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Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

la investigación de aerosol al aire libre comúnmente utiliza partículas muestreada en los filtros. Este procedimiento permite diversas caracterizaciones de las partículas recogidas que se realizan en paralelo. El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. La extracción de las moléculas de alto peso molecular orgánicos, tales como lipopolisacáridos, de los filtros de la muestra implica agitando la muestra en un medio a base de agua libre de pirógenos. El posterior análisis se basa en una reacción enzimática que puede detectarse utilizando una medición turbidimétrico. Como resultado de la alto contenido orgánico en los filtros en la muestra, la extracción de ADN de las muestras se realiza usando un kit de extracción de ADN comercial que fue diseñado originalmente para suelos y modificado para mejorar el rendimiento de ADN. La detección y cuantificación de especies microbianas específicas utilizando Reacti cadena de la polimerasa cuantitativaen el análisis (q-PCR) se describen y se comparan con otros métodos disponibles.

Introduction

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El muestreo del aire en los filtros es una herramienta básica en la investigación de los aerosoles atmosféricos. 1 Los filtros de la muestra son el punto de partida para diversos productos químicos, físicos y caracterizaciones biológicas de las partículas ambientales recogidos. 2-11 La ventaja de este enfoque es que varios análisis pueden ser realizado fuera de línea en la misma muestra. La compilación de los datos de todos los diferentes análisis permite al investigador para obtener una buena comprensión de las características de las partículas y las ayudas recogidas en la resolución de cuestiones complejas en las ciencias de la atmósfera 12,13. Por ejemplo, los acondicionadores de muestras marinas y continentales tomadas durante el mismo período puede compararse con respecto a la toxicidad de las partículas en la muestra y la composición biológica. 14 para este estudio, los lipopolisacáridos (LPS), componentes de paredes celulares bacterianas gram-negativas, también conocidos como endotoxinas, se extrajeron de los filtros en la muestra en tierra y en un sitio en el interior, y se evaluaron utilizando elamebocitos de Limulus lisado (LAL). En paralelo, una evaluación genómica del contenido bacteriano (total de bacterias, gram negativo, y cianobacterias) se realizó en la misma muestra usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR). La prueba de LAL se basa en mediciones de turbidez formados después de la adición de un extracto acuoso de amebocitos del cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, a una solución acuosa que contiene las endotoxinas. Cuanto mayor sea la concentración de endotoxina en la muestra, la turbidez más rápido se desarrolla. 15 El análisis q-PCR se basa en una señal de fluorescencia emitida como un fragmento de ADN específico se amplifica. 16 Por la monitorización en tiempo real de la señal durante la fase exponencial de la PCR reacción y de calibración con una curva estándar, la cantidad inicial de ADN se pueden cuantificar. La combinación de estos dos análisis junto con otros, como se detalla en otro lugar, 14 puede proporcionar una buena estimación de los niveles de endotoxina y de lacantidad de las bacterias de origen en las muestras.

El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. Si bien los métodos de muestreo de las características físicas y químicas inorgánicas de aerosoles son bien conocidos y, más recientemente, se han desarrollado métodos para investigar su componente de materia orgánica, 17 no ha sido escasa la investigación sobre el componente biológico de aerosoles. 18 La razón de la corriente método consiste en llenar este vacío mediante la presentación en detalle un método robusto para la extracción, el análisis y la identificación de la fracción biológica de los aerosoles en el aire. 14

Se espera que el método detallado aquí para encontrar amplio uso en proyectos de investigación en aerosol interiores y exteriores biológicos que implican análisis de filtro. 20-24

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Protocol

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Nota: Se muestra una lista detallada de todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo en la sección de Materiales.

1. Toma de muestras de aire en los filtros

  1. Preparación de los filtros
    1. Para el muestreo de alto volumen, utilice 20.3 x 25.4 cm 2 filtros. Elegir el tipo específico de filtro que mejor se adapte a las necesidades de investigación, así como el tamaño de corte del filtro, si es aplicable. 1 A continuación, filtros de microfibras de cuarzo uso.
    2. filtros pre-horneado utilizadas para la extracción de compuestos orgánicos y biológicos para destruir los residuos orgánicos. Para pre-hornear los filtros, se envuelven individualmente en papel de aluminio y luego hornear en un horno de laboratorio a 450 ° C durante al menos 5 horas.
    3. Almacenar los filtros horneados a -20 ° C hasta el momento de muestreo.
  2. Manejo de instrumentos y muestreo de aire
    1. polvo residual limpia de la cabeza de la alta de muestras de volumen. Limpiar las piezas con toallitas de papel limpias y permitirles ant-aire secovolver a conectarlos a la toma de muestras.
    2. Desinfectar el marco del filtro con etanol, y trabajar con guantes y una bata de laboratorio en todo momento.
    3. Colocar un filtro de pre-cocida al horno dentro del marco del filtro limpio, y proceder de acuerdo con el manual del muestreador de alto volumen.
    4. Marque la fecha y anormal el clima, en su caso (por ejemplo, lluvia, tormenta de polvo) en la envoltura de aluminio, y guardarlo en un lugar limpio hasta la finalización del muestreo.
    5. Recoger el filtro muestreado y doblar por la mitad, con el lado que mira hacia dentro muestreada.
    6. Envolver el filtro en el papel de aluminio original y se almacena a -20 ° C hasta su análisis.
      Nota: Si el intervalo de tiempo entre el muestreo y el análisis es más de 2 meses, almacenar la muestra a -80 ° C para evitar la degradación de la materia orgánica y biológica.

Análisis 2. La endotoxina

Nota: Desinfectar la superficie de trabajo con 70% de una mezcla de etanold trabajo con tubos libres de pirógenos, consejos y reactivos solamente. Si se utiliza material de vidrio, se requiere pre-calentamiento a 250 ° C durante 30 minutos, o 200 ° C durante 60 min. 25 Preparar todos los reactivos en una cabina de bioseguridad de clase II y trabajar con guantes y una bata de laboratorio en todo momento.

  1. Preparación de los reactivos
    1. Siga el protocolo del fabricante kit LAL para rehidratar el lisado poco antes del uso. 26 golpee suavemente en el vial para desalojar LAL restante en las paredes de la botella. Levantar el tapón con cuidado para romper el vacío. Utilizando una jeringa con aguja, añadir 5 ml de agua libre de pirógenos (PFW) al vial para rehidratar todo el contenido lisado y mezclar suavemente para evitar la formación de espuma.
    2. Sellar el vial con la película de parafina plástico cuando no esté en uso y se almacena a 4 ° C durante un máximo de dos días. Almacenar cualquier lisado restante a -20 ° C durante un máximo de tres meses.
      Nota: Este reactivo se puede congelar una vez.
    3. Rehidratar el control de endotoxina estándar (CSE), que contiene 0,5 μ; g E. coli, de acuerdo con el protocolo del fabricante. 27 Determine la cantidad específica de agua que se añade al vial CSE desde la web del fabricante 28 introduciendo el número de lote del kit, cuando se indican en el sitio web. La concentración final de E. coli en el vial, se mide en unidades de endotoxina (UE; donde 10 EU = 1 ng). Etiqueta este vial ed0.
    4. Sellar el vial CSE con película de parafina plástico cuando no esté en uso y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
  2. La curva estándar y la Preparación-filtro con pinchos
    1. En una cabina de bioseguridad de clase II, se preparan 22 2 ml tubos de centrífuga libres de pirógenos que contienen cantidades decrecientes de CSE (tubos Ed1-ED11) o no CSE (el tubo en blanco que contiene sólo PFW) para producir una serie de diluciones de endotoxina duplicado, como se muestra en la Tabla 1.
    2. En un gabinete biológica con flujo circular, cortar 22 piezas circulares de filtro limpio, pre-cocida al horno utilizando un desinfectada 1.1 2 cm de diámetro perforador de corcho.
    3. Coloque los pares de filtros en placas de Petri estériles.
    4. Pico 50 l de cada miembro de la serie de dilución de endotoxina Ed2-ED11 y desde el tubo en blanco en un par correspondiente de filtros.
    5. Deje las placas de Petri que contienen los filtros de puntas abiertas bajo el capó secar durante 30 min.
    6. Coloque cada pieza de filtro en un tubo de 2 ml libre de pirógenos.
">
Tubo Concentración de endotoxina final (UE ml -1) Volumen endotoxina estándar (ml) Volumen de agua libre de pirógenos (ml) volumen total (ml)
ed0 2,500 solución de reserva* 5
ed1 1000 80 (de ed0) 120 200
Ed2 100 20 (de Ed1) 180 200
ed3 50 10 (de Ed1) 190 200
ed4 25 5 (de Ed1) 195 200
ED5 12.5 2.5 (de Ed1) 197.5 200
ed6 6.25 1.25 (de Ed1) 198.75 200
ed7 3,125 6.25 (de Ed2) 193.75 200
ed8 1.563 6.25 (de Ed3) 193.75 200
ED9 0,781 6.25 (de ED4) 193.75 200
ED10 0,391 6.25 (de ED5) 193.75 200
ED11 0,195 6.25 (de ED6) 193.75 200
Blanco 0 0 200 200

Tabla 1:. La endotoxina curva estándar de concentración de endotoxinas, volumen de endotoxina estándar y de agua libre de pirógenos que se añade, y el volumen total obtenido se detallan para cada tubo de dilución de la curva de calibración.

