Summary

Air-samplet Filter Analyse for Endotoxiner og DNA indhold

Published: March 07, 2016
doi:

Summary

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Abstract

Udendørs aerosol forskning almindeligvis bruger partikler samples på filtre. Denne procedure muliggør forskellige karakteriseringer af de opsamlede partikler, der skal udføres parallelt. Formålet med metoden præsenteres her er at opnå en meget nøjagtig og pålidelig analyse af endotoksin og DNA-indhold af bio-aerosoler ekstraheret fra filtrene. Udvindingen af ​​højmolekylære organiske molekyler, såsom lipopolysaccharider, fra filtre i stikprøven involverer omrystning i en pyrogenfri vandbaseret medium. Den efterfølgende analyse er baseret på en enzymatisk reaktion, der kan påvises ved anvendelse af et turbidimetrisk måling. Som følge af den høje organiske indhold på filtrene i stikprøven, er udvinding af DNA fra prøverne udføres under anvendelse af et kommercielt DNA-ekstraktion kit, der oprindeligt er designet til jord og modificeret til at forbedre DNA udbytte. Påvisning og kvantificering af specifikke mikrobielle arter anvender kvantitativ polymerase chain reactipå (q-PCR) analyse er beskrevet og sammenlignet med andre tilgængelige metoder.

Introduction

Air prøvetagning på filtre er et grundlæggende redskab i atmosfæriske aerosoler forskning. 1 Filtrene stikprøven er udgangspunktet for forskellige kemiske, fysiske og biologiske karakterisering af de indsamlede omgivende partikler. 2-11 Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at forskellige analyser kan være udføres off-line på samme prøve. Indsamling af data fra alle de forskellige analyser muliggør forskeren at få en god forståelse af de særlige kendetegn ved de opsamlede partikler og hjælpemidler til at løse komplekse spørgsmål i de atmosfæriske videnskaber. 12,13 For eksempel, marine og indre luft-prøver taget under samme periode kan sammenlignes med hensyn til den samplede partikel toksicitet og biologisk præparat. 14. til denne undersøgelse lipopolysaccharider (LPS), komponenter på gram-negative bakterielle celle-vægge, også kendt som endotoxiner, blev ekstraheret fra filtre samples på land og på en indre sted, og blev evalueret ved hjælp aflimulus amebocytlysat (LAL) -testen. Parallelt hermed et genomisk evaluering af bakterieindholdet (total bakterier, gramnegativ, og cyanobakterier) blev udført på den samme prøve ved anvendelse af kvantitativ polymerase-kædereaktion (q-PCR). LAL test er baseret på målinger af turbiditet dannes efter tilsætning af en vandig ekstrakt af amebocytes fra dolkhalen, Limulus Polyphemus, til en vandig opløsning indeholdende endotoksiner. Højere koncentrationen af endotoksin i prøven, desto hurtigere udvikles uklarhed. 15 Q-PCR-analyse er baseret på et fluorescenssignal udsendt som et specifikt DNA-fragment amplificeres. 16 Ved tidstro overvågning af signalet under den eksponentielle fase af PCR reaktion og kalibrering med en standard kurve, kan den indledende DNA beløb kvantificeres. Kombinationen af disse to analyser sammen med andre, som beskrevet andetsteds, kan 14 give en god vurdering af indholdet af endotoksin ogmængde af kilde- bakterierne i prøverne.

Formålet med metoden præsenteres her er at opnå en meget nøjagtig og pålidelig analyse af endotoksin og DNA-indhold af bio-aerosoler ekstraheret fra filtrene. Mens prøveudtagnings- de fysiske og uorganiske kemiske karakteristika af aerosoler er velkendte og på det seneste er der udviklet metoder til at undersøge dens organisk materiale komponent, 17 har der været få relevante undersøgelser på den biologiske komponent i aerosoler. 18. Begrundelsen for den aktuelle metode er at løse dette hul ved at præsentere i detaljer en robust metode til at udvinde, analysere og identificere den biologiske fraktion af luftbårne aerosoler. 14

Forventes metode beskrevet her for at finde udbredte brug i biologiske indendørs og udendørs aerosol forskningsprojekter, der involverer filter analyse. 20-24

Protocol

Bemærk: En detaljeret liste over alle de materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol er vist i afsnittet Materialer. 1. Air Sampling på filtre Fremstilling af filtre For prøveudtagning høj lydstyrke, bruge 20,3 x 25,4 cm 2 filtre. Vælg den specifikke type filter, der bedst passer til forskningsbehov, samt filter cut-off størrelse, hvis det er relevant. 1 Her bruge kvarts microfiber filtre. Pre-bage filtre beregnet til or…

Representative Results

Det er almindeligt at studere atmosfæriske aerosoler ved hjælp af "off-line" analyser af filtre i stikprøven (se figur 2). 32 Kemiske analyser af sagen omfatte økologisk (f.eks protein, carbonhydridmolekyler, saccharider) og uorganisk (fx metaller, salte) indhold stikprøven . Biologiske analyser omfatte levedygtige og ikke-levedygtige indhold mikroorganisme, artsidentifikation anvendelse af en DNA tilgang eller mikroskopi, samt…

Discussion

Dette arbejde beskriver udvinding og påvisningsmetoder til kvantificering både endotoksiner og DNA til stede i aerosol prøver indsamlet på filtre. Metoderne kræver nøjagtige rutiner og kan udføres nemt, så længe experimentalist klæber til et par væsentlige og vigtige punkter diskuteret her.

For endotoksin påvisningstrinnet bemærke, at lysatet løsning er ganske viskos og har tendens til at frembringe bobler ved pipettering. Det er vanskeligt at fjerne dig bobler, og de fører ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.

Materials

Filter sampling
HiVol 3000 – High Air Volume Sampler Ecotech
Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203mm X 254mm
ELF – Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
Aluminum foil Opal
Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin
Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
Microtubes Axigen MCT-200-C 2ml, pyrogen free
1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series – Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
Name Company Catalog Number Comments
DNA
DNA away Sigma Aldrich 7010
Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 mL 
PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
Glass beads, acid-washed 425-600 Microns Sigma Aldrich G8772-100G
Glass beads, acid-washed <106 microns Sigma Aldrich G4649-100G
PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystems 4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

References

  1. Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
  9. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
  10. Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
  26. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  27. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  28. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
  29. Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
  30. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  31. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  32. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  33. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  34. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  35. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  36. Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
  37. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  38. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Play Video

Cite This Article
Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

View Video