Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

מחקר אירוסול חיצוני כלל משתמש חומר חלקיקי נדגמים מסננים. הליך זה מאפשר אפיונים שונים של חלקיקים שנאספו להתבצע במקביל. מטרת השיטה המוצגת כאן היא להשיג ניתוח מדויק והאמין ביותר של תוכן רעלן הפנימי ו- DNA של ביו-אירוסולים מופקים מסננים. הפקת מולקולות אורגניות משקל מולקולרי גבוה, כגון lipopolysaccharides, ממסנני שנדגמו כרוך רועד המדגם בתווך על בסיס מים pyrogen חינם. הניתוח שלאחר מכן מבוסס על תגובה האנזימטית כי ניתן לאתר באמצעות מדידת turbidimetric. כתוצאת התוכן האורגני הגבוה על מסנני שנדגמו, החילוץ של דנ"א הדגימות מתבצע באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרית אשר תוכננה במקור עבור קרקעות שונות כדי לשפר את תשואת DNA. איתור וכימות של מינים ספציפיים של חיידקים באמצעות Reacti שרשרת פולימראז כמותייםעל (q-PCR) ניתוח מתואר ולעומת משיטות אחרות.

Introduction

דגימת אוויר על מסננים הוא כלי בסיסי במחקר אירוסולים אטמוספריים. 1 המסננים שנדגמו הם נקודת המוצא כימית שונה, פיזי, ומאפיינים ביולוגיים של חלקיקי הסביבה שנאספו. 2-11 היתרון של גישה זו הוא כי ניתוחים שונים יכולים להיות ביצע off-line על מדגם זהה. ליקוט נתונים מכל הניתוחים השונים מאפשר לחוקר לקבל הבנה טובה של המאפיינים של חלקיקים שנאספו ועזרים בפתרון שאלות מורכבות בתחום מדעי האטמוספרה. 12,13 לדוגמה, ימיית יבשת אוויר-דגימות שנלקחו במהלך אותה תקופת ניתן להשוות ביחס רעילות החלקיקים שנדגמו והרכב ביולוגי. 14 לצורך המחקר, lipopolysaccharides (LPS), רכיבים על קירות תא החיידק גרם שליליים, הידוע גם בשם אנדוטוקסינים, חולצו מן מסננים שנדגמו על-shore ב אתר יבש, וכן הוערך באמצעותLimulus lysate amebocyte (LAL) הבדיקה. במקביל, ערכה הגנומי של תוכן החיידקים (חיידקים הכולל, גרמו שלילית, כחוליות) בוצעו על המדגם הזהה באמצעות תגובת שרשרת פולימרז כמוני (q-PCR). מבחן LAL מבוסס על מדידות של עכירות נוצרו בעקבות התוספת של תמצית מימית של amebocytes מן סרטן הפרסה, פוליפמוס Limulus, כדי בתמיסה מימית המכילה את אנדוטוקסינים. ריכוז רעלן הפנימי הגבוה ב המדגם, העכירות מהר מפתחת. 15 ניתוח q-PCR מבוסס על אותות קרינה נפלטים כמו קטע DNA ספציפי מוגבר. 16 על ידי ניטור בזמן אמת של האות בשלב המעריכים של PCR ניתן לכמת תגובת כיול עם עקומת סטנדרט, כמות ה- DNA הראשונית. השילוב של שני אלה מנתח יחד עם אחרים, כמפורט במקומות אחרים, 14 יכול לספק הערכה טובה של רמות של רעלן פנימי ואתכמות חיידקי המקור בדגימות.

מטרת השיטה המוצגת כאן היא להשיג ניתוח מדויק והאמין ביותר של תוכן רעלן הפנימי ו- DNA של ביו-אירוסולים מופקים מסננים. בעוד שיטות הדגימו את המאפיינים הכימיים הפיסיים אנאורגניים אירוסולים ידועות, ולאחרונה, שיטות פותחו כדי לחקור מרכיב החומר האורגני שלה, 17 חלו מחקר דל על המרכיב הביולוגי של אירוסולים. 18 רציונל הזרם שיטה היא לתת מענה לפער זה על ידי ההצגה בפירוט שיטה חזקה לחילוץ, ניתוח וזיהוי החלק הביולוגי של אירוסולים מוטסים. 14

השיטה המפורטת כאן צפויה למצוא שימוש רחב התפשט בפרויקטים מחקריים אירוסול מקורה ביולוגיים החיצוניים המעורבים ניתוח מסנן. 20-24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: רשימה מפורטת של כל החומרים וכלי להשתמש בפרוטוקול זה מוצגת בסעיף החומרים.

1. דגימות אוויר על מסננים

  1. הכנת מסננים
    1. לדגימה בנפח גבוה, להשתמש 20.3 x 25.4 ס"מ 2 מסננים. בחר את סוג מסוים של מסנן המתאים ביותר לצרכים מחקריים, כמו גם את הגודל חתוכים מסנן, אם זה אפשרי. 1 כאן, מסננים מיקרופייבר קוורץ שימוש.
    2. מסננים טרום לאפות מיועד דגימת תרכובת אורגנית וביולוגית להשמיד שאריות אורגניות. טרום לאפות את המסננים, לעטוף אותם בנפרד בנייר אלומיניום ולאפות אותם בתנור מעבדה ב 450 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 5.
    3. אחסן את מסנני אפוי ב -20 ° C עד הדגימה.
  2. טיפול Instrument אוויר דגימה
    1. אבק שיורית נקי מהראש של סמפלר בנפח הגבוהה. נגב את החלקים עם מגבוני נייר נקיים ולאפשר להם befo האוויר יבשמחדש וחיבור מחדש אותם סמפלר.
    2. לחטא את מכלול הסינון עם אתנול, ולעבוד עם כפפות וחלוק מעבדה בכל עת.
    3. מקום מסנן מראש אפוי בתוך מכלול הסינון נקי, והמשך בהתאם למדריך סמפלר בנפח גבוה.
    4. סמן את התאריך בכל תנאי מזג האוויר יוצא דופן, אם (סערה למשל גשם, אבק) החלים על לעטוף אלומיניום, ולשמור אותו במקום נקי עד להשלמת הדגימה.
    5. אסוף את המסנן שנדגמו ומקפלים אותו לשניים, כאשר הצד שנדגמו מול פנימה.
    6. עוטפים את המסנן רדיד ולאחסן אלומיניום המקורי ב -20 ° C עד הניתוח.
      הערה: אם הפרש בזמן בין דיגום ואנליזה הוא יותר מ 2 חודשים, לאחסן המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, כדי למנוע השפלה של החומר האורגני וביולוגיים.

2. ניתוח אנדוטוקסינים

הערה: לחטא את משטח העבודה עם אתנול 70%ד עבודה עם צינורות pyrogen ללא, טיפים ריאגנטים בלבד. אם זכוכית משמשת, טרום חימום ב 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, או 200 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות נדרש. 25 יש להכין את כל ריאגנטים בתוך ארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה ולעבוד עם כפפות וחלוקים מעבדה בכל העת.

  1. הכנת מגיב
    1. פעל על פי פרוטוקול של יצרן ערכת LAL רעננותם את lysate זמן קצר לפני השימוש. 26 קש בעדינות על הבקבוקון כדי לסלק LAL הנותר על קירות הבקבוק. הרם את הפקק בעדינות לשבור את הוואקום. באמצעות מזרק המחטניים, להוסיף 5 מ"ל מים חינם pyrogen (PFW) כדי בקבוקון רעננותם כל תוכן lysate ומערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות קצף.
    2. חותם את הבקבוקון עם סרט פרפין פלסטיק כשאינו בשימוש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד ימים. אחסן כל lysate הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
      הערה: מגיב זה אפשר להקפיא רק פעם אחת.
    3. רעננותם רעלן פנימי תקן הבקרה (CSE), אשר מכיל 0.5 μ; ז א coli, בהתאם פרוטוקול של היצרן. 27 לקבוע את כמות מים מוגדרת יתווספו בקבוקון CSE מאתר האינטרנט של היצרן 28 על ידי הזנת מספר הרבה על ערכת היכן שצוין באתר. הריכוז הסופי של E. coli בבקבוקון, נמדדת ביחידות רעלן פנימי (EU; שם 10 האיחוד האירופי = 1 ננוגרם). לייבל בקבוקון זה Ed0.
    4. חותם את בקבוקון CSE עם סרט פרפין פלסטיק כשאינו בשימוש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  2. עקומת סטנדרט והכנה ממוסמרת-מסנן
    1. בארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה, להכין 22 צינורות pyrogen ללא 2 מיליליטר צנטריפוגות המכילים כמויות ירידה של CSE (צינורות ED1-Ed11) או לא CSE (הצינור הריק המכיל PFW בלבד) כדי לייצר סדרת דילול רעלן פנימי כפולות, כפי שמוצג בטבלה 1.
    2. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך 22 חתיכות עגולות של נקי, מסנן מראש אפוי באמצעות חיטוי 1.1 דקור הפקק 2 ס"מ קוטר.
    3. מניח את הזוגות לסנן לתוך בצלחות פטרי סטרילית.
    4. ספייק 50 μl מכל חבר סדרת דילול רעלן הפנימי ED2-Ed11 ו מהצינור הריק על זוג המסננים מקביל.
    5. השאר את צלחות פטרי המכילות את המסננים הממוסמרים הפתוחים מתחת למכסת המנוע לייבוש למשך 30 דקות.
    6. מניחים כל פיסת מסנן בצינור מ"ל 2 pyrogen חינם.
">
צינור ריכוז רעלן פנימי סופי (EU מ"ל -1) נפח רעלן פנימי רגיל (מ"ל) נפח המים חינם pyrogen (מ"ל) נפח כולל (מיליליטר)
Ed0 2,500 פתרון מניות * 5
ED1 1,000 80 (מ Ed0) 120 200
ED2 100 20 (מ ED1) 180 200
Ed3 50 10 (מ ED1) 190 200
Ed4 25 5 (מתוך ED1) 195 200
Ed5 12.5 2.5 (מ ED1) 197.5 200
Ed6 6.25 1.25 (מ ED1) 198.75 200
Ed7 3.125 6.25 (מ ED2) 193.75 200
Ed8 1.563 6.25 (מ Ed3) 193.75 200
Ed9 .781 6.25 (מ Ed4) 193.75 200
Ed10 .391 6.25 (מ Ed5) 193.75 200
Ed11 .195 6.25 (מ Ed6) 193.75 200
רֵיק 0 0 200 200

טבלת 1:. עקומת סטנדרט אנדוטוקסינים ריכוז אנדוטוקסינים, נפח של רעלן פנימי סטנדרטי של מי pyrogen ללא להתווסף, ואת הנפח הכולל מתקבל מפורט עבור כל צינור דילול בעקום הכיול.

  1. הפקת אנדוטוקסינים מן ניסיוני ומסננים ממוסמרים
    1. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך את מסנני המדגם (מ שלב 1.2) לחתיכות מעגליות באמצעות מקדח פקק קוטר 1.12 סנטימטרים לחטא, ומניח אותם, יחד עם מסנני תקן הממוסמרים (מ שלב 2.2), ב pyrogen ללא 2 צינורות מ"ל (כלומר, דוגמיות).
    2. הוסף 1 מ"ל PFW אל צינורות ולנער אותם במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות שייקר מעבדה.
    3. צנטריפוגה דוגמיות microcentrifuge בבית 375 XG במשך 10 דקות. 29
    4. ה העברהsupernatant דואר, אשר מכיל את אנדוטוקסינים, לתוך צינור pyrogen ללא 2 מ"ל חדש.
  2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) מבחן
    1. קבע את ריכוז רעלן הפנימי בדגימות על ידי ביצוע בדיקת LAL בתוך microplate 96-היטב pyrogen ללא עם תחתית שטוחה ומכסה.
    2. לתכנן את מערך צלחת מראש, כפי שמוצג באיור 1. כלול עקומת סטנדרט מוכן ישירות פתרונות סטנדרטיים רעלן פנימי ED2-Ed11 (ובכך מכסה את טווח הריכוז של 100-0.195 מ"ל האיחוד האירופי / (ראה סעיף 2.2)) בכל צלחת פועל . עקומת התקן צריכה לכבוש בארות 1-10 מתוך שורות A ו- B של הצלחת. מניח בצד בארות 11-12 בשורות אלה עבור דגימות ריקות (ובסך הכל ארבעה חסרים).
    3. הפעל את קורא microplate ולתכנת אותו לתגובה הקינטית המעורבת דגירה של microplate ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת בכל 5 דקות, ואחריו מדידות ספיגות ב 405 ננומטר. חזור 18 פעמים עבור 1.5 שעות.
    4. קבע את efficienCY שבה אנדוטוקסינים המחולצים המסננים המדגם (כלומר., הדגימות המתקבלות המסננים הסטנדרטיים הממוסמרים) באמצעות חלוקת סכום רעלן הפנימי מחושב לפי הסכום המקורי זנקו.
    5. הפעל את assay על ידי צבת 50 μl של פתרונות רעלן הפנימיים הסטנדרטיים (משלב 2.4.2), או של תמצית המסנן הממוסמרת ואת החסר שלה (מתוך סעיף 2.3), או של דגימות הניסוי ואת החסר שלה (גם מ -2.3 סעיף), לפי הצלחת מערך שתוכננה (איור 1) וסגור את המכסה.
    6. זה טוב, להוסיף במהירות 50 μl של פתרון LAL, בעדינות לנער את הצלחת אופקית בזמן שהוא מונח על השולחן לפני הרמת אותו לתוך הקורא.
    7. מניח את הצלחת לקורא הצלחת ולהתחיל בטווח הניסיוני.

איור 1
איור 1:. הצליח מערך אנדוטוקסינים לשעברבשפע של מערך ניתוח רעלן פנימי בתוך microplate 96-היטב.

3. ניתוח הגנום

הערה: מיצוי DNA, לחטא את משטח העבודה עם אתנול 70% ולעבוד עם צינורות סטרילית, טיפים ריאגנטים בלבד. באשר לניתוח DNA q-PCR, לחטא את משטח העבודה עם-decontaminant DNA השטח. יש להכין את כל ריאגנטים בתוך ארון בטיחות ביולוגית בכיתה השנייה ולעבוד עם כפפות וחלוק מעבדה בכל עת.

  1. הכנת Primers דנ"א הבדיקות
    1. לפני מיצוי DNA, או כדי להגדיר, זמינה מסחרי של פריימרים וכן בדיקה (אם שיטת הבדיקה הידרוליזה מוחלת), או לעצב סט חדש של פריימרים וכן בדיקה באמצעות פריימר בעיצוב בכלים חישוביים. 30
    2. רעננותם פריימרים פי פרוטוקול של היצרן או באמצעות 10 מ"מ טריס-0.1 חומצה מ"מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ TE) או מים PCR כיתה.
      הערה: מומלץ לפזר את פריימר PCR הראשוני stOck במאגר TE עם EDTA נמוך (0.1%) כפי שהוא מונע השפלה פריימר כאשר כל הזמן לזמנים ארוכים יותר. השתמש במים PCR כיתה עבור דילולים לאחר להפחית כמויות EDTA שעשוי לעכב PCR תגובות.
    3. הכן aliquots של 50 μl או 100 μl של פריימר בדיקה 0.5 סטרילי צינורות מ"ל ולאחסן ב -20 ° C עד הניתוח.
  2. הערכת ריכוז תאים סטנדרטית לפני DNA הפקה
    1. בתוך צינור צנטריפוגות בגודל מתאים, להכין פתרון תאים סטנדרטיים של מינים של חיידקים עניין (שפופרת Od0, לוח 2 א). מערבבים את ההשעיה על ידי תא pipetting אותה למעלה ולמטה בצינור 7-10 פעמים בעזרת פיפטה עם משעמם קטן.
    2. אם התאים נצבעים (למשל נבגי פטריות מסוימים), לא לבצע הליך מכתים. אם מכתים תא נדרש, לדלל את השעית תא צבע מתאים לגילוי מיקרוסקופי של התאים בעלי עניין. 31
    3. נקה את התלוש לכסות ו hemocytometer עם אתנול. להרטיב ו להטביע את תלוש לכסות על hemocytometer.
    4. טען על 8 μl של השעיה התא לשני תאי hemocytometer על ידי נגיעה בקצה בקפידה של להחליק את המכסה עם קצה פיפטה ומילוי החדר על ידי פעולה נימי. אל מעל / מתחת למלא את התא.
    5. קבע את מספר התאים על ידי הצגה אותם תחת מיקרוסקופ בהגדלת 400X (40X ב אובייקטיבי 10X ב עיני). תשעה ריבועים מדידת 1 x 1 מ"מ 2 ו מסודרים ברשת 3 x 3 צריכים להיראות. פוקוס מיקרוסקופ על אחד מארבעת הריבועים בפינה של הרשת (בהגדלה גבוהה יכולה לשמש). כיכר 1 x 1 מ"מ 2 צריכה להכיל 16 ריבועים קטנים יותר.
    6. לספור את כל התאים בכיכרות הפינתיות 1 x 1 מ"מ 2, כמו גם בכיכר באמצע הרשת 3 x 3. אם יש יותר מדי או מעט מדי תאים לספור, לחזור על התהליך, או להתרכז או דילול השעית התא המקורי כנדרש (1550 תאים צריכים כיסוי אזור בידודם 1 מ"מ 2).
    7. חשבתי את הריכוז של התאים (תאי מיליליטר -1) השעית התא הסטנדרטית Od0 מתא ספירה בממוצע על פני חמשת הריבועים נספרו כדלקמן: תא ספירת מיליליטר -1 = ספירת תאי ממוצע מרובע -1 דילול פקטור 10 4.
  3. הערכת יעילות הפקת DNA
    1. הכן תשעה סטרילי 0.5 מ"ל צינורות לפי טבלה 2 א.
    2. לדלל את הפתרון תאים סטנדרטיים (Od0) המכיל כ -10 7 תאים מ"ל -1 בנפח כולל של 20 μl (Od1).
    3. להוסיף 18 μl מים nuclease חינם PCR כיתה סטרילי (NFW) לצינורות Od2-Od8 ו -20 μl אל הצינור ריק, Od9.
    4. העברת 2 μl של פתרון התא מפני Od1 לתוך Od2. פיפטה בעדינות לתערובת ולהעביר 2 μl מהצינור Od2 כדי Od3. המשך דילול התאים באותו אופן לאורך הצינורות עד וכולל צינור Od8 כדי obtain דילול סדרתי של 10 7 -10 0 תאים מ"ל -1.
    5. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך 18 חתיכות עגולות של נקי, מסנן מראש אפוי, באמצעות מקדח פקק קוטר 1.12 סנטימטרי חיטוי. מניח את המסננים בזוגות לתוך צלחות פטרי סטרילית.
    6. ספייק 10 μl מ הדילולים Od1 כדי Od8 ומן Od9 הצינור הריק על כל המסננים לזווג, כך שיש זוג מסנן אחד המתאים לכל אחד ריכוז תאים סטנדרטי.
    7. השאירו את צלחות פטרי פתוחה מתחת למכסה המנוע ולתת להם להתייבש למשך 30 דקות.
    8. מניחים כל פיסת מסנן בתוך שפופרת מ"ל סטרילי הברגה 2 ולחלץ את ה- DNA על פי הנוהל המפורט בסעיף 3.4.
  4. הפקת DNA מן ניסיוני ומסננים ממוסמרים
    הערה: הפקת DNA המסננת, להשתמש ערכות מסחריות שנועדו להפקת DNA מאדמת פי הפרוטוקול של היצרן בשינויים הבאים.
    1. עבור כל filמדגם ter (Od1-Od8), להכין תערובת של חרוזי זכוכית חומצה שטף בצינור 0.5 מ"ל סטרילי. השתמש 0.1 G חרוזים בעל קוטר של 425-600 מיקרומטר ו -0.3 G חרוזים בעל קוטר של ≤106 מיקרומטר.
    2. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך שלוש חתיכות עגולות ממקומות שנבחרו באופן אקראי על כל דגימה מסננת באמצעות מקדח פקק קוטר 1.12 סנטימטרי חיטוי, ומניח אותם ההברגה 2 צינורות מיליליטר.
    3. מוסיפים את תערובת חרוז זכוכית של חצוצרות.
    4. מוסיפים את החיץ תא-תמס מסופק עם ערכת חילוץ על צינור אחד בקבינט ביולוגי, עם כמות בפרוטוקול של היצרן.
    5. כן דלי הקרח ולשבש את התאים באופן מכאני באמצעות מקצף חרוז.
    6. מקציפים את החרוזים דקות 1 ולאחר מכן למקם אותם על הקרח דקות 1. חזור על חמש פעמים.
    7. להמשיך עם הפרוטוקול של ספק הערכה מהשלב שלאחר תמוגה.
    8. לאחר elution עם חיץ elution מסופק (מכיל 10 מ"מ טריס בuffer) או NFW, טען מדגם eluted דרך הטור שוב כדי לשפר את תשואת DNA.
      הערה: אם לא נותחו באותו יום כמו מיצוי DNA, דגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד הניתוח.
1 "style =" height: 21px; "> Dd0
הכנת A- של סדרת תא דילול רגילה
צינור ריכוז תא סופי (תא מיליליטר -1) נפח תא רגיל (מ"ל) נפח Nuclease מים חינם (מ"ל) סך נפח (מ"ל)
Od0 לקבוע עם Hemocytometer קאמרית לספור
Od1 יש eluted כדי בטווח של 10 מ"ל 7 תאים -1 20
Od2 10 -1 Od1 2 של Od1 18 20
Od3 10 -2 Od1 2 של Od2 18 20
od4 10 -3 Od1 2 של Od3 18 20
Od5 10 -4 Od1 2 של od4 18 20
Od6 10 -5 Od1 2 של Od5 18 20
Od7 10 -6 Od1 2 של Od6 18 20
Od8 10 -7 Od1 2 של Od7 18 20
רֵיק 0 0 20 20
הכנת B- דנ"א רגיל Curve
צינור ריכוז ה- DNA הסופי (מ"ג מ"ל -1) נפח DNA רגיל (מ"ל) נפח Nuclease מים חינם (מ"ל) סך נפח (מ"ל)
לקבוע עם NanoDrop
DD1 יש eluted כדי בטווח של 10 מ"ל 1 מ"ג -1 20
Dd2 10 -1 DD1 2 של DD1 18 20
DD3 10 -2 DD1 2 של Dd2 18 20
Dd4 10 -3 DD1 2 של DD3 18 20
Dd5 10 -4 DD1 2 של Dd4 18 20
Dd6 10 -5 DD1 2 של Dd5 18 20
Dd7 10 -6 DD1 2 של Dd6 18 20
Dd8 10 -7 DD1 2 של Dd7 18 20
רֵיק 0 0 20 20

טבלה 2:. עקומת סטנדרט DNA סדרת דילול תא מיקרואורגניזם רגילה (א) מפורטת עבור נפח התא הסטנדרטי, נפח NFW, ואת הנפח הכולל בצינור אחד דילול. הכנת עקומת סטנדרט DNA (B), מפורטת עבור נפח DNA הסטנדרטי, נפח NFW, ואת הנפח הכולל בצינור אחד דילול.

  1. הכנת עקומת סטנדרט DNA תמצית ה- DNA ישירות ממדגם התקן של מיקרואורגניזם עניין (Dd0) באותו אופן כפי שתואר עבור המסננים הניסיונות בשלב 3.4.
  2. השתמש ספקטרופוטומטר לקבוע את ריכוז ה- DNA של דגימת DNA הסטנדרטית (Dd0) ב 260 ננומטר.
  3. הכן תשעה 0.5 מ"ל צינורות סטרילית שממנו ניתן להכין עקומת סטנדרט DNA, כפי שמוצג בטבלה 2B.
  4. במידת הצורך, לדלל את פתרון ה- DNA תקן Dd0 כדי בטווח ריכוז של 1-10 מיקרוגרם מ"ל -1 בצינור הראשון (DD1) בהיקף כולל של 20 μl.
  5. להוסיף 18 μl של NFW לצינורות Dd2-Dd8 ו -20 μl אל הצינור ריק.
  6. העברת 2 μl של פתרון ה- DNA רגיל מן DD1 לתוך Dd2. Pipet בעדינות לתערובת ולאחר מכן להעביר 2 μl מן Dd2 כדי DD3. המשך דילול DNA באותו אופן לאורך צינורות להשיג דילול סדרתי של 10 0 -10 -7 צינורות Dd2-Dd8 יחד עם containi צינור ריקng רק NFW.
    הערה: אם לא נותחו באותו יום של חילוץ, דגימות חנות ב -20 ° C עד הניתוח.
  • ניתוח כמותי-PCR
    1. הפעילו את מכשיר Q-PCR מראש כדי להתחמם.
    2. בתוך קובץ תוכנית חדשה, הכנס את הפרטים של Q-PCR לרוץ את תוכנת ההפעלה-מכשיר כמפורט בטבלה 3.
      הערה: מכשירים שונים יש עיתוי אופטימלי שונה בכל שלב במחזור תרמית. כניסה זו צוינה במדריך של המכשיר.
    3. לחטא את משטח העבודה עם-decontaminant DNA משטח ולעבוד רק עם צינורות סטרילית, טיפים, ריאגנטים.
    4. כן דלי הקרח ליד ספסל העבודה. חנות לערבב תקי-פולימראז על הקרח.
    5. חשב את המספר הכולל של בארות התגובה כי יהיה עסוק בצלחת. לָדוּן לְכַף זְכוּת תיאורטי תגובות נוספות (5%) ולהכפיל את המספר המוגדל של תגובות על פי היקף לכל תגובה לחישוב reactio הכולל נפח n.
    6. הכן את הברכה מעורבת תגובה, החל NFW, תחל בדיקה, ולבסוף לערבב פולימראז תקי. ראה לדוגמה עבור חישובי נפח לבריכה מעורבת בטבלה 4.
    7. אחסן את תערובת התגובה בחושך על הקרח עד לשימוש.
    8. מקום 1 μl של ה- DNA רגיל, דגימת DNA, או NFW (כביקורת שלילית) בתוך בארות microplate q-PCR ב triplicates.
    9. ודא כי הצלחת נמצאת בעל צלחת כדי למנוע ממנה לגעת קלות משטח העבודה כדי לשמור על ניקיונו.
    10. הוסף 9 μl של הבריכה מעורבת (לוח 4) לתוך כל תגובה גם.
    11. מכסים את הצלחת עם סרט דבק אופטי ולאטום אותו בחוזקה מכל הצדדים.
    12. ספין למטה צלחת בצנטריפוגה עם דליי צלחת דקות 1 XG ב 1000 לפני הצבתו בתוך מכשיר q-PCR.
    13. מניחים את הצלחת לתוך המכשיר ולהפעיל את תוכנית ריצה.
  • ge = "1">
    פָּרָמֶטֶר פרטים תגובות
    שיטת זיהוי חללית הידרוליזה כמוני
    תנאי רכיבה תרמית
    הפעלת denaturation ואנזים ראשוני 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
    denaturation 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות לחזור 45 פעמים
    חישול וסיומת 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות
    מערך פלייט
    עקומת סטנדרט DD1 - Dd8 3 חזרות לכל דילול 1-8 בארות בבית 3 השורות העליונות
    השליטה הלא התבנית (NTC) Nuclease מים חינם (NFW) 3 חזרות ב -9 היטב בחלק העליון3 שורות.
    דגימות נותחו DNA מופק מסננים 3 חזרות לדגימה על הבארות הנותרות.
    סט פריימר לכל היטב
    נפח דגימה 10 מ"ל

    טבלה 3:. פרטים עבור תוכנת ההפעלה q-PCR פרטים של פרמטרים ניתוח לרשמם על קובץ התוכנית q-PCR.

    מֵגִיב נפח לכל תגובה (מ"ל) מספר התגובות פרשת שגיאה (5%) תמהיל סך נפח (מ"ל)
    לערבב פולימראז תקי 5 50 52.5 262.5
    פריימר F (10 מ"מ) 0.5 50 52.5 26.25
    פריימר R (10 מ"מ) 0.5 50 52.5 26.25
    Nuclease מים חינם 3 50 52.5 157.5
    DNA - 1 מיליליטר יתווסף ישירות לתוך בארות היעד ב -96 הצלחת.

    הין-page = "1" FO: keep-עם-previous.within-page = "תמיד"> לוח 4:. כמוני-PCR תגובה מערבבת חישוב נפח לכל תגובה, מספר התגובות, הפרשת שגיאה, ואת הנפח הכולל מחושב להתווסף לתוך תערובת התגובה לכל מגיב מפורט.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    זה נפוץ ללמוד אירוסולים באטמוספירה באמצעות "off-line" מנתח של מסננים שנדגמו (ראה איור 2). 32 בדיקות כימיות של שנדגמו משנה כוללים אורגני (חלבון למשל, מולקולות פחמימנים, סכרידים) ואי-אורגניים (מתכות למשל, מלחים) תוכן . ניתוחים ביולוגיים לכלול תוכן מיקרואורגניזם קיימא ושאינו קיימא, זיהוי מינים באמצעות גישת DNA או מיקרוסקופיה, כמו גם כימותים מבוססים-DNA.

    איור 2
    איור 2: תרשים זרימה ניתוח מדגם פילר סנן לאחר הדגימה-אוויר (א), הכנה של מסנן עבור ניתוחים במורד הזרם (B), ואת ניתוח מרכיבי המדגם (C)..

    e = "1"> למיצוי רעלן פנימי, מסנן-דגימות משנה (1.12 ס"מ 2) הם מזועזעים ב 1 מ"ל PFW במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הדגימות אז הם centrifuged במשך 10 דקות ב 375 x ז. מהירויות צנטריפוגה שונים יכולים לגרום יעילות מיצוי שונים, כפי שמצוין באיור 3 א.

    מבחן מקדים יעיל מיצוי צריך להתנהל עבור המסנן הספציפי שנבחר והפרוטוקול בצע. באיור 3 ב, יעילות מיצוי גבוה מתקבלים spiking נקי לעומת מסנני קוורץ שנדגמו, ושניהם של יעילות אלה נמוכים מזה מושגת באמצעות זיהוי ישיר של הפתרון הסטנדרטי. כפי שנאמר במקום אחר, האופי של אירוסולים הסביבה שנדגמו על המסנן יכול גם להשפיע על יעילות מיצוי רעלן הפנימי. 14,33

    g3.jpg "/>
    איור 3: יעילות מיצוי אנדוטוקסינים השפעת מהירות צנטריפוגה (א) ולסנן עומס (B) על יעילות מיצוי רעלן פנימי.. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    התגובה לגילוי רעלן פנימי כרוכה ביחס של 1: 1 של מגיב LAL תקן רעלן הפנימי, את אנדוטוקסינים חילוץ המדגם, או החסר. מומלץ להשתמש triplicates עבור ניתוח מדגם. עם זאת, עבור עקומות סטנדרטיות, כפילויות מספיקות. כאשר קריאות הקליטה (ב 405 ננומטר) הושלמה, הצפיפות האופטית וכתוצאה מכך (OD) מנותחת לאחר היצוא אותו לתכנית גיליון אלקטרונית נתוני ניתוח לניתוח נוסף של הנתונים.

    ithin-page = "1"> הפקת DNA ממסנן האוויר שנדגמו מתבצעת ישירות חלק של מסננים-שנדגמו משנים. מיצוי DNA מתבצע באמצעות ערכת בידוד DNA מסחרי אדמה-המדגם, עם שינויים מסוימים כדי להגדיל את התשואה DNA. לפיכך, חרוזי זכוכית מתווספים להתסיס בפילטרים א-מקצף חרוז לשפר את שחרורו של DNA לתוך התמיסה. כדי למנוע חימום מדגם (דבר שעלול להוביל denaturation של ה- DNA), שלב זה מחולק לחמישה מרווחי 1 דק ', עם צינור מקורר על הקרח בין המרווחים. המיצוי אז יכול להמשיך על פי הנוהל של היצרן.

    כמו חילוץ רעלן הפנימי, חשוב לבצע ניתוח ראשוני של יעילות ה- DNA החילוץ בתנאי הניסוי הספציפיים. הדבר נעשה על ידי spiking כמות ידועה של פתרון תא אורגניזם סטנדרטי על גבי פיסה לחתוך ממסנן, בעקבות פרוטוקול מיצוי DNA שתואר לעיל.

    הריכוז של מיקרואורגניזם היעד שחולץ מן אירוסולים שנדגמו נקבע תוך שימוש בטכניקות q-PCR. הנה טכניקת חללית הידרוליזה משמשת, אשר יש את היתרון של סגוליות גבוהות, בגלל החללית הנוספת חייבת את תבנית ה- DNA. 35 שיטת SYBR הירוקה יכולה להיות מיושמת גם למטרה זו.

    עקומות כיול נגזרות DNA שחולץ מן אורגניזמים הנבחרים של עניין, תוך שימוש בשיטת החילוץ שתוארה לעיל. ברכה מעורבת של תרכובות התגובה, למעט דגימת DNA, רגילה, או השליטה, ערוכה שמר בחושך על קרח עד לרגע שימוש. לאחר מכן, aliquot של הבריכה מעורבת מתווסף לתוך היטב כל צלחת אופטית 96 microwell. ה- DNA הסטנדרטי, המדגם, או השליטה מתווספת לאחר תערובת התגובה על פי מערך הצלחת. אחרי הכל ריאגנטים הוכנסו לתוך הצלחת, זה יםהוביל עם סרט דבק אופטי וסובב למטה לאסוף את כל טיפות בתחתית הבארות. הצלחת היא מ מוכנסת לתוך מכשיר Q-PCR עבור הגברת מחזור תרמית זיהוי אותות.

    נתוני התפוקה מורכבים ערכי ה- CT PCR, אשר מוגדרים כמספר המחזור שבו כמות ה- DNA המוגברת מגיעה לרמת הסף. באמצעות הערכים העקומים כיול, ריכוז ה- DNA היעד ניתן להשיג (ראה איור 4). 36 הריכוזים הניידים של מיקרואורגניזם ניתן לחשב את ערכי ה- CT של יעילות המיצוי לעומת ספירת hemocytometer של הפתרון אורגניזם הסטנדרטי. 37

    איור 4
    איור 4: עלילת הגברה כמוני-PCR (א) ו calibrat.עקומת יון הנעים בין 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) שבוצע בעבור DNA חיידקי גרמו נציג השלילי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    עבודה זו מתארת ​​שיטות חילוץ וזיהוי לכימות הוא אנדוטוקסינים ובהווה DNA בדגימות אירוסול שנאספו על מסננים. השיטות דורשות שגרות מדויקות וניתן לבצעו בקלות כל עוד בניסויים דבק כמה נקודות חיוניות וחשיבות דנו כאן.

    עבור שלב זיהוי רעלן הפנימי, לציין כי פתרון lysate די צמיג נוטה לייצר בועות על pipetting. קשה להסיר לך בועות, והם להביא לשינויי ערכי microplate הקוראים. לכן, חשוב למקם את המדגם ראשון בצלחת ורק לאחר שווידאת שכל הבועות נעלמו, להמשיך עם התוספת של פתרון lysate. טכניקה מועילה כדי למנוע היווצרות בועה בשלב זה לעבוד לאט עם פיפטה, ולא ללחוץ אותו כל הדרך כאשר ניקוז lysate לתוך הבארות. כתגובה להתחיל מיד לאחר lysate הוא להתווסף endotoשין לחלץ, זה הכרחי כדי להפעיל את הקריאה בהקדם האפשרי. כדי לקצר את הצעד בנוסף lysate, פיפטה רבה ניתן להשתמש. שים לב כמה ערכות ופרוטוקולים יש שלב נוסף טרום הדגירה של דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לאחר מושם בצלחת צחקוק מיקרו. 29 רק לאחר שלב זה, lysate ניתן להוסיף.

    נקודה חשובה להפקת דיגום סביבתית של אנדוטוקסינים היא הנוכחות של מעכבים בדגימות (למשל במדגם זיהום אוויר גבוה). במקרה זה, דילול הופך להיות קריטי, והוא יכול למנוע שיפור שווא, ציין בדרך כלל עבור מדגם לא מדולל. 38

    בדומה לכך, יש כמה נקודות של חשיבות כדי להבטיח את הצלחת והאמינות של גילוי q-PCR. 1) כמו נפח של הפתרונות הוא קטן מאוד, אם הם לא ממוקמים בתחתית הבאר, תכולת המים והירידה DNA יכול להיות מופחת על ידי whil אידוידואר המסדיר את הדגימות על הצלחת. כדי למנוע בעיה זו, למקם את דגימת DNA בתחתית הבאר, לקרר את הצלחת על ידי הצבתו על קרח או אחר פלטפורמת קירור, ולהכין הכל מראש כדי להחיש צעד זה ככל האפשר. 2) כאשר מכינים את תערובת תגובת q-PCR (לוח 4), לכסות את הצינור עם נייר אלומיניום כדי למנוע שפלת צילום. 3) הניסוי הנוכחי מתאר את הכנת תגובה 10 μl. עם זאת, בחלק מכשירי q-PCR, היקף התגובה הוא 20 μl ולאחר מכן את עוצמת הקול של כל מגיב מוכפל בהתאם. 4) תנאי מחזור תרמי האופטימליים עשויים להשתנות עבור פריימרים שונים ותערובות פולימראז. 39 לדוגמא, טמפרטורת החישול צריכה להיות מוגדרת בסביבות טמפרטורת ההתכה של פריימרים, והוא נקבע באופן אמפירי כמו הטמפרטורה שבה הגברה מתרחשת באופן היעיל ביותר. מסיבה זו חשוב גם להכין עקומת כיול עבור כל q-PCR נותחצלחת, כדי להבטיח כי כימות מדויק. עקומות כיול וכן מסננים-ממוסמר סטנדרטיים לשרת גם כביקורת חיובית, על מנת להבטיח כי שום עכבות מתרחשות. כדי למנוע עיכוב, מומלץ להשתמש ערכות חילוץ שנועדו להסיר מעכבים מן הדגימות סביבתיות. 5) מספר מחזורים תרמיים בניסוי זה נקבע את המספר המרבי, 45, על מנת להגביר את הרגישות כמו ריכוזי ה- DNA של התמציות המסננות היו נמוכים מאוד. 6) ודא מחזורים כדי סף (Cτ) ערכים עבור כל דגימות DNA הם בתוך הטווח הדינמי של עקומת הכיול. גם להבטיח כי כל הגברה של מדגם שליטה שלילי הוא לפחות שמונה מחזורים גדול יותר מזה של דגימות DNA. 7) אם עובד עם מגיב גרין SYBR, לוודא כי אין פסגות טמפרטורת התכה מרובות לכל תגובה.

    עבור בדיקת turbidimetric, שתי שיטות כימות רעלן פנימיות זמינות: השיטה הקינטית ואת endpoint שיטת chromogenic. לפי הגישה קינטית, כפי שבוצע בפרוטוקול זה, הזמן הדרוש המדגם להגיע הנמדד ספיג מקסימאלי. כאן, מרווח תגובה קצר יותר מצביע על ריכוז רעלן פנימי גבוה במדגם. בשיטת chromogenic נקודות הקצה, קליטת אור נמדדה לאחר זמן דגירה מוגדר כדי לקבוע את ריכוז רעלן הפנימי. שתי השיטות דורשות עקומת כיול סטנדרטי עבור כימות. 40

    למרות הדיוק ואת הדיוק של מיצוי רעלן פנימי שתוארו לעיל הוא גבוה מאוד, 14 היעילות החילוץ יכול להיות שיפור. יתכן כי סוג אחר של מסנן או תוספת של חומרי ניקוי (כגון polysorbate 20) לנוהל החילוץ יכול לשפר את התשואה של רעלן פנימי שחולצו מן הסינון. יעילות מיצוי אנדוטוקסינים עשוי גם להיות מושפע חלקיקים שונים שנדגמו במקביל על המסנן. 33 עבור התקנה ניסיונית שלנו,גבול הגילוי של השיטה מוערך -3 מ '0.001 איחוד אירופאי. 14

    טכניקות לכימות תמצית ה- DNA שיכול לשמש כחלופה q-PCR כוללים גישה שיבוט אגל דיגיטלי PCR (DD-PCR). היתרונות של Q-PCR על פני גישת השיבוט לצורך זיהוי מינים הם רגישותו יותר וכי היא דורשת ריכוז ה- DNA נמוך עבור שלב ההגברה הראשוני. בנוסף, שלא כמו Q-PCR, שיטת השיבוט, אשר הוא עתיר עבודת זמן רב, הוא לא כמוני. שיטה חלופית עבור כימות של תמצית ה- DNA הוא DD-PCR. 19 היתרון של שיטה זו הוא שהיא אינה דורשת עקומת כיול, כמו זיהוי מבוסס על זן דנ"א יחיד בכל אגל. עם זאת, עבור דגימות סביבתיות, אין שיטה אמינה קיימת עד כה עבור אגל-זיהוי של דנ"א מופק מסננים.

    את היעילות שבה DNA מופק frאום המסנן, כמו גם את הדיוק של מדידות DNA, יכול להיות מושפע מגורמים כגון סוג מסנן, מיקרואורגניזמים יעד, ומכשור. 34,41 לכן היא צריכה להיות מוגדרת לפני הניתוח המדגם. ב התקנת הניסוי שלנו, לגבול של זיהוי יכול להגיע עד -3 3.5 הגנום מ. 14

    לסיכום, השיטה המתוארת כאן ישימה עבור זיהוי וכימות של מינים ביולוגיים-שנדגמו אוויר משני מקורות אנושיים וטבעיים. שימוש מדויק של assay המתאים מאפשר חקירות ערך של שאלות סביבתיות מורכבות להתבצע.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
    2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. (2015).
    3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
    4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
    5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. (2014).
    6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
    7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
    8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
    9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. John Wiley & Sons. (2011).
    10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. John Wiley & Sons. (2007).
    11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
    12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
    13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
    14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
    15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
    16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
    17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
    18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
    19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
    20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
    21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. (2015).
    22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
    23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
    24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
    25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. Euromed. 12.1-12.15 (2003).
    26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
    27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
    28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
    29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
    30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
    31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
    32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
    33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
    34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
    35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
    36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
    37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
    39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. Caister Academic Press. (2011).
    40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
    41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
    Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA
    Play Video
    PDF DOI

    Cite this Article

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter