Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Utomhus aerosol forskning använder vanligen partiklar provtas på filter. Detta förfarande gör det möjligt för olika karakteriseringar av de uppsamlade partiklarna som skall utföras parallellt. Syftet med den metod som presenteras här är att erhålla en mycket noggrann och tillförlitlig analys av den endotoxin och DNA-innehållet i bio-aerosoler extraherade från filter. Extraktionen av högmolekylära organiska molekyler, såsom lipopolysackarider, från filter samplade involverar skakning av provet i ett pyrogenfritt vattenbaserat medium. Den efterföljande analysen bygger på en enzymatisk reaktion som kan detekteras med hjälp av en turbidimetrisk mätning. Som ett resultat av den höga organiska innehållet på filtren samplade utförs extraktionen av DNA från proverna utfördes med användning av en kommersiell DNA-extraktion kit som ursprungligen var avsedd för jordar och modifierad för att förbättra DNA-utbyte. Detektion och kvantifiering av specifika mikrobiella som använder kvantitativa polymerasked Reactipå (q-PCR) analys beskrivs och jämförs med andra tillgängliga metoder.
Luftprovtagning på filter är ett grundläggande verktyg i atmosfären aerosoler forskning. 1 Filtren samplade utgångspunkten för olika kemiska, fysikaliska och biologiska beskrivningar av de uppsamlade omgivande partiklarna. 2-11 Fördelen med denna metod är att olika analyser kan vara utförs off-line på samma prov. Sammanställning av data från alla olika analyser gör det möjligt för forskare att få en god förståelse av egenskaperna hos de uppsamlade partiklarna och hjälpmedel för att lösa komplexa frågor i meteorologi. 12,13 Till exempel, marina och inre luftprover under samma period kan jämföras med avseende på toxicitet samplade partiklar och biologiska sammansättning. 14 för denna studie, lipopolysackarider (LPS), komponenter på gramnegativa bakteriella cellväggar, även känd som endotoxiner, extraherades från filter samplas på land och på en inlands webbplats, och utvärderades med användning avlimulus amöbocytlysat (LAL) test. Parallellt en genomisk utvärdering av bakteriehalt (total bakterier, gramnegativ, och cyanobakterier) utfördes på samma prov med användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR). LAL-testet är baserat på mätningar av grumlighet som bildas efter tillsats av ett vattenhaltigt extrakt av amebocytes från hästskokrabban, Limulus polyphemus, till en vattenlösning innehållande de endotoxiner. Ju högre endotoxin koncentrationen i provet, utvecklar den snabbare grumlighet. 15 den q-PCR-analys är baserad på en fluorescenssignal som utsänds som ett specifikt DNA-fragment amplifieras. 16 Genom realtidsövervakning av den signalen under den exponentiella fasen av PCR reaktion och kalibrering med en standardkurva, kan den initiala DNA mängden kvantifieras. Kombinationen av dessa två analyser tillsammans med andra, som beskrivs på annat håll, kan 14 ge en god uppskattning av halterna av endotoxin och denMängden av käll bakterier i proverna.
Syftet med den metod som presenteras här är att erhålla en mycket noggrann och tillförlitlig analys av den endotoxin och DNA-innehållet i bio-aerosoler extraherade från filter. Även metoder för provtagning de fysiska och oorganiska kemiska egenskaper aerosoler är välkända och, på senare tid, metoder har utvecklats för att undersöka dess organiskt material komponent, 17 har det varit föga forskning om biologisk komponent av aerosoler. 18 Skälet till den nuvarande metod är att ta itu med denna brist genom att presentera i detalj en robust metod för att extrahera, analysera och identifiera biologiska fraktionen av luftburna aerosoler. 14
Metoden beskrivs här förväntas hitta utbredd användning i biologiska inomhus och utomhus aerosol forskningsprojekt där filteranalys. 20-24
Detta arbete beskriver utvinning och detektionsmetoder för att kvantifiera både endotoxiner och DNA närvarande i aerosol prover som samlats på filter. Metoderna kräver noggranna rutiner och kan utföras enkelt så länge experimentalist vidhäftar några viktiga och viktiga punkter som diskuteras här.
För steg endotoxin upptäckt, notera att lysatlösningen är ganska viskös och tenderar att producera bubblor på pipettering. Det är svårt att ta bort dig bubblor, och de leder till …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Filter sampling | |||
HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
Aluminum foil | Opal | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Endotoxin | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DNA | |||
DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |