Air-samplet Filter Analyse for Endotoxiner og DNA indhold
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
Udendørs aerosol forskning almindeligvis bruger partikler samples på filtre. Denne procedure muliggør forskellige karakteriseringer af de opsamlede partikler, der skal udføres parallelt. Formålet med metoden præsenteres her er at opnå en meget nøjagtig og pålidelig analyse af endotoksin og DNA-indhold af bio-aerosoler ekstraheret fra filtrene. Udvindingen af højmolekylære organiske molekyler, såsom lipopolysaccharider, fra filtre i stikprøven involverer omrystning i en pyrogenfri vandbaseret medium. Den efterfølgende analyse er baseret på en enzymatisk reaktion, der kan påvises ved anvendelse af et turbidimetrisk måling. Som følge af den høje organiske indhold på filtrene i stikprøven, er udvinding af DNA fra prøverne udføres under anvendelse af et kommercielt DNA-ekstraktion kit, der oprindeligt er designet til jord og modificeret til at forbedre DNA udbytte. Påvisning og kvantificering af specifikke mikrobielle arter anvender kvantitativ polymerase chain reactipå (q-PCR) analyse er beskrevet og sammenlignet med andre tilgængelige metoder.
Introduction
Air prøvetagning på filtre er et grundlæggende redskab i atmosfæriske aerosoler forskning. 1 Filtrene stikprøven er udgangspunktet for forskellige kemiske, fysiske og biologiske karakterisering af de indsamlede omgivende partikler. 2-11 Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at forskellige analyser kan være udføres off-line på samme prøve. Indsamling af data fra alle de forskellige analyser muliggør forskeren at få en god forståelse af de særlige kendetegn ved de opsamlede partikler og hjælpemidler til at løse komplekse spørgsmål i de atmosfæriske videnskaber. 12,13 For eksempel, marine og indre luft-prøver taget under samme periode kan sammenlignes med hensyn til den samplede partikel toksicitet og biologisk præparat. 14. til denne undersøgelse lipopolysaccharider (LPS), komponenter på gram-negative bakterielle celle-vægge, også kendt som endotoxiner, blev ekstraheret fra filtre samples på land og på en indre sted, og blev evalueret ved hjælp aflimulus amebocytlysat (LAL) -testen. Parallelt hermed et genomisk evaluering af bakterieindholdet (total bakterier, gramnegativ, og cyanobakterier) blev udført på den samme prøve ved anvendelse af kvantitativ polymerase-kædereaktion (q-PCR). LAL test er baseret på målinger af turbiditet dannes efter tilsætning af en vandig ekstrakt af amebocytes fra dolkhalen, Limulus Polyphemus, til en vandig opløsning indeholdende endotoksiner. Højere koncentrationen af endotoksin i prøven, desto hurtigere udvikles uklarhed. 15 Q-PCR-analyse er baseret på et fluorescenssignal udsendt som et specifikt DNA-fragment amplificeres. 16 Ved tidstro overvågning af signalet under den eksponentielle fase af PCR reaktion og kalibrering med en standard kurve, kan den indledende DNA beløb kvantificeres. Kombinationen af disse to analyser sammen med andre, som beskrevet andetsteds, kan 14 give en god vurdering af indholdet af endotoksin ogmængde af kilde- bakterierne i prøverne.
Formålet med metoden præsenteres her er at opnå en meget nøjagtig og pålidelig analyse af endotoksin og DNA-indhold af bio-aerosoler ekstraheret fra filtrene. Mens prøveudtagnings- de fysiske og uorganiske kemiske karakteristika af aerosoler er velkendte og på det seneste er der udviklet metoder til at undersøge dens organisk materiale komponent, 17 har der været få relevante undersøgelser på den biologiske komponent i aerosoler. 18. Begrundelsen for den aktuelle metode er at løse dette hul ved at præsentere i detaljer en robust metode til at udvinde, analysere og identificere den biologiske fraktion af luftbårne aerosoler. 14
Forventes metode beskrevet her for at finde udbredte brug i biologiske indendørs og udendørs aerosol forskningsprojekter, der involverer filter analyse. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde beskriver udvinding og påvisningsmetoder til kvantificering både endotoksiner og DNA til stede i aerosol prøver indsamlet på filtre. Metoderne kræver nøjagtige rutiner og kan udføres nemt, så længe experimentalist klæber til et par væsentlige og vigtige punkter diskuteret her.
For endotoksin påvisningstrinnet bemærke, at lysatet løsning er ganske viskos og har tendens til at frembringe bobler ved pipettering. Det er vanskeligt at fjerne dig bobler, og de fører ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
- Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
