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エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

屋外のエアロゾル研究は、一般的にフィルターにサンプリングされた粒子状物質を使用しています。この手順では、収集された粒子の様々な特徴付けは、並列に実行されることを可能にします。ここで提示された方法の目的は、フィルターから抽出したバイオエアロゾルのエンドトキシンとDNA含有量の高精度で信頼性の高い分析を得ることです。サンプリングされたフィルタのようなリポ多糖類のような高分子量の有機分子の抽出は、発熱物質を含まない水ベースの培地中で試料を振盪することを含みます。その後の分析は、濁度測定を用いて検出することができる酵素反応に基づいています。サンプリングされたフィルタの高い有機含有量の結果として、試料からのDNAの抽出は、元々の土壌のために設計され、DNAの収量を改善するために変更された市販のDNA抽出キットを用いて行われます。定量的ポリメラーゼ連鎖をReactiを使用して、特定の微生物種の検出および定量(Q-PCR)分析に説明し、他の利用可能な方法と比較されます。

Introduction

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フィルター上の空気サンプリングは、大気エアロゾル研究の基本的なツールである。1サンプリングフィルタは、様々な化学的、物理的、および収集した周囲の粒子の生物学的特徴付けのための出発点です。2-11このアプローチの利点は、様々な分析ができることです同じサンプルでオフラインで実行。たとえば、12,13は大気科学に複雑な問題を解決するために集められた粒子と助剤の特性を十分に理解を得るために、研究者を可能にするすべての異なる分析からのデータをコンパイル、同じ時に撮影した海洋と内陸空気サンプル期間がこの研究のためにサンプリングされた粒子の毒性及び生物学的組成物。14に対して比較することができる、リポ多糖(LPS)、また内毒素としても知られているグラム陰性細菌の細胞壁の構成要素は、海岸オンとでサンプリングフィルタから抽出しました。内陸部位、および使用して評価しました。カブトガニアメーバ様細胞溶解液(LAL)試験。並行して、ゲノム細菌のコンテンツの評価(総細菌、グラム陰性、およびシアノバクテリア)が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)を使用して同じサンプルについて行きました。 LAL試験はエンドトキシンを含有する水溶液に、カブトガニ、 カブトガニからのアメーバ様細胞の水性抽出物の添加後に形成された濁度の測定値に基づいています。試料中のエンドトキシン濃度を、高速濁度が発生高い。15、Q-PCR分析は、特定のDNA断片が増幅されるように放出された蛍光信号に基づいている。16個の信号のリアルタイムモニタリングによりPCRの対数期の間の反応および標準曲線を用いて較正し、初期DNA量を定量することができます。これら二つの組み合わせは、他の場所で詳述されるように、14は、エンドトキシンとのレベルの良好な推定を提供することができ、他の人と一緒に分析しますサンプルソースの細菌の量。

ここで提示された方法の目的は、フィルターから抽出したバイオエアロゾルのエンドトキシンとDNA含有量の高精度で信頼性の高い分析を得ることです。エアロゾルの物理的および無機化学的特性をサンプリングするための方法はよく知られており、最近では、方法は、その有機物成分を調査するために開発されてきたが、17エアロゾルの生物学的成分に乏しい研究があった。18根拠電流のこの方法は、具体的に、抽出分析、及び空気中のエアロゾルの生物学的部分を同定するための強力な方法を提示することによって、このギャップを解決することである。14

ここでの詳細な方法は、フィルタの分析を含む生物学的な屋内と屋外のエアロゾル研究プロジェクトに広範な用途を見出すことが期待される。20-24

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Protocol

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注:このプロトコルで使用されるすべての材料および機器の詳細なリストは、材料のセクションに示されています。

フィルタ1.エアサンプリング

  1. フィルタの作製
    1. 大量のサンプリングについては、20.3 X 25.4センチメートル2のフィルタを使用しています。該当する場合は、ここで1。、最高の研究の必要性だけでなく、フィルターのカットオフサイズにフィットする、特定の種類のフィルタを選択して石英マイクロファイバーフィルターを使用しています。
    2. 有機残留物を破壊するために、有機および生物学的化合物のサンプリングのために意図プリベークフィルター。プリベークするにはフィルター、アルミ箔で個別にそれらをラップした後、少なくとも5時間、450℃で実験室炉でそれらを焼きます。
    3. サンプリングまで-20℃で焼いたフィルターを保管してください。
  2. 楽器取り扱いと空気サンプリング
    1. 大量のサンプラーのヘッドから残留ほこりを清掃してください。クリーンペーパーワイプと部品を拭きし、空気乾燥befoにそれらを許可しますサンプラーにそれらを再接続再。
    2. エタノールでフィルタカセットを消毒し、すべての回で手袋と白衣で動作します。
    3. きれいなフィルタカセット内部のプレ焼いたフィルターを配置し、高容量サンプラーマニュアルに従って進みます。
    4. マークの日付と異常な気象条件、適用可能な場合( 例えば 、雨、砂塵嵐)アルミラップに、サンプリングが完了するまで清潔な場所に保存します。
    5. サンプリングフィルタを収集し、サンプリングされた側を内側に向けて、半分に折ります。
    6. 分析まで-20℃で純正アルミ箔とストア内のフィルタを包みます。
      注:サンプリングと分析の間の時間差は、長い、2ヶ月を超える場合、有機及び生物材料の劣化を回避するために-80℃で試料を保存します。

2.エンドトキシン分析

:70%エタノールANと作業面を消毒します唯一の発熱物質を含まないチューブ、ヒントや試薬とDの仕事。ガラス製品が使用されている場合は、30分間250℃、または60分間、200℃で予備加熱が必要である。25は、クラスII安全キャビネット内の全ての試薬 ​​を準備し、手袋、常に白衣で動作します。

  1. 試薬の調製
    1. LALはボトルの壁に残って取り除くために、バイアルを軽く使用の直前に。26をタップし、溶解物を再水和するためにLALキットの製造業者のプロトコルに従ってください。真空を破るために静かにストッパーを持ち上げます。針付き注射器を使用して、すべての溶解物の内容を再水和し、泡の形成を避けるために、穏やかに混合するためにバイアルに発熱物質を含まない水(PFW)の5ミリリットルを追加します。
    2. プラスチックパラフィンフィルムでバイアルを密封していないときは2日まで4℃で使用し、店舗インチまでの3ヶ月間-20℃で残りの溶解液を保管してください。
      注:この試薬は、一度だけ凍結させることができます。
    3. 0.5μを含むコントロール標準エンドトキシン(CSE)を、再水和;グラムE.製造元のプロトコルに従って大腸菌 、27のウェブサイト上で指定されたキットのロット番号を入力することで、メーカーのウェブサイト28からCSEバイアルに添加される水の特定の量を決定します。 E.最終濃度バイアル中の大腸菌は 、(EU;ここで、10 EU = 1 ngの)エンドトキシン単位で測定されます。このバイアルED0にラベルを付けます。
    4. プラスチックパラフィンフィルムないときは、4週間まで4℃で使用し、ストア内でCSEバイアルを密封します。
  2. 標準曲線とスパイク・フィルタの準備
    1. クラスII安全キャビネットでは、 に示すように、重複したエンドトキシン希釈系列を生成するためにCSE(チューブED1-ED11)、または全くCSE(のみPFWを含む素管)の減少量を含む22の発熱物質を含まない2ミリリットル遠心管を準備1。
    2. 円形の流れと生物学的なキャビネットでは、消毒済みの1.1を使用して、クリーン、プレ焼きフィルタの22円形の部分をカット直径2cmのコルクボーラー。
    3. 滅菌ペトリ皿にフィルタのペアを配置します。
    4. フィルタの対応する対にエンドトキシン希釈系列ED2-ED11の各メンバーから、ブランクチューブから50μlのスパイク。
    5. 30分間乾燥させるためにボンネットの下にオープンスパイクフィルタを含むペトリ皿のままにしておきます。
    6. 発熱物質を含まない2ミリリットルチューブに各フィルタピースを置きます。
">
チューブ 最終エンドトキシン濃度(EUミリリットル-1) 標準エンドトキシン量(ミリリットル) 発熱物質を含まない水の量(ミリリットル) 総容量(ミリリットル)
ED0 2500 原液* 5
ED1 80(ED0から) 120 200
ED2 100 20(ED1から) 180 200
ED3 50 10(ED1から) 190 200
ED4 25 5(ED1から) 195 200
ED5 12.5 2.5(ED1から) 197.5 200
Ed6 6.25 1.25(ED1から) 198.75 200
ED7 3.125 6.25(ED2から) 193.75 200
ED8 1.563 6.25(ED3から) 193.75 200
ED9 0.781 6.25(ED4から) 193.75 200
ED10 0.391 6.25(ED5から) 193.75 200
ED11 0.195 6.25(Ed6から) 193.75 200
ブランク 0 0 200 200

表1:エンドトキシン標準曲線エンドトキシン濃度は、標準的な内毒素および発熱物質を含まない水の量を添加すると、得られた全容積は、キャリブレーション曲線の各希釈管のための詳細です。

  1. 実験およびスパイクされたフィルタからのエンドトキシンの抽出
    1. 円形の流れと生物学的なキャビネットでは、発熱物質を含まない2で、(ステップ2.2から)スパイク標準フィルタと一緒に、消毒1.12センチメートル直径のコルクボーラーを使用して、それらを配置した円形片に(ステップ1.2から)のサンプルフィルタをカットmlチューブ( すなわち、試料管)。
    2. チューブ1 mlのPFWを追加し、実験室用振盪機を用いて、室温で60分間、それらを横に振ります。
    3. 遠心分離機10分間、375×gで微量のサンプルチューブ29
    4. 転送番目新しい発熱物質を含まない2ミリリットルチューブに、エンドトキシンを含む電子上清、。
  2. LAL(LAL)試験
    1. 平坦な底部と蓋で発熱物質を含まない96ウェルマイクロプレートにLAL試験を行うことにより、試料中のエンドトキシン濃度を決定します。
    2. 図1に示すように、事前に板アレイを計画し、すべての実行中のプレートに(100から0.195 EU / mlである(セクション2.2を参照)の濃度範囲をカバーするため、)エンドトキシン標準溶液ED2-ED11から直接作成した標準曲線を含めます。標準曲線は、ウェルをプレートの列AとBの1-10を占有する必要があります。ブランクサンプルのため、これらの行のウェル11月12日を取っておく(4ブランクの合計を作ります)。
    3. マイクロプレートリーダーをオンにして、37℃でマイクロプレートのインキュベーションを伴うし、405nmで吸収測定に続いて5分ごとに、揺れ運動反応のためにそれをプログラムします。 1.5時間18回繰り返します。
    4. efficienを決定エンドトキシンをスパイクオリジナルの量によって算出されたエンドトキシン量の分裂を経てサンプルフィルタ( すなわち 、スパイク標準フィルタから得られた試料)から抽出されるとCY。
    5. (また、セクション2.3から)(ステップ2.4​​.2から)、またはスパイクフィルタエキスと(セクション2.3から)その空白の、または実験サンプルとそのブランクの標準エンドトキシン溶液を50μlのを配置することによってアッセイを開始し、計画されたプレートアレイ( 図1)のとおり、カバーを閉じます。
    6. 各ウェルに、迅速LAL溶液50μlを追加し、静かにそれは読者にそれを持ち上げる前に、テーブルの上に置かれている間に水平板を横に振ります。
    7. プレートリーダーでプレートを置き、実験操作を開始します。

図1
図1:エンドトキシンアレイプレートの元96ウェルマイクロプレート中のエンドトキシン分析配列の十分。

3.ゲノム解析

注:DNA抽出のために、70%エタノールで作業面を消毒し、唯一の滅菌チューブ、ヒントや試薬で動作します。 DNAのQ-PCR分析のために、表面のDNA-除染で作業面を消毒します。クラスII安全キャビネット内の全ての試薬を準備し、すべての回で手袋と白衣で動作します。

  1. DNAプライマーおよびプローブの調製
    1. DNA抽出、いずれかの順序(加水分解プローブ法が適用される場合)、プライマーの市販セットとプローブ、またはプライマーの新しいセットおよびプライマーの計算ツールをデザインを使用してプローブを設計する前に30
    2. 10mMのTris-0.1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(TE緩衝液)またはPCRグレードの水のいずれかを使用して製造業者のプロトコルに従って、プライマーを再水和します。
      注:最初のPCRプライマー世紀を溶解することをお勧めします長時間保持するとき、それは、プライマーの劣化を防止するように、低EDTA(0.1%)のTE緩衝液中OCK。 PCR反応を阻害する可能性があるEDTAの量を減らすために、後続の希釈のためのPCRグレードの水を使用してください。
    3. 分析まで-20℃で50μlのアリコートまたは滅菌0.5ミリリットルチューブにおけるプライマーとプローブの100μlのとストアを準備します。
  2. DNA抽出の前に、標準的な細胞濃度評価
    1. 適切なサイズの遠心管では、対象の微生物種(チューブOD0、 表2A)の標準的な細胞液を調製。小口径でピペットを用いてチューブにダウン7-10回、それをピペッティングにより細胞懸濁液を混ぜます。
    2. 細胞は、( 例えば 、特定の真菌の胞子)着色されている場合は、染色手順を実行しないでください。細胞染色が必要な場合、関心対象の細胞の顕微鏡的検出に適した色素で細胞懸濁液を希釈する。31
    3. カバースリップとhemocytomを清掃してくださいエタノールで計。少し湿らせ、血球計数器にカバースリップを貼ります。
    4. 慎重にピペットの先端でカバースリップの端をタッチし、毛管作用によってチャンバを充填することにより、両方の血球計数器室への細胞懸濁液の約8μLをロードします。オーバー/下室を埋めないでください。
    5. 400X倍率(接眼レンズ、対物と10Xで40倍)で、顕微鏡下でそれらを表示することにより、細胞の数を決定します。 9つの正方形のx 1 1ミリメートル2を測定し、3×3の格子状に配置が見られるべきです。グリッドの四隅の正方形のいずれかを、顕微鏡の焦点を合わせる(より高い倍率を使用することができます)。 1×1ミリメートル2の正方形は16小さい正方形を含むべきです。
    6. 4 1×1ミリメートル2コーナーの正方形で、同様に3×3のグリッドの中央の正方形のすべてのセルを数えます。カウントする多すぎるまたは少なすぎるセルがある場合、(必要に応じて元の細胞懸濁液を濃縮又は希釈のいずれかの手順を繰り返し15-50細胞)を選抜1ミリメートル2の面積を重ねる必要があります。
    7. 細胞から標準的な細胞懸濁液OD0中の細胞(細胞ミリリットル-1)の濃度を計算し、次のように5カウント正方形にわたって平均回数:細胞数ミリリットル-1 =平均細胞数の二乗-1希釈ファクター10 4。
  3. DNA抽出効率の評価
    1. 表2Aによると9滅菌0.5ミリリットルチューブを準備します。
    2. 約10 7細胞ミリリットルを含有することが-120μlの(OD1)の総体積で標準細胞溶液(OD0)を希釈します。
    3. OD2-OD8と素管、OD9に20μLをチューブに無菌ヌクレアーゼフリーPCRグレードの水(NFW)の18μLを加えます。
    4. OD2にOD1から細胞溶液2μLを移します。ピペットを穏やかに混合し、OD3にチューブOD2から2μLを転送します。 OにOD8を最大管に沿って同様の方法で細胞を希釈し、チューブを含む続けます10 7 -10 0細胞mlの連続希釈をbtain -1。
