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Biology

शोधन और के amyloid तंतु को refolding (उनकी) Published: December 19, 2015 doi: 10.3791/53432
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Virologie et Immunologie Moléculaires, INRA

Abstract

कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक यूकेरियोटिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हम यह Shadoo, प्रिओन परिवार से संबंधित एक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल करते हैं। समावेश शरीर में वर्णित है के रूप में (उनकी) 6 -tagged पुनः संयोजक Shadoo की शुद्धि के लिए एक chromatographic विधि व्यक्त किया। समावेश शरीर 8 एम यूरिया में solubilized और आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन करने के लिए एक नी 2 + -charged स्तंभ के लिए बाध्य कर रहे हैं। बाध्य प्रोटीन Imidazole की एक ढाल से eluted हैं। Shadoo प्रोटीन युक्त भिन्न एक उच्च शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के अधीन हैं। अंतिम चरण के लिए शुद्ध Shadoo में लवण, यूरिया और imidazole दूर करने के लिए desalted है। संयोजक Shadoo प्रोटीन प्रिओन रोगों में होने वाली प्रोटीन रचना विकारों की biophysical और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण अभिकर्मक है। कई रिपोर्टों प्रिओन neurodegenerative रोगों चाकू के बयान से उत्पन्न होने वाले प्रदर्शनLe, amyloid तंतु का आदेश दिया। अम्लीय और तटस्थ पर amyloid तंतु में Shadoo fibrillate करने के लिए कैसे का वर्णन नमूना प्रोटोकॉल / बुनियादी PHS प्रस्तुत कर रहे हैं। उत्पादन और यह एक तेजी से और कम लागत तरीके से प्रोटीन की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए अनुमति देता है के बाद से Shadoo, prion रोगों पर काम कर प्रयोगशालाओं में अनुसंधान की सुविधा कर सकते fibrillate करने के लिए पर तरीकों।

Introduction

मानव में भेड़ और क्र्युट्ज़्फेल्ड्ट-जेकब रोग में गोजातीय स्पाँन्जिफार्म पशुओं में मस्तिष्क विकृति, स्क्रैपी शामिल हैं, जो prion neurodegenerative रोगों, घातक और असाध्य हैं। Prion रोगों मुख्य रूप से पार β-चादर में, α-सर्पिलों से बना सेलुलर प्रिओन प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन की विशेषता है 1,2 conformer एमीलोयड समृद्ध। क्रॉस-β-संरचनाओं घनी पैक होते हैं और अत्यधिक आदेश दिया क्रिस्टलीय-तरह β-पत्र हाइड्रोजन बांड 3,4 के साथ स्थिर हो। Prion amyloids भर्ती के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करते हैं और एक मोनोमेरिक प्रोटीन इकाई परिवर्तित बढ़ रही है कि किनारे पर β किस्में के कारण स्वयं को दोहराने कर सकते हैं।

"प्रोटीन केवल" परिकल्पना के अनुसार, prion प्रोटीन की एमीलोयड conformer एकमात्र संक्रामक एजेंट है। हालांकि, कुछ अन्य biomolecules प्रिओन विकारों के लिए आवश्यक होने के लिए प्रस्तावित किया गया है। उदाहरण के लिए, कोशिका झिल्ली एक जगह जहां conversi माना जाता हैपर जगह लेता है और कुछ नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड रूपांतरण की प्रक्रिया 5,6 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, कुछ प्रोटीन भी प्रिओन विकृतियों में शामिल किया जा सकता है। Doppel और Shadoo 7.8: विशेष रूप से, प्रिओन प्रोटीन परिवार के दो अन्य सदस्य हैं। स्नातक DI-सल्फाइड पुलों के साथ स्थिर एक अपेक्षाकृत कठोर संरचना है और amyloid तंतु 9 करने के लिए आत्म-भाजन और कुल करने में विफल रहता है। इसके विपरीत, प्रिओन प्रोटीन के समान है, Shadoo amyloid महीन रेशा संरचनाओं में एक β-शीट समृद्ध संरचना और आत्म सहयोगी अपनाने कर सकते हैं। यह Shadoo मूल निवासी शर्तों के तहत या नकारात्मक आरोप लगाया झिल्ली 10,11 बाध्यकारी पर fibrillate सकता है कि दिखाया गया था। एमीलोयड-तरह तंतुओं में Shadoo का रूपांतरण विकृतियों के साथ जुड़ा हो सकता है। दरअसल, एमीलोयड संरचनाओं की तरह की बीमारी का कारण तंत्र है जिसके द्वारा खराब समझ रहे हैं।

Shadoo एक हाइड्रोफोबिक डोमेन (एचडी) और मिलकर Arg / Gly की एक श्रृंखला भालू समान टी दोहराताप्रिओन प्रोटीन (चित्रा 1 ए) के एन टर्मिनल हिस्सा ओ। प्रिओन प्रोटीन के एन टर्मिनल भाग के रूप में, Shadoo अत्यधिक सकारात्मक आरोप लगाया और एक नेटिव असंरचित प्रोटीन 11,12 प्रतीत होता है। यह सीधे प्रिओन प्रोटीन बाध्य कर सकते हैं के बाद से Shadoo प्रिओन विकारों के लिए कार्यात्मक संबंधित प्रतीत हो रहा है। इसके अलावा, अपनी अभिव्यक्ति नीचे प्रिओन विकृति 13,14 के दौरान नियंत्रित किया जाता है। हालांकि, prion रोग में Shadoo की भूमिका अभी तक स्थापित नहीं है।

हम माउस Shadoo जीन की कोडिंग अनुक्रम ले जा रही एक प्लाज्मिड विकसित की है। प्लाज्मिड ई परिणत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कोलाई एन टर्मिनल अपने 6 संलयन Shadoo प्रोटीन के उत्पादन के लिए। यह अभिव्यक्ति प्रणाली अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला में स्थापित किया जाता है और आमतौर पर हमारे चल रही परियोजनाओं 6,15,16 में प्रयोग किया जाता है। Shadoo की अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा ई की पसंद है कोलाई तनाव। सक्षम BL21 बैक्टीरियल तनाव आमतौर पर पुनः संयोजक प्रो की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता हैteins Shadoo सफलतापूर्वक व्यक्त की और तब्दील SoluBL21 बैक्टीरियल तनाव से केवल शुद्ध किया गया था। SoluBL21 सक्षम ई कोलाई जिनकी अभिव्यक्ति माता पिता BL21 में नहीं detectable घुलनशील उत्पाद दे दी प्रोटीन के उत्पादन के लिए विकसित BL21 मेजबान तनाव का एक बेहतर उत्परिवर्ती है। SoluBL21 ई में Shadoo के उच्च स्तर अभिव्यक्ति कोली शामिल किए जाने के शरीर में प्रोटीन का संचय होता है। एक गैर देशी प्रोटीन अत्यधिक ई में व्यक्त किया जाता है जब एक सामान्य की सुविधा है, के रूप में कोलाई, इस प्रोटीन अघुलनशील समावेश शरीर में जमा हो जाता है। Shadoo शायद विभिन्न डिग्री के लिए जोड़ प्रोटीन द्वारा गठित उच्च संवर्धित गतिशील संरचनाओं के लिए गैर-सहसंयोजक हाइड्रोफोबिक या आयनिक बातचीत (या दोनों के संयोजन के माध्यम से) समुच्चय। (I) एक विकृतीकरण माध्यम में अन्य जैविक अणुओं से प्रोटीन की एक चयनात्मक जुदाई, और (ii) शुद्ध प्रोटीन की एक renaturation विट्रो तह में उपयोग करते हुए: परिणाम में, शुद्धि कम से कम दो कदम शामिलतकनीक।

Shadoo के चुनिंदा जुदाई 8M यूरिया (या वैकल्पिक 6M Guanidine एचसीएल) युक्त एक बफर समाधान में हासिल की थी। (मैं) renaturation एक अम्लीय पीएच समाधान में Shadoo polymerized प्राप्त करने के लिए पीएच ≥ का एक समाधान 7 में एक असंरचित मोनोमेरिक Shadoo प्रोटीन, या (ii) renaturation प्राप्त करने के लिए: यूरिया हटाने और प्रोटीन की renaturation विभिन्न प्रोटोकॉल को लागू करने से किया जा सकता है विशेषता पार β-शीट रूपांकनों के साथ स्थिर एमीलोयड तंतुओं में।

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Protocol

प्लाज्मिड और Shadoo अभिव्यक्ति की 1. पीढ़ी

नोट: जीन एन्कोडिंग murine Shadoo प्रोटीन (Shadoo 25-122), अभिव्यक्ति वेक्टर पीईटी-28 11 में subcloned था। इस क्लोन ई में तब्दील हो गया था पहले से 11 के रूप में समझाया कोलाई एक एन टर्मिनल hexahistidine टैग, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) के साथ Shadoo प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, बैक्टीरियल तनाव SoluBL21। प्लाज्मिड लेखकों से अनुरोध किया जा सकता है। इसकी अमीनो एसिड अनुक्रम से गणना Shadoo की आणविक वजन 12,243.2 दा है।

नोट: एक छिलके वाला प्रवाह हुड के तहत या करीबी लेम्प लौ को बैक्टीरिया के साथ सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन।

  1. एक मानक गर्मी झटका प्रोटोकॉल का उपयोग, पीईटी-28-अपने 6 -Shadoo प्लाज्मिड के साथ सक्षम SoluBL21 बैक्टीरिया रूपांतरण। प्लाज्मिड की 1-5 μl इस मिश्रण के लिए (आमतौर पर 10 पीजी करने के लिए 100एक ट्यूब में बैक्टीरिया के 50 μl में एनजी)। 45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका प्रदर्शन करते हैं।
  2. संस्कृति 40 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन (चित्रा 1 बी) के साथ पूरक Luria-Bertani माध्यम में 0.5-0.7 का एक 600 तक 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बदल दिया।
  3. संस्कृति के लिए, 240 माइक्रोग्राम / एमएल isopropyl-β-डी thiogalactopyranoside, ITPG जोड़कर Shadoo अभिव्यक्ति हे / एन प्रेरित। 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 rpm पर झटकों के तहत संस्कृति बैक्टीरिया। नोट: आमतौर पर, बैक्टीरियल संस्कृति एक 600 3 हे / एन की पहुँचता है।
    नोट: तब्दील बैक्टीरिया भविष्य प्रोटीन के उत्पादन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस के लिए, जीवाणु संस्कृति aliquots में 10% -50% (वी / वी) बाँझ ग्लिसरॉल जोड़ने और -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रोक।

आकृति 1
Shadoo अभिव्यक्ति की Shadoo अभिव्यक्ति का निर्माण, बैक्टीरिया परिवर्तन और प्रेरण की चित्रा 1. योजना (के रूप में चरण 1 में वर्णित)। (ए) Shadoo के लिए अभिव्यक्ति का निर्माण प्रोटीन, NT के एन टर्मिनस से जुड़े हुए एक hexahistidine टैग encodes। योजना Shadoo प्रोटीन एक सी टर्मिनस (सीटी) के बाद बुनियादी arginine / ग्लाइसिन दोहराता (हरी सिलेंडर), एक हाइड्रोफोबिक डोमेन (एचडी), और एक एकल एन ग्लाइकोसिलेशन साइट (चो), होता है कि पता चलता है। (बी) पीईटी-28-अपने 6 -Shadoo प्लाज्मिड 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए गर्मी के झटके से SoluBL21 बैक्टीरिया में तब्दील हो जाता है। परिवर्तित जीवाणु चयनात्मक अगर / एमएल केनामाइसिन 40 माइक्रोग्राम युक्त पर चढ़ाया जाता है। थाली से एक ही कॉलोनी में एक 1,000-3,000 मिलीलीटर प्रकार के बरतन फ्लास्क में एक संस्कृति टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति 1 मिमी IPTG साथ प्रेरित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कम दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा Shadoo प्रोटीन की 2. शोधन (LPLC)

  1. सेल और मेंclusion निकायों तैयारी
    1. जीवाणु निलंबन लीजिए और centrifugation ट्यूब (चित्रा 2) में स्थानांतरित।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2500 XG पर स्पिन,। Decanting और सेल संस्कृति की 500 मिलीलीटर से निकाली गई हर गोली के लिए resuspend छर्रों (विरोधी प्रोटीज कॉकटेल के साथ 50 मिमी Tris, 10 मिमी EDTA, पीएच 8) 15 मिलीलीटर बफर में से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      नोट: resuspended छर्रों जमे हुए हैं और कई दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। बर्फ़ीली बैक्टीरियल कोशिकाओं सेल की सुविधा।
    3. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और Coomassie धुंधला द्वारा कच्चे तेल की बैक्टीरिया छर्रों का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन की अधिक अभिव्यक्ति की जाँच करें।
      1. इस के लिए, जीवाणु संस्कृति के सेंट्रीफ्यूज 1 मिलीलीटर गोली कोशिकाओं के लिए। 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl Laemmli विकृतीकरण गोली समाधान (277.8 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 6.8, 4.4% एसडीएस, डब्ल्यू 44.4% / वी ग्लिसरॉल, नीले 0.02% bromophenol) और गर्मी जोड़ें।
      2. एक 12% acrylamide जेल को लोड नमूना के 10 μl, चलाने एसडीएस पृष्ठ और विसूAlize Coomassie धुंधला द्वारा प्रोटीन को अलग किया।
    4. ) 2.1.2 से पूरी तरह से resuspended गोली 0.5% अंतिम एकाग्रता के लिए ट्राइटन X-100 जोड़ें।
    5. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में निलंबन सेते हैं।
    6. बैक्टीरियल कोशिकाओं lyse करने के लिए बर्फ के ठंडे पानी में 6-12 माइक्रोन पर चोटी से शिखर आयाम 5 मिनट के लिए निलंबन Sonicate।
    7. स्थानांतरण साफ 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूबों में निलंबन sonicated।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब।
    9. Decanting द्वारा तैरनेवाला निकालें और ट्यूब प्रति बाध्यकारी बफर (20 मिमी Tris एचसीएल बफर, पीएच 7.4, 0.5 एम NaCl, 8 एम यूरिया, 5 मिमी Imidazole) के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    10. घूर्णन पहिया हे / एन पर प्लेस ट्यूबों पूरी तरह से शामिल किए जाने के शरीर से प्रोटीन resuspend।

    चित्र 2
    शामिल किए जाने की शुद्धि की चित्रा 2. इस योजनाShadoo व्यक्त निकायों (2.1 चरण में वर्णित है)। तब्दील बैक्टीरिया centrifugation द्वारा काटा और lysis बफर में resuspended हैं। निलंबन 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated, और फिर यंत्रवत् बैक्टीरियल कोशिकाओं को तोड़ने के लिए sonicated है। Sonication नमूना हीटिंग रोकने के लिए बर्फ पर किया जाता है। टूटी हुई कोशिकाओं centrifugation द्वारा काटा और समावेश शरीर से प्रोटीन solubilize के लिए 8 एम यूरिया युक्त एक बफर में resuspended हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  2. नी 2 + -affinity क्रोमैटोग्राफी
    नोट: क्रोमैटोग्राफी 5 मिलीलीटर Sepharose chelating स्तंभ (चित्रा 3), एक नी 2 + -charged का उपयोग कर FPLC प्रणाली पर किया जाता है। सभी समाधान / मिनट 1 मिलीलीटर के प्रवाह की दर के साथ स्तंभ पर लोड कर रहे हैं।
    1. यह चार्ज करने के क्रम में Sepharose स्तंभ में 0.2 एम NISO 4 पानी के घोल का 10 मिलीलीटर इंजेक्षननी 2 + -ions साथ।
    2. Imidazole की एक कम एकाग्रता (20 मिमी Tris एचसीएल बफर, पीएच 7.4, 0.5 एम NaCl, 8 एम यूरिया, 5 मिमी Imidazole) युक्त बाध्यकारी बफर के 30-50 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा नी 2 + -ions के साथ आरोप लगाया स्तंभ संतुलित करना।
    3. एक 50 मिलीलीटर इंजेक्शन पाश के साथ यूरिया solubilized प्रोटीन लोड करें।
    4. अच्छी तरह से अनबाउंड प्रोटीन की एक अधिकतम हटाने के क्रम में 10 मिलीलीटर कम imidazole बाध्यकारी बफर (20 मिमी Tris एचसीएल बफर, पीएच 7.4, 0.5 एम NaCl, 8 एम यूरिया, 5 मिमी Imidazole) के साथ स्तंभ धोने से प्रवाह के माध्यम से अंश की वसूली स्तंभ से।
    5. (मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.4, 0.5 एम NaCl, 8 एम यूरिया, 80 मिमी imidazole 20) गैर विशेष स्तंभ के लिए बाध्य प्रोटीन elute के लिए वाशिंग बफर के 50-100 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें।
    6. 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.4, 0.5 एम NaCl, 8 एम यूरिया युक्त बफर में 80-800 मिमी Imidazole की एक 15 मिनट रैखिक ढाल लागू करें। ढाल आवेदन के दौरान 1 मिलीलीटर अंशों लीजिए। नोट: उनकी टैग-प्रोटीन बुद्धि eluted हैं(एक प्रतियोगी के रूप में प्रयोग किया जाता) imidazole युक्त बफर के हा ढाल।
    7. (2.1.3.1 देखें) प्रत्येक अंश की एक 8 μl विभाज्य लो और 4 μl 4x Laemmli विकृतीकरण समाधान जोड़ें। 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर हीट समाधान।
    8. लोड Coomassie धुंधला द्वारा प्रोटीन आकार मार्कर के 10 μl और 12% acrylamide जेल के लिए प्रत्येक नमूना के 10 μl, चलाने एसडीएस पृष्ठ और कल्पना अलग प्रोटीन। नोट: गणना की Shadoo की आणविक वजन अपने अमीनो एसिड अनुक्रम 12,243.2 दा है के रूप में।
    9. पूल Shadoo युक्त सभी अंशों।

    चित्र तीन
    (कदम 2.2-2.4 में वर्णित है) 3. शोधन प्रक्रिया चित्रा। (ए) नी 2 + -ions polyhistidine टैग प्रोटीन के चुनिंदा शुद्धि की अनुमति देता है जो हिस्टिडीन अवशेष, द्वारा समन्वित किया जा सकता। Imidazole के माध्यम से, प्रोटीन elute करने के लिए प्रयोग किया जाता हैनी 2 + आयन के साथ समन्वय और बाध्य प्रोटीन को विस्थापित करने की क्षमता। (बी) के एक आकार अपवर्जन स्तंभ पर अलग हो रहे हैं -column नी 2 + पर बनाए रखा गया है कि अलग-अलग हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या के प्रोटीन। प्रोटीन के सबसे छोटे लोगों के लिए सबसे बड़ा से eluted हैं। (सी) का उपयोग करने से पहले, Shadoo युक्त भिन्न जमा और यूरिया, imidazole और नमक को दूर करने के desalted कर रहे हैं। गुणवत्ता नियंत्रण assays के एसडीएस पृष्ठ / Coomassie धुंधला, पश्चिमी सोख्ता शामिल हैं। शुद्ध Shadoo फ्रीज सूखे की जा सकती है। -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब Lyophilized Shadoo महीने के लिए स्थिर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  3. आकार अपवर्जन वर्णलेखन
    नोट: एक दूसरे शुद्धि कदम अन्य प्रोटीन पहले शुद्धि चरण के दौरान सह-eluted से Shadoo प्रोटीन को अलग करती है जो आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी में होते हैं(चित्रा 3 बी)।
    1. 1.5 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर पर 20 मिमी Tris एचसीएल बफर, पीएच 7.4, 0.5 एम NaCl, 8 एम यूरिया का 250 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा कुल बिस्तर मात्रा 120 मिलीलीटर की Superdex स्तंभ संतुलित करना।
    2. Equilibrated स्तंभ पर 2.2.9 से Shadoo युक्त लोड जमा अंशों। ऊपर बफर के निरंतर प्रवाह पर 40 मिलीलीटर की स्तंभ-शून्य मात्रा के बाद 1 मिलीलीटर अंशों लीजिए।
    3. प्रत्येक अंश की एक 10 μl विभाज्य लो और भिन्न Shadoo होते हैं, जो पता लगाने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में एक एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और Coomassie धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    4. Shadoo युक्त पूल अंशों।
  4. Desalting
    नोट: Desalting प्रक्रिया आगे biophysical और जैव रासायनिक अध्ययन (चित्रा 3 सी) के लिए उपयुक्त एक बफर में पुनः संयोजक Shadoo प्रोटीन प्राप्त करने के लिए लवण, imidazole और यूरिया हटा। एक ही परिणाम बफर के खिलाफ नमूने dialyzing द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
    1. 150 मिलीलीटर के साथ 53 मिलीलीटर की एक desalting स्तंभ संतुलित करना/ मिनट 5 मिलीलीटर के प्रवाह की दर पर 10 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर, पीएच 5, के।
    2. लोड स्तंभ पर Shadoo अंशों जमा। अमोनियम एसीटेट बफर के इंजेक्शन पर मैन्युअल यूवी डिटेक्टर के उत्पादन में 280 एनएम पर सिग्नल की वृद्धि बताते हैं कि अंशों इकट्ठा।
    3. रुक सूखी desalted Shadoo और -20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
    4. एक पर्याप्त बफर में lyophilized Shadoo, जैसे कि 10 मिमी सोडियम एसीटेट बफर, पीएच 5 भंग, पहले का उपयोग करने के लिए।
      नोट: polyhistidine टैग enterokinase से हटाया जा सकता है।

शारीरिक पीएच पर amyloid तंतु में Shadoo की इन विट्रो कोडांतरण में 3.

नोट: अनायास Shadoo प्रोटीन समुच्चय और पीएच ≥ 7 11 पर तंतुओं रूपों।

चित्रा 4
Shadoo amyloid तंतु को refolding की चित्रा 4. योजना (descri के रूप मेंमिलाते हुए, जबकि एक अम्लीय समाधान में पीएच ≥ 7 के बफर में भंग कर दिया जब चरण 3 में बिस्तर)। शुद्ध Shadoo अनायास amyloid तंतु में धर्मान्तरित, Shadoo 1 एम GDN एचसीएल के साथ ऊष्मायन पर amyloid तंतु को बदल देता है। गुणवत्ता नियंत्रण assays के इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी और tht धुंधला शामिल हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एक 20 मिमी Tris एचसीएल बफर, 7.4 पीएच में 2 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए Shadoo पतला। 280 एनएम पर समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को मापने और 20,970 के Shadoo एमिनो एसिड संरचना से deduced विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके एकाग्रता उपाय।
  2. एमीलोयड संरचनाओं (चित्रा 4) के लिए सहज प्रोटीन रूपांतरण अनुमति देने के लिए, कुछ हफ़्ते के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शंक्वाकार प्लास्टिक ट्यूब में समाधान के 500 μl सेते हैं।
  3. हौसले से एक अंतिम conce करने के लिए टी (tht) thioflavin तैयार जोड़ेंShadoo समाधान की 100 μl विभाज्य 10 माइक्रोन की ntration। आरटी पर 5 मिनट के लिए समाधान सेते हैं। एमीलोयड संरचनाओं 17 की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए 435 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर 460 से 520 एनएम के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने।

अम्लीय PHS पर amyloid तंतु को Shadoo की इन विट्रो कोडांतरण में 4.

  1. 2 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए 1 एम GdnHCl, 20 मिमी ना-एसीटेट बफर, पीएच 5 में Shadoo पतला।
  2. 3-7 दिनों के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर झटकों के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में इस समाधान के 500 μl सेते हैं।
  3. 3.3 में के रूप में समाधान का एक विभाज्य tht जोड़कर amyloid तंतु की उपस्थिति की जाँच करें।
  4. Shadoo amyloid तंतु शुद्ध करने के लिए, 10 मिमी ना-एसीटेट बफर, पीएच 5.0 के खिलाफ प्राप्त निलंबन dialyze।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध तंतुओं स्टोर।

चित्रा 5 नी 2 + से eluted चित्रा 5. प्रतिनिधि परिणाम है। प्रोटीन भिन्न chelating स्तंभ (ए) और आकार अपवर्जन स्तंभ (बी) एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला उपयोग विश्लेषण किया गया -charged। शुद्ध Shadoo की पहचान SPRN विरोधी Shadoo एंटीबॉडी (सी) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

शुद्ध Shadoo प्रोटीन के बारे में 5-10 मिलीग्राम जीवाणु संस्कृति की लीटर प्रति प्राप्त की है। एक दो कदम शुद्धि उच्च शुद्धता की पुनः संयोजक Shadoo प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। पहले कदम के लिए उनकी टैग-प्रोटीन को बरकरार रखे हुए है कि एक नी 2 + -charged स्तंभ के साथ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा किया जाता है। Eluted अंशों एसडीएस पृष्ठ के अधीन है और Coomassie खूब ब्लू (चित्रा 5 ए) के साथ दाग रहे हैं। Shadoo प्रोटीन युक्त भिन्न जमा और आगे उनके आकार के अनुसार प्रोटीन को अलग करती है, जो आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (Shadoo आणविक वजन के बारे में 12 केडीए है) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं। क्षालन पर एकत्र भिन्न एसडीएस पृष्ठ / Coomassie विश्लेषण (चित्रा 5 ब) द्वारा कल्पना कर रहे हैं। इसके अलावा, Shadoo प्रोटीन सी टर्मिनल क्षेत्र (चित्रा 5C) से 76-105 अमीनो एसिड के बीच एक संवेदनशील मिलान को बांधता है कि एक विशिष्ट विरोधी Shadoo एंटीबॉडी, SPRN का उपयोग करते हुए पश्चिमी धब्बा इसका सबूत है।

Shadoo एक को refoldingmyloid तंतुओं tht धुंधला (चित्रा 6A) द्वारा और नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6B) द्वारा सत्यापित है। Tht एमीलोयड विधानसभाओं के लिए विशेषता पार β-शीट चतुर्धातुक संरचनाओं बांधता है जो एक फ्लोरोसेंट रंजक है। चित्रा 6A में tht तीव्रता में वृद्धि हुई Shadoo amyloidal संरचनाओं में बदल जाती है कि इंगित करता है।

चित्रा 6
चित्रा 6. प्रतिनिधि परिणाम है। 2 माइक्रोन मोनोमर बराबर एकाग्रता की (ए) Shadoo तंतुओं आरटी पर 5 मिनट के लिए tht (10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के साथ preincubated थे। फ्लोरोसेंट उत्सर्जन तीव्रता 435 एनएम पर एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग प्रत्येक नमूना के लिए दर्ज की गई हैं। Shadoo नियंत्रण एस की तुलना में amyloid तंतु को polymerized युक्त समाधान में tht प्रतिदीप्ति तीव्रता में उल्लेखनीय वृद्धि नोटमोनोमेरिक Shadoo की olution। Fibrillated Shadoo (बी) संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक माउस Shadoo प्रोटीन की एक बड़ी राशि की शुद्धि दोनों के लिए एक आसान और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। वर्णित विधि सफल solubilization और (उनकी 6) -tagged पुनः संयोजक Shadoo प्रोटीन की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। शीर्षक में बाहर की ओर इशारा है, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि एक प्रोकार्योटिक जीवाणु ई में व्यक्त की है जब कोलाई Shadoo समावेश शरीर में जम जाता है। Shadoo शुद्धि के लिए पहले, बैक्टीरिया ट्राइटन X-100 युक्त एक बफर में sonication द्वारा lysed किया जाना है। इसके बाद समावेश शरीर 8 एम यूरिया denaturing समाधान में solubilized जा सकता है। इसके अलावा, पूरे शोधन प्रक्रिया Shadoo भाजन और कुल के लिए जाता है के बाद से 8 एम यूरिया बफर समाधान में प्रदर्शन किया जा रहा है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी: solubilization और समावेश शरीर के स्पष्टीकरण के बाद, विकृत प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला दो कदम शोधन प्रक्रिया के अधीन है। आत्मीयता chromatography कदम एक नी 2 + chelating स्तंभ -charged करने के लिए (उनकी 6) -tag के माध्यम से Shadoo बंधन में होते हैं। 8 एम यूरिया समाधान प्रोटीन में विकृत कर रहे हैं और उनके हिस्टिडीन अवशेष सतह उजागर कर रहे हैं। इसके अलावा, यूरिया प्रोटिएजों दूषित होने की स्थिति में प्रोटियोलिसिस को रोकने के द्वारा Shadoo संरचनात्मक अखंडता को बढ़ावा देता है। दूसरी शुद्धि चरण में, Shadoo Imidazole की ढाल दूषित पदार्थों को प्रोटीन को अलग करने के क्रम में आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के अधीन है साथ से eluted। दूसरे चरण के दौरान बड़े प्रोटीन वे इस प्रकार, मैट्रिक्स के छिद्रों में प्रवेश करने में असमर्थ हैं और रूप में, पहले eluted कॉलम के माध्यम से एक सीधा रास्ता है कर रहे हैं। वे pores में प्रवेश और एक अधिक जटिल पथ हो सकता है के बाद से छोटे प्रोटीन, Shadoo के रूप में, स्तंभ से elute अब लेने के लिए। अंत में, प्रोटीन तैयारी यूरिया, imidazole और नमक को दूर करने के desalted है। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस प्रक्रिया पुनः संयोजक Shadoo निम्नलिखित उच्च शुद्धता के लिए शुद्ध होता है कि इंगित करता है। यह वी में उपयोग किया जा सकताarious जैविक और जैव प्रौद्योगिकी अध्ययन करता है।

ई कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। ई में स्तनधारी प्रोटीन व्यक्त की कम लागत, आसान हेरफेर, तेज़ी और सुविधा कोलाई इस मेजबान जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए पहली पसंद उपकरण की हैं। हालांकि, सभी स्तनधारी प्रोटीन घुलनशील रूप में या / और इस बैक्टीरिया में पर्याप्त मात्रा में व्यक्त किया जा सकता है। कभी कभी, बाधाओं वैकल्पिक मीडिया 18-20 का उपयोग कर, प्रमोटरों बदल रहा है, अभिव्यक्ति के तापमान को कम शुद्धि टैग जोड़ने के रूप में विभिन्न रणनीतियों से दूर किया जा सकता है। हालांकि, कुछ मामलों में, एक इष्टतम अभिव्यक्ति हालत खोजने समय और प्रयास में एक उच्च लागत हो सकती है। पुनः संयोजक Shadoo का उत्पादन करने के लिए कठिनाइयों SoluBL21 सक्षम ई के साथ पार कर रहे थे कोलाई तनाव। इस उत्परिवर्ती मेजबान तनाव काफी Shadoo उत्पादन की उपज में सुधार हुआ है और हमें पूरी तरह से घुलनशील प्राप्त करने की अनुमतिShadoo। प्राप्त पैदावार रेंज 5-10 मिलीग्राम / एल संस्कृति में थे।

संयोजक Shadoo परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी 11,12 से एक यादृच्छिक-कुंडल सुविधा देने के लिए एक नेटिव असंरचित प्रोटीन होना दिखाया गया था। एक बेहद सकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन होने के नाते (पीआई ~ 10.44) Shadoo शारीरिक पीएच पर कुल करने के लिए जाता है। हालांकि, Shadoo अम्लीय PHS के बफर समाधान में पूरी तरह से घुलनशील है। हम विभिन्न PHS पर amyloid तंतु को Shadoo भाजन करने के लिए यहाँ सरल और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। Polymerized Shadoo कुछ neurodegenerative रोगों की विशेषताएँ कि रोग प्रोटीन foldings अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। हमारी प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध पुनः संयोजक Shadoo गठनात्मक संक्रमण की प्रक्रिया के आगे जैव रासायनिक और संरचनात्मक अभिलक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसका प्राथमिक संरचना के आधार पर, Shadoo glycosylphosphatidyli की कुर्की के लिए एक एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन साइट और संकेत पेप्टाइड्स है की भविष्यवाणी की थीnositol (जीपीआई) लंगर अपनी सी टर्मिनस (चित्रा 1 ए) के बगल में। कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली बाद translational संशोधनों प्रदर्शन करने में सक्षम नहीं है, क्योंकि समावेश शरीर से शुद्ध संयोजक Shadoo कार्बोहाइड्रेट से वंचित है। परिणाम में, प्रोटीन, वसा या न्यूक्लिक एसिड के साथ पुनः संयोजक Shadoo की बातचीत मूल निवासी प्रोटीन की तुलना में संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Shadoo ग्लाइकोसिलेशन के महत्व को हाल ही में ubiquitination 21 से प्रोटीन संशोधन के बाद Shadoo एंटीबॉडी गिरावट के लिए प्रस्तावित किया गया था। prion रोग में जीपीआई लंगर की भूमिका अच्छी तरह से जाना जाता है, लेकिन कई अध्ययनों जीपीआई लंगर प्रिओन रोगों 22,23 के रोगजनन में एक भूमिका निभा सकते हैं नहीं है। इस प्रकार, बैक्टीरियल Shadoo खाते में इन सीमाओं को लेने के लिए इन विट्रो अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता व्यक्त किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
AKTA FPLC  GE, Amersham # 1363
HiLoad 16/60 Superdex GE Healthcare 17-1069-01
HiTrap IMAC GE Healthcare GE17-0920-05
HiPrep26/10 Desalting column GE Healthcare GE17-5087-01
SoluBL21 Competent E. coli Genlantis C700200
pET-28b+ Novogen 69865-3
IPTG Sigma-Aldrich I6758
LB-Broth medium Sigma-Aldrich L3022
Eppendorf Biophotometar Eppendorf 550507804
Trito X-100 Life Technologies 85111
NiSO4 Sigma-Aldrich 656895
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl Sigma-Aldrich RES3098T
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4693116001
NaCl Sigma-Aldrich 746398
Imidazol Sigma-Aldrich I5513
Gdn-HCl Sigma-Aldrich G4505
protein size marker  Thermo Fisher Scientific 26620

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 106 Shadoo prion रोग amyloid फाइबर आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन उनकी टैग प्रोटीन शुद्धि समावेशी पिंड क्रोमैटोग्राफी
शोधन और के amyloid तंतु को refolding (उनकी)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged संयोजक Shadoo प्रोटीन में समावेश शरीर के रूप में अभिव्यक्त<em&gt; ई कोलाई</em
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Li, Q., Richard, C. A., Moudjou, M., … More

Li, Q., Richard, C. A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J. Vis. Exp. (106), e53432, doi:10.3791/53432 (2015).

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