Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Air-samplet Filter Analyse for Endotoxiner og DNA indhold

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

Udendørs aerosol forskning almindeligvis bruger partikler samples på filtre. Denne procedure muliggør forskellige karakteriseringer af de opsamlede partikler, der skal udføres parallelt. Formålet med metoden præsenteres her er at opnå en meget nøjagtig og pålidelig analyse af endotoksin og DNA-indhold af bio-aerosoler ekstraheret fra filtrene. Udvindingen af ​​højmolekylære organiske molekyler, såsom lipopolysaccharider, fra filtre i stikprøven involverer omrystning i en pyrogenfri vandbaseret medium. Den efterfølgende analyse er baseret på en enzymatisk reaktion, der kan påvises ved anvendelse af et turbidimetrisk måling. Som følge af den høje organiske indhold på filtrene i stikprøven, er udvinding af DNA fra prøverne udføres under anvendelse af et kommercielt DNA-ekstraktion kit, der oprindeligt er designet til jord og modificeret til at forbedre DNA udbytte. Påvisning og kvantificering af specifikke mikrobielle arter anvender kvantitativ polymerase chain reactipå (q-PCR) analyse er beskrevet og sammenlignet med andre tilgængelige metoder.

Introduction

Air prøvetagning på filtre er et grundlæggende redskab i atmosfæriske aerosoler forskning. 1 Filtrene stikprøven er udgangspunktet for forskellige kemiske, fysiske og biologiske karakterisering af de indsamlede omgivende partikler. 2-11 Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at forskellige analyser kan være udføres off-line på samme prøve. Indsamling af data fra alle de forskellige analyser muliggør forskeren at få en god forståelse af de særlige kendetegn ved de opsamlede partikler og hjælpemidler til at løse komplekse spørgsmål i de atmosfæriske videnskaber. 12,13 For eksempel, marine og indre luft-prøver taget under samme periode kan sammenlignes med hensyn til den samplede partikel toksicitet og biologisk præparat. 14. til denne undersøgelse lipopolysaccharider (LPS), komponenter på gram-negative bakterielle celle-vægge, også kendt som endotoxiner, blev ekstraheret fra filtre samples på land og på en indre sted, og blev evalueret ved hjælp aflimulus amebocytlysat (LAL) -testen. Parallelt hermed et genomisk evaluering af bakterieindholdet (total bakterier, gramnegativ, og cyanobakterier) blev udført på den samme prøve ved anvendelse af kvantitativ polymerase-kædereaktion (q-PCR). LAL test er baseret på målinger af turbiditet dannes efter tilsætning af en vandig ekstrakt af amebocytes fra dolkhalen, Limulus Polyphemus, til en vandig opløsning indeholdende endotoksiner. Højere koncentrationen af endotoksin i prøven, desto hurtigere udvikles uklarhed. 15 Q-PCR-analyse er baseret på et fluorescenssignal udsendt som et specifikt DNA-fragment amplificeres. 16 Ved tidstro overvågning af signalet under den eksponentielle fase af PCR reaktion og kalibrering med en standard kurve, kan den indledende DNA beløb kvantificeres. Kombinationen af disse to analyser sammen med andre, som beskrevet andetsteds, kan 14 give en god vurdering af indholdet af endotoksin ogmængde af kilde- bakterierne i prøverne.

Formålet med metoden præsenteres her er at opnå en meget nøjagtig og pålidelig analyse af endotoksin og DNA-indhold af bio-aerosoler ekstraheret fra filtrene. Mens prøveudtagnings- de fysiske og uorganiske kemiske karakteristika af aerosoler er velkendte og på det seneste er der udviklet metoder til at undersøge dens organisk materiale komponent, 17 har der været få relevante undersøgelser på den biologiske komponent i aerosoler. 18. Begrundelsen for den aktuelle metode er at løse dette hul ved at præsentere i detaljer en robust metode til at udvinde, analysere og identificere den biologiske fraktion af luftbårne aerosoler. 14

Forventes metode beskrevet her for at finde udbredte brug i biologiske indendørs og udendørs aerosol forskningsprojekter, der involverer filter analyse. 20-24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: En detaljeret liste over alle de materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol er vist i afsnittet Materialer.

1. Air Sampling på filtre

  1. Fremstilling af filtre
    1. For prøveudtagning høj lydstyrke, bruge 20,3 x 25,4 cm 2 filtre. Vælg den specifikke type filter, der bedst passer til forskningsbehov, samt filter cut-off størrelse, hvis det er relevant. 1 Her bruge kvarts microfiber filtre.
    2. Pre-bage filtre beregnet til organisk og biologisk sammensatte prøver at ødelægge organiske rester. Til at pre-bage filtrene, pak dem enkeltvis i alufolie og derefter bage dem i et laboratorium ovn ved 450 ° C i mindst 5 timer.
    3. Opbevar de bagte filtre ved -20 ° C indtil prøveudtagning.
  2. Instrument Håndtering og Air Sampling
    1. Ren resterende støv fra lederen af ​​den store mængde sampler. Tør delene med rene papirservietter og tillade dem at lufttørre before gentilslutning dem til sampler.
    2. Desinficer filterkassetten med ethanol, og arbejde med handsker og en kittel på alle tidspunkter.
    3. Placer en pre-bagt filter inde i ren filter kassette, og gå frem efter sampler manual høj lydstyrke.
    4. Marker dato og eventuelle usædvanlige vejrforhold, hvis det er relevant (f.eks regn, støv storm) på aluminium wrap, og gemme det i et rent sted indtil afslutningen af prøveudtagningen.
    5. Saml det samplede filter og fold det på midten, med den samplede side vendt indad.
    6. Pak filteret i den oprindelige aluminiumfolie og opbevares ved -20 ° C indtil analyse.
      Bemærk: Hvis tidsintervallet mellem prøveudtagning og analyse er længere end 2 måneder, opbevare prøven ved -80 ° C for at undgå nedbrydning af det organiske og biologisk materiale.

2. Endotoxin Analyse

Bemærk: Desinficer bordpladen med 70% ethanol end arbejde med pyrogenfrie rør, tips og reagenser kun. Hvis der anvendes glasvarer, er for-opvarmning ved 250 ° C i 30 minutter, eller 200 ° C i 60 minutter kræves. 25 Forbered alle reagenser i et klasse II biosikkerhed kabinet og arbejde med handsker og kittel på alle tidspunkter.

  1. Klargøring af reagens
    1. Følg LAL kit producentens protokol at rehydrere lysatet kort før anvendelsen. 26 Tryk forsigtigt på hætteglasset for at løsne LAL resterende på flaskernes vægge. Proppen løftes forsigtigt at bryde vakuumet. Ved hjælp af en nål sprøjte, tilsættes 5 ml pyrogenfrit vand (PFW) til hætteglasset at rehydrere alle lysatet indhold og bland forsigtigt for at undgå skumdannelse.
    2. Forsegl hætteglasset med plastik paraffin film, når den ikke er i brug og opbevares ved 4 ° C i op til to dage. Opbevar resterende lysat ved -20 ° C i op til tre måneder.
      Bemærk: Dette reagens kan fryses én gang.
    3. Rehydrere kontrolstandard endotoksin (CSE), der indeholder 0,5 μg E. coli, i overensstemmelse med producentens protokol. 27 Bestem bestemt mængde vand, der skal tilføjes til CSE hætteglasset fra producentens websted 28 ved at indtaste lotnummer for sættet når det er anført på hjemmesiden. Slutkoncentrationen af E. coli i hætteglasset, måles i endotoksinenheder (EU; hvor 10 EU = 1 ng). Mærk denne hætteglas Ed0.
    4. Forsegl CSE hætteglas med plast paraffin film, når den ikke er i brug og opbevares ved 4 ° C i op til 4 uger.
  2. Standard Curve og Spiked-filter Forberedelse
    1. I en klasse II biosikkerhed kabinet, forberede 22 pyrogenfrie 2 ml centrifugerør indeholdende faldende mængder af CSE (rør ED1-Ed11) eller ingen CSE (den tomme rør indeholdende kun PFW) for at fremstille en duplikeret endotoksin fortyndingsserie, som vist i tabel 1.
    2. I et biologisk kabinet med cirkulært flow, sender 22 cirkulære stykker af rent, pre-bagt filteret med en desinficeret 1.1 2 cm kork diameter borer.
    3. Placer filter par i sterile petriskåle.
    4. Spike 50 ul fra hvert medlem af endotoksin fortyndingsrække Ed2-Ed11 og fra den tomme rør på en tilsvarende par filtre.
    5. Lad petriskåle indeholdende spidse filtre åbne under hætten for at tørre i 30 min.
    6. Sted hvert filter stykke i en pyrogenfri 2 ml rør.
">
Rør Endelig endotoksinkoncentration (EU ml-1) Standard endotoxin volumen (ml) Pyrogenfrit vand volumen (ml) totalvolumen (ml)
Ed0 2.500 stamopløsning * 5
ED1 1.000 80 (fra Ed0) 120 200
Ed2 100 20 (fra ED1) 180 200
ED3 50 10 (fra ED1) 190 200
Ed4 25 5 (fra ED1) 195 200
ED5 12.5 2.5 (fra ED1) 197,5 200
Ed6 6,25 1,25 (fra ED1) 198,75 200
Ed7 3.125 6,25 (fra Ed2) 193,75 200
Ed8 1,563 6,25 (fra ED3) 193,75 200
Ed9 0,781 6,25 (fra Ed4) 193,75 200
ED10 0,391 6,25 (fra ED5) 193,75 200
Ed11 0,195 6,25 (fra Ed6) 193,75 200
Blank 0 0 200 200

Tabel 1:. Endotoksin Standard Curve Endotoxin koncentration, volumen standard endotoxin og pyrogenfrit vand, der skal tilsættes, og det samlede volumen opnået er specificeret for hver fortynding rør i kalibreringskurven.

  1. Endotoxin Ekstraktion fra forsøg og pigge filtre
    1. I et biologisk kabinet med cirkulære flow, klippe prøvetagningsfiltre (fra trin 1.2) i cirkulære stykker ved hjælp af en desinficeret 1,12 cm kork diameter borer, og placere dem sammen med de spidse standard filtre (fra trin 2.2) i pyrogenfri 2 ml rør (dvs. prøven rør).
    2. Tilsæt 1 ml PFW til rørene og ryste dem i 60 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af en laboratorie-rysteapparat.
    3. Centrifugeres prøveglassene i en mikrocentrifuge ved 375 xg i 10 min. 29
    4. Overfør the supernatant, som indeholder de endotoksiner, ind i en ny pyrogenfri 2 ml rør.
  2. Limulus amebocytlysat (LAL) Test
    1. Bestem koncentrationen af ​​endotoksin i prøverne ved at udføre LAL test i en pyrogenfri 96-brønds mikroplade med en flad bund og et låg.
    2. Planlæg pladen array i forvejen, som vist i figur 1. Medtag en standardkurve fremstillet direkte fra endotoksin standardløsninger Ed2-Ed11 (og dermed dækker koncentrationsområdet 100-0.195 EU / ml (se afsnit 2.2)) i hver kører plade . Standardkurven skal fylde brøndene 1-10 af rækker A og B af pladen. Braklægning brønde 11-12 i disse rækker for blindprøver (dvs. i alt fire blanke).
    3. Tænd mikropladelæser og programmere den til en kinetisk reaktion, der involverer inkubation af mikropladen ved 37 ° C og omrystning hver 5 min, efterfulgt af absorptionsmålinger ved 405 nm. Gentag 18 gange i 1,5 timer.
    4. Bestem effekticy, hvormed endotoksiner er udvundet fra prøvetagningsfiltre (dvs.., de er fremstillet af de spikede standard filtre prøver) via deling af den beregnede endotoksin beløb fra det oprindelige beløb tilsat.
    5. Start analysen ved at placere 50 pi standard endotoksin løsninger (fra trin 2.4.2), eller den spidse filter ekstrakt og dens blanke (fra afsnit 2.3), eller af de eksperimentelle prøver og dets emner (også fra afsnit 2.3), som pr den planlagte plade-array (figur 1), og luk dækslet.
    6. Til hver brønd, hurtigt tilføje 50 ul LAL løsning, og forsigtigt ryste pladen vandret, mens den er placeret på bordet, før den løftes i læseren.
    7. Pladen anbringes i pladelæseren og starte den eksperimentelle løb.

Figur 1
Figur 1:. Endotoxin matrix plade En exrigelig af et endotoksin analyse array i en 96-brønds mikroplade.

3. Genomisk Analyse

Bemærk: DNA-ekstraktion, desinficere bordpladen med 70% ethanol og arbejde med sterile rør, tips og reagenser kun. For q-PCR-analyse af DNA, desinficere bordpladen med overfladen DNA-decontaminant. Forbered alle reagenser i en klasse II biosikkerhed kabinet og arbejde med handsker og en kittel på alle tidspunkter.

  1. Fremstilling af DNA-primere og prober
    1. Forud for DNA-ekstraktion, enten bestille et kommercielt tilgængeligt sæt primere og en probe (hvis der anvendes den hydrolyseprobe metode) eller designe et nyt sæt primere og en probe under anvendelse af primer designe beregningsværktøjer. 30
    2. Rehydrere primerne ifølge fabrikantens protokol under anvendelse af enten 10 mM Tris-0,1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (TE-buffer) eller PCR-grade vand.
      Bemærk: Det anbefales at opløse den indledende PCR-primer stock i TE-buffer med lavt EDTA (0,1%), da det forhindrer primer nedbrydning, når det opbevares i længere tidsrum. Anvende PCR-grade vand for efterfølgende fortyndinger at reducere EDTA beløb der vil kunne bremse PCR-reaktioner.
    3. Der forberedes delprøver på 50 pi eller 100 pi af primer og probe i sterile 0,5 ml rør og opbevares ved -20 ° C indtil analyse.
  2. Standard Cell Koncentration Evaluering Før DNA Extraction
    1. I en passende størrelse centrifugerør, udarbejde en standard celle løsning af de mikrobielle arter af interesse (rør Od0, tabel 2A). Bland cellesuspensionen ved pipettering op og ned i røret 7-10 gange ved anvendelse af en pipette med en lille boring.
    2. Hvis cellerne er farvet (f.eks visse svampesporer), ikke udfører en farvning procedure. Hvis cellefarvning er påkrævet, fortyndes cellesuspensionen i et egnet farvestof til mikroskopisk detektion af cellerne af interesse. 31
    3. Rengør dækglasset og hemocytometer med ethanol. Fugt og anbringe dækglasset til hæmocytometeret.
    4. Indlæse omkring 8 pi af cellesuspensionen i begge hæmocytometer kamre ved omhyggeligt at berøre kanten af ​​dækglasset med spidsen af ​​pipetten og fylde kammeret ved kapillarvirkning. Må ikke over / under fylde kammeret.
    5. Bestem antallet af celler ved at se dem under et mikroskop ved 400X forstørrelse (40X i objektiv og 10X i okulær). Ni firkanter måler 1 x 1 mm 2 og arrangeret i en 3 x 3 gitter skal ses. Fokusere mikroskopet på et af de fire hjørner kvadrater af gitteret (en højere forstørrelse kan bruges). 1 x 1 mm2 ligge bør indeholde 16 mindre kvadrater.
    6. Tæl alle cellerne i de fire 1 x 1 mm 2 hjørne kvadrater samt i midten kvadrat af 3 x 3 gitter. Hvis der er for mange eller for få celler til at tælle, gentage proceduren, enten koncentrere eller fortynde den oprindelige celle suspension er relevant (15-50 celler bør overlay en pille 1 mm 2-område).
    7. Beregne koncentrationen af cellerne (celler ml-1) i standard cellesuspension Od0 fra celletal som et gennemsnit af de fem optalte firkanter som følger: Cell count ml-1 = Gennemsnit celletal ligge -1 fortyndingsfaktor 10 4.
  3. Evaluering af DNA ekstraktionseffektivitet
    1. Forbered ni sterile 0,5 ml rør ifølge tabel 2A.
    2. Fortynd standard celle opløsning (Od0) til at indeholde omkring 10 7 celler ml -1 i et samlet volumen på 20 pi (OD1).
    3. Tilføj 18 pi sterilt nuklease-fri PCR-grade vand (NFW) til rørene OD2-Od8 og 20 pi til det tomme rør, Od9.
    4. Overfør 2 pi af cellen løsning fra OD1 ind OD2. Pipette forsigtigt for at blande og overføre 2 pi fra røret OD2 til Od3. Fortsæt fortynding af cellerne på samme måde langs rørene til og med rør Od8 til obtain en seriel fortynding af 10 7 -10 0 celler ml-1.
    5. I et biologisk kabinet med cirkulært flow, sender 18 cirkulære stykker af rent, pre-bagt filter, anvendelse af et desinficeret 1,12 cm kork diameter borer. Placer filtrene parvis i sterile petriskåle.
    6. Spike 10 pi fra fortyndinger OD1 til Od8 og fra den tomme rør Od9 på hver af de parrede filtre, således at der er et filter par svarer til hver standard cellekoncentration.
    7. Lad petriskåle åbne under kølerhjelmen og lad dem tørre i 30 min.
    8. Sted hvert filter stykke i en steril skruelåg 2 ml rør og ekstrahere DNA ifølge proceduren beskrevet i afsnit 3.4.
  4. DNA ekstraktion fra forsøg og pigge filtre
    Bemærk: Til DNA ekstraktion fra filtre, bruge kommercielle kit er beregnet til DNA-ekstraktion fra jord ifølge producentens protokol med de følgende modifikationer.
    1. For hver filter prøve (OD1-Od8), udarbejde en blanding af syre-vaskede glasperler i et 0,5 ml sterilt rør. Bruge 0,1 g perler med en diameter på 425-600 um og 0,3 g perler med en diameter på ≤106 um.
    2. I et biologisk kabinet med cirkulære flow, skære tre runde stykker fra tilfældigt udvalgte steder på hvert filter prøve ved hjælp af en desinficeret 1,12 cm kork diameter borer, og placere dem i skrue-top 2 ml rør.
    3. Tilsæt glaskugle blandingen til rørene.
    4. Tilsæt celle-lysis buffer leveret med ekstraktion kit til hvert rør i den biologiske kabinet, med beløbet i producentens protokol.
    5. Forbered en spand is og forstyrre cellerne mekanisk ved hjælp af en perle beater.
    6. Pisk perlerne i 1 minut og derefter placere dem på is i 1 min. Gentag fem gange.
    7. Fortsæt med sættet leverandørens protokol fra post-lysis trin.
    8. Efter eluering med den medfølgende elueringsbuffer (indeholder 10 mM Tris Buffer) eller NFW, genindlæse eluerede prøve gennem kolonnen igen for at forbedre DNA udbytte.
      Bemærk: Hvis ikke analyseres samme dag som DNA-ekstraktion, kan prøverne opbevares ved -20 ° C indtil analyse.
1 "style =" height: 21px; "> Dd0
A- Udarbejdelse af Standard Cell Fortynding Series
Rør Endelig cellekoncentration (celle ml-1) Standard cellevolumen (ml) Nuklease frit vand volumen (ml) Samlet volumen (ml)
Od0 afgøre med Hemocytometer tællekammer
OD1 bør elueres til intervallet 10 7 celler ml-1 20
OD2 10 -1 OD1 2 af OD1 18 20
Od3 10 -2 OD1 2 af OD2 18 20
Od4 10 -3 OD1 2 af Od3 18 20
OD5 10 -4 OD1 2 af Od4 18 20
Od6 10 -5 OD1 2 af OD5 18 20
Od7 10 -6 OD1 2 af Od6 18 20
Od8 10 -7 OD1 2 af Od7 18 20
Blank 0 0 20 20
B- Fremstilling af DNA Standard Curve
Rør Endelig DNA-koncentration (mg ml-1) Standard DNA volumen (ml) Nuklease frit vand volumen (ml) Samlet volumen (ml)
afgøre med NanoDrop
DD1 bør elueres til den række af 10 1 mg ml-1 20
DD2 10 -1 DD1 2 af DD1 18 20
DD3 10 -2 DD1 2 af DD2 18 20
DD4 10 -3 DD1 2 af DD3 18 20
DD5 10 -4 DD1 2 af DD4 18 20
DD6 10 -5 DD1 2 af DD5 18 20
DD7 10 -6 DD1 2 af DD6 18 20
Dd8 10 -7 DD1 2 af DD7 18 20
Blank 0 0 20 20

Tabel 2:. DNA Standard Curve Standard mikroorganisme celle fortyndingsrække (A) detaljeret for standard cellevolumen, NFW volumen, og det samlede volumen i hver fortynding rør. DNA standard forberedelse kurve (B), detaljeret for standard DNA volumen, NFW volumen, og det samlede volumen i hver fortynding rør.

  1. DNA Standard Curve Preparation Uddrag DNA direkte fra en standard prøve af mikroorganismen af ​​interesse (Dd0) under anvendelse af samme procedure som beskrevet for de eksperimentelle filtre i trin 3.4.
  2. Brug et spektrofotometer til bestemmelse af DNA-koncentrationen af ​​standard DNA-prøve (Dd0) ved 260 nm.
  3. Forbered ni sterile 0,5 ml rør, hvorfra man kan forberede en DNA standardkurve, som vist i tabel 2B.
  4. Om nødvendigt fortyndes standard DNA-opløsning Dd0 til inden for et koncentrationsområde på 1-10 ug ml -1 i det første rør (DD1) i et totalt volumen på 20 pi.
  5. Tilføj 18 pi NFW til rørene DD2-Dd8 og 20 pi til den tomme rør.
  6. Overfør 2 ul af standard DNA-opløsning fra DD1 i DD2. Pipette forsigtigt for at blande og derefter overføre 2 pi fra DD2 til DD3. Fortsæt fortynde DNA på samme måde langs rørene for at opnå en seriel fortynding af 10 0 -10 -7 i rør DD2-Dd8 sammen med en blank rør containing kun NFW.
    Bemærk: Hvis ikke analyseres samme dag for ekstraktion, opbevare prøver ved -20 ° C indtil analyse.
  • Kvantitativ-PCR-analyse
    1. Tænd for q-PCR instrument på forhånd for at varme op.
    2. I et nyt program fil, indsætte oplysninger om Q-PCR køre i det instrumentspecifikke drift software, som beskrevet i tabel 3.
      Bemærk: Forskellige instrumenter har forskellige optimale timing for hver termisk cyklus trin. Denne indgang er angivet i instrumentets manual.
    3. Desinficer bordpladen med overfladen DNA-decontaminant og arbejder kun med sterile rør, tips og reagenser.
    4. Forbered en spand is ved siden af ​​arbejder bænken. Store Taq-polymerase mix på is.
    5. Beregn det samlede antal reaktionsskakter, der vil blive besat i pladen. Foretag teoretisk godtgørelse for ekstra reaktioner (5%) og formere det udvidede antal reaktioner ved volumen pr reaktion at beregne den samlede reaction volumen.
    6. Forbered reaktionen blandet pool, startende fra NFW, primere, sonde, og endelig Taq polymerase mix. Se eksempel til beregninger lydstyrken for den blandede pulje i tabel 4.
    7. Opbevar reaktionsblandingen i mørke og på is indtil anvendelse.
    8. Placer 1 pi standard DNA, prøve-DNA, eller NFW (som negativ kontrol) inde brøndene i q-PCR mikroplade i triplikater.
    9. Sikre, at pladen er i en plade holder at forhindre det i at røre arbejdsfladen og holde den ren.
    10. Tilføj 9 pi af den blandede pulje (tabel 4) i hver reaktion brønd.
    11. Dæk pladen med optisk selvklæbende film og lukkes tæt fra alle sider.
    12. Spin ned pladen i en centrifuge med plade spande i 1 minut ved 1000 xg, før du placerer den i q-PCR-enhed.
    13. Pladen anbringes i instrumentet og aktivere kørende program.
  • Parameter Detaljer Kommentarer
    metode Detection Kvantitativ hydrolyseprobe
    Termiske cykelforhold
    Indledende denaturering og enzymaktivering 95 ° C i 10 min
    denaturering 95 ° C i 15 sek gentag 45 gange
    Annealing og forlængelse 60 ° C i 60 sek
    Plade-array
    standardkurve DD1 - Dd8 3 gentagelser per fortynding i 1-8 brønde på de 3 øverste rækker
    Ikke-template-kontrol (NTC) Nuklease frit vand (NFW) 3 gentagelser i 9. såvel i toppen3 rækker.
    analyserede prøver DNA ekstraheret fra filtre 3 gentagelser per prøve ved de resterende brønde.
    primersæt per hver brønd
    prøvevolumen 10 ml

