Summary

Luft samplade Filter Analys för endotoxiner och DNA-innehåll

Published: March 07, 2016
doi:

Summary

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Abstract

Utomhus aerosol forskning använder vanligen partiklar provtas på filter. Detta förfarande gör det möjligt för olika karakteriseringar av de uppsamlade partiklarna som skall utföras parallellt. Syftet med den metod som presenteras här är att erhålla en mycket noggrann och tillförlitlig analys av den endotoxin och DNA-innehållet i bio-aerosoler extraherade från filter. Extraktionen av högmolekylära organiska molekyler, såsom lipopolysackarider, från filter samplade involverar skakning av provet i ett pyrogenfritt vattenbaserat medium. Den efterföljande analysen bygger på en enzymatisk reaktion som kan detekteras med hjälp av en turbidimetrisk mätning. Som ett resultat av den höga organiska innehållet på filtren samplade utförs extraktionen av DNA från proverna utfördes med användning av en kommersiell DNA-extraktion kit som ursprungligen var avsedd för jordar och modifierad för att förbättra DNA-utbyte. Detektion och kvantifiering av specifika mikrobiella som använder kvantitativa polymerasked Reactipå (q-PCR) analys beskrivs och jämförs med andra tillgängliga metoder.

Introduction

Luftprovtagning på filter är ett grundläggande verktyg i atmosfären aerosoler forskning. 1 Filtren samplade utgångspunkten för olika kemiska, fysikaliska och biologiska beskrivningar av de uppsamlade omgivande partiklarna. 2-11 Fördelen med denna metod är att olika analyser kan vara utförs off-line på samma prov. Sammanställning av data från alla olika analyser gör det möjligt för forskare att få en god förståelse av egenskaperna hos de uppsamlade partiklarna och hjälpmedel för att lösa komplexa frågor i meteorologi. 12,13 Till exempel, marina och inre luftprover under samma period kan jämföras med avseende på toxicitet samplade partiklar och biologiska sammansättning. 14 för denna studie, lipopolysackarider (LPS), komponenter på gramnegativa bakteriella cellväggar, även känd som endotoxiner, extraherades från filter samplas på land och på en inlands webbplats, och utvärderades med användning avlimulus amöbocytlysat (LAL) test. Parallellt en genomisk utvärdering av bakteriehalt (total bakterier, gramnegativ, och cyanobakterier) utfördes på samma prov med användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR). LAL-testet är baserat på mätningar av grumlighet som bildas efter tillsats av ett vattenhaltigt extrakt av amebocytes från hästskokrabban, Limulus polyphemus, till en vattenlösning innehållande de endotoxiner. Ju högre endotoxin koncentrationen i provet, utvecklar den snabbare grumlighet. 15 den q-PCR-analys är baserad på en fluorescenssignal som utsänds som ett specifikt DNA-fragment amplifieras. 16 Genom realtidsövervakning av den signalen under den exponentiella fasen av PCR reaktion och kalibrering med en standardkurva, kan den initiala DNA mängden kvantifieras. Kombinationen av dessa två analyser tillsammans med andra, som beskrivs på annat håll, kan 14 ge en god uppskattning av halterna av endotoxin och denMängden av käll bakterier i proverna.

Syftet med den metod som presenteras här är att erhålla en mycket noggrann och tillförlitlig analys av den endotoxin och DNA-innehållet i bio-aerosoler extraherade från filter. Även metoder för provtagning de fysiska och oorganiska kemiska egenskaper aerosoler är välkända och, på senare tid, metoder har utvecklats för att undersöka dess organiskt material komponent, 17 har det varit föga forskning om biologisk komponent av aerosoler. 18 Skälet till den nuvarande metod är att ta itu med denna brist genom att presentera i detalj en robust metod för att extrahera, analysera och identifiera biologiska fraktionen av luftburna aerosoler. 14

Metoden beskrivs här förväntas hitta utbredd användning i biologiska inomhus och utomhus aerosol forskningsprojekt där filteranalys. 20-24

Protocol

Obs: En detaljerad lista över alla material och instrument som används i detta protokoll visas i avsnittet Material. 1. luftprovtagning på Filter Framställning av Filters För hög volym provtagning använda 20,3 x 25,4 cm 2 filter. Välj den specifika typ av filter som bäst passar forskningsbehov, liksom filterbrytstorlek om tillämpligt. 1 Här används kvarts mikrofilter. Pre-baka filter avsedda för organisk och biologisk förening…

Representative Results

Det är vanligt att studera atmosfären aerosoler med hjälp av "off-line" analyser av filter i urvalet (se figur 2). 32 Kemiska analyser av ärendet inkludera organiska (t.ex. protein, kolvätemolekyler, sackarider) och oorganiska (t.ex. metaller, salter) innehåll samplas . Biologiska analyser inkluderar livskraftiga och icke livskraftiga mikroorganismer innehåll, artbestämning med hjälp av en DNA-metod eller mikroskopi, samt D…

Discussion

Detta arbete beskriver utvinning och detektionsmetoder för att kvantifiera både endotoxiner och DNA närvarande i aerosol prover som samlats på filter. Metoderna kräver noggranna rutiner och kan utföras enkelt så länge experimentalist vidhäftar några viktiga och viktiga punkter som diskuteras här.

För steg endotoxin upptäckt, notera att lysatlösningen är ganska viskös och tenderar att producera bubblor på pipettering. Det är svårt att ta bort dig bubblor, och de leder till …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.

Materials

Filter sampling
HiVol 3000 – High Air Volume Sampler Ecotech
Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203mm X 254mm
ELF – Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
Aluminum foil Opal
Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin
Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
Microtubes Axigen MCT-200-C 2ml, pyrogen free
1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series – Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
Name Company Catalog Number Comments
DNA
DNA away Sigma Aldrich 7010
Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 mL 
PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
Glass beads, acid-washed 425-600 Microns Sigma Aldrich G8772-100G
Glass beads, acid-washed <106 microns Sigma Aldrich G4649-100G
PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystems 4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

References

  1. Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
  9. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
  10. Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
  26. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  27. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  28. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
  29. Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
  30. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  31. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  32. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  33. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  34. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  35. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  36. Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
  37. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  38. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Play Video

Cite This Article
Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

View Video