Abstract
Escherichia coli-expressionssystemet är ett kraftfullt verktyg för framställning av rekombinanta eukaryota proteiner. Vi använder den för att producera Shadoo, ett protein som tillhör prion familjen. En kromatografisk metod för reningen av (His) 6-märkt rekombinant Shadoo uttryckt som inklusionskroppar beskrivs. Inklusionskropparna löses i 8 M urea och bunden till en Ni 2+ -charged kolumnen för att utföra jon affinitetskromatografi. Bundna proteiner eluerades med en gradient av imidazol. Fraktioner innehållande Shadoo proteinet utsattes för gelkromatografi för erhållande av ett höggradigt renat protein. I det slutliga steget renades Shadoo avsaltas för att avlägsna salter, urea och imidazol. Rekombinant Shadoo protein är en viktig reagens för biofysikaliska och biokemiska studier av proteinkonforma störningar förekommer i prionsjukdomar. Många rapporter visade att prionneurodegenerativa sjukdomar kommer från avsättningen av knivhuggle, beordrade amyloidfibriller. Exempel protokoll beskriver hur man fibrillera Shadoo i amyloidfibriller vid surt och neutralt / grundläggande pH presenteras. De metoder för att producera och fibrillera Shadoo kan underlätta forskning i laboratorier som arbetar med prionsjukdomar, eftersom det möjliggör produktion av stora mängder protein i en snabb och billig sätt.
Introduction
Prion neurodegenerativa sjukdomar, som omfattar bovin spongiform encefalopati hos nötkreatur, scrapie hos får och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom hos människor, är dödlig och obotlig. Prionsjukdomar kännetecknas av konformationsförändringar av cellulär prionprotein huvudsakligen sammansatta av a-spiraler, in i den tvär β ark anrikade amyloid anpassare 1,2. Kors p-strukturer innehåller tätt packade och höggradigt ordnade kristallina liknande p-ark stabiliserad med vätebindningar 3,4. Prion amyloider kan självreplikera på grund av p-strängar på den växande kanten som ger en mall för rekrytering och omvandling av ett monomert protein enhet.
Enligt den "enda protein" hypotes är amyloid konformeren av prionprotein den enda smittämnet. Men vissa andra biomolekyler föreslagits vara nödvändigt för prionsjukdomar. Exempelvis är cellmembran tros vara ett ställe där conversipå sker och några negativt laddade lipider har visats förbättra konverteringen 5,6. Dessutom kan vissa proteiner också vara delaktiga i prion patologier. Närmare bestämt finns det två andra medlemmar av prionproteinet familjen: Doppel och Shadoo 7,8. Doppel har en relativt stel struktur stabiliserad med di-sulfid broar och underlåter att själva polymeriseras och aggregat till amyloidfibriller 9. Däremot liknar prionproteinet kan Shadoo anta en β-sheet-berikat struktur och själv associera till amyloidfibrill strukturer. Det visade sig att Shadoo kan fibrillera under nativa förhållanden eller vid bindning negativt laddade membran 10,11. Omvandling av Shadoo in amyloidliknande fibrer kan vara associerade med patologier. I själva verket är de mekanismer genom vilka amyloidliknande strukturer orsakar sjukdom dåligt kända.
Shadoo bär en hydrofob domän (HD) och en rad tandem Arg / Gly upprepar liknande to den N-terminala delen av prionprotein (Figur 1A). Eftersom den N-terminala delen av prionprotein, är Shadoo starkt positivt laddad och verkar vara en native ostrukturerad protein 11,12. Shadoo verkar vara funktionellt relaterade till prionsjukdomar, eftersom det direkt kan binda prionprotein. Dessutom är dess uttryck nedregleras under prion patologi 13,14. Emellertid är rollen av Shadoo i prionsjukdom ännu inte fastställts.
Vi utvecklade en plasmid som bär den kodande sekvensen för mus Shadoo genen. Plasmiden användes för att transformera E. coli för framställning av N-terminala His 6-fusions Shadoo protein. Detta uttryck är väletablerat i vårt laboratorium och används ofta i våra pågående projekt 6,15,16. En viktig fråga för expression av Shadoo är valet av E. coli-stam. Medan behöriga BL21 bakteriestammen är vanligen används för uttryck av rekombinant proproteiner Shadoo uttrycktes framgångsrikt och renades bara från den transformerade SoluBL21 bakteriestam. SoluBL21 kompetenta E. coli är en förbättrad mutant av BL21 värdstam utvecklats för produktion av proteiner vars uttryck i moder BL21 gav ingen detekterbar löslig produkt. Hög nivå uttryck av Shadoo i SoluBL21 E. coli leder till ackumulering av proteinet i inklusionskroppar. Som ett allmänt drag, när en icke-nativt protein uttrycks kraftigt i E. coli, tenderar detta protein att ackumulera i olösliga inklusionskroppar. Shadoo aggregerar förmodligen genom icke-kovalenta hydrofoba eller joniska interaktioner (eller en kombination av båda) och höggradigt anrikade dynamiska strukturer som bildas av proteinet vikta i olika grad. Följaktligen innefattar reningen åtminstone två steg: (i) en selektiv separation av proteinet från andra biomolekyler i en denatureringsmedium, och (ii) en renaturering av det renade proteinet med användning av in vitro-veckningtekniker.
Den selektiva separationen av Shadoo uppnåddes i en buffertlösning innehållande 8 M urea (eller alternativt 6M guanidin-HCl). Urea avlägsnande och renaturering av proteinet kan göras med hjälp av olika protokoll: (i) renaturering i ett surt pH-lösning för att erhålla en ostrukturerad monomert Shadoo protein, eller (ii) renaturering i en lösning med pH ≥ 7 för att erhålla Shadoo polymeriserade till stabila amyloidfibrer med karaktäristiska motiv tvär β-ark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av plasmid och Shadoo Expression
Obs: Den gen som kodar för murint Shadoo protein (Shadoo 25-122), subklonades i expressionsvektorn pET-28 11. Denna klon transformerades in i E. coli SoluBL21 bakteriestam, för att uttrycka Shadoo protein med en N-terminal hexahistidinmarkör, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) som förklarats tidigare 11. Plasmiden kan beställas från författarna. Molekylvikten för Shadoo beräknades från dess aminosyrasekvens är 12,243.2 Da.
Obs: Utför alla manipulationer med bakterier under en laminal flöde huva eller nära bunsenlåga.
- Transformera kompetenta SoluBL21 bakterier med pET-28-His 6 -Shadoo plasmiden, med användning av en standardvärmechocksprotokoll. För denna blandning en till 5 pl av plasmiden (typiskt 10 pg till 100ng) i 50 pl av bakterierna i ett rör. Utför värmechock vid 42 ° C under 45 sek.
- Kultur transformerad bakterier vid 37 ° C tills en 600 av 0,5-0,7 i Luria-Bertani-medium kompletterat med 40 mg / ml kanamycin (Figur 1B).
- Inducera Shadoo expressions O / N genom att tillsätta 240 | ig / ml isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid, ITPG, till odlingen. Kultur bakterier under skakning vid 150 rpm vid 37 ° C. Obs: Normalt når A 600 av 3 O / N bakteriekultur.
Note: Transformerad bakterier kan förvaras vid -80 ° C för framtida proteinproduktion. För detta, tillsätt 10% -50% (vol / vol) steril glycerol i bakteriella odlings alikvoter och frysa dem vid -80 ° C.
Figur 1. Schema för Shadoo expressionskonstrukt, bakterier transformation och induktion av Shadoo uttryck (såsom beskrivs i steg 1). (A) Uttryckningskonstruktionen för Shadoo kodar en hexahistidin-markör fuserad till N-terminalen av proteinet, Nt. Systemet visar att Shadoo protein innehåller basiska arginin / glycin upprepningar (grön cylinder), en hydrofob domän (HD), och ett enda N-glykosyleringsställe (CHO), följt av en C-terminal (Ct). (B) pET-28-His 6 -Shadoo plasmiden transformeras in i SoluBL21 bakterier genom värmechock för 45 sekunder vid 42 ° C. Transformerade bakterierna stryks ut på selektiv agar innehållande 40 pg / ml kanamycin. En enda koloni från plattan används för att ympa en kultur i en 1000-3000 ml skakkolv. Expression av det rekombinanta proteinet induceras med 1 mM IPTG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Rening av Shadoo protein genom lågtrycks vätskekromatografi (LPLC)
- Cellys och Islutsats organ beredning
- Samla bakteriesuspensionen och överför till centrifugrör (Figur 2).