    Tabel 3:. Detaljer for q-PCR drift software Nærmere oplysninger om analyseparametre, der skal opføres i q-PCR program fil.

    Reagens Volumen pr reaktion (ml) Antal reaktioner Tillæg for fejl(5%) Samlet volumen mix (ml)
    Taq-polymerase mix 5 50 52.5 262,5
    F primer (10 mM) 0.5 50 52.5 26,25
    R primer (10 mM) 0.5 50 52.5 26,25
    Nuklease frit vand 3 50 52.5 157,5
    DNA - 1 ml vil blive tilsat direkte i mål-brønde i 96-pladen.

    Tabel 4:. Kvantitativ-PCR Reaction Mix Beregning Volumen pr reaktion, antal reaktioner, godtgørelse for fejl, og det samlede beregnede volumen der skal tilsættes til reaktionsblandingen pr reagens er detaljeret.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Det er almindeligt at studere atmosfæriske aerosoler ved hjælp af "off-line" analyser af filtre i stikprøven (se figur 2). 32 Kemiske analyser af sagen omfatte økologisk (f.eks protein, carbonhydridmolekyler, saccharider) og uorganisk (fx metaller, salte) indhold stikprøven . Biologiske analyser omfatte levedygtige og ikke-levedygtige indhold mikroorganisme, artsidentifikation anvendelse af en DNA tilgang eller mikroskopi, samt DNA-kvantificering.

    Figur 2
    Figur 2: Filer prøveanalyse rutediagram filter efter luft-prøveudtagning (A), fremstilling af filteret for downstream analyser (B) og analyse af de prøvekomponenter (C)..

    e = "1"> For endotoksin ekstraktion, er filter delprøver (1,12 cm2) rystes i 1 ml PFW i 60 minutter ved stuetemperatur. Prøverne centrifugeres derefter i 10 minutter ved 375 x g. Forskellige centrifugeringshastigheder kan resultere i forskellige ekstraktionseffektiviteter, som vist på figur 3A.

    Der bør foretages en indledende prøve for udvinding effektivitet for den specifikke filter vælges og protokol udføres. I figur 3B er højere ekstraktionseffektiviteter opnået fra spiking ren sammenlignet med samplede kvarts filtre, og begge disse effektiviteter er lavere end den, der opnås via direkte påvisning af standardopløsningen. Som diskuteret andetsteds, kan arten af de omgivende aerosoler stikprøven på filteret også påvirke endotoksin ekstraktionseffektiviteten. 14,33

    g3.jpg "/>
    Figur 3: Endotoxin udsugningseffektivitet Virkningen af centrifugering hastighed (A) og filter belastning (B) på endotoksin ekstraktionseffektiviteten.. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Reaktionen til endotoxin påvisning involverer en 1: 1-forhold mellem LAL reagens til endotoksin standard, prøven ekstraheret endotoxiner, eller emnerne. Det anbefales at bruge triplikater for prøveanalyse. Men for standardkurver, dubletter er tilstrækkelige. Når absorption aflæsninger (ved 405 nm) er afsluttet, er den resulterende optiske densitet (OD) analyseret efter at eksportere det til en data-analyse regnearksprogram for yderligere analyse af data.

