This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Cardiac tissue engineering har avancerede kraftigt i det seneste årti, med flere grupper som publicerer resultaterne af fuldt funktionelle, slå væv fremstillet af både murine cardiomyocytter 1-6 og senest, menneskelige stamcelle-afledte hjertemyocytter 7-12. Den hjertevævet ingeniørområdet er drevet af to primære og væsentlige uafhængige mål: 1) at udvikle eksogene podninger, der kan transplanteres ind i svigtende hjerter til at forbedre funktionen 4-6; og 2) at udvikle in vitro modeller til at studere fysiologi og sygdom, eller som screening-værktøjer til terapeutisk udvikling 2,7.
Tre-dimensionel (3-D) cellekultur betragtes som afgørende for at udvikle næste generation af screening-værktøjer, som 3-D matrix afspejler en mere naturlig hjerte-mikromiljø end traditionelle 2-D monolag cellekultur; faktisk nogle aspekter af cellebiologi er fundamentalt anderledes i 2-D vs. 3-D kulturer 13,14 </sup>. Derudover er manipuleret hjertevæv konstrueret af helt definerede komponenter: en ekstracellulær matrix, og en cellepopulation. For traditionelle manipuleret humane hjertevæv, mens den ekstracellulære matrix sammensætning (normalt fibrin 9 eller kollagen 7,8,10) er strengt kontrolleret, input cellesammensætning er mindre veldefineret, med hele blandingen af celler fra en rettet hjertedifferentiering af enten embryonale stamceller (ESC 7,9) eller inducerede pluripotente stamceller (IPSC 10,12) er tilsat til vævene. Afhængigt af den specifikke cellelinie og effektiviteten af differentiering anvendte protokol, kan den resulterende procentdel af cardiomyocytter variere fra mindre end 25% til over 90% af den specifikke cardiomyocyte fænotype (dvs. ventricular-, atrial- eller pacemaker-lignende) kan også variere, selv de ikke-cardiomyocyte fraktion kan være meget heterogen 15,16 og ændre løbetiden for den differentierede hjerte- myocytes 17.
Nylige hjertevæv ingeniørarbejde har forsøgt at styre input population af celler, med enten en human embryonal stamcelle linje kardial reporter 8 eller celleoverflademarkører 18 er anvendt til at isolere den hjertemyocyt komponent af differentiering. Mens det i begyndelsen et væv sammensat af kun hjertemyocytter synes at være det ideelle, dette er i virkeligheden ikke tilfældet; hECTs udelukkende består af hjertemyocytter undlader at komprimere i funktionelle væv, med nogle grupper finde en 3: 1-forhold mellem hjertemyocytter: fibroblaster producerer den højeste ryk kraft 8. Ved hjælp af forskellige celleadskillelsesmetoder, herunder overflademarkører for levende cellesortering, er det muligt at skabe hECTs med definerede cellepopulationer. Mens markører for ikke-kardiale stromaceller har været tilgængelige i nogen tid, såsom det formodede fibroblast markør CD90 19,20, har overflademarkører af hjertemyocytter været vanskeligereat identificere. SIRPα var blandt de første kardiale overflademarkører identificeret for humane hjertemyocytter 18 og har vist sig at være yderst selektiv for hjertets afstamning. For nylig har vi fundet, at dobbelt-sortering for SIRPα + og CD90 – celler giver næsten rene cardiomyocytter, med CD90 + population udviser en fibroblastlignende fænotype (Josowitz, upublicerede observationer). Baseret på disse indsamlede resultater, heri beskriver vi skabe hECTs anvendelse af en 3: 1 blanding af SIRPα + / CD90 – cardiomyocytter og CD90 + fibroblaster.
Evnen til at konstruere en helt defineret menneske hjertevæv er afgørende ikke kun for at skabe robuste screening-værktøjer, men også for at udvikle modelsystemer til at undersøge nye celle- og genbaserede hjerte- behandlinger. Især talrige celleterapi til hjertesvigt, udnytte celletyper, herunder mesenchymstamceller (MSC) 21 </sup>, kardiale stamceller 22 og knoglemarvsceller mononukleære celler 23-25, er blevet testet i kliniske forsøg. Mens mange af de første resultater er lovende 21,23,25, den oprindelige ydelse ofte mindskes med tiden 26-29. En lignende udvikling er blevet rapporteret i murine manipuleret hjertevæv, som viser en betydelig funktionel fordel på grund af MSC tilskud, men fordelen er ikke opretholdes under langvarig kultur en. Underliggende sub-optimal ydeevne er vores begrænsede viden om de mekanismer, der styrer celleterapi. En dybere forståelse af, hvordan terapeutisk celler udøve deres gavnlige indflydelse, såvel som potentielle negative konsekvenser af myocyt-nonmyocyte interaktioner, ville muliggøre udviklingen af bedre behandlinger giver klinisk signifikante og vedvarende fordele, med minimale bivirkninger, for patienter med hjertesvigt.
Her beskriver vi brugen af definerede hECTs at interrogspiste mekanismer for celle-baseret behandling. Den kontrollerede væv sammensætning er afgørende for at identificere specifikke faktorer, der påvirker cardiomyocyte ydeevne. Direkte supplere hECTs med den terapeutiske celletype af interesse (f.eks MSC), kan afsløre virkningerne på hjertemyocyt ydeevne, som vi har vist i rotte ECTS 1.
Følgende multi-trins protokol begynder med rettet cardiac stamcelle differentiering, efterfulgt af fremstilling af multi-væv bioreaktor, og afsluttende med en beskrivelse af væv konstruktion og funktionel analyse. Vores eksperimenter udføres ved hjælp af NIH-godkendte H7 humane embryonale stamceller (embryonale) linje. Imidlertid har de følgende protokoller også blevet testet under anvendelse af en yderligere embryonale linje og tre induceret pluripotente stamcelle (hiPSC) linjer med lignende resultater. Vi har fundet, at effektiviteten i cardiomyocyte differentiering og succes i hek fabrikation kan være cellelinje afhængig, især for hiPSC linjer afledt af individuelle patienter. Ved at følge denne protokol, er to 6-brønds skåle belagt med i alt 1,68 mio hESCs (140.000 celler per brønd), hvilket giver ca. 2,5 millioner myocytter efter differentiering i 20 dage og sortering, nok til at gøre seks definerede væv.
Konstruktion af definerede humane manipuleret hjertevæv (hek) kan give en mere konsekvent og pålidelig model af menneskets hjertemyocyt funktion. Kritisk, er alle cellulære og ekstracellulære komponenter i systemet kendt og kan manipuleres som ønsket, og dermed fjerne den confounding indflydelsen fra andre ukendte celletyper som følge af differentieringsprocessen. Til afbalancering hurtig cellevækst og højt udbytte, er det foretrukket, at differentieringen starter ved 75% sammenløb af hESCs, ideelt fire dage ef…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH (1F30HL118923-01A1) til TJC, NIH / NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C til KDC, forskningsbevillingen råd Hongkong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) til BDG, den amerikanske heart Association (12PRE12060254) til RJ, og Research Grant Råd Hongkong (TBR'er, T13-706 / 11) til RL Yderligere finansiering blev givet til TJC af NIH DRB 5T32GM008553-18 og som et praktikophold på NIDCR-Tværfaglig uddannelse i systemer og Developmental Biologi og fødselsdefekter T32HD075735. Forfatterne ønsker også at takker Arthur Autz på The Zahn centrum af byen College of New York for at få hjælp med bearbejdning bioreaktoren og Mamdouh Eldaly til teknisk bistand. Vi takker også Dr. Kenneth Boheler for rådgivning om hjerte-differentiering, og Dr. Joshua Hare for generøst giver humane mesenkymale stamceller.
Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
Polysulfone | McMaster-Carr | ||
Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |