Abstract
De Escherichia coli expressiesysteem is een krachtig hulpmiddel voor de productie van recombinante eukaryotische proteïnen. We gebruiken het om Shadoo een eiwit behorend tot de familie prion produceren. Een chromatografische werkwijze voor het zuiveren van (His) 6 gemerkte recombinant Shadoo uitgedrukt als inclusielichamen wordt beschreven. De inclusielichamen worden opgelost in 8 M ureum en gebonden aan een Ni 2 + -charged kolom ion affiniteitschromatografie voeren. Gebonden eiwitten worden geëlueerd door een gradiënt van imidazool. Fracties bevattende Shadoo eiwit worden onderworpen aan grootte-uitsluitingschromatografie op een sterk gezuiverde eiwit te verkrijgen. In de laatste stap gezuiverde Shadoo ontzout zouten, ureum en imidazol te verwijderen. Recombinant Shadoo eiwit is een belangrijk reagens voor biofysische en biochemische studies van eiwitconformatie aandoeningen die zich in prionziekten. Veel rapporten aangetoond dat prion neurodegeneratieve ziekten afkomstig van de depositie van stable, besteld amyloïde fibrillen. Monster protocollen beschrijven hoe Shadoo fibrilleren in amyloïde fibrillen bij zure en neutrale / basic pH worden gepresenteerd. De werkwijzen over het produceren en fibrilleren Shadoo kunnen onderzoek in laboratoria aan prionziekten te vergemakkelijken, aangezien het voor de productie van grote hoeveelheden eiwit in een snelle en goedkope manier.
Introduction
Prion neurodegeneratieve ziekten, die bovine spongiforme encefalopathie bij runderen, scrapie bij schapen en ziekte van Creutzfeldt-Jakob bij mensen omvatten fataal en ongeneeslijk. Prion ziekten worden gekenmerkt door conformatieveranderingen cellulaire prioneiwit voornamelijk uit α-helices, in de cross-β-sheet amyloid verrijkte conformer 1,2. Cross-β-structuren bevatten dicht opeengepakte en sterk geordende kristallijne-achtige β-sheets gestabiliseerd met waterstofbruggen 3,4. Prion amyloids kan zichzelf repliceren vanwege de β-strengen aan de groeiende rand die een sjabloon voor werving verschaffen en het omzetten van een monomeer eiwit unit.
Volgens de "alleen eiwit" hypothese van de amyloïde conformeer van prion eiwit enig infectieus agens. Echter, sommige andere biomoleculen voorgesteld essentieel prion ziekten zijn. Zo worden celmembranen gedacht aan een plek waar conversi zijnOp plaatsvindt en bepaalde negatief geladen lipiden is aangetoond dat het conversieproces 5,6 versterken. Daarnaast kunnen sommige eiwitten ook betrokken bij prion ziekten. Concreet zijn er twee andere leden van het prion eiwit familie: Doppel en Shadoo 7,8. Doppel een relatief stijve constructie gestabiliseerd met di-sulfide bruggen en niet aan zichzelf polymeriseren en aggregaat om amyloïde fibrillen 9. In tegenstelling, vergelijkbaar met prion eiwitten, Shadoo een β-sheet-verrijkte structuur en zelf-associëren in amyloïde fibril structuren aannemen. Er werd aangetoond dat Shadoo kan fibrilleren onder natuurlijke condities of na binding negatief geladen membranen 10,11. Omzetting van Shadoo in amyloïde-achtige vezels kunnen worden geassocieerd met pathologieën. Inderdaad zijn de mechanismen die amyloïde structuren ziekte veroorzaken slecht begrepen.
Shadoo draagt een hydrofoob domein (HD) en een reeks tandem Arg / Gly herhaalt vergelijkbare to de N-terminale deel van prion eiwit (Figuur 1A). Omdat het N-terminale deel van prion proteïne wordt Shadoo sterk positief geladen en blijkt een native ongestructureerde eiwit 11,12 zijn. Shadoo lijkt functioneel verband met prion aandoeningen te zijn, omdat het direct prion eiwit kan binden. Verder wordt de expressie downgereguleerde tijdens prion pathologie 13,14. Echter, de rol van Shadoo in prionziekte nog niet vastgesteld.
We ontwikkelden een plasmide dat de coderende sequentie van het muizen Shadoo gen. Het plasmide werd gebruikt voor het transformeren van E. coli voor productie van N-terminale His6-fusie-eiwit Shadoo. Het expressiesysteem is goed ingeburgerd in ons laboratorium en wordt vaak gebruikt in onze lopende projecten 6,15,16. Een belangrijk punt voor de expressie van Shadoo is de keuze van de E. coli stam. Terwijl bevoegde bacteriestam BL21 wordt gebruikt voor expressie van recombinant proeiwitten Shadoo werd succesvol tot expressie gebracht en gezuiverd uit alleen de getransformeerde SoluBL21 bacteriestam. SoluBL21 competente E. coli is een verbeterde mutant van BL21 gastheerstam ontwikkeld voor de productie van eiwitten waarvan de expressie in de bovenliggende BL21 gaf geen detecteerbaar oplosbaar product. Hoog niveau expressie van Shadoo in SoluBL21 E. coli leidt tot ophoping van het eiwit in inclusielichamen. Een algemeen kenmerk, wanneer een niet-natief eiwit sterk tot expressie gebracht in E. coli, dit eiwit accumuleert in onoplosbare inclusielichamen. Shadoo waarschijnlijk aggregaten via niet-covalente hydrofobe of ionische interacties (of een combinatie van beide) tot zeer verrijkt dynamische structuren gevormd door het gevouwen eiwit in verschillende mate. Bijgevolg, het zuiveren ten minste twee fasen: (i) een selectieve scheiding van het proteïne uit andere biomoleculen in denaturatie medium, en (ii) een renaturatie van het gezuiverde eiwit via in vitro vouwingtechnieken.
De selectieve scheiding van Shadoo werd in een bufferoplossing met 8M ureum (of alternatief 6M guanidine HCl) bereikt. De ureum verwijderen en renaturatie van het eiwit kan door het toepassen van verschillende protocollen: (i) renaturatie in een zure pH-oplossing een ongestructureerde monomeer Shadoo eiwit, of (ii) renaturatie verkrijgen van een oplossing met pH ≥ 7 tot Shadoo gepolymeriseerde verkrijgen in stabiele amyloïde vezels met karakteristieke cross-β-sheet motieven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van plasmide en Shadoo Expression
Opmerking: Het gen dat codeert Shadoo murine eiwit (Shadoo 25-122), werd gesubkloneerd in de expressievector pET-28 11. Deze kloon werd getransformeerd in E. coli SoluBL21 bacteriestam, om Shadoo eiwit met een N-terminale hexahistidine tag, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) uitdrukken zoals eerder 11 beschreven. Het plasmide kan worden opgevraagd bij de auteurs. Het molecuulgewicht van Shadoo berekend uit de aminozuursequentie 12,243.2 Da.
Opmerking: Voer alle manipulaties met bacteriën onder een laminal stroming kap of dicht bij Bunsen vlam.
- Transformeren bevoegde SoluBL21 bacteriën met de PET-28-His 6 -Shadoo plasmide, met behulp van een standaard heat shock protocol. Hiervoor mengsel 1 tot 5 ul van het plasmide (gewoonlijk 10 pg tot 100ng) in 50 pl van de bacteriën in een buis. Voer de hitteschok bij 42 ° C gedurende 45 sec.
- Culture getransformeerde bacteriën bij 37 ° C tot 600 A van 0,5-0,7 in Luria-Bertani medium aangevuld met 40 mg / ml kanamycine (Figuur 1B).
- Induceren Shadoo expressie O / N door het toevoegen van 240 ug / ml isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, ITPG, de cultuur. Kweken bacteriën onder schudden bij 150 rpm bij 37 ° C. Opmerking: Typisch, bacteriecultuur bereikt Een 600 van 3 O / N.
Opmerking: Getransformeerde bacteriën kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig eiwitproductie. Hiervoor voeg 10% -50% (v / v) steriele glycerol in bacteriële kweek monsters en bevriezen bij -80 ° C.
Figuur 1. Schema van Shadoo expressieconstruct, bacteriën transformatie en inductie van Shadoo expressie (zoals beschreven in stap 1). (A) Het expressieconstruct voor Shadoo codeert voor een hexahistidine tag gefuseerd aan de N-terminus van het eiwit, Nt. Het schema toont dat Shadoo eiwit bevat basic arginine / glycine herhalingen (groene cilinder), een hydrofoob domein (HD) en een N-glycosylatieplaats (CHO), gevolgd door een C-terminus (Ct). (B) pET-28-His 6 -Shadoo plasmide wordt getransformeerd in bacteriën SoluBL21 door heat shock gedurende 45 seconden bij 42 ° C. Getransformeerde bacteriën worden uitgeplaat op selectieve agar dat 40 ug / ml kanamycine. Een enkele kolonie van de plaat wordt gebruikt om een kweek te inoculeren in een 1.000-3.000 ml schudkolf. Expressie van het recombinante proteïne wordt geïnduceerd met 1 mM IPTG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Zuivering van Shadoo eiwit van Low Pressure Liquid Chromatography (LPLC)
- Cellysis en insluiting lichamen voorbereiding
- Verzamel de bacteriële suspensie en breng deze in centrifugeren buisjes (figuur 2).
- Spin bij 2500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant door decanteren en resuspendeer pellets in 15 ml buffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 met anti-protease cocktail) per pellet afkomstig van 500 ml celkweek.
Opmerking: Geresuspendeerde pellets kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -20 ° C gedurende enkele dagen. Freezing vergemakkelijkt bacteriële cellen lyse. - Controleer de overexpressie van recombinant eiwit gebruikt onzuivere bacteriën korrels door SDS-PAGE-analyse en Coomassie kleuring.
- Hiervoor centrifuge 1 ml bacteriekweek om cellen te pelleteren. Voeg 100 ul Laemmli denaturatie-oplossing (277,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% w / v glycerol, 0,02% broomfenolblauw) tot pellet en warmte bij 100 ° C gedurende 5 min.
- Belasting 10 pi van het monster aan een 12% acrylamide gel, run SDS-PAGE en visualize gescheiden eiwitten door Coomassie kleuring.
- Voeg Triton X-100 0,5% eindconcentratie aan de volledig geresuspendeerde pellet 2.1.2).
- Incubeer de suspensie in een waterbad op 37 ° C gedurende 30 min.
- Sonificeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 6-12 micron piek-tot-piek amplitude in ijskoud water om bacteriële cellen te lyseren.
- Transfer gesoniceerde suspensie in schone 50 ml centrifugeren buizen.
- Centrifugebuizen bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant door decanteren en voeg 5 ml bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M ureum, 5 mM imidazool) per buis.
- Plaats de buisjes op de draaiende wiel O / N om volledig mengen eiwitten uit insluitingslichamen.
Figuur 2. Schema van de zuivering van opnemingorganen (zoals beschreven in stap 2,1). Getransformeerde bacteriën tot expressie Shadoo geoogst door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer. De suspensie wordt geincubeerd bij 37 ° C gedurende 30 min, en vervolgens gesoniceerd het mechanisch verbreken van bacteriële cellen. Sonicatie uitgevoerd op ijs sample verhitting te voorkomen. Gebroken cellen worden geoogst door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in een buffer die 8 M ureum om eiwitten uit insluitingslichamen oplosbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. - Ni 2+ Affiniteit chromatografie
Opmerking: Chromatografie wordt uitgevoerd op FPLC-systeem onder toepassing van een Ni2 + -charged, 5 ml chelerende Sepharose-kolom (Figuur 3A). Alle oplossingen worden geladen op de kolom met een stroomsnelheid van 1 ml / min.- Injecteer 10 ml van 0,2 M NiSO 4 water oplossing in de kolom Sepharose om het op te ladenmet Ni 2+ -ionen.
- Equilibreren van de kolom geladen met Ni2 + -ionen door het injecteren van 30-50 ml van de bindende buffer die een lage concentratie imidazool (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M ureum, 5 mM imidazool).
- Laad het ureum oplosbaar eiwit met een 50 ml injectie lus.
- Herstel de doorstroomfractie door grondig wassen van de kolom met 10 ml lage imidazool bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M ureum, 5 mM imidazool) teneinde een maximum van ongebonden eiwitten te verwijderen uit de kolom.
- Was de kolom met 50-100 ml van de wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M ureum, 80 mM imidazool) eiwitten niet specifiek aan de kolom gebonden elueren.
- Breng een 15 min lineaire gradiënt van 80-800 mM imidazool in buffer bevattende 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M ureum. Verzamel 1 ml fracties tijdens het verloop applicatie. Opmerking: His-tag-eiwitten worden geëlueerd witha gradiënt van imidazool-bevattende buffer (gebruikt als concurrent).
- Neem een 8 pi monster van elke fractie en voeg 4 pi 4x Laemmli denaturatie-oplossing (zie 2.1.3.1). Hitte oplossingen bij 100 ° C gedurende 5 min.
- Belasting 10 pi proteïne groottemerker en 10 pl van elk monster tot 12% acrylamide gel, run SDS-PAGE en zichtbaar gescheiden eiwitten door Coomassie kleuring. Opmerking: Het molecuulgewicht van Shadoo omgerekend en zijn aminozuursequentie is 12,243.2 Da.
- Pool alle fracties die Shadoo.
Figuur 3. Zuivering procedure (zoals beschreven in stappen 2.2-2.4). (A) Ni2 + -ionen kunnen worden gecoördineerd door histidineresten die de selectieve zuivering van polyhistidine-gemerkte eiwitten mogelijk maakt. Imidazool wordt gebruikt om het eiwit te elueren, door middelhet vermogen om te coördineren met Ni2 + -ion en verdringt het gebonden proteïne. (B) eiwitten van verschillende hydrodynamische radius die op de Ni2 + -kolom worden gescheiden op een kolom met uitsluiting op grootte werden behouden. Eiwitten worden geëlueerd van de grootste tot de kleinste. (C) vóór gebruik fracties met Shadoo worden samengevoegd en ontzout ureum, imidazool en zouten te verwijderen. Kwaliteitscontrole testen omvatten SDS-PAGE / Coomassie kleuring, Western blotting. Gezuiverd Shadoo kan worden gevriesdroogd. Gevriesdroogde Shadoo is stabiel gedurende maanden indien bewaard bij -20 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. - Gelpermeatiechromatografie
Opmerking: Een tweede zuiveringsstap bestaat in de grootte-uitsluitingschromatografie die Shadoo eiwit scheidt van de andere eiwitten co-elueerden in de eerste zuiveringsstap(Figuur 3B).- Equilibreren kolom van Superdex 120 ml totaalvolume van het bed door het injecteren van 250 ml van 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M ureum met een stroomsnelheid van 1,5 ml / min.
- Load samengevoegde fracties die Shadoo van 2.2.9 op de kolom geëquilibreerd. Verzamel 1 ml fracties na de kolom lege volume van 40 ml bij de constante stroom van de bovengenoemde buffer.
- Neem een 10 ul monster van elke fractie en het uitvoeren van een SDS-PAGE-analyse en Coomassie kleuring, zoals hierboven beschreven, om te achterhalen welke fracties bevatten Shadoo.
- Pool fracties die Shadoo.
- Ontzouten
Opmerking: Het ontzouten procedure verwijdert zouten, imidazool en ureum Shadoo recombinant eiwit te verkrijgen in een buffer geschikt voor verdere biofysische en biochemische studies (figuur 3C). Hetzelfde resultaat kan worden verkregen door het dialyseren monsters tegen buffer.- Equilibreer een ontzoutingskolom van 53 ml met 150 mlvan 10 mM ammoniumacetaat, pH 5 bij stroomsnelheid van 5 ml / min.
- Load samengevoegde Shadoo fracties op de kolom. Na injectie van de ammoniumacetaatbuffer verzamelen handmatig fracties die een toename van het signaal bij 280 nm aan de uitgang van de UV detector tonen.
- Vriesdrogen de ontzoute Shadoo en op te slaan bij -20 ° C.
- Los gelyofiliseerd Shadoo adequaat buffer, zoals 10 mM natriumacetaat buffer, pH 5, vóór gebruik.
Opmerking: De polyhistidine tag kan worden verwijderd met enterokinase.
3. In Vitro Montage van Shadoo in amyloïdfibrillen bij fysiologische pH
Opmerking: De Shadoo eiwit aggregaten en spontaan vormt fibrillen bij een pH ≥ 7 11.
Figuur 4. Schema van Shadoo hervouwing om amyloïde fibrillen (zoals described in stap 3). Gezuiverd Shadoo spontaan omgezet in amyloïde fibrillen wanneer opgelost in buffer van pH ≥ 7. In een zure oplossing, Shadoo omgezet in amyloïde fibrillen na incubatie met 1 M Gdn-HCl onder schudden. Kwaliteitscontrole testen omvatten elektronische microscopie en ThT vlekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verdun Shadoo tot een eindconcentratie van 2 uM in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4. Meet de concentratie door meting van de extinctie van de oplossing bij 280 nm en met de extinctiecoëfficiënt afgeleid uit Shadoo aminozuursamenstelling van 20.970.
- Incubeer 500 ul van de oplossing in een conische kunststof buis bij 4 ° C gedurende enkele weken, spontane omzetting eiwit amyloïde structuren (figuur 4) mogelijk maken.
- Voeg vers bereide thioflavine T (ThT) tot een uiteindelijke concentration van 10 uM tot 100 pl aliquot van de Shadoo oplossing. Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Meet fluorescentie-emissie van 460 tot 520 nm onder toepassing van een excitatiegolflengte van 435 nm voor de aanwezigheid van amyloïde structuren 17 te verifiëren.
4. In Vitro Montage van Shadoo om amyloïdefibrillen bij zure pH
- Verdun Shadoo in 1 M GdnHCl, 20 mM Na-acetaatbuffer, pH 5 tot een eindconcentratie van 2 uM.
- Incubeer 500 ul van deze oplossing in een conische buis onder voortdurend schudden bij 37 ° C, gedurende 3-7 dagen.
- Controleer de aanwezigheid van amyloïde fibrillen door toevoeging ThT aan een deel van de oplossing in 3,3.
- Dialyseren verkregen suspensie tegen 10 mM Na-acetaatbuffer, pH 5,0, tot Shadoo amyloïde fibrillen te zuiveren.
- Bewaar gezuiverd fibrillen bij 4 ° C.
Figuur 5. Representatieve resultaten. Protein fracties geëlueerd uit Ni 2+ -charged chelerende kolom (A) en size exclusion kolom (B) werden geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Identificatie van gezuiverd Shadoo werd beoordeeld met behulp van anti-Shadoo SPRN antilichaam (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ongeveer 5-10 mg gezuiverd eiwit Shadoo verkregen per liter bacteriekweek. Een twee-staps zuivering nodig om recombinant Shadoo van hoge zuiverheid te verkrijgen. De eerste stap wordt uitgevoerd door affiniteitschromatografie met een Ni2 + -charged kolom His-tag-eiwitten behoudt. Geëlueerde fracties worden onderworpen aan SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue (Figuur 5A). Fracties bevattende Shadoo eiwit worden samengevoegd en verder gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie welke eiwitten gescheiden volgens hun grootte (Shadoo molecuulgewicht ongeveer 12 kDa). Fracties verzameld na elutie worden zichtbaar gemaakt door SDS-PAGE / Coomassie-analyse (Figuur 5B). Bovendien wordt Shadoo bewezen door Western-blot onder toepassing van een specifiek anti-Shadoo antilichaam SPRN dat bindt aan een epitoop tussen 76-105 aminozuren van het proteïne C-eindstandige gebied (figuur 5C).
Shadoo hervouwing eenmyloid fibrillen wordt geverifieerd door ThT kleuring (figuur 6A) en door negatieve kleuring elektronenmicroscopie (figuur 6B). ThT is een fluorescente kleurstof die cross-β-sheet quaternaire structuren kenmerkend voor amyloid assemblies bindt. Verhoging van de ThT intensiteit in figuur 6A blijkt dat Shadoo wordt omgezet amyloidal structuren.
Figuur 6. Representatieve resultaten. (A) Shadoo fibrillen van 2 uM monomeer equivalent daarvan werden vooraf geïncubeerd met ThT (10 uM eindconcentratie) gedurende 5 min bij RT. Fluorescente emissie intensiteiten worden geregistreerd voor elk monster met behulp van een excitatie golflengte bij 435 nm. Opmerking een aanzienlijke toename van ThT fluorescentie-intensiteit in een oplossing die Shadoo gepolymeriseerd om amyloïde fibrillen vergeleken met de controle solution monomeer Shadoo. (B) Transmissie elektronenmicroscopie van gefibrilleerde Shadoo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een eenvoudig en efficiënt protocol voor zowel expressie en zuivering van een grote hoeveelheid recombinant muizen Shadoo eiwit wordt gepresenteerd. De beschreven werkwijze maakt succesvolle solubilisatie en zuivering van (His6) gemerkte recombinant Shadoo eiwit. Het is belangrijk, zoals in de titel, dat bij expressie in een prokaryotische bacterie E. Shadoo coli accumuleert in inclusielichamen. Vóór Shadoo zuivering bacteriën worden gelyseerd door sonicatie in een buffer die Triton X-100. Vervolgens inclusielichaampjes kan worden opgelost in 8 M ureum denaturerende oplossing. Verder is de gehele zuivering procedure worden uitgevoerd in 8 M ureum bufferoplossing sinds Shadoo neiging te polymeriseren en aggregaat. Na solubilisatie en verduidelijking van inclusielichamen wordt het supernatant bevattende gedenatureerde eiwitten onderworpen aan tweestaps zuiveringsprocedure: affiniteitschromatografie en op grootte scheidende chromatografie. De affiniteit Chromatoggrafie stap bestaat uit het binden Shadoo via de (His 6) -tag een Ni 2+ -charged chelerende kolom. In 8 M ureumoplossing eiwitten worden gedenatureerd en de histidine residuen oppervlakgeëxponeerde. Bovendien ureum bevordert Shadoo structurele integriteit door te voorkomen proteolyse bij contaminerende proteases. In de tweede zuiveringsstap, Shadoo geëlueerd van de gradiënt van imidazool onderworpen aan grootte-uitsluitingschromatografie om verontreinigende eiwitten te scheiden. Tijdens de tweede stap worden grote eiwitten eerst geëlueerd, aangezien zij niet in staat zijn de poriën van de matrix voeren en aldus een direct pad door de kolom. Kleinere eiwitten, zoals Shadoo, langer duren om te elueren uit de kolom, omdat ze de poriën kunnen gaan en hebben een meer ingewikkelde pad. Tenslotte wordt het eiwitpreparaat ontzout ureum, imidazool en zouten te verwijderen. Kwaliteitscontrole geeft aan dat het volgen van deze procedure recombinant Shadoo is om hoge zuiverheid gezuiverd. Het kan worden gebruikt in verschillende biologische en biotechnologische studies.
De E. coli-expressiesysteem is een zeer nuttig hulpmiddel voor expressie van recombinante eiwitten. De lage kosten, gemakkelijke manipulatie, snelheid en het gemak van het uitdrukken van zoogdieren eiwitten in E. coli maken van deze host de eerste keuze tool voor life science toepassingen. Niet alle eiwitten van zoogdieren kunnen worden uitgedrukt in oplosbare vorm of / en in een voldoende hoeveelheid in deze bacterie. Soms kan obstakels worden overwonnen door verschillende strategieën zoals het verlagen van expressie temperatuur, het veranderen van de initiatiefnemers, het toevoegen van zuivering labels, het gebruik van alternatieve media 18-20. Echter, in sommige gevallen, het vinden van een optimale conditie expressie kan hoge kosten tijd en inspanningen. Moeilijkheden om recombinant Shadoo produceren werden overwonnen met de SoluBL21 competente E. coli stam. Deze mutant gastheerstam aanzienlijk verbeterde de opbrengst van Shadoo productie en liet ons toe om volledig oplosbaar te verkrijgenShadoo. Opbrengsten verkregen waren in het bereik van 5-10 mg / l cultuur.
Recombinant Shadoo werd aangetoond dat het een native ongestructureerde eiwit geven van een random-coil functie door circulair dichroïsme spectroscopie 11,12 zijn. Omdat een sterk positief geladen proteïne (pI ~ 10,44) Shadoo klontert bij de fysiologische pH. Echter, Shadoo volledig oplosbaar is in bufferoplossingen zure pH. Presenteerden we hier eenvoudig en efficiënt protocollen Shadoo om amyloïde fibrillen polymeriseren bij verschillende pH's. Gepolymeriseerde Shadoo vormt een waardevol instrument om pathologische eiwit vouwen dat sommige neurodegeneratieve ziekten karakteriseren bestuderen. Het recombinante Shadoo gezuiverd met behulp van onze procedure kan worden gebruikt voor verdere biochemische en structurele karakterisering van de conformationele overgangsproces.
Op basis van de primaire structuur werd Shadoo voorspeld een N-gekoppelde glycosylatieplaats en signaalpeptiden hebben voor bevestiging van de glycosylphosphatidylinositol (GPI) anker naast de C-terminus (figuur 1A). Recombinant Shadoo gezuiverd uit inclusielichamen wordt beroofd van koolhydraten sinds E.coli expressie systeem is niet in staat om post-translationele modificaties uit te voeren. Bijgevolg kan interacties van recombinant Shadoo eiwitten, lipiden en nucleïnezuren gemodificeerd worden vergeleken met het natieve eiwit. Zo werd het belang van Shadoo glycosylering onlangs voorgesteld voor Shadoo proteasome degradatie na eiwitmodificatie door ubiquitinering 21. De rol van GPI anker in prion ziekte is niet bekend, maar veel studies suggereren dat GPI anker een rol kan spelen bij de pathogenese van prionziekten 22,23. Aldus bacteriële expressie Shadoo kan worden gebruikt voor in vitro studies gebaseerd op deze beperkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
References
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
- Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
- Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
- Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
- Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
- Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
- Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
- Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
- Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
- Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
- Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
- Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
- Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
- Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
- Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
- Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
- Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
- Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
- Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).