    Som i endotoksin ekstraktion, er det vigtigt at udføre en foreløbig analyse af DNA ekstraktionseffektivitet under de specifikke eksperimentelle betingelser. Dette gøres ved at tilsætte en kendt mængde af en standard organisme celle opløsningen på et stykke skæres fra filteret, efter den ovenfor beskrevne DNA-ekstraktion protokol.

    Koncentrationen af ​​målmikroorganismen ekstraheret fra aerosoler i stikprøven bestemmes under anvendelse q-PCR. Her hydrolyseprobe teknik anvendes, hvilket har den fordel af høj specificitet, på grund af den ekstra probe bundet til template-DNA'et. 35 The SYBR green metode kan også anvendes til dette formål.

    Kalibreringskurver er afledt af DNA ekstraheret fra de valgte organismer af interesse, under anvendelse af ekstraktionsmetode beskrevet ovenfor. En blandet pulje af reaktionsprodukterne forbindelser, eksklusive DNA-prøven, standard eller kontrol, fremstilles og opbevares i mørke og på is indtil brug. Derefter en portion af den blandede pulje tilsættes til hver brønd i en 96 mikrobrønd optisk plade. tilsættes DNA standard, prøve eller kontrol efter Reaktionsblanding ifølge pladen array. Efter alle reagenser er blevet indsat i pladen, er det havført med en optisk klæbende film og spundet ned at samle alle dråberne på bunden af ​​brøndene. Pladen er end indsat i q-PCR instrument for termisk cyklus amplifikation og signaldetektion.

    Outputdataene består af PCR Ct-værdier, der defineres som antallet af cykler, hvor den amplificerede DNA beløbet når tærskelniveauet. Ved hjælp af kalibreringskurven værdier, kan fås koncentrationen af mål-DNA (se figur 4). 36. Den mikroorganisme celle koncentrationer kan beregnes ud fra de Ct-værdier for ekstraktionseffektiviteten sammenlignet med en hæmocytometer optælling af standard organisme løsning. 37

    Figur 4
    Figur 4: Kvantitativ-PCR-amplifikation plot (A) og calibrat.ion kurve på mellem 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) udføres for repræsentativ gram negative bakterielt DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Dette arbejde beskriver udvinding og påvisningsmetoder til kvantificering både endotoksiner og DNA til stede i aerosol prøver indsamlet på filtre. Metoderne kræver nøjagtige rutiner og kan udføres nemt, så længe experimentalist klæber til et par væsentlige og vigtige punkter diskuteret her.

    For endotoksin påvisningstrinnet bemærke, at lysatet løsning er ganske viskos og har tendens til at frembringe bobler ved pipettering. Det er vanskeligt at fjerne dig bobler, og de fører til ændringer i mikroplade-læser værdier. Derfor er det vigtigt først at placere prøven i pladen og efter at have sikret, at alle boblerne forsvandt, fortsætte med tilsætning af lysatet opløsning. En hjælpsom teknik til at forhindre bobledannelse i dette trin er at arbejde langsomt med pipetten, og ikke at trykke det hele vejen, når dræne lysatet i brøndene. Som en reaktion igangsættes umiddelbart efter lysatet tilsætning til endotoxin udvinde, er det vigtigt at starte læsningen snarest muligt. For at afkorte lysatet tilsætning trin kan en multikanalpipette anvendes. Bemærk, at i nogle kits og protokoller er der en ekstra forinkubationstrin af prøverne ved 37 ° C i 10 minutter, efter at den er placeret i mikro titter pladen. 29 Først efter dette trin, kan lysatet tilsættes.

    Et vigtigt punkt for miljømæssig prøve ekstraktion af endotoxiner er tilstedeværelsen af inhibitorer i prøverne (fx i luftprøve høj forurening). I dette tilfælde fortynding bliver kritisk, og kan forhindre falsk ekstraudstyr, typisk observeres for ikke-fortyndet prøve. 38

    Ligeledes er der flere punkter af betydning for at sikre succes og pålideligheden af ​​q-PCR-detektion. 1) Da mængden af ​​løsningerne er meget små, hvis de ikke er placeret i bunden af ​​brønden, kan vandindholdet i DNA dråbe reduceres ved inddampning while arrangere prøverne på pladen. For at undgå dette problem, placere DNA-prøven ved bunden af ​​brønden, køle pladen ved at placere den på is eller en anden afkøling platform, og forberede alt på forhånd til hurtigere dette trin så meget som muligt. 2) Ved udarbejdelsen af q-PCR-reaktionsblandingen (tabel 4), dække rør med aluminiumfolie for at forebygge fotonedbrydning. 3) Den foreliggende eksperiment beskriver fremstillingen af ​​en 10 pi reaktion. Men i nogle q-PCR instrumenter, er reaktionsvolumenet 20 pi, og derefter mængden af ​​hvert reagens ganges tilsvarende. 4) De optimale termiske forhold cyklus kan ændre sig for forskellige primere og polymerase blandinger. 39 For eksempel bør annealingstemperaturen fastsættes til omkring smeltetemperaturen for primerne, og bestemmes empirisk som den temperatur, ved hvilken amplifikation forekommer mest effektivt. Af denne grund er det også vigtigt at forberede en kalibreringskurve for hver analyserede q-PCRplade, for at sikre, at kvantificeringen er korrekte. Kalibreringskurver samt standard-spiked filtre fungerer også som en positiv kontrol, for at sikre, at ingen hæmning opstår. For at undgå hæmning, anbefales det at bruge udvinding kits designet til at fjerne inhibitorer fra miljøprøver. 5) antallet af varmecykler i dette forsøg var sat til det maksimale antal, 45, med henblik på at øge følsomheden som DNA-koncentrationer fra filteret ekstrakter var meget lave. 6) Sørg for, at cykler til Threshold (Cτ) værdier for alle DNA-prøver er inden dynamikområde kalibreringskurven. Også sikre, at enhver amplifikation af en negativ kontrolprøve, er mindst otte cykler større end den af ​​DNA-prøverne. 7) Hvis du arbejder med SYBR Green reagens, skal du sørge for, at der ikke er nogen flere smeltende temperatur toppe pr reaktion.

    For turbidimetrisk test, to endotoxin kvantificeringsmetoder er tilgængelige: den kinetiske metode og Slutpunt chromogen metode. I den kinetiske metode, som udføres i denne protokol, den tid, der kræves for prøven at nå maksimal absorbans måles. Her, en kortere reaktionstid interval indikerer en koncentration højere endotoksin i prøven. I endpoint chromogen fremgangsmåde lysabsorption måles efter en defineret inkubationstid at bestemme endotoksin-koncentration. Begge metoder kræver en standardkalibreringskurve for kvantificering. 40

    Selv om præcision og nøjagtighed af endotoksin ekstraktion ovenfor beskrevne er meget høj, kunne 14 ekstraktionseffektiviteten forbedres. Det er muligt, at en anden type filter eller tilsætningen af ​​en detergent (såsom Polysorbat 20) til ekstraktionsproceduren kunne forbedre udbyttet af endotoksin ekstraheret fra filteret. Endotoxin Centrifugeringsevne kan også påvirkes af forskellige partikler stikprøven parallelt på filteret. 33 Til vores forsøgsopstilling, denMetodens detektionsgrænse er estimeret til 0,001 EU m -3. 14

    Teknikker til kvantificering af DNA ekstrakt, der kunne tjene som et alternativ til q-PCR omfatter kloning tilgang og digital dråbe PCR (DD-PCR). Fordelene ved q-PCR over kloning tilgang til identifikation arter er dens større følsomhed, og at det kræver en lavere DNA-koncentration for den indledende amplifikationstrin. Derudover, i modsætning q-PCR, kloning metoden, som er arbejdskrævende og tidskrævende, er ikke kvantitativ. En alternativ metode til kvantificering af DNA ekstrakt er DD-PCR. 19 Fordelen ved denne teknik er, at det ikke kræver en kalibreringskurve, som detekteringen er baseret på et enkelt DNA-stamme i hver dråbe. Men for miljøprøver, eksisterer hidtil for dråbe-detektion af DNA ekstraheret fra filtre, ingen pålidelig metode.

    Den effektivitet, hvormed DNA ekstraheres from filteret, samt nøjagtighed og præcision af DNA målinger kan påvirkes af faktorer som filtertype, målmikroorganismer og instrumentering. 34,41 Det bør derfor defineres forud for analysen. I vores forsøgsopstilling, kan detektionsgrænsen nå ned til 3,5 genom m -3. 14

    Afslutningsvis den her beskrevne metode anvendes til identifikation og kvantificering af værelser med samplet biologiske arter fra både menneskeskabte og naturlige kilder. Præcis brug af den relevante analyse giver værdifulde undersøgelser af komplekse miljømæssige spørgsmål, der skal gennemføres.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
    2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. (2015).
    3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
    4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
    5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. (2014).
    6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
    7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
    8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
    9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. John Wiley & Sons. (2011).
    10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. John Wiley & Sons. (2007).
    11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
    12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
    13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
    14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
    15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
    16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
    17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
    18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
    19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
    20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
    21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. (2015).
    22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
    23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
    24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
    25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. Euromed. 12.1-12.15 (2003).
    26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
    27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
    28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
    29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
    30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
    31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
    32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
    33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
    34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
    35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
    36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
    37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
    39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. Caister Academic Press. (2011).
    40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
    41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
    Air-samplet Filter Analyse for Endotoxiner og DNA indhold
    Play Video
    PDF DOI

    Cite this Article

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter