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Bioengineering

定义人工程心脏组织建设探讨心肌细胞疗法的机理

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

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心脏组织工程已在过去十年中极大地推进,以多组发布最近来自鼠心肌细胞1-6和,充分发挥功能,打浆组织,人干细胞衍生的心肌细胞7-12的结果。心脏组织工程领域是由两个主要和基本上独立目标驱动:1),以开发可移植到衰竭心脏改善功能4-6外源性移植物;和2) 的体外模型开发用于研究生理学和疾病,或作为筛选工具用于治疗发展2,7。

三维(3-D)的细胞培养物被认为是开发下一代筛选工具,作为3维矩阵反映更自然心脏微环境比传统的二维单层细胞培养至关重要;的确细胞生物学的一些方面是在2-D对的3-D培养物13,14根本不同9或胶原7,8,10)被严格控制,输入单元组合物不太明确,与细胞的整个混合物从一个定向心脏分化任胚胎干细胞(ESC 7,9)或诱导的多能干细胞(IPSC的10,12)被添加到组织中。取决于具体的细胞系和所使用的分化方案的效率,所得到的心肌细胞的百分比可以从低于25%的范围内,以90%以上,具体的心肌的表型( ,ventricular-,atrial-或起搏器状)也可以有所不同,甚至非心肌分数可以是高度异质15,16和改变的分化心肌米到期yocytes 17。

最近心脏组织工程工作一直试图控制单元的输入口,与任一心脏记者人胚胎干细胞系8或细胞表面标记18被用来分化的心肌细胞成分分离。虽然最初只心肌细胞组成的组织,似乎是理想的,这是事实上并非如此;完全的心肌细胞组成hECTs无法压缩成功能的组织,具有一定的群体找到一个3:心肌细胞比为1:成纤维细胞产生了最高的抽搐力8。通过使用各种小区选择方法,其中包括表面标记活细胞分选,可以创建具有限定的细胞群体hECTs。而非心脏间质细胞的标记物已经有一段时间,如推定的成纤维细胞标记物CD90 19,20,心肌细胞的表面标记已经比较困难鉴别。 SIRPα是确定用于人类心肌细胞18中的第一心脏表面标记之间并已被证明是心脏谱系高度选择性。最近,我们已发现,双分拣SIRPα+和CD90 -细胞产生几乎纯的心肌细胞,与CD90 +群体表现出成纤维细胞样表型(Josowitz,未发表的观察结果)。基于这些发现收集,在此,我们介绍了如何创建使用3 hECTs:SIRPα+ / CD90的结合1 -心肌细胞和CD90 +成纤维细胞。

工程师一个完全确定的人类心脏组织的能力,不仅是用于创建健壮的筛选工具,而且还为开发模型系统研究新兴细胞和基于基因的心脏治疗至关重要。在心脏衰竭特别是,众多的细胞疗法,利用细胞类型,包括间质干细胞(MSC)21 22和骨髓单核细胞23-25,已经在临床试验中进行测试。虽然许多初步结果已被看好21,23,25,最初的好处往往削弱随着时间的推移26-29。类似的趋势已经报道鼠工程心脏组织,这显示显著功能的好处,由于MSC的补充,但效益长期培养1期间不会持续。基础的亚最佳性能是我们有限理事细胞疗法的机制的知识。如何治疗细胞发挥其有益的影响,以及肌细胞nonmyocyte相互作用的潜在的负面影响更深的了解,将有助于提高治疗的临床收益和显著效益的持续发展,以最小的副作用,患者的心脏衰竭。

在这里,我们描述了使用定义hECTs来interrog吃的基于细胞的疗法的机制。受控组织构成是必要的识别影响心肌性能的具体因素。直接补充hECTs与感兴趣的治疗性细胞类型( 例如 ,干细胞),可以揭示在心肌细胞性能的影响,如我们在大鼠的ECT 1已经证明。

以下多步协议开始指示心脏干细胞的分化,其次多的组织的生物反应器的制造,并与组织结构和功能分析的说明结束。我们的实验中使用的是美国国立卫生研究院批准H7人类胚胎干细胞(hESC细胞)线进行。但是,以下的协议也已使用额外的人类胚胎干细胞系,并与类似的结果3诱导多能干细胞(hiPSC)行测试。我们已发现,在心肌细胞的分化和成功HECT制造效率可以细胞系相关的,特别是FO从个别病人衍生řhiPSC线。按照此协议,两个6孔皿镀有共168万人类胚胎干细胞(每孔14万个细胞),它区分了20天,分选,足以花费六个定义组织后产生大约250万细胞。

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Protocol

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注:执行使用HEPA过滤II级生物安全柜在无菌条件下,所有的细胞操纵和由通过0.2μm过滤器过滤他们消毒所有的解决方案。无论是在相同的无菌条件或层流罩进行组织结构和功能测试。

1.在心脏分化准备H7人类胚胎干细胞的播种

  1. (1天)准备基底膜基质
    1. 解冻的hESC合格基底膜基质的150微升等分试样在冰上过夜,在4℃。
  2. 在涂层板胚胎干细胞(0-4天),电镀
    1. 稀释解冻矩阵成12毫升的冰冷DMEM / F12拌匀。
    2. 传输1毫升的DMEM / F12-基​​质溶液到6孔组织培养处理过的培养皿的每个孔中的。矩阵罐外套两个6孔平板的每个等分试样。
    3. 在室温下孵育的包被的板至少1小时。
      注意:在我们的经验,用石蜡密封包被的培养皿可以存储在基质溶液在4℃下使用前长达10天。
    4. 在大约75%汇合时,从使用6-毫升非酶解试剂的10cm皿解离H7人类胚胎干细胞。 5分钟后,使用一次性细胞刮刀轻轻刮去从培养表面的细胞和细胞悬浮液转移到一个无菌的15毫升离心管中。
    5. 除去0.5毫升从15ml试管和转移的细胞解离溶液的一个新的无菌的15毫升管(离开5.5毫升解离试剂,以进一步分离所述人类胚胎干细胞),用于干细胞系的传播。
    6. 沉淀0.5萃取池在300×g离心20℃5分钟。除去上清液和8毫升含有1%青霉素-链霉素的多能干细胞培养基轻轻悬浮然后转移到一个新的,包衣的10cm组织培养皿,保持37℃和5%的CO 2以维持干细胞系。
      注意:在媒体的变化保持多能性干细胞介质上冰。
    7. 同时,添加5.5微升的10mM ROCK抑制剂Y-27632的剩余5.5毫升离解的溶液,并继续在室温下孵育5〜10分钟。轻轻地用5毫升血清吸管混合细胞。继续孵育直到单细胞悬浮液实现,然后沉淀细胞,在300×g离心,在室温下5分钟。
    8. 悬浮细胞在5ml多能干细胞介质,并使用血球计数器进行细胞计数。
    9. 种子以每孔14万个细胞的密度的6孔培养皿的每个孔中。种子两个6孔板创建一共有六个定义的组织。电镀后剩余的细胞进行处理。
    10. 填充井到1ml与多能干细胞培养基,并在37℃,5%的CO 2下孵育。二十四小时后,去除介质和加入2毫升的新鲜多能干细胞培养基到每个孔中( 图1A
    11. 检查板的汇合处的每一天,开始分化一旦细胞达到约75%汇合( 图1B - D)。

人类胚胎干细胞2(4-24天)分化为心肌30,31

  1. (4-7天,分化0-3天),中胚层诱导
    1. 通过组合500毫升RPMI 1640中,用10ml B27添加物(无胰岛素)和5的青霉素-链霉素母液(10,000微克/毫升链霉素万国际单位/毫升青霉素)毫升制备的RPMI分化培养基I( 表1)。等分试样,在冰上,入50ml试管并储存在4℃。
    2. (第4天,分化0天)加入2.4微升的小分子GSK3抑制剂CHIR99021(10毫米的股票,6μM终浓度)准备中胚层诱导媒体12 RPMI分化培养基毫升一,从每个孔中取出多能干细胞介质一个次用2ml中胚层诱导培养基的更换,每孔。返回板的孵化器。
      注:显着的细胞死亡通常与另外CHIR99021( 图1E)的发生。单层将恢复,但冲洗死细胞远用DMEM / F12冲洗是很重要的。
    3. 如上所述(第5天,分化第1天)准备新鲜的中胚层诱导培养基。除去从各旧媒体以及并用1ml的DMEM / F12的冲洗一次,每孔。 2毫升新鲜中胚层诱导培养基添加到每个孔中。
      注:冲洗0-10天,每天大大增加了心肌细胞的产量和纯度。
    4. (第6天,分化2天)取出心脏诱导媒体和每孔的10ml DMEM / F12冲洗一次。替换用2ml我(没​​有小分子添加,但仍与B27(没有胰岛素)补充)的RPMI分化培养基冲洗,并返回到培养箱中。
  2. (7-13天,分化大Ÿ3-10)心脏中胚层诱导
    1. (7天,分化3日)加入6微升的小分子抑制剂Wnt信号IWR-1(10毫米的股票,5微米决赛)的准备心脏中胚层诱导媒体12毫升RPMI分化培养基的一
    2. 除去从各介质孔,每孔1的10ml DMEM / F12冲洗一次,并用2ml心脏中胚层诱导培养基的更换,每孔。
    3. 如上文所述(第8天,分化第4天)准备额外12毫升心脏中胚层诱导媒体。移除介质之前加入的那一天,以每孔1的10ml DMEM / F12冲洗一次,用每阱2毫升的新鲜心脏中胚层分化培养基的更换,并返回到培养箱中。
    4. (9-10天,分化每天5-6)在这两天,取出心脏中胚层诱导媒体和冲洗每孔用1毫升DMEM / F12的。
    5. 加入2毫升的新鲜RPMI分化培养基的我(不小分子添加,但仍与B27(无胰岛素)补充)到每个孔中并将板返回孵化器。
  3. (11-24天,分化日7-20)胚胎源性心肌细胞组织/成熟
    1. 通过组合500毫升RPMI 1640中,用10ml B27添加物(胰岛素)和5的青霉素-链霉素原液毫升制备的RPMI分化培养基II( 表1)。等分试样,在冰上,入50ml试管并储存在4℃。
    2. (第11天,分化第7天)从各取出的RPMI分化培养基(不含胰岛素)以及并用1ml的DMEM / F12冲洗。用2ml的新的RPMI分化培养基II(胰岛素)的每个取代孔,并返回到培养箱中。
      注意:自发跳动应先天7和10之间观察到如果在此期间没有观察到打浆,则通常表明分化效率差。该协议可以持续15日为止的一天为了观察跳动,但如无跳动是第15天观察到的最好是圣一场新的艺术分化。
    3. (12-24天,分化日8-20)每天,删除旧的分化培养基并用2ml新鲜的RPMI分化培养基Ⅱ的取代每孔以允许打浆单层细胞成熟和组织( 图1F, 视频图1 )。
      注意:根据所述残留的细胞死亡,可能有必要通过10分化一天/ 1的10ml DMEM F12冲洗。

3.(第24天,分化第20天)心肌细胞和成纤维细胞样细胞的分离

  1. 从单层细胞分离
    1. 除去分化培养基并用1ml的PBS冲洗一次。
    2. 用1毫升的酶解溶液(0.04%胰蛋白酶/ 0.03%EDTA)至各孔离解的单层。
    3. 移动板进入培养箱10分钟。同时,添加12微升ROCK抑制剂的至6ml的胰蛋白酶中和溶液。
    4. GentlY添加1ml含有ROCK抑制剂到板的各孔中,以中和胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶中和溶液。
    5. 使用无菌移液管,轻轻混匀每孔掰开的细胞团。
    6. 传送从6孔板全部12毫升至15毫升离心管中。
      注意:由于两个6孔平板在这个协议中使用的,两个15毫升管将需要。
    7. 传输3毫升的PBS至板的一个孔中,然后在相同3毫升依次传送到每个随后的井以收集任何残留的细胞上的菜。传送从最终剩余3毫升井到含有细胞相同的15ml离心管中。
    8. 粒料在300×g离心在4℃下5分钟。
  2. 准备细胞通过FACS活细胞分选
    1. 通过加入5ml胎牛血清至45毫升的PBS在冰上用50μlROCK抑制剂的制备染色缓冲液。
    2. 从细胞象素除去上清让(在3.1.8)和1.2毫升染色缓冲液悬浮。
    3. 转移200微升细胞悬浮液到一个新的,预冷的50毫升离心管置于冰上。这将是阴性染色对照。
    4. 传送剩下的1 ml的细胞悬浮液到一个新的,预冷的50毫升离心管在冰上,加入2微升SIRPα-PE / Cy7的(1:500稀释度)和4微升CD90-FITC(1:250稀释度) 。轻轻地用移液管混合细胞悬浮液,并返回到冰上。
    5. 1小时孵育两个阴性对照和样品,在一个摇杆振动筛,在冰上,在4℃下。
    6. 通过加入3ml RPMI培养基(胰岛素)的两个15ml离心管中制备样品收集管中。加入3微升ROCK抑制剂的每管并储存在冰上。
    7. 沉淀经染色的细胞在300×g离心5分钟,在4℃下,用每漂洗至少10毫升冰冷的PBS中漂洗两次。
    8. 1微升的DAPI(1微克/毫升)添加到5ml染色缓冲液中。平缓重悬以1-3毫升用移液管将含DAPI染色缓冲的样品沉淀。
    9. 添加500μl的染色缓冲液(无DAPI添加)的阴性对照。
    10. 通过40微米的细胞滤网过滤轻轻两个阴性对照和样品以除去细胞团块并转移至聚苯乙烯在冰上FACS管。立即将样品细胞分选。
    11. 要建立活细胞类似的排序方法18,使用阴性对照,设置闸门,选择活细胞(DAPI负),并收集两个FITC +( ,CD90 +成纤维细胞)和PE / Cy7的+( ,SIRPα+心肌细胞)在20psi( 图2)独立地人口。
      注:在设置栅极之后,阴性对照可固定在4%PFA通过染色心脏肌钙蛋白-T来确定分化效率。
      注意:有些学者喜欢使用同种型对照,而不是未染色的对照来设置门电路以补偿用于非特异性抗体结合。所谓的荧光减一(FMO)控制是另一种可能性。由于FITC,DAPI和PE-Cy7的信号的清晰的双峰分布,我们从阳性群体门控,保守瞄准远到正栅极,这可能排除某些真阳性而有助于减少任何误报。
  3. 在组织工程准备细胞再聚集
    1. 小区的排序后,在1ml DMEM中含有10%新生牛血清,1%青霉素 - 链霉素和0.2%两性霉素B(“NBS介质”)沉淀都收集管和重悬。
    2. 重组的SIRPα+和CD90 +细胞在3:1的比例和板组合的细胞在非组织培养在为60 平方厘米(10厘米培养皿)2百万个细胞的密度处理培养皿。加入10 mL NBS媒体和101,ROCK抑制剂Y-27632 l的。
    3. 放置细胞悬浮液中的组织培养孵化48小时,以使细胞再聚集成小簇。

4.人类心脏组织工程

  1. 制造多组织生物反应器
    注意:要补充图3A插图,有详细的生物反应器的设计原理图CAD文件可向作者请求。
    1. 机通过钻0.5mm直径六个均匀间隔的孔成聚四氟乙烯9×33×3.25毫米长方体的PDMS母模。
    2. 使用立铣刀,机从聚砜测量25×35×11 立方毫米的框架。该帧的目的是为了保持与PDMS讯息对准在底板的孔中(从上方取得的铸造构造的)。
    3. 使用1毫米的端铣刀,机器6个孔(6×1×1毫米3),4毫米分割成一个20×40×5毫米3一块黑色的聚四氟乙烯,以形成基板。
    4. 混合在一个10的弹性体基础和用于聚二甲基硅氧烷(PDMS)固化剂1 w / w的比率,并添加到自定义聚四氟乙烯模具(步骤4.1.1)来创建六个力传感讯息两排,并孵育过夜,并在真空在80℃。固化后,轻轻地从母模取出PDMS,仔细标记每个岗位为增强对比度和自动实时后偏转跟踪黑色永久性标记的顶部。
      注意:聚四氟乙烯是相当软,并很容易被损坏。清洗,PDMS铸造,以确保系统和一致的PDMS后几何长寿母模前时要小心。为0.5mm导线可以用来清洁每次使用后支柱上的孔,但照顾到不刮孔的内部。
      注意:另一种方法是脱气真空下的PDMS在室温下几个小时,然后让在环境压力下将混合物固化。这可能导致在固化过程中与PDMS形成较少的残留气泡。
    5. 消毒所有组件蒸汽高压灭菌器。
      注:PDMS母模(步骤4.1.1)和聚砜帧(步骤4.1.2)都是可重复使用。自投(步骤4.1.4)中创建的PDMS职位也可重复使用,但只有约10用途。然而,由于使用模具师傅可以根据需要创建更多的PDMS的职位。
  2. 收集Reaggregated心肌细胞
    1. 除去从培养箱的reaggregated细胞和所有10个毫升再聚集媒体转移到50毫升离心管中。
    2. 冲洗用3毫升的PBS在板和漂洗转移到含有再聚集媒体相同的50ml离心管中。
    3. 添加3毫升0.04%胰蛋白酶/ 0.03%EDTA至10 cm培养皿,并返回到培养箱中5分钟。
    4. 5分钟后,检查用倒置化合物显微镜板在10倍的放大倍率,以确保完全细胞dissocia化从盘。如果一些残留的集群仍然附着,轻轻搅动板分离的团块。如果簇保持连接,返回到培养箱中另一2-3分钟。不要孵化时间超过十分钟显著细胞死亡,可能会出现。
    5. 一旦所有的细胞分离,加入3ml胰蛋白酶中和溶液。轻轻混匀与胰蛋白酶的细胞溶液,并转移到含有再聚集媒体的50ml离心管中的中和溶液,并用PBS冲洗一次。
    6. 冲洗用5ml PBS的整个盘并转移到含有细胞同样的50毫升管。
    7. 沉淀细胞,在300×g离心,在室温下5分钟。
    8. 去除上清,悬浮在1毫升NBS媒体的颗粒,然后转移到一个1.5 ml离心管。
    9. 沉淀,在300×g离心,在室温下5分钟,去除上清。心脏细胞(CD90 +基质细胞和SIRPα+ MYOCytes)现在已经准备好为组织构建。
  3. (可选)收取利息的补充细胞
    注意:除了仅含SIRPα+心肌细胞和CD90 +成纤维细胞样细胞中的定义组织中,也可以添加感兴趣的额外的细胞以询问其对组织的功能的效果。例如大鼠MSC已经显示增强大鼠的工程心脏组织1的功能。以下任选的步骤描述了补充细胞来定义的系统的集合。
    1. 收集辅助细胞类型的利益使用0.25%胰蛋白酶/ 0.1%的EDTA( 例如 ,间充质干细胞)。
    2. 沉淀细胞,在300×g离心在室温下5分钟,然后在5毫升适当的细胞培养介质的悬浮为感兴趣的细胞类型。例如,对于干细胞,可以使用补充有20%胎牛血清,1%青霉素 - 链霉素和0.2%两性霉素B至培养的C厄尔。
    3. 使用血球进行细胞计数,然后在300 xg离心再次沉淀细胞,在室温下5分钟。
    4. 除去在1ml细胞培养基和转移的上清,重悬到1.5ml微量离心管中。
    5. 沉淀细胞,在300×g离心,在室温下5分钟。
    6. 去除上清。补充细胞现在已经准备好组织建设。
      注意:如果所述补充细胞以在组织中的细胞总数的10%的浓度加入,则所定义的组织,这将需要每组织50000补充细胞作为每个组织含有50万心脏细胞(均CD90 +基质细胞和SIRPα+细胞)。
  4. 创建人工程心脏组织
    注:储存在冰上,并在室温温度下,所有的解决方案的细胞。下面列出的所有卷每个组织。通常情况下,大约6种组织可以从两个构造6孔复心脏分化的阿泰。
    1. 稀释60.0微升5毫克/毫升的胶原库存的3.125毫克/毫升与1.5微升的1M NaOH中,10倍的PBS 9.6微升和24.9微升的灭菌超去离子水。
      关键的一步:避免在制备过程中引入气泡的每个解决方案,气泡会扰乱适当的组织形成。
    2. 同时添加10倍的MEM 12.0微升和0.2N的HEPES pH为9至稀胶原混合物以创建胶原组合。为了避免引入气泡进入胶原组合加入两种溶液走在15ml离心管的一侧。
    3. 基底膜基质添加到0.9毫克/毫升至胶原混合的最终浓度,并储存在冰上,以创建最终组织组合。胶原的最终浓度应为2毫克/毫升。
    4. 添加reaggregated细胞500,000到组织混合物(肌细胞+成纤维细胞浓度为20万个/ ml)和填充到25微升的每一个终体积与任一无细胞NBS介质或感兴趣的( 例如 ,的hMSCs)补充细胞类型的50,000个细胞并充分混合组织,以形成均匀的细胞悬浮液。
      注意:补充的细胞数将来自不同的应用而变化。这里使用的10%的补充。
    5. 小心,吸管25微升细胞悬浮液到每个生物反应器中的底板的六个孔中的,而不引入气泡进入井中。
    6. 推PDMS力传感器的两行上的聚砜框架的任一侧,形成6对相对帖子,然后反在底板顶部的框架,使一对柱进入每个孔含有细胞悬浮液。
      注:聚砜框架包括标签在PDMS对齐提供帮助。
    7. 小心地将生物反应器,底板下来,到60毫米的菜,然后将菜没有它的10cm皿内盖,放置在顶部的10厘米盖,并移动整个生物反应器组件于组织培养孵化器,等待两个小时的组织到凝胶。
    8. 2小时后,从孵化器中取出的生物反应器,并添加14毫升NBS媒体向整个组件,足以覆盖基板上。返回到孵化器,并每天换一半的媒体。
    9. 四十八个小时后,小心地轻轻底板的每侧几毫米一次离开所述帧去除基板,改变介质,然后返回所述生物反应器,组织朝下,向媒体。
    10. 每天都在不断变化,国家统计局培养基的一半。
      注意:在组织的自发收缩可以组织结构后,早在3天观察到的,早5天至第7产生可测量的抽搐的力。

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Representative Results

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以获得心肌细胞,的Boheler和廉分化方法略加修改使用30,31。当务之急是在分化过程中的细胞生长的对数阶段开始,也即初始种群足够汇合排序(约75%是最优的)后,得到的细胞的可用数目。典型地,对于H7的hESCs,在保持在37℃的每一个的6孔培养皿的孔140000人类胚胎干细胞中必不可少8媒体和5%CO 2培养箱的密度电镀后4天产生充分融合培养开始分化,如所示在图1A中- ð。因为胰岛素抑制在分化过程32心脏说明书中,胰岛素的培养基(分化培养基I, 表1)是用于分化的第10天。一旦分化经由GSK3抑制剂CHIR99021的应用程序启动,显著的细胞死亡会发生( 图1E)。因此有必要每天改变培养基。分化的第2天,将细胞从CHIR99021除去在分化培养基我休息(没有添加小分子)24小时。在分化培养基中24小时休息后,将细胞用IWR-1处理48小时,在此之后就开始自组织成从开始分化击败早七天簇( 图1F)。因为心脏规范已经IWR-1的应用之后发生,介质被改变为含有胰岛素(分化培养基II, 表1)的介质。通过18天分化,跳动的细胞的集落都连接并从细胞表面部分分离,形成鲁棒整个盘( 视频图1)跳动“网”。

在第20天,跳动的单层轻轻分解VI一个酶促方法获得的单细胞活荧光相关的细胞分选(FACS)。使用上述的分化的方法,我们保守收获人口SIRPα+的约65%和10%为CD90 +( 图2)。一般为1-2百万SIRPα+细胞每6孔板获得。

SIRPα+的比例为1::再聚集在一个3 48小时后CD90 +细胞,在限定的细胞聚集体具有基于胶原的水凝胶混合并在多组织生物反应器的基板吸移到窄孔中。通常情况下,从盘移除之前,5-10个细胞的小簇可以看出跳动餐具的表面上。该定义组织的生物反应器由三部分组成:一个母模铸造的PDMS职位;一帧的职务两个PDMS架;和含有黑色聚四氟乙烯底板六口井的组织结构( URE 3A)。整个组织施工过程在冰上并在无菌条件下进行的。加入液体细胞基质混合物在底板孔后,将PDMS帖附连到聚砜帧,然后反转,使支柱与在底板( 图3B)的孔对齐。培养48小时后,将组织应该足够压实该底板可以去掉。底板是最容易从媒体中提取整个系统,轻轻地从PDMS底板间去除多余的介质分离。如果所有的媒体都不会被删除,剩下的液体的表面张力可拉断的职位组织。一旦媒体被删除,轻轻一推底板背靠PDMS职位,以帮助放松从底板组织。然后通过轻轻移动一面向上几毫米,那么另一侧上相同的量逐步推向底板关闭。重复这个过程,直到巴seplate被除去,与所有6 hECTs附连到各自的PDMS端桩( 图4A)。卸下底板应采取不超过一分钟以上。系统替换到细胞培养介质,反转,使所有的组织由细胞培养基覆盖。

大约拆卸底座后一天,弱局部收缩应该是在明亮的视野显微镜的定义hECTs观察到。 7天后,将组织已经成熟并压制( 图4B-C)用对准肌节( 图4D)。该组织明显,平均5-15μN的力( 图4E)的偏转PDMS职位。抽搐力的测量所定义的工程心脏组织可以通过邮寄尖端偏转的实时跟踪与高速摄像机和自定义数据采集软件进行测量,并应用后偏转的光束确定后弯曲理论杨氏模量使用力传感器硅氧烷职位,如更详细先前。1,7-说明维护数据采集过程中的无菌可确保随着时间的推移来测量在组织功能变化的能力。我们一直保持功能组织数周,如其他地方1中更详细地解释。我们的初步结果表明的HECT收缩力大幅提升,当组织在两个1赫兹和2赫兹起搏的频率( 图4F)的补充有10%人类间质干细胞。

图1
图1:扩张和心脏分化过程中H7的hESC的代表性图像 。扩张阶段应该持续4天,从24(A)扩大菌落生长,48(B),72(C (D)。生长96小时后,将分化开始时,CHIR99021处理(E)的第一个48小时期间得到的基本上细胞死亡。之后IWR-1治疗两天,重组出现(F)形成,早一天打7.进一步组织成一个强劲跳动的“网”7日发生到20日,当单层分离的细胞群创建工程心脏组织。

视频图1:后分化17天的代表心脏单层 。请点击此处观看该视频的单层内自发的跳动,通常前7和10天日间观察,并通过分化17天的单分子层已形成相互关联的“网“这有力地跳动。

名称 组成 使用天分化
分化媒体我 RPMI 1640
B27补充(减胰岛素)
青霉素 - 链霉素
D0-D1(带CHIR99021)
D2
D3-D5(与IWR-1)
D5,D7
分化媒体II RPMI 1640
B27补充(胰岛素)
青霉素 - 链霉素
D7-D20

表1:分化媒体组成。

图2
图2:代表活细胞排序ING结果制备了两个样品:未染色的控制和使用1染色控制:SIRPα-PE / Cy7的抗体稀释500和1:250稀释的CD90-FITC抗体。染色后,将细胞在20psi在排序的PBS,10%新生小牛血清,10μMROCK抑制剂Y-27632,和1μg/ ml的DAPI组成缓冲器排序。两种细胞群中的前向和侧向散射轮廓进行门控以排除碎片(A,蓝色线),然后单个细胞通过比较脉冲宽度和高度选择在正向散射(B,蓝线)(脉冲宽度分析)和侧散射通道(C,蓝线)。人口(D,蓝线) -下,被选通DAPI选择的活细胞。收集最后的细胞群通过检查现场人群的FITC和PE-Cy7的表达水平来确定。未染色的控制(E,左)被用来建立相应的门以选择FITC +(CD90)和SIRPα-PE / Cy7的+(心肌细胞)人口存在的染色样品中(E,右)。该FITC和SIRPα-PE / Cy7的+收集在单独的15ml离心管中poplations。

图3
图3:示意图多组织生物反应器和心脏组织工程过程的多组织生物反应器构建需要三个成分(A):1)的聚四氟乙烯母模9×33×5mm的3,6均匀间隔的孔直径0.5mm; 2)25×35×11 mm 3的聚砜框架持有组织建设和培养过程中PDMS职位;和3)20×40×5mm的3个黑色聚四氟乙烯底板为6×1×1毫米3维6个孔,水疗土木工程署相距4毫米沿其长度。要创造人类的工程心脏组织(B)中,PDMS职位由使用聚四氟乙烯母模,然后其中两个是压在聚砜帧标签来形成6对力传感悬臂职位PDMS软光刻制造。组织溶液吸移到在黑聚四氟乙烯底板的孔中。然后,框架和职位的反转,使一对职位进入每孔装有组织结构的聚四氟乙烯基板对齐。 48小时后,底板被删除,定义组织的培养就上岗,在国家统计局的媒体其余反转。

图4
图4:代表性的图像和限定人工程心脏组织的功能测量的多组织bioreact或系统持有并联(A,箭头)6种组织。定义的组织是自组装内组织创建七天后(顶视图,B和斜侧视图,C)。 (D)。定义HECT的部分染色肌钙蛋白T(cTnT)的。 (E)代表抽搐跟踪显示期间电场刺激1赫兹起搏随着时间的推移原始的力量。 (F)的抽搐在1赫兹(0-2秒)和2赫兹(2-4秒)起搏刺激期间追踪,以箭头标记的频率变化,这两个未补充定义hECTs(实线)和补充有10%的hMSCs组织(虚线)。

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Discussion

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定义人工程心脏组织(HECT)的建设可以提供人体心肌细胞的功能更一致和可靠的模型。关键的是,系统中的所有细胞和细胞外成分是已知的并且根据需要,从而消除从分化过程产生的其他未知的细胞类型的混杂影响可以被操纵。以平衡快速的细胞生长和高收率,优选的分化开始在人类胚胎干细胞的75%汇合时,理想的电镀后四天。此外,这两个排序后的细胞解离和再凝集期间使用ROCK抑制剂Y-27632的大大增强细胞生存力。肌细胞的自发搏动的期间分化过程的存在是分化的效率和健康的一个重要指标。如果自发跳动不遵守这可能表明分化效率低下,要么是由于无效试剂或亏损的干细胞的多能性。

在组织建设,PDMS岗位必须与底板创建持续足够长的时间测量的收缩功能,形成良好的组织渠道正确对齐。以增强便于装置对准,强化围绕在那里它们易于断裂的职位组织形成,可以额外宽度(约交直径在立柱的每一侧一个)添加到该通道的端部,这表现通过“狗骨头”形, 如图3A的通道。如果没有适当的设备对准的组织将或者从支柱分离培养后不久,或将保持在良好时底板​​被移除。如果一个结构良好的组织底板拆卸过程中脱落,就可以轻轻重新将组织用解剖显微镜下细镊子的职位,虽然它很容易损伤娇嫩的hECTs如果有充分的不注意。</ P>

所描述的定义的系统的主要优势是询问基于细胞的组合物的具体的控制的直接细胞 - 细胞相互作用的机制在心肌细胞疗法的贡献的能力。细胞在动物中的注射是不精确的,可能会低存活率和保留33。此外,在靶组织注射的细胞的作用是通过与其它的生理系统,如对免疫系统的相互作用复杂。这样,理解在心肌细胞疗法的直接细胞 - 细胞相互作用的贡献是具有挑战性的模式生物,以解决。因此,一个优点是所描述的方法是,细胞 - 细胞相互作用在仿生三维环境分析,保留心肌龛的关键方面,并在特定的细胞类型的兴趣的存在下 - 即,心肌细胞和成纤维细胞。使用定义的HECT系统的效用是demonstrated与来自人骨髓34,35衍生和组织创建过程中在临床试验中的细胞混合物用10%的hMSCs的补充。这是补充了的hMSCs这些组织比未补充定义的人体组织( 图4F)表现出较大的收缩力。由于组织环境和组合物已被控制,与MSC补充组织功能的增强体现的hMSCs心肌功能的固有效果。另一个强度的系统是自组织比以前使用的更小,使用的多能干细胞作为细胞来源的定向分化时-1,7-细胞的使用是更有效的,一个重要的考虑因素。

超出研究细胞疗法的机制,该定义HECT系统将使心血管细胞 - 细胞相互作用的细胞基础的审查。到组织常量细胞的生物学的扰动之前乱子,例如用的shRNA,将允许的理事细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用的分子机制的研究。一个附加的优点于组织工程系统能够官能收缩对准肌原纤维的形成。因此,使用定义HECT系统,肌原纤维的形成,心肌细胞的发展和组织结构的组织的动态都可以通过细​​胞外基质或细胞的分子操作的部件的修改的影响。该HECT系统的人力和3-D的性质还增加了结果的可译性。

而所描述的系统提供了一个强有力的方法对理解心血管生物学基本的问题,但也不是没有局限性。首先,工程组织表现出不成熟的表型,从新生的心肌标本7发表抽搐力数据一致的虽然表型不成熟可以是在评估细胞相互作用的机制一个混杂因素,有证据表明,患病的心肌恢复到胎儿基因程序7,36-38。如果从HECT系统结果证明是在衰竭的心脏的上下文相关的,这可能是用于测试心脏疗法是有利的。组织施工期间该协议还采用了人类胚胎干细胞合格的基底膜基质。这个矩阵的组成可以不同批次,虽然定义地下室矩阵替代品的情况,他们还没有在hECTs的背景下进行评估。

其它限制包括缺乏血管系统的和无系统级的相互作用效应。定组织的大小,代谢需求通过扩散单独完成,因此,不需要的血管系统,以确保细胞活力。然而,内皮细胞信号可以是在特定的细胞疗法的一个重要因素。如果是这样的话,内特定数量的thelial细​​胞可以简单地组织施工过程中加入到所述限定的细胞混合。而系统级的相互作用是细胞的机制完全理解重要的是,工程组织系统提供了一个还原的方法来简化,以系统地处理机制的问题。通过引入相关系统效应,例如白细胞掺入的免疫应答,或通过添加邻近的组织类型来询问旁分泌信号需要复杂可以被添加到所定义的组织系统。

作为一个调查工具,所定义的人工程化的心脏组织系统提供物种特异性的人类细胞的优点,具有控制生物复杂性,收缩功能的直接的和纵向监测仿生的3-D培养环境,和一个定义的细胞和基质组合物。对于HECT系统未来的方向包括操纵利率机智的治疗细胞类型ħ的siRNA或shRNA之前在组织为了研究细胞 - 细胞相互作用的特定分子细节的介绍。此外,不是使用人类胚胎干细胞以形成心脏细胞,有可能在努力在工程化组织相关的心脏疾病的表现模型使用从患者诱导多能干细胞(iPS细胞)与遗传突变。因此,我们的定义与细胞群体创造人类工程心脏组织的方法,有望开辟新的途径为研究心脏细胞疗法,以帮助加速新疗法对患者有心脏疾病的发展。

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Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院(1F30HL118923-01A1)到TJC,NIH / NHLBI PEN合同HHSN268201000045C到KDC,香港TRS T13-706 / 11(KDC),美国国立卫生研究院(R01 HL113499),以BDG,美国的研究资助局的支持心脏协会(12PRE12060254)到RJ和香港研究资助局(TBRS,T13-706 / 11)RL额外的资金由美国国立卫生研究院DRB 5T32GM008553-18并在系统和发展NIDCR,跨学科培训实习提供给TJC生物学与出生缺陷T32HD075735。作者还希望衷心感谢亚瑟Autz在纽约城市学院的赞恩中心协助加工技术援助生物反应器马姆杜Eldaly。我们也感谢肯尼斯Boheler对心脏分化咨询医生,和Joshua野兔博士慷慨地提供人类骨髓间充质干细胞。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

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References

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定义人工程心脏组织建设探讨心肌细胞疗法的机理
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Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

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