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독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

야외 에어로졸 연구는 일반적으로 필터에 샘플링 된 입자상 물질을 사용합니다. 이 절차는 수집 된 입자의 다양한 특성 분석이 병렬로 수행 될 수있다. 여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 샘플링 필터와 리포 폴리 사카 라이드와 같은 고 분자량의 유기 분자의 추출은 발열원이없는 수성 매질에서 샘플을 진동하는 것을 포함한다. 후속 분석을 혼탁도 측정을 이용하여 검출 할 수 효소 반응에 기초한다. 샘플링 필터에 대한 높은 유기 함량의 결과로서, 샘플의 DNA의 추출은 원래의 토양에 대한 설계 DNA 수율을 개선하기 위해 수정 된 상업적인 DNA 추출 키트를 사용하여 수행된다. 검출 및 정량 중합 효소 연쇄를 Reacti를 이용하여 특정 종의 미생물 정량(Q-PCR) 분석 기술 및 사용 가능한 다른 방법과 비교된다.

Introduction

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필터에 공기 샘플링 대기 에어로졸 연구에서 기본적인 도구이다. 샘플링 필터는 다양한 화학적, 물리적, 및 수집 된 주변 입자의 생물학적 특성화를위한 시작점이다. 2-11이 방법의 장점은 여러 가지 분석 될 수 있다는 동일한 샘플에 오프라인으로 수행. 연구원을 모든 다른 분석에서 데이터를 가능하게 컴파일하면 대기 과학 분야의 복잡한 문제 해결에 수집 된 입자와 보조기구의 특성을 잘 이해를 얻을. 12, 13 예를 들어, 해양 및 내륙 공기 샘플은 같은 기간 동안 촬영 기간이 연구 샘플링 입자 독성 생물 조성물. (14)에 대해 비교 될 수 있으며, 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), 또한 내 독소라고도 그람 음성 박테리아 세포 벽의 성분은 육상과 샘플링 필터로부터 추출 된 내륙 사이트 및 사용하여 평가 하였다물러 amebocyte 용 해물 (LAL) 테스트. 병행하여, 박테리아 게놈 콘텐츠 평가 (총 세균, 그램 네거티브 및 시아 노 박테리아) 정량 중합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 사용하여 동일한 샘플상에서 수행 하였다. LAL 시험 독소를 함유하는 수용액에, 참게, 물러의 polyphemus에서 amebocytes의 수성 추출물을 첨가 한 다음에 형성 탁도 측정에 기초한다. 샘플에서 높은 내 독소 농도는 빠른 탁도 발생한다. 15 Q-PCR 분석은 특정한 DNA 단편을 증폭으로 방출 형광 신호에 기초한다. (16) 신호의 실시간 모니터링함으로써 PCR의 지수 단계 표준 곡선과의 반응 및 교정은 초기 DNA 량을 정량 할 수있다. 이 두 가지의 조합은 다른 설명 된대로, 14 및 독소의 레벨의 양호한 추정을 제공 할 수있는 다른 사람들과 함께 분석샘플 소스 박테리아의 양.

여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 에어로졸의 물리적 및 무기 화학 특성을 샘플링하는 방법은,보다 최근에 방법이 그 유기물 성분을 조사하기 위해 개발 된 공지되어 있지만,도 17은 에어로졸의 생물학적 성분에 부족한 연구되고있다. (18)는 현재의 근거 방법은 구체적으로, 추출 분석 및 공기 에어로졸 생물학적 부분을 식별하기위한 강력한 방법을 제공함으로써이 갭을 해결하는 것이다. (14)

여기에 설명 된 방법은 필터의 분석을 포함하는 생물학적 실내 및 실외 에어로졸 연구 프로젝트에 대폭적인 사용을 찾을 것으로 예상된다. 20-24

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Protocol

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참고 : 모든 재료와이 프로토콜에 사용되는 악기의 자세한 목록은 자료 섹션에 표시됩니다.

필터 1. 에어 샘플링

  1. 필터의 제조
    1. 높은 볼륨 샘플링의 경우, 20.3 X 25.4 cm (2) 필터를 사용합니다. 가장 연구 요구에 적합한 필터의 특정 유형뿐만 아니라, 필터 컷오프 크기가 적용되는 경우를 선택한다. (1) 여기서 사용 석영 마이크로 필터.
    2. 유기 및 생물학적 화합물 샘플링위한 사전 베이킹 필터는 유기 잔류 물을 파괴한다. - 사전 베이킹 필터, 알루미늄 호일에 개별적으로 포장 한 후 적어도 5 시간 동안 450 ° C에서 실험실로 그들을 구워합니다.
    3. 샘플링 할 때까지 -20 ° C에서 구운 필터를 저장합니다.
  2. 악기 취급 및 공기 샘플링
    1. 높은 볼륨 샘플러의 머리에서 청소 잔여 먼지. 깨끗한 종이 잎사귀와 부품을 닦고 자연 건조 사이클로 작업하기 전에에 허용샘플러에 다시 연결 다시.
    2. 에탄올로 필터 카세트를 소독, 장갑과 항상 실험실 코트와 함께 작동합니다.
    3. 클린 필터 카세트 내부에 미리 구운 필터를 배치하고 높은 볼륨 샘플러 설명서에 따라 진행합니다.
    4. 및 알루미늄 포장에 적용 (예를 들어, 비, 먼지 폭풍), 샘플링이 완료 될 때까지 깨끗한 장소에 저장하면 날짜와 비정상적인 기상 조건을 표시합니다.
    5. 샘플링 필터를 수집하고 샘플링 된면이 안쪽으로 향하도록, 반으로 접습니다.
    6. 분석 할 때까지 -20 ℃에서 원래 알루미늄 박 및 저장소 필터 감싸.
      주 : 샘플링 및 분석 간의 시간 지연이 길어 2개월 넘으면, 유기 및 생물학적 물질의 열화를 방지하기 위해 -80 ℃에서 샘플을 저장한다.

2. 독소 분석

참고 : 70 % 에탄올로 작업 표면 소독만 발열 물질이없는 튜브, 팁 및 시약 D 작동합니다. 유리를 사용하는 경우, 30 분 동안 250 ° C, 60 분 동안 200 ℃에서 예열이 요구된다. (25) 클래스 II 바이오 캐비닛 모든 시약을 준비하고 장갑 항상 실험실 코트 작업.

  1. 시약 준비
    1. 사용 직전에 해물을 재수하는 LAL 키트 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. (26) 탭을 부드럽게 유리 병에 병 벽에 남아있는 LAL을 제거 할 수 있습니다. 진공을 깰 조심스럽게 마개를 들어 올립니다. 니들 주사기를 사용하여, 모든 분해물 함량을 재수 거품 형성을 방지하기 위해 부드럽게 혼합 바이알에 발열 물질없는 물 (PFW) 5 mL를 추가한다.
    2. 플라스틱 파라핀 필름과 유리 병을 밀봉하지 않을 때까지 이틀 동안 4 ° C에서 사용 및 저장에. 최대 세 달 동안 -20 ° C에서 남아있는 해물을 저장합니다.
      참고 :이 시약은 한 번만 고정 할 수 있습니다.
    3. 0.5 μ를 포함하는 제어 표준 독소 (CSE)를, 재수; g E. 콜라이, 제조자의 프로토콜에 따라.도 27은 웹 사이트에 지정된 키트 로트 번호를 입력하여 제조사의 웹 사이트 (28)로부터 CSE 바이알에 첨가되는 물의 양을 결정 특정. E.의 최종 농도 (EU 여기서, (10) 유럽 연합 (EU) = 1 NG) 대장균은 유리 병에, 독소 단위로 측정된다. 이 유리 병 Ed0 레이블.
    4. 플라스틱 파라핀 필름 CSE 유리 병을 밀봉하지 않을 경우 최대 4 주 동안 4 ° C에서 사용 및 저장에.
  2. 표준 곡선과 아군 필터 제조
    1. 표에 나타낸 바와 같이 클래스 II 바이오 캐비닛, 중복 독소 희석 시리즈를 제조 CSE (튜브 ED1-Ed11) 또는 아니오 CSE (빈 튜브 만 PFW 함유)의 저하 량을 함유하는 22 발열원이없는 2 ml의 원심 분리 튜브를 준비 1.
    2. 원형 흐름 생물학적 캐비닛에, 소독 1.1을 사용하여 깨끗하고 사전 구운 필터 (22) 원​​형 조각을 잘라 2cm 직경 코르크 구멍 뚫는.
    3. 멸균 배양 접시에 필터 쌍을 배치합니다.
    4. 필터의 대응하는 쌍에 독소 희석 시리즈 Edc에-Ed11의 각 멤버로부터 빈 튜브에서 50 μl의 스파이크.
    5. 30 분 동안 건조 후드 오픈 스파이크 필터를 포함하는 배양 접시를 남겨주세요.
    6. 발열이없는 2 ML 튜브에 각각의 필터 조각을 놓습니다.
">
튜브 최종 독소 농도 (EU ml의 1) 표준 독소의 양 (㎖) 발열 무료 물의 양 (㎖) 총 부피 (㎖)
Ed0 2,500 원액 * (5)
ED1 1,000 80 (Ed0에서) (120) (200)
ED2 (100) 20 (ED1에서) (180) (200)
ED3 (50) 10 (ED1에서) (190) (200)
ED4 (25) 5 (ED1에서) 195 (200)
Ed5 12.5 2.5 (ED1에서) 197.5 (200)
Ed6 6.25 1.25 (ED1에서) 198.75 (200)
Ed7 3.125 6.25 (Edc에에서) 193.75 (200)
Ed8 1.563 6.25 (ED3에서) 193.75 (200)
Ed9 0.781 6.25 (ED4에서) 193.75 (200)
Ed10 0.391 6.25 (Ed5에서) 193.75 (200)
Ed11 0.195 6.25 (Ed6에서) 193.75 (200)
공백 0 0 (200) (200)

표 1. 엔도톡신 표준 곡선 엔도톡신 농도는 표준 독소 및 발열원이없는 물 부피 추가되는, 얻어진 총 부피는 검량선의 각 희석 튜브에 대한 상세이다.

  1. 실험과 아군 필터에서 독소 추출
    1. 원형 흐름 생물학적 캐비닛 무 발열원 2 (단계 2.2)에서 아군 표준 필터와 함께 소독 1.12 cm 직경 코르크 송곳을 사용하여, 그 배치의 원형 조각으로한다 (단계 1.2) 샘플 필터를 잘라 ml의 튜브 (즉, 샘플 튜브).
    2. 튜브에 1 ㎖의 PFW 추가 검사실 쉐이커를 사용하여 실온에서 60 분 동안을 흔들어.
    3. 10 분 동안 375 XG에의 microcentrifuge에서 샘플 튜브를 원심 분리기. (29)
    4. 전송 일새로운 발열원이없는 2 ml의 튜브에, 독소가 포함 E 상등액.
  2. 물러 Amebocyte 해물 (LAL) 테스트
    1. 평평한 바닥 뚜껑 무 발열원 96 웰 마이크로 플레이트에 LAL 시험을 행하여 시료 엔도톡신 농도를 결정한다.
    2. 도 1에 도시 된 바와 같이. 미리 플레이트 배열을 계획마다 실행 플레이트 (100-0.195 EU / ㎖ (2.2 절 참조)의 농도 범위를 포함하므로) 엔도톡신 표준액 Edc에-Ed11로부터 직접 제조 된 표준 곡선을 포함 . 표준 곡선은 우물 행의 1-10과 판의 B를 차지한다. 빈 샘플이 행에 우물 11 ~ 12를 따로 설정 (네 공백 총을).
    3. 마이크로 플레이트 리더를 켜고 37 ° C에서 마이크로의 배양을 포함하는 405 nm에서 흡수 측정 한 다음 5 분마다 진동 운동 반응을 프로그래밍합니다. 1.5 시간 동안 18 번 반복합니다.
    4. efficien를 결정CY가있는 독소를 샘플 필터로부터 추출된다 (예., 아군 표준 필터에서 얻어진 샘플) 원래 양만큼 계산 독소 량이 분할 비아 아군.
    5. 또는 아군 필터 추출물 (2.3 절)에서 그 공백의 (단계 2.4.2에서) 표준 독소 솔루션의 50 μl를 배치하여 분석을 시작하거나 실험 샘플 (또한 2.3 절에서) 그 공백, 커버 계획 판 배열 (그림 1) 당 닫있다.
    6. 각각의 잘, 빨리 LAL 용액 50 μl를 추가하고이 판독기에 올려 전에 테이블에 배치하는 동안 부드럽게 수평으로 판을 흔들어.
    7. 플레이트 판독기에서 접시를 놓고 실험 실행을 시작합니다.

그림 1
그림 1 :. 독소 배열 판 전96- 웰 마이크로 플레이트에서 독소 분석 어레이 충분한.

3. 게놈 분석

주 : DNA 추출의 경우, 70 % 에탄올로 작업 표면을 소독 만 멸균 튜브, 조언 및 시약와 함께 작동합니다. DNA의 Q-PCR 분석의 경우, 표면에 DNA-오염 제거제 작업 표면 소독. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 모든 시약을 준비하고 장갑과 항상 실험실 코트와 함께 작동합니다.

  1. DNA 프라이머 및 프로브의 제조
    1. DNA 추출, 어느 순서 (가수 분해 프로브 방법이 적용되는 경우) 프라이머 시판 세트 프로브 또는 프라이머 새로운 프라이머 계산 툴 설계를 사용하여 프로브를 설계하기 이전. 30
    2. 중 10 mM 트리스 - 0.1 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA) (TE 버퍼) 또는 PCR 등급의 물을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 프라이머를 재수.
      참고 : 초기 PCR 프라이머 성을 용해하는 것이 좋습니다긴 시간 동안 유지 때 프라이머 저하를 방지로 낮은 EDTA (0.1 %)과 TE 버퍼 옥토퍼스. PCR 반응을 억제 할 수 EDTA의 양을 줄이기 위해 다음 희석에 대한 PCR 등급 물을 사용합니다.
    3. 분석 할 때까지 -20 ° C에서 50 μL의 분취 또는 멸균 0.5 ml의 튜브 프라이머 및 프로브 100 ㎕ 및 저장을 준비합니다.
  2. 표준 셀 농도 평가 DNA 추출에 앞서
    1. 적절한 크기 원심 튜브에 관심 미생물 종 (튜브 OD0 테이블 2A)의 표준 셀 용액을 준비한다. 작은 구멍과 피펫을 사용하여 튜브에 그것을 피펫 팅에 의해 아래로 7-10 번 세포 현탁액을 섞는다.
    2. 세포 (예를 들어 특정 진균 포자) 컬러 경우 염색 절차를 수행하지 않는다. 세포 염색이 필요한 경우, 관심있는 셀의 검출을위한 미세 적합한 염료의 세포 현탁액을 희석한다. 31
    3. 커버 슬립과 hemocytom를 청소에탄올 라 미터. 적셔과 혈구로 커버 슬립을 부착합니다.
    4. 조심스럽게 피펫 팁 커버 슬립의 가장자리를 터치하고 모세관 작용에 의해 챔버를 충전함으로써 모두 혈구 챔버에 세포 현탁액을 약 8 μL를로드. 이상 / 아래에있는 챔버를 기입하지 마십시오.
    5. 400X 배율 (눈에 객관적이고 10 배에서 40 배)에 현미경을 확인하여 세포의 수를 결정합니다. 나인 사각형 1 개 1 측정 mm의 2, 3 × 3 격자 배열을 볼 수 있습니다. 격자의 네 모서리 사각형 중 하나에 초점 현미경 (배율 이상이 사용될 수있다). 1 × 1mm 2 평방 16 작은 사각형을 포함해야합니다.
    6. 모든 사 1 × 1mm 2 모서리 사각형의 셀뿐만 아니라에서 3 × 3 격자의 중앙 광장을 계산합니다. 카운트가 너무 많거나 너무 적은 셀이있는 경우, 15 (어느 농축 또는 적절한 원래 세포 현탁액을 희석 절차를 반복50 세포) 내서 1mm 2 영역을 오버레이한다.
    7. 다음 셀에서 표준 세포 현탁액 OD0의 셀 (셀 ML-1)의 농도를 계산은 다섯 카운트 제곱 걸쳐 평균화 횟수 : 셀 카운트 용액 -1 = 평균 셀 카운트 제곱 -1 희석 팩터 10 4.
  3. DNA 추출 효율의 평가
    1. 표 2A에 따라 구 멸균 0.5 ml의 튜브를 준비합니다.
    2. 표준 셀 용액 (OD0)을 20 μL (OD1)의 총 부피를 약 10 mL를 107 세포를 포함하도록 희석 -1.
    3. OD2 - Od8와 빈 튜브, Od9 20 μl를 튜브 멸균 뉴 클레아없는 PCR 등급 물 (NFW)의 18 μl를 추가합니다.
    4. 전송로 OD1, OD2에서 세포 용액 2 μL. 피펫 부드럽게 혼합 OD3에 관 OD2에서 2 μl를 전송합니다. O에 Od8을까지 튜브를 따라 동일한 방식으로 세포를 희석 튜브 계속10 7 0 -10 셀 ML의 일련의 희석을 btain -1.
    5. 원형 흐름 생물학적 캐비닛에, 소독 1.12 cm 직경 코르크 구멍 뚫는을 사용하여, 깨끗하고, 사전에 구운 필터 (18) 원형 조각을 잘라. 멸균 배양 접시에 쌍으로 필터를 배치합니다.
    6. 각 표준 세포 농도에 해당하는 하나의 필터 쌍가되도록, 한 쌍의 필터들 각각에 Od8와 빈 튜브에서 희석 Od9 OD1 10 μL 스파이크.
    7. 후드 오픈 페트리 접시를두고 30 분 동안 그들을 건조 할 수 있습니다.
    8. 멸균 나사 상위 2 ML 튜브에 각각의 필터 조각을 놓고 3.4 절에 설명 된 절차에 따라 DNA를 추출한다.
  4. 실험과 아군 필터에서 DNA 추출
    참고 : 필터로부터 DNA 추출을 위해, 다음의 수정을 제조자의 프로토콜에 따라 토양 DNA 추출을 위해 설계된 상업용 키트를 사용한다.
    1. 각 FIL에 대한터 샘플 (OD1 - Od8)를 0.5 ml의 멸균 튜브에 산 세척 유리 구슬의 혼합물을 준비합니다. ≤106 ㎛의 직경이 425-600 ㎛ 내지 0.3 g 비드 직경 0.1 g 비드를 사용한다.
    2. 원형 흐름 생물학적 캐비닛에, 소독 1.12 cm 직경 코르크 구멍 뚫는를 사용하여 각 필터 샘플에 대한 무작위로 선택된 위치에서 세 개의 원형 조각을 절단하고 나사 상위 2 ml의 튜브에 배치합니다.
    3. 튜브에 유리 구슬 혼합물을 추가합니다.
    4. 제조사의 프로토콜에 표시된 양의 생물학적 캐비닛 각 튜브에 추출 키트와 함께 제공 세포 용해 완충액을 추가한다.
    5. 얼음 양동이를 준비하고 기계적으로 비드 비터를 사용하여 세포를 파괴.
    6. 1 분 동안 구슬을 구타 한 후 1 분 동안 얼음에 배치합니다. 다섯 번 반복합니다.
    7. 후 용해 단계에서 키트 공급 업체의 프로토콜을 진행합니다.
    8. 공급 용출 버퍼 용출 후 (10 mM 트리스 B에 포함uffer) 또는 NFW는 DNA 수율을 개선하기 위해 다시 컬럼을 통해 용출 샘플을 다시로드합니다.
      주 : DNA 추출과 동일한 날에 분석되지 않은 경우, 샘플을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
1 "스타일 ="높이 : 21px; "> DD0
표준 셀 희석 시리즈의 A- 준비
튜브 최종 세포 농도 (셀 ML의 -1) 표준 세포 부피 (mL) 중 클레아 무료 물의 양 (㎖) 총 부피 (㎖)
OD0 밑단 결정계산 챔버 ocytometer
OD1 107 셀 ML의 범위로 용출한다 -1 (20)
OD2 10 -1 OD1 OD1 2 (18) (20)
OD3 10-2 OD1 OD2의 2 (18) (20)
Od4 10-3 OD1 OD3 2 (18) (20)
Od5 10-4 OD1 Od4 2 (18) (20)
Od6 10-5 OD1 Od5 2 (18) (20)
Od7 10-6 OD1 Od6 2 (18) (20)
Od8 10-7 OD1 Od7 2 (18) (20)
공백 0 0 (20) (20)
DNA 표준 곡선의 B- 준비
튜브 최종 DNA 농도 (mg의 ml의 1) 표준 DNA 양 (㎖) 클레아 무료 물의 양 (㎖) 총 부피 (㎖)
NanoDrop로 결정
DD1 10 1 밀리그램 (M1)의 범위로 용출한다 -1 (20)
DD2 10 -1 DD1 DD1 2 (18) (20)
DD3 10-2 DD1 DD2 2 (18) (20)
DD4 10-3 DD1 DD3 2 (18) (20)
DD5 10-4 DD1 DD4 2 (18) (20)
Dd6 10-5 DD1 DD5 2 (18) (20)
Dd7 10-6 DD1 Dd6 2 (18) (20)
DD8 10-7 DD1 Dd7 2 (18) (20)
공백 0 0 (20) (20)

표 2. DNA 표준 곡선 표준 셀 볼륨 NFW 부피, 각 희석 튜브에 전량에 대한 구체적인 표준 미생물 세포의 일련의 희석 (A). 표준 DNA 용적 NFW 부피, 각 희석 튜브에 전량에 대한 상세한 DNA 표준 곡선 제제 (B).

  1. DNA 표준 곡선 준비 단계 3.4 실험 필터에 대해 설명한 것과 동일한 절차를 이용하여 관심있는 미생물 (DD0)의 표준 시료로부터 DNA를 추출한다.
  2. 260 nm에서의 표준 DNA 샘플 (DD0)의 DNA 농도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다.
  3. 표 2b에 나타낸 바와 같이, DNA의 표준 곡선을 제조하는 아홉 멸균 0.5 ㎖의 튜브를 준비한다.
  4. 필요한 경우, 20 ㎕의 총 부피의 1-10 μg의 용액 -1 1 튜브 (DD1)의 농도 범위 내에서 표준 DNA 용액 DD0 희석.
  5. DD2-DD8와 빈 튜브에 20 μl를 튜브 NFW 18 μl를 추가합니다.
  6. 전송 DD2에 DD1의 표준 DNA 용액 2 μL. 피펫 부드럽게 섞어 다음 DD3에 DD2에서 2 μl를 전송합니다. 튜브 빈 튜브 containi 함께 10 0 -10 일련의 희석 -7 튜브 DD2-DD8을 달성하기 위해 함께 동일한 방법으로 DNA를 희석 계속NG 만 있을수없는 일이야.
    주 : 분석까지 -20 ° C에서 추출 당일 스토어 샘플을 분석하지 않으면.
  • -PCR 정량 분석
    1. 따뜻하게 사전에 Q-PCR 기기에 전환합니다.
    2. 표 3에 설명 된대로 새 프로그램 파일에서 악기 운영 소프트웨어에서 실행되는 Q-PCR에 대한 세부 정보를 삽입합니다.
      참고 : 다른 장비는 각각의 열 사이클 단계에 대해 서로 다른 최적의 타이밍을 가지고있다. 이 입력은 기기의 설명서에 지정됩니다.
    3. 표면 DNA-오염 제거제와 작업 표면을 소독 만 멸균 튜브, 팁 및 시약와 함께 작동합니다.
    4. 다음 작업 벤치에 얼음 양동이를 준비합니다. 얼음 저장소의 Taq 중합 효소 믹스.
    5. 플레이트 점유 될 반응 웰의 총 수를 계산한다. 추가 반응에 대한 이론적 인 여유 (5 %)를 확인하고 reactio 합계를 계산하는 반응 부피 당 반응의 확대 개수를 곱n 개의 볼륨입니다.
    6. 있을수없는 일이야, 프라이머, 프로브, 그리고 마지막으로 Taq 중합 효소 믹스에서 시작, 반응 혼합 풀을 준비합니다. 표 4의 혼합 풀 볼륨 계산 예를 참조하십시오.
    7. 사용할 때까지 반응 어둠 속에서 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
    8. 삼중의 Q-PCR 마이크로의 우물 내부 (음성 대조군)을 표준 DNA 샘플의 DNA, 또는 NFW 1 μl를 놓습니다.
    9. 플레이트 작업 표면에 접촉을 방지하고 청결을 유지하기 위해 접시 홀더에 있는지 확인하십시오.
    10. 물론 각각의 반응으로 혼합 풀 (표 4)의 9 μl를 추가합니다.
    11. 광학 접착 필름과 판을 덮고 모든면에서 단단히 밀봉.
    12. Q-PCR 장치에 배치하기 전에 1,000 XG에서 1 분 동안 판 버킷과 원심 분리기에 접시를 스핀 다운.
    13. 악기에 접시를 놓고 실행중인 프로그램을 활성화합니다.
  • 매개 변수 세부 코멘트
    검출 방법 양이 가수 분해 프로브
    열 사이클링 조건
    초기 변성 및 효소 활성화 10 분 동안 95 ° C
    변성 15 초 동안 95 ° C 45 번 반복
    어닐링 및 연장 60 초 동안 60 ° C
    플레이트 배열
    표준 곡선 DD1 - DD8 상위 3 행에서 1-8 우물에 희석 당 3 반복
    비 템플릿 컨트롤 (NTC) 뉴 클레아없는 물 (NFW) 3 9의 반복 잘에 가기3 행.
    분석 샘플 DNA 필터에서 추출 나머지 우물에서 샘플 당 3 반복.
    프라이머 세트 각 웰 당
    샘플 량 10 ml의

    표 3 :. Q-PCR 운영 소프트웨어에 대한 자세한 분석 매개 변수의 세부 사항은 Q-PCR 프로그램 파일에 입력합니다.

    시약 반응 당 양 (㎖) 반응의 수 오류에 대한 수당(5 %) 전체 볼륨 믹스 (㎖)
    Taq 중합 효소 믹스 (5) (50) 52.5 262.5
    F 프라이머 (10 밀리미터) 0.5 (50) 52.5 26.25
    R 프라이머 (10 밀리미터) 0.5 (50) 52.5 26.25
    뉴 클레아없는 물 (50) 52.5 157.5
    DNA - 1 ml를 96 판의 대상 우물에 직접 추가됩니다.

    표 4 :. 양적-PCR 반응 혼합 계산 반응에 따라 볼륨, 반응의 수, 허용 오차, 그리고 총 계산 볼륨 시약 당 반응 혼합물에 첨가 될 상세한이다.

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    Representative Results

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    그것은 "오프라인"샘플링 필터를 분석을 사용하여 대기 에어로졸을 학습하는 것이 일반적이다 (도 2 참조). (32) 화학 샘플링없이 유기 (예 : 단백질, 탄화수소 분자 당) 및 무기 (예를 들어 금속 염)을 포함하는 콘텐츠 분석 . 생물학적 분석 가능한 비 생존 미생물 함량 DNA 방법 또는 현미경을 사용하여 종 식별뿐만 아니라 기반 DNA 정량을 포함한다.

    그림 2
    도 2 : 파일러 시료 분석 흐름도 공기 샘플링 (A) 후 필터 하류 분석 (B) 및 샘플 성분 (C) 분석 용 필터의 제조..

    E = "1"> 독소 추출, 필터 부 샘플 (1.12 cm 2)을 실온에서 60 분 동안 1 ml의 PFW에서 진탕된다. 샘플은 375 x g에서 10 분간 원심 분리한다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 다른 원심 분리 속도는, 다른 추출 효율을 초래할 수있다.

    추출 효율을위한 예비 실험을 수행 특정 선택 필터 및 프로토콜을 수행해야한다. 도 3B에서, 더 높은 추출 효율 샘플링 수정 필터와 비교하여 청정 급상승로부터 획득되며, 이들 모두의 효율은 표준 용액의 직접 검출을 통해 달성보다 낮다. 다른 곳에서 논의 된 바와 같이, 필터 주위에서 샘플링 에어로졸의 특성은 또한 내 독소 추출 효율에 영향을 미칠 수있다. 14,33

    g3.jpg "/>
    3 : 엔도톡신 추출 효율 독소 추출 효율의 원심 분리 속도 (A) 및 필터 하중 (B)의 효과.. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    엔도톡신 표준 시료 추출 독소 또는 공백에 LAL 시약 : 1 비율 독소 검출 반응 일을 포함한다. 샘플 분석을 위해 삼중를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 표준 곡선에 대한 중복은 충분하다. (405 nm에서) 흡수 측정이 완료되면, 생성 된 광학 밀도 (OD)는 데이터의 추가 분석을 위해 데이터 분석 스프레드 시트 프로그램으로 보낸 후에 분석된다.

    독소 추출에서, 특정 실험 조건에서 DNA 추출 효율의 예비 분석을 수행하는 것이 중요하다. 이는 전술 한 DNA 추출 프로토콜에 따라 필터로부터 절단 부재에 표준 생물 세포 용액의 양을 공지 급상승하여 이루어진다.

    샘플링 에어로졸 추출 대상의 미생물 농도는 Q-PCR을 사용하여 결정된다. 여기서, 가수 분해 프로브 기법 때문에 주형 DNA에 결합 된 추가적인 프로브의 높은 특이성의 이점을 갖고 사용된다. 35 SYBR 그린 방법은 이러한 목적을 위해 적용 할 수있다.

    교정 곡선은 상기 추출 방법을 사용하여, 관심있는 선택된 생물체로부터 추출 된 DNA로부터 유도된다. DNA 샘플, 표준 또는 컨트롤을 제외한 반응 화합물의 혼합 풀, 제조까지 필요한 어두운 얼음에 보관된다. 이어서, 혼합 된 풀의 분취 액 96 마이크로 웰 광학 플레이트에 각 웰에 첨가한다. DNA 표준 시료 또는 제어 판 배열에있어서, 반응 혼합물 후에 첨가된다. 모든 시약이 판에 삽입 된 후에는 바다입니다광학 접착제 필름 주도 웰의 바닥에 모든 작은 방울을 수집 스핀 다운. 플레이트는 열 사이클 증폭 및 신호 검출을위한 Q-PCR 기기에 삽입보다 길다.

    출력 데이터는 증폭 된 DNA 양이 임계 레벨에 도달하는 사이클 수로 정의된다 코네티컷 PCR 값들로 구성된다. 검량선 값을 이용하여, 타겟 DNA의 농도는 (도 4 참조)를 얻을 수있다. (36) 미생물의 세포 농도는 표준 생체 용액의 혈구 계수에 비해 광 추출 효율의 코네티컷 값으로부터 계산 될 수있다. (37)

    그림 4
    그림 4 : 정량적-PCR 증폭 플롯 (A)calibrat.-4 10 × 2 사이에 -2 × 10 2 (B)가 대표적인 그람 음성 세균의 DNA에 대해 수행에 이르기까지 이온 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

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    이 작품은 필터에 수집 된 에어로졸 샘플에서 독소와 DNA의 존재를 모두 정량 추출 및 검출 방법을 설명합니다. 정확한 방법은 루틴을 필요로 한 실험자 여기서 설명한 몇몇 필수적인 중요한 점 접착 쉽게 수행 될 수있다.

    독소 검출 단계, 파쇄 용액은 매우 점성과 피펫에 버블을 생성하는 경향이 있습니다. 너를 거품 제거하기 곤란하며, 이들은 마이크로 플레이트 리더 값의 변화로 이어질. 따라서, 먼저, 플레이트에만 모든 기포가 사라진 것을 확인한 뒤, 시료를 배치 분해물 용액의 첨가를 계속하는 것이 중요하다. 이 단계에서 기포 형성을 방지하는 유용한 기술 피펫 느리게 작동하고, 웰에 파쇄물을 배출 할 때 모든 방법을 눌러 아니다. 해물이 endoto에 추가되면 반응으로 즉시 시작신화는 가능한 빨리 판독을 시작하는 것이 필수적이며, 추출한다. 분해물 첨가 공정을 단축하기 위해, 멀티 채널 피펫이 사용될 수있다. 이 마이크로 킥킥 웃음 플레이트에 배치 한 후 일부 키트 프로토콜에 10 분 동안 37 ℃에서 샘플의 추가 예비 인큐베이션 단계는가 있습니다. (29)에만이 단계 후에, 용 해물을 첨가 할 수있다.

