This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Cardiac tissue engineering har avansert kraftig i det siste tiåret, med flere grupper publisering resultatene av fullt funksjonelle, slo vev laget av både murine cardiomyocytes 1-6 og, mer nylig, menneskestamcelle-avledet hjertemuskelceller 7-12. Den hjerte tissue engineering feltet er drevet av to primære og hovedsak uavhengige mål: 1) å utvikle eksogene grafts som kan transplanteres inn i sviktende hjerter for å bedre funksjon 4-6; og 2) å utvikle seg in vitro modell for å studere fysiologi og sykdom, eller som screening verktøy for utvikling av terapeutiske medikamenter 2,7.
Tre-dimensjonal (3-D) cellekultur er ansett som nødvendig for å utvikle neste generasjon screening verktøy, som 3-D matrise reflekterer en mer naturlig hjertemikromiljøet enn tradisjonelle to-D monolagscellekultur; faktisk noen aspekter av cellebiologi er fundamentalt forskjellig i 2-D vs 3-D kulturer 13,14 </sup>. I tillegg er konstruert for hjertevev oppbygget av fullstendig definerte komponenter: en ekstracellulær matriks, og en cellepopulasjon. For tradisjonelle modifiserte humane kardiale vev, mens den ekstracellulære matrise-blandingen (vanligvis fibrin 9 eller kollagen 7,8,10) er strengt kontrollert, inngangscellen sammensetningen blir mindre godt definert, med hele blandingen av celler fra en rettet kardial differensiering av enten embryonale stamceller (ESC 7,9) eller induserte pluripotente stamceller (IPSC 10,12) blir lagt til vevene. Avhengig av den spesifikke cellelinjen og effektiviteten av differensiering protokollen som brukes, kan den resulterende prosentandelen av kardiomyocytter varierer fra under 25% til over 90%, det spesifikke kardiomyocytt fenotype (dvs. ventricular-, atrial-, eller pacemaker-lignende) kan også variere, selv de ikke-kardiomyocytt brøkdel kan være svært heterogen 15,16 og endre modenhet av differensiert hjerte myocytes 17.
Nylige hjertevev ingeniørarbeid har forsøkt å kontrollere inngangs populasjon av celler, med enten en hjerte reporter humane embryonale stamceller linje 8 eller celleoverflatemarkører 18 blir brukt til å isolere den kardiale myocyte komponenten av differensiering. Selv om utgangspunktet en vev sammensatt av bare i hjertemuskelceller ville synes å være den ideelle, er dette faktisk ikke er tilfelle; hECTs sammensatt utelukkende av hjertemuskelceller mislykkes i å komprimere i funksjonelle vev, med enkelte grupper finne et 3: 1 forhold av hjertemuskelceller: fibroblaster fremstilling av det høyeste trekning kraft 8. Ved hjelp av forskjellige celleutvelgelsesmetoder, inkludert overflatemarkører for levende cellesortering, er det mulig å lage hECTs med definerte celle populasjoner. Mens markører for ikke-hjerte stromale celler har vært tilgjengelige i noen tid, slik som den antatte fibroblast markør CD90 19,20, har overflatemarkører av hjertemuskelceller vært vanskeligereå identifisere. SIRPα var blant de første kardiale overflatemarkører som er identifisert for menneskehjertemuskelceller 18 og har vist seg å være meget selektive for hjerte avstamning. Nylig har vi funnet ut at dobbel-sortering for SIRPα + og CD90 – celler gir nesten rene cardiomyocytes, med CD90 + befolkningen viser en fibroblast-lignende fenotype (Josowitz, upubliserte observasjoner). Basert på disse funnene er samlet, heri beskriver vi skape hECTs ved anvendelse av en 3: 1 blanding av SIRPα + / CD90 – kardiomyocytter og CD90 + fibroblaster.
Evnen til å konstruere et fullstendig definert humant hjertevev er viktig ikke bare for å lage robuste screening verktøy, men også for å utvikle modellsystemer for å undersøke frem celle- og gen-baserte hjerte terapier. Spesielt mange cellen terapi for hjertesvikt, utnytte celletyper, inkludert mesenchymale stamceller (MSC) 21 </sup>, hjerte stamceller 22 og benmarg mononukleære celler 23-25, har blitt testet i kliniske studier. Mens mange av de første resultatene har vært lovende 21,23,25, minsker den første fordelen ofte over tid 26-29. En lignende trend har blitt rapportert i murine utviklet hjerte vev, som viser en betydelig funksjonell fordel på grunn av MSC tilskudd, men fordelen er ikke vedvarende ved langtids kultur 1. Underliggende sub-optimal ytelse er vår begrensede kunnskap om mekanismene som styrer cellen terapi. En dypere forståelse av hvordan terapeutiske celler utøve sin gunstig innflytelse, samt mulige negative konsekvenser av myocyte-nonmyocyte interaksjoner, vil muliggjøre utvikling av bedre behandlingsformer som gir klinisk signifikante og vedvarende fordeler, med minimale bivirkninger, for pasienter med hjertesvikt.
Her beskriver vi bruk av definerte hECTs til interrogspiste mekanismer for cellebasert terapi. Den kontrollerte vevssammensetning er avgjørende for å identifisere spesifikke faktorer som påvirker kardiomyocytt ytelse. Direkte supplere hECTs med den terapeutiske celletype av interesse (f.eks MSC), kan avsløre effekter på hjertets muskelceller ytelse, som vi har vist i rotte studiepoeng 1.
Den følgende flertrinns protokoll begynner med rettet hjertestamcelledifferensiering, etterfulgt av fremstillingen av multi-vev bioreaktor, og avsluttende med en beskrivelse av vev konstruksjon og funksjonell analyse. Våre eksperimenter er utført ved hjelp av NIH-godkjent H7 humane embryonale stamceller (hESC) linje. Imidlertid har de følgende protokoller også blitt testet ved hjelp av en ekstra hESC linje og tre induserte pluripotent stamcelle (hiPSC) linjer med lignende resultater. Det er funnet at effektiviteten i kardiomyocytt differensiering og suksess i hect fabrikasjon kan være avhengige cellelinje, spesielt for hiPSC linjene fra individuelle pasienter. Ved å følge denne protokoll, er to seks-brønners skåler belagt med et total på 1,68 millioner hESCs (140.000 celler per brønn), noe som gir ca. 2,5 millioner myocytter etter differensiering i 20 dager og sortering, nok til å gjøre seks definerte vev.
Bygging av definerte menneske konstruerte kardiale vev (hect) kan gi en mer konsistent og pålitelig modell av menneskelig hjerte myocyte funksjon. Kritisk, blir alle cellulære og ekstracellulære komponenter i det system som er kjent og kan manipuleres etter ønske, og dermed fjerne den forvirrende innvirkning av andre ukjente celletyper som følge av differensieringsprosessen. For å balansere rask cellevekst og høyt utbytte, er det foretrukket at differensieringen starter ved 75% konfluens av de hESCs, helst fire d…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH (1F30HL118923-01A1) til TJC, NIH / NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C til KDC, forskningsstipend rådet av Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) til BDG, den amerikanske heart Association (12PRE12060254) til RJ, og stipend Norges HKSAR (TBRS, T13-706 / 11) til RL Ytterligere midler ble gitt til TJC ved NIH DRB 5T32GM008553-18 og som en traineestilling på NIDCR-Tverrfaglig opplæring i systemer og Utviklings Biologi og fødselsskader T32HD075735. Forfatterne ønsker også å takknemlig erkjenne Arthur Autz på The Zahn Center of The City College of New York for å få hjelp med maskinering bioreaktor og Mamdouh Eldaly for teknisk assistanse. Vi takker også Dr. Kenneth Boheler for råd om hjerte differensiering, og Dr. Joshua Hare for sjenerøst gi menneskelige stamceller.
Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
Polysulfone | McMaster-Carr | ||
Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |