-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Verdünnter Shadoo bis zu einer Endkonzentration von 2 & mgr; M in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4. Messen der Konzentration durch Messen der optischen Dichte der Lösung bei 280 nm und unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Shadoo Aminosäurezusammensetzung von 20.970 abgeleitet.
- Inkubieren 500 ul der Lösung in einem konischen Kunststoffröhrchen bei 4 ° C für ein paar Wochen, um eine spontane Umwandlung Protein Amyloid-Strukturen (Figur 4) zu ermöglichen.
- Hinzufügen frisch Thioflavin T (THT) bis zu einer endgültigen conce vorbereitetntration von 10 um bis 100 & mgr; l Aliquot der Lösung Shadoo. Inkubieren der Lösung für 5 Minuten bei RT. Messung der Fluoreszenzemission von 460 bis 520 nm unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 435 nm, um das Vorhandensein von Amyloid-Strukturen 17 zu verifizieren.
4. In-vitro-Montage von Shadoo an Amyloidfibrillen bei sauren pH-Werten
- Verdünnter Shadoo in 1 M GdnHCl, 20 mM Na-Acetatpuffer, pH 5 zu einer Endkonzentration von 2 uM.
- Inkubieren 500 ul dieser Lösung in einem konischen Röhrchen unter ständigem Schütteln bei 37 ° C für 3-7 Tage.
- Prüfen Sie das Vorhandensein von Amyloidfibrillen durch Zugabe ThT zu einem aliquoten Teil der Lösung nach 3.3.
- Dialyse erhaltene Suspension gegen 10 mM Na-Acetat-Puffer, pH 5,0, zu Shadoo Amyloidfibrillen zu reinigen.
- Bewahren Sie gereinigte Fibrillen bei +4 ° C.
Figur 5. Repräsentative Ergebnisse. Proteinfraktionen aus Ni 2+ eluiert -charged chelatbildende Säule (A) und Größenausschluss-Säule (B) wurden unter Verwendung von SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Bezeichnung des gereinigten Shadoo wurde mit SPRN Anti Shadoo Antikörper (C) bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
Etwa 5-10 mg gereinigtes Shadoo Protein pro Liter Bakterienkultur erhalten. Ein Zwei-Schritt-Reinigung ist notwendig, um rekombinante Shadoo hoher Reinheit zu erhalten. Der erste Schritt ist durch Affinitätschromatographie mit einem Ni 2+ -charged Spalte, die His-Tag-Proteine behält geführt. Eluierten Fraktionen werden der SDS-PAGE unterworfen und mit Coomassie Brilliant Blue (5A) angefärbt. Fraktionen Shadoo Protein enthalten, werden vereinigt und weiter durch Grßenausschlußchromatographie, die Proteine nach ihrer Größe trennt, (Shadoo Molekulargewicht etwa 12 kDa) gereinigt. Fraktionen nach Elution gesammelt werden durch SDS-PAGE / Coomassie-Analyse (5B) visualisiert. Zusätzlich wird Shadoo durch Western-Blot unter Verwendung eines spezifischen anti-Shadoo Antikörper SPRN, die zu einer empfindlichen Epitop zwischen den Aminosäuren 76 bis 105 vom Protein C-terminalen Region (5C) bindet belegt.
Shadoo Rückfaltung einmyloid Fibrillen durch ThT Färbung (6A) und durch die Negativfärbung-Elektronenmikroskopie (6B) verifiziert. ThT ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der Quer β-Faltblatt Quartärstrukturen charakteristisch für Amyloide bindet. Erhöhung der ThT Intensität in 6A zeigt an, dass Shadoo an Amyloidstrukturen umgewandelt.
Figur 6. Repräsentative Ergebnisse. (A) Shadoo Fibrillen von 2 um Monomer-Äquivalent-Konzentration wurden mit ThT (10 & mgr; M Endkonzentration) für 5 min bei RT vorinkubiert. Fluoreszenzemissionsintensitäten für jede Probe unter Verwendung einer Anregungswellenlänge bei 435 nm aufgezeichnet. Beachten eine signifikante Erhöhung ThT Fluoreszenzintensität in einer Lösung, die Shadoo polymerisiert Amyloidfibrillen im Vergleich zur Kontroll solution von monomeren Shadoo. (B) Transmissionselektronenmikroskopie fibrillierter Shadoo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ein einfaches und effizientes Protokoll sowohl für die Expression und Reinigung einer großen Menge an rekombinantem Maus Shadoo Protein präsentiert. Das beschriebene Verfahren ermöglicht erfolgreiche Solubilisierung und Reinigung von (His 6) -markierte rekombinanten Shadoo Protein. Es ist wichtig, wie in dem Dokument darauf hingewiesen, dass, wenn in einem prokaryontischen Bakteriums E. ausgedrückt coli Shadoo sammelt sich in Einschlusskörpern. Vor Shadoo Reinigung haben Bakterien, durch Beschallung in einem Puffer, der Triton X-100 lysiert. Anschließend Einschlußkörper in 8 M Harnstoff solubilisiert Denaturierungslösung werden. Ferner hat das gesamte Reinigungsverfahren in 8 M Harnstoffpuffer-Lösung durchgeführt werden, da Shadoo neigt zur Polymerisation und aggregieren. Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie: nach der Solubilisierung und Klärung der Einschlusskörper wird der Überstand denaturierten Proteine enthält, einer zweistufigen Reinigungsverfahren unterworfen wird. Die Affinität Chromatoggraphie Schritt besteht in der Bindungs Shadoo über das (His 6) -Tag, um ein Ni 2+ -charged Chela Spalte. In 8 M Harnstofflösung Proteine denaturiert und ihre Histidinreste oberflächenexponiert sind. Außerdem fördert Harnstoff Shadoo strukturelle Integrität durch die Verhinderung der Proteolyse in dem Fall von kontaminierenden Proteasen. Im zweiten Reinigungsschritt eluiert Shadoo aus mit dem Gradienten von Imidazol an Grßenausschlußchromatographie, um kontaminierende Proteine abzutrennen. Im zweiten Schritt werden große Proteine zuerst eluiert, da sie nicht in der Lage, die Poren der Matrix eindringen und somit einen direkten Weg durch die Säule. Kleinere Proteine, wie Shadoo, länger, um von der Säule zu eluieren, da sie die Poren eindringen und haben eine mehr gewundenen Weg. Schließlich wird das Proteinpräparat entsalzt Harnstoff, Imidazol und Salze zu entfernen. Qualitätskontrolle zeigt an, dass nach diesem Verfahren rekombinante Shadoo mit hoher Reinheit gereinigt. Es kann in v genutzt werdenarious biologische und biotechnologische Untersuchungen.
E. coli-Expressionssystem ist ein äußerst nützliches Werkzeug für die Expression von rekombinanten Proteinen. Die niedrigen Kosten, einfache Handhabung, Schnelligkeit und Bequemlichkeit der exprimierenden Säugerproteinen in E. coli machen dieses Wirts die erste Wahl Tool für Life Science Anwendungen. Allerdings können nicht alle Säugetierproteinen in löslicher Form und / oder in einer ausreichenden Menge in diesen Bakterien exprimiert werden. Manchmal kann Hindernisse, unterschiedliche Strategien, wie Senkung Ausdruck Temperatur ändern Promotoren, das Hinzufügen Reinigungs-Tags, mit alternativen Medien 18-20 überwunden werden. Jedoch kann in einigen Fällen mit der eine optimale Expression Bedingung kann eine hohe Zeitaufwand und die Anstrengungen. Schwierigkeiten, rekombinante Shadoo produzieren wurden mit dem SoluBL21 kompetente E. überwinden coli-Stamm. Diese mutierten Wirtsstamm deutlich verbessert die Ausbeute an Shadoo Produktion und uns erlaubt, vollständig löslich zu erhaltenShadoo. Ausbeuten lagen im Bereich von 5-10 mg / l Kultur.
Rekombinante Shadoo wurde gezeigt, dass ein nativ unstrukturierte Protein geben einen Random-Coil-Funktion von CD-Spektroskopie 11,12 sein. Ein stark positiv geladenes Protein (pI ~ 10,44) Shadoo neigt bei physiologischem pH aggregieren. Jedoch Shadoo in Pufferlösungen von sauren pHs vollständig löslich. Wir präsentierten hier einfache und effiziente Protokolle Shadoo an Amyloidfibrillen bei verschiedenen pH-Werten polymerisieren. Polymerisierten Shadoo ein wertvolles Instrument, um pathologische Proteinfaltungen, die einige neurodegenerative Erkrankungen charakterisieren zu studieren. Das rekombinante Shadoo mit unserem Verfahren gereinigt kann für weitere biochemische und strukturelle Charakterisierung des Konformationsübergang Verfahren verwendet werden.
Auf der Grundlage ihrer Primärstruktur wurde Shadoo voraussichtlich eine N-gebundene Glykosylierungsstelle und Signalpeptide zur Befestigung des glycosylphosphatidyli habennositol (GPI) Anker neben dem C-Terminus (1A). Rekombinante Shadoo aus Einschlußkörpern gereinigte Kohlenhydrate entzogen, da E. coli-Expressionssystem ist nicht in der Lage, post-translationale Modifikationen durchzuführen. Folglich kann Wechselwirkungen rekombinanter Shadoo mit Proteinen, Lipiden oder Nukleinsäuren im Vergleich zu dem nativen Protein modifiziert werden. Beispielsweise die Bedeutung der Glycosylierung Shadoo wurde kürzlich für Shadoo Proteasom Abbau nach der Proteinmodifikation durch Ubiquitinierung 21 vorgeschlagen. Die Rolle der GPI-Anker in Prion-Krankheit nicht bekannt, aber viele Studien darauf hin, dass GPI-Anker kann eine Rolle bei der Pathogenese von Prionenerkrankungen 22,23 spielen. Somit exprimiert bakteriellen Shadoo können für in vitro-Studien unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
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