    독소의 환경 샘플 추출을위한 중요한 점은 (높은 오염 공기 샘플에서 예) 샘플 억제제의 존재이다. 이 경우, 희석 중요하게, 거짓 인핸스 일반적 희석되지 않은 샘플에서 관찰을 방지 할 수있다. (38)

    마찬가지로, Q-PCR 검출의 성공 및 신뢰성을 보장하는 중요한 여러 지점이있다. 이들은 웰의 하부에 배치되지 않는 경우 용액의 부피가 매우 작 같이 1) DNA 강하 수분이 증발 whil 의해 감소​​ 될 수있다전자 접시에 샘플을 배치. 이 문제를 방지 웰의 바닥에 DNA 샘플을 놓고, 얼음 냉각 또는 다른 플랫폼에 배치하여 판을 냉각하고, 가급적이 단계 살리 미리 모두를 제조 하였다. Q-PCR 반응 혼합물 (표 4)를 제조하는 경우 2), 광 열화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 커버. 3) 본 실험은 10 ㎕의 반응의 제조 방법을 설명한다. 그럼에도 불구하고, 일부 Q-PCR 장비에서 반응 부피를 20 μL이고, 각 시약의 부피는 따라서 곱해진다. 4) 최적의 열 사이클 조건은 상이한 프라이머 및 효소 혼합물에 대해 변할 수있다. 예를 들어, 39, 소둔 온도가 프라이머의 융점 부근에서 설정되어야하고, 증폭은 가장 효율적으로 발생되는 온도로서 실험적으로 결정된다. 이 때문에 각각의 Q-PCR 분석을위한 검량선을 작성하는 것도 중요판, 정량화가 정확한지 확인합니다. 교정 곡선뿐만 아니라 표준 아군 필터가 더 억제가 발생하지 않도록, 또한 양성 대조군으로 작용한다. 억제를 미연에 방지하기 위해서는 환경 시료에서 억제제를 제거하도록 설계 추출 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 이 실험에서 열 사이클 5) 수는 최대 수 (45)에 설정된 필터 추출물로부터 DNA 농도로서 감도를 향상시키기 위해 매우 낮았다 하였다. 6) 임계 값에 사이클이 (모든 DNA 샘플에 대한 Cτ) 값은 검정 곡선의 동적 범위 내에 있는지 확인합니다. 또한, 음성 대조군 샘플의 어떠한 증폭 DNA 시료의 것보다 적어도 8 사이클 크다는 것을 보장한다. SYBR 녹색 시약으로 작업하는 경우 7), 반응 당에는 여러 용융 온도 피크가 없는지 확인합니다.

    혼탁 테스트를 위해,이 독소의 정량 방법을 사용할 수 있습니다 운동 방법과 endpoi발색 방법을 NT. 운동 방식에서,이 프로토콜에서 수행되는 바와 같은, 샘플에 필요한 시간은 최대 흡광도 측정에 도달한다. 여기서, 짧은 간격은 반응 시료에서 높은 엔도톡신 농도를 나타낸다. 엔드 발색 방법에있어서, 광 흡수 엔도톡신 농도를 결정하기 위해 정의 된 배양 시간 후에 측정한다. 두 방법 모두 정량 표준 교정 곡선을 필요로한다. (40)

    상기 독소 추출 정밀도 및 정확도가 매우 높지만, 14 광 추출 효율을 향상시킬 수있다. 이 추출 조작을 필터 또는 다른 형태 (예 : 폴리 소르 베이트 20) 세정제의 첨가 필터로부터 추출 된 독소의 수율을 향상시킬 수있다. 독소 추출 효율은 필터에 병렬로 샘플링 다른 입자들에 의해 좌우 될 수있다. 우리의 실험 장치 33,검출 방법의 한계는 0.001 EU의 분 -3 것으로 추정된다. (14)

    Q-PCR에 대한 대안이 될 수있는 DNA 추출물을 정량하기위한 기술은 클로닝 방법, 디지털 액적 PCR (DD-PCR)을 포함한다. 종의 식별을위한 클로닝 방법을 통해 Q-PCR의 장점은 민감도이며 이는 초기 증폭 단계 낮은 DNA 농도를 요구한다는. 또, 노동 집약적이고 시간 소모적 인 Q-PCR, 클로닝하는 방법과 달리, 정량적 아니다. DNA 추출물의 정량 다른 방법은 DD-PCR이다. (19)이 기술의 장점은, 검출 각 액적 단일 DNA의 변형에 기초로이 검량선을 필요로하지 않는다는 것이다. 그러나, 환경 시료에 대해, 더 신뢰할 수있는 방법은 지금까지 필터에서 추출 된 DNA의 액적 감지 존재하지 않습니다.

    DNA는 FR을 추출의 효율성OM 필터뿐만 아니라 DNA 측정의 정확도 및 정밀도는 따라서 전에 시료 분석에 정의되어야 이러한 필터 유형, 대상 미생물 및 계측. 34,41 같은 요인에 의해 영향을받을 수있다. 우리의 실험 설정에서, 검출 한계는 3.5 게놈 미터 -3까지 도달 할 수있다. (14)

    결론적으로, 여기에 설명 된 방법은 인위적 천연 소스 모두 항공 샘플링 생물 종의 식별 및 정량 적용 할 수있다. 적절한 분석의 정확한 사용은 복잡한 환경 문제의 중요한 연구가 수행 될 수 있습니다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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    References

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    독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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