  1. La extracción de endotoxina de la Experimental y filtros fortificados
    1. En un armario biológico con el flujo circular, corte los filtros de muestra (de la etapa 1.2) en piezas circulares con un 1,12 cm desinfectado perforador de corcho de diámetro, y colocarlos, junto con los filtros estándar de puntas (de la etapa 2.2), en libre de pirógenos 2 tubos ml (es decir, los tubos de muestra).
    2. Añadir 1 ml PFW a los tubos y sacudirlos para 60 min a temperatura ambiente, usando un agitador de laboratorio.
    3. Centrifugar los tubos de muestra en una microcentrífuga a 375 xg durante 10 min. 29
    4. º de transferenciae sobrenadante, que contiene las endotoxinas, en un nuevo tubo 2 ml libre de pirógenos.
  2. Limulus lisado de amebocitos (LAL) Prueba
    1. Determinar la concentración de endotoxina en las muestras mediante la realización de la prueba de LAL en una microplaca de 96 pocillos libre de pirógenos con un fondo plano y una tapa.
    2. Planificar el conjunto de placa de antemano, como se muestra en la Figura 1. Incluir una curva patrón preparada directamente de las soluciones estándar de endotoxina Ed2-ED11 (y por lo tanto, que cubren el rango de concentración de 100-0.195 UE / ml (ver sección 2.2)) en cada placa de correr . La curva estándar debe ocupar los pozos 1-10 de filas A y B de la placa. Ponga a un lado pozos 11-12 en estas filas para muestras en blanco (haciendo un total de cuatro espacios en blanco).
    3. Encender el lector de microplacas y programarlo para una reacción cinética que implica la incubación de la microplaca a 37 ° C y agitando cada 5 min, seguido por mediciones de absorción a 405 nm. Repetir 18 veces durante 1,5 horas.
    4. Determinar la efficiencia con la que las endotoxinas se extraen de los filtros de muestreo (es decir., las muestras obtenidas de los filtros estándar con púas) a través de la división de la cantidad de endotoxina calculada por la cantidad original se dispararon.
    5. Iniciar el ensayo mediante la colocación de 50 l de las soluciones estándar de endotoxina (de la etapa 2.4.2), o del extracto filtro de púas y sus espacios en blanco (de la Sección 2.3), o de las muestras experimentales y sus espacios en blanco (también de la sección 2.3), según el planificada placa matriz (Figura 1) y cierre la cubierta.
    6. A cada pocillo, añadir rápidamente 50 l de solución de LAL, y agitar suavemente la placa horizontalmente mientras se coloca sobre la mesa antes de levantar en el lector.
    7. Colocar la placa en el lector de placas e inicio de la experimentación.

Figura 1
Figura 1:. La endotoxina placa de matriz Un examplio de una matriz de análisis de endotoxina en una microplaca de 96 pocillos.

3. Análisis Genómico

Nota: Para la extracción de ADN, la desinfección de la superficie de trabajo con un 70% de etanol y trabajar con tubos estériles, consejos y reactivos solamente. Para el análisis Q-PCR de ADN, la desinfección de la superficie de trabajo con superficie ADN-descontaminante. Preparar todos los reactivos en una cabina de bioseguridad de clase II y trabajar con guantes y una bata de laboratorio en todo momento.

  1. Preparación de los cebadores de ADN y sondas
    1. Antes de la extracción de ADN, ya sea para un conjunto comercialmente disponible de cebadores y una sonda (si se aplica el método de hidrólisis de la sonda), o diseñar un nuevo conjunto de cebadores y una sonda utilizando el cebador diseño de herramientas computacionales. 30
    2. Rehidratar los cebadores de acuerdo con el protocolo del fabricante usando ácido o bien 10 mM de Tris-0,1 etilendiaminotetraacético mM (EDTA) (tampón TE) o agua de calidad para PCR.
      Nota: Se recomienda disolver el cebador de PCR inicial stock en tampón TE con baja EDTA (0,1%), ya que evita la degradación del cebador cuando se mantienen durante tiempos más largos. Use agua de calidad para PCR para las diluciones posteriores destinadas a reducir las cantidades de EDTA que podrían inhibir las reacciones de PCR.
    3. Preparar alícuotas de 50 l o 100 l del cebador y la sonda en estériles tubos de 0,5 ml y se almacena a -20 ° C hasta su análisis.
  2. Patrón de evaluación Concentración celular antes de la extracción de ADN
    1. En un tubo de centrífuga de tamaño adecuado, preparar una solución de células estándar de las especies microbianas de interés (tubo Od0, Tabla 2A). Mezclar la suspensión celular pipeteando arriba y abajo en el tubo de 7-10 veces con una pipeta con un pequeño orificio.
    2. Si las células son de color (por ejemplo, ciertas esporas de hongos), no realice un procedimiento de tinción. Si se requiere la tinción de células, se diluye la suspensión celular en un colorante adecuado para la detección microscópica de las células de interés. 31
    3. Limpiar la hoja de la cubierta y hemocytometernos con etanol. Humedecer y colocar el cubreobjetos con el hemocitómetro.
    4. Cargar unos 8 l de la suspensión celular en ambas cámaras del hemocitómetro tocando cuidadosamente el borde de la hoja de la cubierta con la punta de la pipeta y el llenado de la cámara por acción capilar. No más / menos llenar la cámara.
    5. Determinar el número de células mediante la visualización de ellos bajo un microscopio a 400 aumentos (40X en el objetivo y 10X en ocular). Nueve cuadrados de 1 x 1 mm 2 y dispuestas en una cuadrícula de 3 x 3 deben ser vistos. Enfocar el microscopio en una de las cuatro esquinas de la rejilla (un aumento mayor se puede utilizar). El 1 x 1 mm 2 cuadrado debe contener 16 cuadrados más pequeños.
    6. Contar todas las células de los cuadrados de las esquinas de cuatro 1 x 1 mm 2, así como en la plaza medio de la red de 3 x 3. Si hay demasiadas o demasiado pocas células para contar, repetir el procedimiento, ya sea concentrar o diluir la suspensión celular original como apropiado (15-50 células deben superponer un singularizar área de 1 mm 2).
    7. Calcular la concentración de las células (células ml-1) en la suspensión celular estándar Od0 de la celda de conteo promedio a través de los cinco cuadrados contados a partir de la siguiente manera: la célula conteo de células ml-1 = media cuadrada recuento -1 Factor de dilución 10 4.
  3. Evaluación de la eficiencia de extracción de ADN
    1. Preparar nueve estériles de 0,5 ml tubos de acuerdo con la Tabla 2A.
    2. Diluir la solución de células estándar (Od0) para contener aproximadamente 10 7 células ml-1 en un volumen total de 20 l (OD1).
    3. Añadir 18 l de agua de calidad para PCR libre de nucleasa estéril (NFW) a los tubos OD2-OD8 y 20 l al tubo en blanco, OD9.
    4. Transferencia de 2 l de la solución de células de øD1 en OD2. Pipeta suavemente para mezclar y transferir 2 l de tubo de OD2 a OD3. Continuar diluyendo las células de la misma manera a lo largo de los tubos hasta e incluyendo el tubo OD8 a obtain una dilución en serie de 10 7 -10 0 células ml -1.
    5. En un armario biológico con el flujo circular, corte 18 piezas circulares de filtro limpio, pre-cocido al horno, utilizando un desinfectada 1,12 cm perforador de corcho diámetro. Colocar los filtros en pares en placas de Petri estériles.
    6. Pico 10 l de diluciones OD1 a OD8 y desde el tubo en blanco OD9 en cada uno de los filtros emparejados, de tal manera que hay un par de filtros que corresponden a cada concentración de células estándar.
    7. Deje las placas de Petri abiertas bajo el capó y dejarlos secar durante 30 minutos.
    8. Coloque cada pieza de filtro en un tubo ml con tapa de rosca 2 estéril y extraer el ADN de acuerdo con el procedimiento detallado en el apartado 3.4.
  4. Extracción de ADN a partir de la experimentación y filtros fortificados
    Nota: Para la extracción de ADN de los filtros, utilizar kits comerciales diseñados para la extracción de ADN de suelo de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones.
    1. Para cada filmuestra ter (OD1-OD8), preparar una mezcla de perlas de vidrio lavados con ácido en un tubo estéril de 0,5 ml. Use 0,1 g perlas que tienen un diámetro de perlas de 425 a 600 micras y 0,3 g con un diámetro de ≤106 m.
    2. En un gabinete biológica con flujo circular, cortar tres piezas circulares de lugares seleccionados al azar en cada muestra utilizando un filtro de 1,12 cm desinfectada barrena de diámetro, y colocarlos en tapa de rosca tubos de 2 ml.
    3. Añadir la mezcla de perlas de vidrio de los tubos.
    4. Añadir el tampón de lisis celular suministrado con el kit de extracción a cada tubo en el armario biológica, con la cantidad indicada en el protocolo del fabricante.
    5. Preparar un cubo de hielo y romper las células mecánicamente usando un batidor de bolas.
    6. Batir las perlas durante 1 min y luego colocarlos en hielo durante 1 min. Repita cinco veces.
    7. Proceder con el protocolo del proveedor kit de la etapa posterior a la lisis.
    8. Después de la elución con el tampón de elución suministrado (contiene 10 mM Tris bUffer) o NFW, volver a cargar la muestra eluida través de la columna de nuevo para mejorar el rendimiento de ADN.
      Nota: Si no se analizaron en el mismo día de la extracción de ADN, las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta su análisis.
1 "style =" height: 21px; "> DD0
A- Preparación de series de dilución estándar de la célula
Tubo La concentración final de células (células ml-1) volumen de células estándar (ml) volumen de agua libre de nucleasa (ml) Volumen total (ml)
Od0 determinar con Hemocytometer cámara de recuento
øD1 debe ser eluida a la gama de 10 7 células ml -1 20
OD2 10 -1 øD1 2 de OD1 18 20
OD3 10 -2 øD1 2 de OD2 18 20
OD4 10 -3 øD1 2 de OD3 18 20
OD5 10 -4 øD1 2 de OD4 18 20
OD6 10 -5 øD1 2 de OD5 18 20
OD7 10 -6 øD1 2 de OD6 18 20
OD8 10 -7 øD1 2 de OD7 18 20
Blanco 0 0 20 20
B- Preparación de ADN Curva Estándar
Tubo Concentración final de ADN (mg ml -1) volumen de ADN estándar (ml) volumen de agua libre de nucleasa (ml) Volumen total (ml)
determinar con NanoDrop
DD1 debe ser eluida a la gama de 10 1 mg ml -1 20
DD2 10 -1 Dd1 2 de Dd1 18 20
DD3 10 -2 Dd1 2 de Dd2 18 20
DD4 10 -3 Dd1 2 de DD3 18 20
dd5 10 -4 Dd1 2 de DD4 18 20
Dd6 10 -5 Dd1 2 de DD5 18 20
DD7 10 -6 Dd1 2 de Dd6 18 20
DD8 10 -7 Dd1 2 de DD7 18 20
Blanco 0 0 20 20

Tabla 2:. DNA curva estándar serie de dilución de células microorganismo Standard (A) detallada para el volumen estándar de células, el volumen NFW, y el volumen total en cada tubo de dilución. Preparación de ADN estándar curva (B) y detallado para el volumen estándar de ADN, el volumen NFW, y el volumen total en cada tubo de dilución.

  1. ADN Standard Curve Preparación Extraer el ADN directamente a partir de una muestra estándar del microorganismo de interés (DD0) usando el mismo procedimiento como se describe para los filtros experimentales en el paso 3.4.
  2. Use un espectrofotómetro para determinar la concentración de ADN de la muestra de ADN estándar (DD0) a 260 nm.
  3. Preparar nueve estériles tubos de 0,5 ml de partida para preparar una curva estándar de ADN, tal como se muestra en la Tabla 2B.
  4. Si es necesario, diluir la solución de ADN estándar DD0 a dentro de un intervalo de concentración de 1-10 mg ml -1 en el primer tubo (Dd1) en un volumen total de 20 l.
  5. Añadir 18 l de NFW a los tubos Dd2-DD8 y 20 l al tubo en blanco.
  6. Transferencia de 2 l de la solución estándar de ADN a partir Dd1 en Dd2. Pipetear suavemente para mezclar y luego transferir 2 l de Dd2 a DD3. Continuar diluyendo el ADN de la misma manera a lo largo de los tubos para lograr una serie de dilución de 10 0 -10 -7 en tubos Dd2-DD8 junto con un tubo en blanco containing única NFW.
    Nota: Si no se analizaron en el mismo día de la extracción, las muestras almacenar a -20 ° C hasta su análisis.
  • Análisis cuantitativo-PCR
    1. Encienda el instrumento q-PCR con antelación para calentarse.
    2. En un nuevo archivo de programa, introduzca los detalles de la q-PCR se ejecute en el software del instrumento operacional como se detalla en la Tabla 3.
      Nota: Los diferentes instrumentos tienen diferente momento óptimo para cada etapa del ciclo térmico. Esta entrada se especifica en el manual del instrumento.
    3. Desinfectar la superficie de trabajo con superficie ADN-descontaminante y trabajar sólo con tubos estériles, consejos y reactivos.
    4. Preparar un cubo de hielo junto a la mesa de trabajo. Tienda de mezcla de Taq-polimerasa en hielo.
    5. Calcular el número total de pocillos de reacción que serán ocupadas en el plato. Hacer asignación teórica para reacciones adicionales (5%) y multiplicar el número ampliado de reacciones por el volumen por reacción para calcular el total de Reaction volumen.
    6. Preparar la piscina de reacción se mezcla, a partir de NFW, cebadores, sondas, y por último la mezcla de polimerasa Taq. Ver el ejemplo de los cálculos de volumen de la piscina mixta en la Tabla 4.
    7. Almacenar la mezcla de reacción en la oscuridad y en hielo hasta su uso.
    8. Coloque 1 l de ADN estándar, el ADN de la muestra, o NFW (como control negativo) en el interior de los pozos en la microplaca q-PCR por triplicado.
    9. Asegúrese de que la placa está en un soporte de la placa para evitar que entre en contacto con la superficie de trabajo y para mantenerlo limpio.
    10. Añadir 9 l de la piscina mixta (Tabla 4) en cada pocillo de reacción.
    11. Cubrir la placa con película adhesiva óptica y sellarlo herméticamente desde todos los lados.
    12. Centrifugar la placa en una centrífuga con cubos de placas durante 1 min a 1.000 xg antes de colocarlo en el dispositivo q-PCR.
    13. Colocar la placa en el instrumento y activar el programa en ejecución.
  • Parámetro detalles comentarios
    método de detección sonda de hidrólisis cuantitativa
    condiciones de ciclos térmicos
    La desnaturalización inicial y activación enzimática 95 ° C durante 10 min
    La desnaturalización 95 ° C durante 15 seg repetir 45 veces
    El recocido y extensión 60 ° C durante 60 seg
    placa array
    Curva estándar DD1 - DD8 3 repeticiones por cada dilución de 1-8 pozos en las 3 primeras filas
    control sin plantilla (NTC) agua libre de nucleasa (NFW) 3 repeticiones en el así en la parte superior3 filas.
    Las muestras analizadas ADN extraído de filtros 3 repeticiones por muestra en los pocillos restantes.
    conjunto de cebadores por cada pocillo
    volumen de la muestra 10 ml

    Tabla 3:. Los detalles de software operativo q-PCR Los detalles de los parámetros de análisis que se introducirán en el archivo de programa q-PCR.

    Reactivo Volumen por reacción (ml) Número de reacciones Subsidio para el error(5%) Mezcla Volumen total (ml)
    Taq polimerasa mezcla 5 50 52.5 262.5
    F imprimación (10 mM) 0,5 50 52.5 26.25
    R imprimación (10 mM) 0,5 50 52.5 26.25
    agua libre de nucleasa 3 50 52.5 157,5
    DNA - 1 ml se añade directamente en los pocillos de destino en la placa 96.

    Tabla 4:.-cuantitativa de la mezcla de reacción de PCR Cálculo del volumen por reacción, número de reacciones, el subsidio para el error, y el volumen total calculado que se añaden a la mezcla de reacción por reactivo son detallada.

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    Representative Results

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    Es común para estudiar los aerosoles atmosféricos utilizando "off-line" los análisis de los filtros incluidos en la muestra (véase la Figura 2). Analiza 32 Química de la incluirá orgánica (por ejemplo, proteínas, moléculas de hidrocarburos, sacáridos) e inorgánicos (por ejemplo, metales, sales) contenido en la muestra cuestión . análisis biológicos incluyen contenido viable y no viable de microorganismos, la identificación de especies utilizando un enfoque de ADN o la microscopía, así como la cuantificación basada en el ADN.

    Figura 2
    Figura 2: Filer diagrama de flujo análisis de la muestra del filtro después de la toma de muestras de aire (A), la preparación del filtro para análisis posteriores (B), y el análisis de los componentes de la muestra (C)..

    e = "1"> Para la extracción de endotoxina, de filtro de sub-muestras (1,12 cm 2) se agitan en 1 ml PFW durante 60 min a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 375 x g. Diferentes velocidades de centrifugación pueden dar lugar a diferentes eficiencias de extracción, como se indica en la Figura 3A.

    Una prueba preliminar para la eficacia de extracción debe llevarse a cabo para el filtro específico elegido y el protocolo realizado. En la Figura 3B, el aumento de la eficiencia de extracción se obtienen de clavar limpio en comparación con los filtros de cuarzo en la muestra, y los dos de estas eficiencias son más bajos que el conseguido a través de la detección directa de la solución estándar. Como se discutió en otra parte, la naturaleza de los aerosoles ambiente de la muestra en el filtro también puede afectar a la eficiencia de extracción de endotoxina. 14,33

    g3.jpg "/>
    Figura 3: eficacia de la extracción de endotoxinas El efecto de la velocidad de centrifugación (A) y la carga del filtro (B) en la eficiencia de extracción de endotoxina.. Las barras de error representan la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    La reacción para la detección de endotoxinas implica una relación 1: 1 de reactivo de LAL con el estándar de endotoxina, las endotoxinas de muestra extraído, o los espacios en blanco. Se recomienda el uso de los triplicados para el análisis de la muestra. Sin embargo, para las curvas de calibración, los duplicados son suficientes. Cuando se hayan completado las lecturas de absorción (a 405 nm), la densidad óptica resultante (OD) se analiza después de la exportación en un programa de hoja de análisis de datos para su posterior análisis de los datos.

    Al igual que en la extracción de endotoxina, es importante llevar a cabo un análisis preliminar de la eficacia de la extracción de ADN en las condiciones experimentales específicas. Esto se hace por spiking una cantidad conocida de una solución de células organismo estándar sobre un pedazo de corte del filtro, siguiendo el protocolo de extracción de ADN descrito anteriormente.

    La concentración del microorganismo diana extraído de los aerosoles en la muestra se determina usando Q-PCR. Aquí se utiliza la técnica de sonda de hidrólisis, que tiene la ventaja de una alta especificidad, a causa de la sonda adicional unido a la plantilla de ADN. 35 El método de verde SYBR se puede aplicar también para este propósito.

    Las curvas de calibración se derivan de ADN extraído de los organismos seleccionados de interés, utilizando el método de extracción descrito anteriormente. Una piscina de mezclado de los compuestos de reacción, con exclusión de la muestra de ADN, estándar o control, se prepara y se mantiene en la oscuridad y en hielo hasta su utilización. A continuación, se añade una parte alícuota de la piscina mixta en cada pocillo de una placa óptica de 96 pocillos de microtitulación. Se añade el patrón de ADN, la muestra, o el control después de la mezcla de reacción de acuerdo a la matriz de la placa. Después de que todos los reactivos se han insertado en la placa, es marLED con una película adhesiva óptica y se centrifugaron para recoger todas las gotas en el fondo de los pocillos. La placa es que inserta en el instrumento q-PCR para la amplificación de ciclo térmico y la detección de la señal.

    Los datos de salida consisten en valores de PCR Ct, que se define como el ciclo en el cual la cantidad de ADN amplificado alcanza el nivel de umbral. Utilizando los valores de curva de calibración, la concentración de ADN diana puede obtenerse (véase la Figura 4). 36 concentraciones de células de microorganismo se pueden calcular a partir de los valores de Ct de la eficacia de la extracción en comparación con un recuento de hemocitómetro de la solución organismo estándar. 37

    Figura 4
    Figura 4: Quantitative PCR-gráfico de amplificación (A) y calibrat.curva de iones que oscila entre 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) realizaron de ADN bacteriano gram negativo representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Este trabajo describe los métodos de extracción y detección para cuantificar tanto las endotoxinas y ADN presente en las muestras recogidas en los filtros de aerosol. Los métodos requieren rutinas precisos y se pueden realizar fácilmente, siempre que el experimentador se adhiere a algunos puntos esenciales e importantes discutidos aquí.

    Para la etapa de detección de endotoxinas, tenga en cuenta que la solución de lisado es bastante viscoso y tiende a producir burbujas en la pipeta. Es difícil de eliminar las burbujas de ti, y que conducen a cambios en los valores de microplacas de lectores. Por lo tanto, es importante colocar primero la muestra en la placa y sólo después de asegurarse de que todas las burbujas desaparecieron, continuar con la adición de la solución de lisado. Una técnica útil para evitar la formación de burbujas en este paso es trabajar lentamente con la pipeta, y no presionar todo el camino al drenar el lisado en los pocillos. Como reacción iniciar inmediatamente una vez que el lisado se añadió a la endotoextraer xin, es esencial para iniciar la lectura tan pronto como sea posible. Para acortar la etapa de adición de lisado, una pipeta multicanal puede ser utilizado. Tenga en cuenta que en algunos kits y protocolos hay una etapa de pre-incubación adicional de las muestras a 37 ° C durante 10 min, después de que se coloca en la placa micro titter. 29 Sólo después de este paso, se puede añadir el lisado.

    Un punto importante para la extracción de muestras ambientales de endotoxinas es la presencia de inhibidores en las muestras (por ejemplo, en la muestra de aire de alta contaminación). En este caso, la dilución se vuelve crítica, y puede evitar falsa mejora, típicamente observado para la muestra no diluida. 38

    Del mismo modo, hay varios puntos de importancia para asegurar el éxito y la fiabilidad de la detección q-PCR. 1) Como el volumen de las soluciones es muy pequeña, si no se colocan en la parte inferior del pozo, el contenido de agua en la gota de ADN podría reducirse en whil evaporacióne la organización de las muestras en la placa. Para evitar este problema, coloque la muestra de ADN en la parte inferior del pozo, enfriar la placa colocándola en hielo u otra plataforma de enfriamiento, y preparar todo de antemano para acelerar este paso lo más posible. 2) En la preparación de la mezcla de reacción Q-PCR (Tabla 4), ​​cubrir el tubo con papel de aluminio para evitar la fotodegradación. 3) El presente experimento describe la preparación de una reacción de 10 microlitros. Sin embargo, en algunos instrumentos q-PCR, el volumen de reacción es de 20 l y entonces el volumen de cada reactivo se multiplica en consecuencia. 4) Las condiciones óptimas de ciclo térmico pueden cambiar para diferentes cebadores y mezclas de polimerasa. 39 Por ejemplo, la temperatura de recocido debe fijarse en torno a la temperatura de fusión de los cebadores, y se determina empíricamente como la temperatura a la que se produce la amplificación más eficiente. Por esta razón también es importante para preparar una curva de calibración para cada q-PCR analizadoplaca, para asegurar que la cuantificación es exacta. Las curvas de calibración, así como filtros de pinchos de normas sirven también como control positivo, para asegurar que no se produce inhibición. Para evitar la inhibición, se recomienda el uso de kits de extracción diseñadas para eliminar los inhibidores a partir de muestras ambientales. 5) El número de ciclos térmicos en este experimento se establece en el número máximo, de 45 años, con el fin de aumentar la sensibilidad como las concentraciones de ADN de los extractos de filtro eran muy bajos. 6) Asegúrese de que los ciclos de umbral (valores Cτ) para todas las muestras de ADN están dentro del rango dinámico de la curva de calibración. También asegúrese de que cualquier amplificación de una muestra de control negativo es de al menos ocho ciclos mayor que la de las muestras de ADN. 7) Si se trabaja con el reactivo SYBR Green, asegúrese de que no hay múltiples picos de temperatura de fusión por reacción.

    Para ensayo turbidimétrico, dos métodos de cuantificación de endotoxinas están disponibles: el método cinético y el endpoint método cromogénico. En el enfoque de cinética, tal como se realiza en este protocolo, el tiempo requerido para que la muestra alcance la absorbancia máxima se mide. Aquí, un intervalo de reacción más corto indica una concentración más alta de endotoxina en la muestra. En el método cromogénico de punto final, la absorción de luz se mide después de un tiempo de incubación definido para determinar la concentración de endotoxinas. Ambos métodos requieren una curva de calibración estándar para la cuantificación. 40

    Aunque la precisión y exactitud de la extracción de endotoxina se ha descrito anteriormente es muy alta, 14 la eficacia de la extracción se puede mejorar. Es posible que un tipo diferente de filtro o la adición de un detergente (como polisorbato 20) para el procedimiento de extracción podrían mejorar el rendimiento de la endotoxina extraída del filtro. Eficiencia de extracción de endotoxina también puede estar influenciada por diferentes partículas de la muestra en paralelo en el filtro. 33 Para nuestra configuración experimental, laSe calcula el límite del método de detección para ser 0.001 m -3 UE. 14

    Las técnicas para cuantificar el extracto de ADN que podría servir como una alternativa a la q-PCR enfoque incluyen la clonación y la gotita digital de PCR (DD-PCR). Las ventajas de la q-PCR sobre el enfoque de clonación para la identificación de las especies son su mayor sensibilidad y que se requiere una concentración de ADN inferior para el paso inicial de amplificación. Además, a diferencia de q-PCR, el método de clonación, que es un trabajo intensivo y requiere mucho tiempo, no es cuantitativo. Un método alternativo para la cuantificación del extracto de ADN es DD-PCR. 19 La ventaja de esta técnica es que no requiere una curva de calibración, ya que la detección se basa en una sola cepa de ADN en cada gotita. Sin embargo, para muestras ambientales, ningún método fiable existe hasta el momento para la gotita de detección de ADN extraído de filtros.

    La eficiencia con la que se extrae el ADN from el filtro, así como la exactitud y la precisión de las mediciones de ADN, pueden ser influenciados por factores como el tipo de filtro, microorganismos diana, y. instrumentación 34,41 Por lo tanto, debe definirse antes del análisis de la muestra. En nuestra configuración experimental, el límite de detección puede alcanzar hasta 3,5 m -3 genoma. 14

    Para concluir, el método aquí descrito es aplicable para la identificación y cuantificación de especies biológicas en la muestra de aire, tanto de fuentes antropogénicas y naturales. uso preciso del ensayo apropiado permite investigaciones valiosas de las cuestiones ambientales complejas que deben realizarse.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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    References

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    Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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