- Snurra vid 2500 x g, under 20 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten genom dekantering och återsuspendera pellets i 15 ml buffert (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 med anti-proteas cocktail) för varje pellet härrörande från 500 ml cellkultur.
Obs: Resuspenderade pelletar kan frysas och förvaras vid -20 ° C under flera dagar. Frysning underlättar bakterieceller lys. - Kontrollera överexpression av rekombinant protein med användning av råa bakterie pelletar genom SDS-PAGE-analys och Coomassie-färgning.
- För detta, att centrifugera 1 ml bakteriekultur pelle celler. Lägg 100 | il Laemmli-denatureringslösning (277,8 mM tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% vikt / volym glycerol, 0,02% bromfenolblått) för att pelletera och värm vid 100 ° C under 5 minuter.
- Belastning 10 | il av provet till en akrylamidgel 12%, köra SDS-PAGE och visuAlize separerade proteiner genom Coomassie-färgning.
- Lägg till Triton X-100 till 0,5% slutkoncentration till helt återsuspenderade pelleten från 2.1.2).
- Inkubera suspensionen i vattenbad vid 37 ° C under 30 minuter.
- Sonikera suspension 5 min vid 6-12 mikron topp-till-toppamplitud i iskallt vatten för att lysera bakterieceller.
- Överför sonikerad suspension i rena 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera rören vid 15 tusen xg under 15 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten genom dekantering och tillsätt 5 ml av bindningsbuffert (20 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,4, 0,5 M NaCI, 8 M urea, 5 mM imidazol) per rör.
- Placera rören på roterande hjul O / N för att helt resuspendera proteiner från inklusionskroppar.
Figur 2. Scheme of rening av integrationorgan (såsom beskrivs i steg 2,1). Transformerade bakterier som uttrycker Shadoo skördas genom centrifugering och återsuspenderades i lyseringsbuffert. Suspensionen inkuberas vid 37 ° C under 30 minuter, och sonikerades sedan för att mekaniskt bryta bakterieceller. Sonikering sker på is för att förhindra prov uppvärmning. Trasiga celler skördas genom centrifugering och återsuspenderades i en buffert innehållande 8 M urea för att lösa proteiner från inklusionskroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. - Ni2 + -affinity kromatografi
Obs: kromatografi utförs på FPLC-system med användning av en Ni2 + -charged, 5 ml Sepharose-kelaterande kolonn (figur 3A). Samtliga lösningar laddades på kolonnen med en flödeshastighet av 1 ml / min.- Injicera 10 ml av 0,2 M Niso 4 vattenlösning i Sepharose-kolonnen för att ladda denmed Ni 2+ -joner.
- Jämvikta kolonnen laddades med Ni2 + -joner genom att injicera 30-50 ml av bindningsbuffert innehållande en låg koncentration av imidazol (20 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,4, 0,5 M NaCI, 8 M urea, 5 mM imidazol).
- Ladda urea-solubiliserade proteiner med en 50 ml injektionsslinga.
- Återskapa genomflödesfraktionen genom noggrann tvättning av kolonnen med 10 ml låg imidazol bindningsbuffert (20 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,4, 0,5 M NaCI, 8 M urea, 5 mM imidazol) i syfte att avlägsna ett maximum av obundna proteiner från kolonnen.
- Tvätta kolonnen med 50 till 100 ml av tvättbuffert (20 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCI, 8 M karbamid, 80 mM imidazol) att eluera proteiner icke-specifikt bundna till kolonnen.
- Applicera en 15 min linjär gradient av 80-800 mM imidazol i buffert innehållande 20 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCI, 8 M urea. Samla 1 ml fraktioner under gradienten ansökan. Obs: His-taggade proteinerna elueras withektar gradient av imidazol-innehållande buffert (används som en konkurrent).
- Ta en 8 pl portion av varje fraktion och tillsätt 4 pl 4x Laemmli denatureringslösning (se 2.1.3.1). Värmelösningar vid 100 ° C under 5 min.
- Fylla på 10 il proteinstorleksmarkör och 10 ul av varje prov till akrylamidgel 12%, kör SDS-PAGE och visualisera separerade proteiner från Coomassie-färgning. Obs: Molekylvikten för Shadoo beräknat bildar dess aminosyror sekvens är 12,243.2 Da.
- Pool alla fraktioner innehållande Shadoo.
Figur 3. Rening förfarande (som beskrivs i steg 2,2-2,4). (A) Ni 2 + -joner kan samordnas av histidinrester, vilket gör det möjligt för selektiv rening av polyhistidin-märkta proteiner. Imidazol används för att eluera proteinet, genomdess förmåga att samordna med Ni2 + -jonen och förskjuta det bundna proteinet. (B) Proteiner med varierande hydrodynamisk radie som kvarhölls på Ni 2+ kolonn separeras på en storleksuteslutningskolonn. Proteiner elueras från den största till de minsta. (C) Före användning fraktioner innehållande Shadoo poolas och avsaltas att avlägsna urea, imidazol och salter. Kvalitetskontroll analyser inkluderar SDS-PAGE / Coomassie färgning, Western blotting. Renat Shadoo kan frystorkas. Lyofiliserat Shadoo är stabil i flera månader vid förvaring vid -20 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra. - Storleksuteslutningskromatografi
Obs: Ett andra reningssteg består i storleksuteslutningskromatografi som separerar Shadoo protein från andra proteiner sameluerade under det första reningssteget(Figur 3B).- Jämvikta Superdex-kolonn av 120 ml total bäddvolym genom att injicera 250 ml 20 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,4, 0,5 M NaCI, 8 M urea vid en flödeshastighet av 1,5 ml / minut.
- Last poolade fraktionerna innehållande Shadoo från 2.2.9 på jämviktad kolonn. Samla 1 ml fraktioner efter kolonnen-hålrumsvolym på 40 ml vid det konstanta flödet av ovanstående buffert.
- Ta en 10 | il alikvot av varje fraktion och utföra en SDS-PAGE-analys och Coomassie-färgning såsom beskrivits ovan för att ta reda på vilka fraktioner som innehåller Shadoo.
- Pool fraktioner innehållande Shadoo.
- Avsaltning
Obs: avsaltningsprocedur bort salter, imidazol och urea för att erhålla rekombinant Shadoo protein i en buffert lämplig för ytterligare biofysikaliska och biokemiska studier (figur 3C). Samma resultat kan erhållas genom att dialysera prover mot bufferten.- Jämvikta en avsaltningskolonn av 53 ml med 150 mlav 10 mM ammoniumacetatbuffert, pH 5, vid en flödeshastighet av 5 ml / min.
- Belastning poolade Shadoo fraktioner på kolonnen. Vid injektion av ammoniumacetatbuffert samla manuellt fraktioner som visar en ökning av signalen vid 280 nm vid utgången från UV-detektorn.
- Frystorka den avsaltade Shadoo och förvara den vid -20 ° C.
- Lös lyofiliserad Shadoo i en adekvat buffert, såsom 10 mM natriumacetatbuffert, pH 5, före användning.
Obs! Polyhistidintagg kan tas bort med enterokinas.
3. In vitro Montering av Shadoo i amyloidfibriller vid fysiologiskt pH
Obs! Shadoo proteinaggregat och spontant bildar fibriller vid pH ≥ 7 11.
Figur 4. Scheme of Shadoo återveckning till amyloidfibriller (som describädd i steg 3). Renat Shadoo omvandlar spontant till amyloidfibriller vid upplösning i buffert med pH ≥ 7. I en sur lösning, omvandlar Shadoo till amyloidfibriller vid inkubering med ett M Gdn-HCI under skakning. Kvalitetskontroll analyser innefattar elektronisk mikroskopi och ThT färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Späd Shadoo till en slutlig koncentration av 2 | iM i en 20 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,4. Mäta koncentrationen genom att mäta den optiska densiteten för lösningen vid 280 nm och med hjälp av extinktionskoefficienten härledd från Shadoo aminosyrakompositionen av 20.970.
- Inkubera 500 ul av lösningen i ett koniskt plaströr vid 4 ° C för ett par veckor, för att möjliggöra spontan protein konvertering till amyloid strukturer (Figur 4).
- Lägg nyberedd tioflavin T (ThT) till en slutlig concentration av 10 | iM till en 100 | il alikvot av Shadoo lösningen. Inkubera lösningen under 5 min vid RT. Mät fluorescensemission 460-520 nm med användning av en excitationsvåglängd av 435 nm för att kontrollera förekomsten av amyloid strukturer 17.
4. In vitro Montering av Shadoo till amyloidfibriller vid surt pH
- Späd Shadoo i 1 M GdnHCl, 20 mM Na-acetatbuffert, pH 5 till en slutkoncentration av 2 ^ M.
- Inkubera 500 pl av denna lösning i ett koniskt rör med kontinuerlig skakning vid 37 ° C, under 3-7 dagar.
- Kontrollera förekomsten av amyloidfibriller genom att lägga ThT till en alikvot av lösningen enligt 3.3.
- Dialysera erhållna suspensionen mot 10 mM Na-acetat-buffert, pH 5,0, för att rena Shadoo amyloidfibriller.
- Lagra renade fibriller vid 4 ° C.
Figur 5. Representativa resultat. Proteinfraktioner eluerade från Ni2 + -charged kelaterande kolonn (A) och storleksuteslutningskolonn (B) analyserades med användning av SDS-PAGE och Coomassie-färgning. Identifiering av renat Shadoo bedömdes med hjälp SPRN anti-Shadoo antikropp (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om 5-10 mg renat Shadoo protein erhålles per liter bakteriekultur. Det behövs en två-stegs rening för att uppnå rekombinant Shadoo med hög renhet. Det första steget utföres genom affinitetskromatografi med en Ni 2+ -charged kolumn som behåller His-taggade proteinerna. Eluerade fraktioner utsattes för SDS-PAGE och färgades med Coomassie Brilliant Blue (figur 5A). Fraktioner innehållande Shadoo proteinet poolas och renas ytterligare genom storleksuteslutningskromatografi, som separerar proteiner efter deras storlek (Shadoo molekylvikten är omkring 12 kDa). Fraktioner uppsamlade efter eluering visualiseras genom SDS-PAGE / Coomassie-analys (figur 5B). Dessutom är Shadoo bevisas genom Western-blotting med användning av en specifik anti-Shadoo antikropp, SPRN som binder till en känslig epitop mellan 76-105 aminosyror från protein C-terminala regionen (figur 5C).
Shadoo omveckning till enmyloid fibriller verifieras genom ThT färgning (Figur 6A) och med negativ färgning elektronmikroskopi (figur 6B). ThT är ett fluorescerande färgämne som binder kors β-ark kvartära strukturer karakteristiska för amyloidaggregat. Ökning av ThT intensiteten i figur 6A visar att Shadoo omvandlas till amyloidal strukturer.
Figur 6. Representativa resultat. (A) Shadoo fibriller av 2 ^ M-monomer ekvivalent koncentration förinkuberades med ThT (10 ^ M slutlig koncentration) under 5 min vid RT. Fluorescerande emissionsintensiteter registreras för varje prov med användning av en excitationsvåglängd på 435 nm. Observera en betydande ökning av ThT fluorescensintensitet i en lösning innehållande Shadoo polymeriseras till amyloidfibriller jämfört med kontroll solution av monomert Shadoo. (B) Transmissionselektronmikroskopi av fibrillerad Shadoo. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett enkelt och effektivt protokoll för både expression och rening av en stor mängd rekombinant mus Shadoo proteinet presenteras. Den beskrivna metoden tillåter framgångsrik solubilisering och rening av (His 6)-märkt rekombinant Shadoo protein. Det är viktigt, såsom påpekas i titeln, som när den uttrycks i en prokaryot bakterie E. coli Shadoo ackumuleras i inklusionskroppar. Före Shadoo rening, bakterier har att lyseras genom sonikering i en buffert innehållande Triton X-100. Därefter inklusionskroppar kan lösas i 8 M urea denatureringslösning. Vidare har hela reningsförfarandet utföras i 8 M ureabuffert lösning, eftersom Shadoo tenderar att polymerisera och aggregat. Efter solubilisering och klargörande av inneslutningskroppar, är supernatanten innehållande denaturerade proteiner utsattes för två-stegs reningsmetod: affinitetskromatografi och storleksuteslutningskromatografi. Affinitets Chromatoggrafi steget består i bindning Shadoo via (His 6) -taggen till en Ni2 + -charged kelaterande kolonn. I 8 M urealösning proteiner denatureras och deras histidinrester är ytexponerade. Dessutom karbamid främjar Shadoo strukturell integritet genom att förhindra proteolys i händelse av kontaminerande proteaser. I det andra reningssteget, Shadoo eluerades från med gradient av imidazol utsattes för storleksuteslutningskromatografi i syfte att separera kontaminerande proteiner. Under det andra steget, är stora proteiner eluerades först, eftersom de är oförmögna att tränga in i porerna hos matrisen och således har en direkt väg genom kolonnen. Mindre proteiner, som Shadoo, tar längre tid att eluera från kolonnen, eftersom de kan komma in i porerna och har en mer invecklad bana. Slutligen är proteinberedningen avsaltades för att avlägsna karbamid, imidazol och salter. Kvalitetskontroll tyder på att följa denna procedur rekombinanta Shadoo renas till hög renhet. Det kan användas i vOlika biologiska och biotekniska studier.
E. coli-expressionssystem är ett mycket användbart verktyg för expression av rekombinanta proteiner. Den låga kostnaden, enkel hantering, snabbhet och bekvämlighet att uttrycka däggdjursproteiner i E. coli gör av denna värd det första valet verktyg för life science applikationer. Men inte alla däggdjursproteiner kan uttryckas i löslig form eller / och i en tillräcklig mängd i denna bakterie. Ibland kan hindren övervinnas genom olika strategier som att sänka uttryck temperatur, ändra promotorer, lägga renings taggar, användning av alternativa medier 18-20. Men i vissa fall, att hitta en optimal expression tillstånd kan ha en hög kostnad i tid och ansträngningar. Svårigheter att producera rekombinant Shadoo vanns med SoluBL21 kompetenta E. coli-stam. Denna mutant värdstammen förbättrats avsevärt utbytet av Shadoo produktion och tillät oss att få helt lösligShadoo. Utbyten erhölls var i intervallet från 5 till 10 mg / I odling.
Rekombinant Shadoo visade sig vara en native ostrukturerad protein ger en slumpmässig spole funktionen genom cirkulär dikroism-spektroskopi 11,12. Att vara ett mycket positivt laddat protein (pl ~ 10.44) Shadoo tenderar att aggregera vid fysiologiskt pH. Emellertid är Shadoo fullständigt löslig i buffertlösningar med sura pH-värden. Vi presenterade här enkla och effektiva protokoll för att polymerisera Shadoo till amyloidfibriller vid olika pH-värden. Polymeriserad Shadoo utgör ett värdefullt verktyg för att studera patologiska proteinveck som präglar vissa neurodegenerativa sjukdomar. Den rekombinanta Shadoo renades med användning av vårt förfarande kan användas för ytterligare biokemiska och strukturella karakteriseringar av konformationsövergångsprocessen.
Baserat på dess primärstruktur, var Shadoo förutsägs ha en N-kopplat glykosyleringsställe och signalpeptider för infästning av glycosylphosphatidylinositol (GPI) ankare intill dess C-terminal (figur 1 A). Rekombinant Shadoo renat från inklusionskroppar berövas kolhydrater eftersom E. coli-expressionssystem är inte kan utföra posttranslationella modifieringar. Följaktligen kan interaktioner av rekombinant Shadoo med proteiner, lipider eller nukleinsyror modifieras jämfört med det nativa proteinet. Till exempel var vikten av Shadoo glykosylering nyligen föreslagits för Shadoo proteasom nedbrytning efter protein modifiering av ubikitinering 21. Rollen av GPI-ankare i prionsjukdom är inte känt, men många studier tyder på att GPI-ankare kan spela en roll i patogenesen av prionsjukdomar 22,23. Således, uttryckt bakterie Shadoo kan användas för in vitro-studier som tar hänsyn till dessa begränsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
References
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
- Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
- Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
- Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
- Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
- Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
- Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
- Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
- Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
- Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
- Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
- Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
- Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
- Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
- Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
- Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
- Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
- Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
- Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).
