エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
屋外のエアロゾル研究は、一般的にフィルターにサンプリングされた粒子状物質を使用しています。この手順では、収集された粒子の様々な特徴付けは、並列に実行されることを可能にします。ここで提示された方法の目的は、フィルターから抽出したバイオエアロゾルのエンドトキシンとDNA含有量の高精度で信頼性の高い分析を得ることです。サンプリングされたフィルタのようなリポ多糖類のような高分子量の有機分子の抽出は、発熱物質を含まない水ベースの培地中で試料を振盪することを含みます。その後の分析は、濁度測定を用いて検出することができる酵素反応に基づいています。サンプリングされたフィルタの高い有機含有量の結果として、試料からのDNAの抽出は、元々の土壌のために設計され、DNAの収量を改善するために変更された市販のDNA抽出キットを用いて行われます。定量的ポリメラーゼ連鎖をReactiを使用して、特定の微生物種の検出および定量（Q-PCR）分析に説明し、他の利用可能な方法と比較されます。
Introduction
フィルター上の空気サンプリングは、大気エアロゾル研究の基本的なツールである。1サンプリングフィルタは、様々な化学的、物理的、および収集した周囲の粒子の生物学的特徴付けのための出発点です。2-11このアプローチの利点は、様々な分析ができることです同じサンプルでオフラインで実行。たとえば、12,13は大気科学に複雑な問題を解決するために集められた粒子と助剤の特性を十分に理解を得るために、研究者を可能にするすべての異なる分析からのデータをコンパイル、同じ時に撮影した海洋と内陸空気サンプル期間がこの研究のためにサンプリングされた粒子の毒性及び生物学的組成物。14に対して比較することができる、リポ多糖（LPS）、また内毒素としても知られているグラム陰性細菌の細胞壁の構成要素は、海岸オンとでサンプリングフィルタから抽出しました。内陸部位、および使用して評価しました。カブトガニアメーバ様細胞溶解液（LAL）試験。並行して、ゲノム細菌のコンテンツの評価（総細菌、グラム陰性、およびシアノバクテリア）が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）を使用して同じサンプルについて行きました。 LAL試験はエンドトキシンを含有する水溶液に、カブトガニ、 カブトガニからのアメーバ様細胞の水性抽出物の添加後に形成された濁度の測定値に基づいています。試料中のエンドトキシン濃度を、高速濁度が発生高い。15、Q-PCR分析は、特定のDNA断片が増幅されるように放出された蛍光信号に基づいている。16個の信号のリアルタイムモニタリングによりPCRの対数期の間の反応および標準曲線を用いて較正し、初期DNA量を定量することができます。これら二つの組み合わせは、他の場所で詳述されるように、14は、エンドトキシンとのレベルの良好な推定を提供することができ、他の人と一緒に分析しますサンプルソースの細菌の量。
ここで提示された方法の目的は、フィルターから抽出したバイオエアロゾルのエンドトキシンとDNA含有量の高精度で信頼性の高い分析を得ることです。エアロゾルの物理的および無機化学的特性をサンプリングするための方法はよく知られており、最近では、方法は、その有機物成分を調査するために開発されてきたが、17エアロゾルの生物学的成分に乏しい研究があった。18根拠電流のこの方法は、具体的に、抽出分析、及び空気中のエアロゾルの生物学的部分を同定するための強力な方法を提示することによって、このギャップを解決することである。14
ここでの詳細な方法は、フィルタの分析を含む生物学的な屋内と屋外のエアロゾル研究プロジェクトに広範な用途を見出すことが期待される。20-24
Protocol
注：このプロトコルで使用されるすべての材料および機器の詳細なリストは、材料のセクションに示されています。 フィルタ1.エアサンプリングフィルタの作製大量のサンプリングについては、20.3 X 25.4センチメートル2のフィルタを使用しています。該当する場合は、ここで1。、最高の研究の必要性だけでなく、フィルターのカットオフサ?…
Representative Results
それは、「オフライン」サンプリングフィルタの解析を用いた大気エアロゾルを勉強するのが一般的である（ 図2を参照）。32化学をサンプリング問題、有機（ 例えば、タンパク質、炭化水素分子、糖類）と無機（ 例えば 、金属、塩）を含むコンテンツの分析。生物学的分析は、生存および非生存微生物コンテンツ、DNAのアプロー?…
Discussion
この作品は、フィルター上に採取したエアロゾル試料中のエンドトキシンおよび存在するDNAの両方を定量化するための抽出および検出方法について説明します。方法は、正確なルーチンを必要とし、限り実験者は、ここで説明するいくつかの本質的で重要なポイントに付着するように容易に行うことができます。
エンドトキシン検出ステップでは、ライセート溶液は非?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
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Cite This Article
Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).