    5. 円形の流れと生物学的なキャビネットでは、消毒1.12センチメートル直径のコルクボーラーを使用して、クリーン、プレ焼きフィルタの18円形の部分をカット。滅菌ペトリ皿にペアでフィルタを配置します。
    6. 各スタンダードセルの濃度に相当する1フィルタ対が存在するように、対のフィルタのそれぞれにOD8にし、素管OD9から希釈液OD1から10μLをスパイク。
    7. ボンネットの下に開いたペトリ皿のままにして、30分間、それらを乾燥させます。
    8. 滅菌スクリュートップ2ミリリットルチューブに各フィルタピースを置き、セクション3.4で詳述した手順に従ってDNAを抽出します。
  4. 実験とスパイクフィルタからのDNA抽出
    注:フィルタからのDNA抽出のために、以下の変更を加え、製造業者のプロトコルに従って、土壌からのDNA抽出のために設計された市販のキットを使用します。
    1. 各フィルのためのターサンプル(OD1-OD8)、0.5ミリリットル滅菌チューブに酸洗浄ガラスビーズの混合物を準備します。 ≤106ミクロンの直径を有する425から600ミクロンと0.3グラムのビーズの直径が0.1グラムのビーズを使用してください。
    2. 円形の流れと生物学的なキャビネットでは、消毒1.12センチメートル直径のコルクボーラーを使用して、各フィルタのサンプルにランダムに選択された位置から3の円形の部分をカットし、スクリュートップ2ミリリットルチューブに配置します。
    3. チューブにガラスビーズ混合物を追加します。
    4. 製造業者のプロトコルに指示された量で、生物学的なキャビネット内に各チューブに抽出キットに付属の細胞溶解バッファーを追加します。
    5. 氷のバケツを用意し、機械的にビーズビーターを使用して細胞を破壊。
    6. 1分間ビーズを破って、その後、1分間氷の上に置きます。 5回繰り返します。
    7. ポスト溶解工程からのキットの供給元のプロトコールに進みます。
    8. 供給された溶出緩衝液で溶出した後(10 mMトリスbを含んでいますuffer)またはNFWは、DNAの収量を向上させるために再びカラムに通して溶出された試料をリロードします。
      注:DNA抽出と同じ日に分析されていない場合、サンプルは分析まで-20℃で保存することができます。
1 "スタイル="高さ:21px; "> Dd0から
スタンダードセルの希釈系列のA-準備
チューブ最終細胞濃度(細胞ml -1の) 標準的な細胞容積(ミリリットル) ヌクレアーゼを含まない水の量(ミリリットル) 総容量(ミリリットル)
OD0 裾に決定カウント室ocytometer
OD1 10 7細胞mlの範囲に溶出されるべきである-1 20
OD2 10 -1 OD1 OD1の2 18 20
OD3 10 -2 OD1 OD2の2 18 20
OD4 10 -3 OD1 OD3の2 18 20
OD5 10 -4 OD1 OD4の2 18 20
Od6 10 -5 OD1 OD5の2 18 20
OD7 10 -6 OD1 Od6の2 18 20
OD8 10 -7 OD1 OD7の2 18 20
ブランク 0 0 20 20
DNA標準曲線のB-準備
チューブ最終DNA濃度(mgをミリリットル-1) 標準的なDNAの量(ml)をヌクレアーゼを含まない水の量(ミリリットル) 総容量(ミリリットル)
光度計で決定
DD1 10 の1mg mlの範囲に溶出されるべきである-1 20
DD2 10 -1 DD1 DD1の2 18 20
DD3 10 -2 DD1 DD2の2 18 20
DD4 10 -3 DD1 DD3の2 18 20
DD5 10 -4 DD1 DD4の2 18 20
DD6 10 -5 DD1 DD5の2 18 20
DD7 10 -6 DD1 DD6の2 18 20
DD8 10 -7 DD1 DD7の2 18 20
ブランク 0 0 20 20

表2:標準的な細胞体積、NFWボリューム、および各希釈チューブ中の総容積の詳細なDNA標準曲線標準微生物細胞の希釈系列(A)。標準的なDNA量、NFWボリューム、および各希釈チューブ中の総容積の詳細なDNA標準曲線調製物(B)。

  1. DNA標準曲線の準備ステップ3.4で実験的なフィルタについて記載したのと同じ手順を使用して、目的の微生物(Dd0から)の標準試料から直接DNAを抽出します。
  2. 260nmでの標準DNAサンプル(Dd0から)のDNA濃度を決定するために、分光光度計を使用してください。
  3. 表2Bに示されるように、DNAの標準曲線を作成するためにどのから9の滅菌0.5 mlチューブを準備します。
  4. 必要に応じて、全量20μlに1-10μgのml -1の第1チューブ(DD1)中の濃度範囲内に標準DNA溶液Dd0からを希釈。
  5. ブランクチューブにDD2-DD8と20μLをチューブにNFWの18μLを加えます。
  6. DD2にDD1からの標準DNA溶液の2μLを移します。ピペットは、穏やかに混合した後、DD3にDD2から2μLを転送します。 10 0 -10の連続希釈を達成するために、チューブに沿って同様の方法でDNAを希釈-7チューブDD2-DD8で一緒に素管containiを続行NGのみNFW。
    注:分析まで-20℃で、抽出の同じ日に店のサンプルを分析していない場合。
  • 定量-PCR分析
    1. ウォームアップするために、事前にQ-PCR装置のスイッチをオンにします。
    2. 新しいプログラムファイルには、Q-PCRの詳細を挿入し、表3に詳述されるように、機器-動作するソフトウェアで実行されます。
      注:さまざまな楽器は、各熱サイクルの段階ごとに異なる​​最適なタイミングを持っています。この入力は、機器の取扱説明書で指定されています。
    3. 表面DNA-除染剤のみ滅菌チューブ、ヒント、および試薬との仕事で作業面を消毒。
    4. 次の作業台に氷のバケツを準備します。氷の上でストアのTaqポリメラーゼミックス。
    5. プレートに占有される反応ウェルの合計数を計算します。余分な反応のための理論上の引当金(5%)を作成し、合計reactioを計算するために、反応体積あたりにより反応の拡大数を掛けn個のボリューム。
    6. NFW、プライマー、プローブ、最後にTaqポリメラーゼミックスから出発して、反応混合プールを準備します。 表4中の混合プールのボリュームの計算の例を参照してください。
    7. 使用するまで暗所で、氷上で反応ミックスを保管してください。
    8. 三重でのQ-PCRマイクロプレートのウェルの内部標準DNA、サンプルDNA、またはNFW(陰性対照として)の1μLを置きます。
    9. プレートは、作業面に触れることを防ぐために、クリーンに保つためにプレートホルダーであることを確認してください。
    10. 各反応ウェルに混合プール( 表4)の9μLを加えます。
    11. 光学接着フィルムでプレートをカバーし、すべての側面からしっかりとそれを封印。
    12. Q-PCR装置に置く前に、千×gで1分間プレートバケットと遠心機にプレートをスピンダウン。
    13. 機器にプレートを置き、実行中のプログラムを活性化させます。
  • パラメーター 細部 注釈
    検出方法定量的な加水分解プローブ
    サーマルサイクリング条件
    初期変性および酵素活性化 10分間、95°C
    変性 15秒間95°C 45回繰り返し
    アニーリングおよび伸長 60秒間60℃、
    板アレイ
    標準曲線 DD1 - DD8 トップ3行で1-8ウェル中の希釈あたり3リピート
    非テンプレートコントロール(NTC) ヌクレアーゼを含まない水(NFW) よく上部の9 番目の3リピート3行。
    分析されたサンプルフィルターから抽出したDNA 残りのウェルでのサンプルあたり3を繰り返します。
    プライマーセット各ウェルあたり
    試料容量 10ミリリットル

    表3:Q-PCRプログラムファイルに入力される分析パラメータのQ-PCRのオペレーティングソフトウェアのための詳細詳細。

    試薬 反応あたりの容量(ml) 反応数 エラーのための引当金(5%) トータルボリュームミックス(ミリリットル)
    Taqポリメラーゼミックス 5 50 52.5 262.5
    Fプライマー(10ミリモル) 0.5 50 52.5 26.25
    Rプライマー(10ミリモル) 0.5 50 52.5 26.25
    ヌクレアーゼを含まない水 3 50 52.5 157.5
    DNA - 1ミリリットルは96プレート中の標的ウェルに直接追加されます。

    表4:定量的-PCR反応ミックス計算反応あたり巻、反応の数、誤差の許容値、および合計計算されたボリューム試薬あたりの反応ミックスに追加するには、詳細です。

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    Representative Results

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    それは、「オフライン」サンプリングフィルタの解析を用いた大気エアロゾルを勉強するのが一般的である( 図2を参照)。32化学をサンプリング問題、有機( 例えば、タンパク質、炭化水素分子、糖類)と無機( 例えば 、金属、塩)を含むコンテンツの分析。生物学的分析は、生存および非生存微生物コンテンツ、DNAのアプローチや顕微鏡を用いて種の同定、ならびにDNAに基づく定量化が含まれます。

    図2
    図2: ファイラー検体分析 フローチャート空気サンプリング(A)の後にフィルタ、下流分析(B)、およびサンプル成分(C)の分析のためのフィルターの調製

    E = "1">内毒素抽出、フィルタサブサンプル(1.12 cm 2で )、室温で60分間、1mlのPFWで振盪します。次いで、試料を375×gで10分間遠心分離します。異なる遠心分離速度は、 図3Aに示されるように、別の抽出効率をもたらすことができます。

    抽出効率のための予備試験を実施し、特定の選択したフィルタおよびプロトコルのために行われるべきです。 図3Bに、より高い抽出効率は、サンプリングされた水晶フィルタに比べてきれいなスパイクから得られ、これらの効率の両方を標準溶液の直接検出を介して達成されるものよりも低いです。他の場所で議論したように、フィルターでサンプル周囲のエアロゾルの性質はまた、エンドトキシンの抽出効率に影響を与えることができる。14,33

    g3.jpg "/>
    3: エンドトキシン抽出効率エンドトキシン抽出効率の遠心分離速度(A)及びフィルタ荷重(B)の効果エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    エンドトキシン標準品、サンプル抽出エンドトキシン、または空白にLAL試薬の1:1の比率エンドトキシン検出のための反応は、1を伴います。サンプル分析のための三連を使用することをお勧めします。しかし、標準曲線のために、重複が十分です。 (405nmでの)吸収の読みが完了すると、結果として得られる光学密度(OD)は、データのさらなる分析のためのデータ解析表計算プログラムにそれをエクスポートした後に分析されています。

    エンドトキシン抽出のように、特定の実験条件下でのDNA抽出効率の予備的な分析を行うことが重要です。これは、上述のDNA抽出プロトコールに従って、フィルタから切断片に標準生物細胞溶液の既知量をスパイクすることによって行われます。

    サンプリングされたエアロゾルから抽出された標的微生物の濃度は、Q-PCRを用いて決定されます。こちらの鋳型DNAに結合した追加のプローブの、高い特異性の利点を有するプローブ法が使用される加水分解、35 SYBR緑の方法も、この目的のために適用することができます。

    較正曲線は、上述の抽出方法を用いて、関心のある選択された生物から抽出されたDNAに由来します。 DNAサンプル、標準、または対照を除いた反応化合物の混合プールを、調製し、必要になるまで暗所で、氷上で維持されます。その後、混合プールのアリコートを、96マイクロウェル光学プレートの各ウェルに追加されます。 DNAの標準、サンプル、またはコントロールが板アレイに従って反応ミックスの後に追加されます。すべての試薬はプレートに挿入された後、それは海です光学接着剤フィルムを導き、ウェルの底にすべての液滴を収集するためにスピンダウン。プレートは、熱サイクル増幅およびシグナル検出のためのQ-P​​CR計器に挿入さ以下です。

    出力データは、増幅されたDNAの量が閾値レベルに達するサイクル数として定義されているPCRのCt値からなります。較正曲線値を使用して、標的DNAの濃度は、( 図4参照 )を得ることができる。36、微生物の細胞濃度は、標準的な生体液の血球計カウントと比較して抽出効率のCt値から計算することができる。37

    図4
    4: 定量的-PCR増幅プロット (A)とセイ-4 10×2の間-2×10 2(B)の範囲のイオン曲線は、代表的なグラム陰性細菌DNAに対して行う。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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    この作品は、フィルター上に採取したエアロゾル試料中のエンドトキシンおよび存在するDNAの両方を定量化するための抽出および検出方法について説明します。方法は、正確なルーチンを必要とし、限り実験者は、ここで説明するいくつかの本質的で重要なポイントに付着するように容易に行うことができます。

    エンドトキシン検出ステップでは、ライセート溶液は非常に粘性であり、ピペッティングの際に泡を生成する傾向があることに注意してください。あなたが泡除去することは困難である、と彼らは、マイクロプレートリーダー値に変化をもたらします。したがって、まず、プレートにのみ、すべての泡が消えていることを確認した後、サンプルを配置ライセート溶液の添加を継続することが重要です。この段階で気泡形成を防止するための有用な技術をピペットでゆっくりと動作するように、ウェルへの溶解液を排出する際にすべての方法、それを押すことではありません。溶解物をendotoに追加されると即座に反応が開始されるようにXIN抽出物は、できるだけ早く読み取りを開始することが不可欠です。溶解物添加工程を短縮するため、マルチチャネルピペットを使用することができます。それは、マイクロタイタープレートに入れた後、いくつかのキットおよびプロトコルで10分間、37℃でのサンプルの追加のプレインキュベーション工程があることに注意してください。29のみ、このステップの後、溶解物を添加することができます。

    エンドトキシンの環境サンプル抽出のための重要な点は、(高汚染空気試料中などで )試料中の阻害剤の存在です。この場合、希釈は重要となり、誤った拡張を防ぐことができ、典型的には非希釈サンプルを観察した。38

    同様に、Q-PCR検出の成功と信頼性を確保するための重要な点がいくつかあります。溶液の体積が非常に小さくなるように、それらはウェルの底部に配置されていない場合1)、DNAドロップ中の水分が蒸発whilによって低減することができ電子板にサンプルを配置します。この問題を防ぐウェルの底部のDNAサンプルを置き、氷又は他の冷却プラットホーム上に置くことによって、プレートを冷却し、可能な限り、この手順を早めるために、事前にすべてのものを調製しました。 Q-PCR反応混合物( 表4)を調製する場合2)、光劣化を防止するためにアルミホイルでチューブをカバーします。 3)今回の実験は、10μlの反応の調製を記載します。それにもかかわらず、いくつかのQ-PCR機器において、反応体積は20μlであり、各試薬の量は、それに応じて乗算されます。 4)最適な熱サイクル条件は、異なるプライマーおよびポリメラーゼミックスのために変更することができる。例えば39、アニーリング温度は、プライマーの融解温度付近に設定する必要があり、増幅が最も効率的に起こる温度として経験的に決定されます。この理由のために、各分析Q-PCRのための検量線を作成することも重要ですプレートは、定量化が正確であることを確認します。検量線だけでなく、標準的なスパイクフィルタは全く阻害が発生しないことを確実にするために、ポジティブコントロールとしても機能します。阻害を回避するために、環境サンプルから阻害剤を除去するように設計された抽出キットを使用することをお勧めします。 5)この実験における熱サイクルの数は、フィルタの抽出物からのDNAの濃度は非常に低かったように感度を高めるために、最大数、45に設定しました。 6)すべてのDNAサンプルのしきい値(Cτ)値へのサイクルは、検量線のダイナミックレンジ内にあることを確認してください。また、陰性対照試料の任意の増幅は、DNAサンプルのそれよりも少なくとも8サイクル大きいことを確認してください。 7)SYBRグリーン試薬を扱う場合は、反応当たりない複数の融解温度ピークがないことを確認します。

    比濁テストでは、2エンドトキシン定量法が用意されています。運動の方法とendpoi発色法をNT。動力学的なアプローチでは、このプロトコルで実行されるように、サンプルに必要な時間は、最大吸光度が測定される到達します。ここでは、より短い反応区間は、試料中のより高いエンドトキシン濃度を示します。エンドポイント色素形成方法では、光吸収はエンドトキシン濃度を決定するために定義されたインキュベーション時間後に測定されます。どちらの方法でも、定量化のための標準検量線を必要とします。40

    上述した内毒素抽出の精度と精度が非常に高いが、14の取り出し効率を向上させることができました。フィルタの異なるタイプまたは抽出手順に(例えば、ポリソルベート20など)、界面活性剤の添加は、フィルタから抽出されたエンドトキシンの収率を向上させることが可能です。エンドトキシンの抽出効率は、フィルタに並列にサンプリング異なる粒子によって影響を受けることができる。私たちの実験のために33、検出方法の限界は0.001 EU Mは-3であると推定される。14

    Q-PCRの代替として働くことができるDNA抽出物を定量化するための技術は、クローニングアプローチとデジタル滴PCR(DD-PCR)が挙げられます。種の同定のためのクローニングアプローチ上のQ-PCRの利点は、その高い感度であり、それは最初の増幅段階のためのより低いDNA濃度を必要とすること。また、労働集約的で時間がかかるQ-PCR、クローニング方法とは異なり、定量的ではありません。 DNA抽出物の定量のための別の方法は、DD-PCRである。19この技術の利点は、検出は、各小滴内の単一のDNA株に基づいているように、それは、検量線を必要としないことです。しかし、環境試料のために、信頼できる方法は、フィルターから抽出したDNAの液滴検出のために、これまで存在しません。

    DNAは、FR抽出される効率OMフィルタ、ならびにDNAの測定の正確さ及び精度は、したがって、先行のサンプル分析に定義する必要があり、このようなフィルタタイプ、標的微生物、および器具。34,41のような要因によって影響され得ます。我々の実験では、検出限界は3.5ゲノムメートルにまで達することができ-3。14

    結論として、ここで説明する方法は、人為起源と自然の両方のソースからの空気サンプリング生物種の同定および定量に適用可能です。適切なアッセイの正確な使用は、複雑な環境問題の貴重な調査を行うことを可能にします。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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    References

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    エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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