Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cardiac tissue engineering har avancerede kraftigt i det seneste årti, med flere grupper som publicerer resultaterne af fuldt funktionelle, slå væv fremstillet af både murine cardiomyocytter 1-6 og senest, menneskelige stamcelle-afledte hjertemyocytter 7-12. Den hjertevævet ingeniørområdet er drevet af to primære og væsentlige uafhængige mål: 1) at udvikle eksogene podninger, der kan transplanteres ind i svigtende hjerter til at forbedre funktionen 4-6; og 2) at udvikle in vitro modeller til at studere fysiologi og sygdom, eller som screening-værktøjer til terapeutisk udvikling 2,7.

Tre-dimensionel (3-D) cellekultur betragtes som afgørende for at udvikle næste generation af screening-værktøjer, som 3-D matrix afspejler en mere naturlig hjerte-mikromiljø end traditionelle 2-D monolag cellekultur; faktisk nogle aspekter af cellebiologi er fundamentalt anderledes i 2-D vs. 3-D kulturer 13,14 9 eller kollagen 7,8,10) er strengt kontrolleret, input cellesammensætning er mindre veldefineret, med hele blandingen af celler fra en rettet hjertedifferentiering af enten embryonale stamceller (ESC 7,9) eller inducerede pluripotente stamceller (IPSC 10,12) er tilsat til vævene. Afhængigt af den specifikke cellelinie og effektiviteten af differentiering anvendte protokol, kan den resulterende procentdel af cardiomyocytter variere fra mindre end 25% til over 90% af den specifikke cardiomyocyte fænotype (dvs. ventricular-, atrial- eller pacemaker-lignende) kan også variere, selv de ikke-cardiomyocyte fraktion kan være meget heterogen 15,16 og ændre løbetiden for den differentierede hjerte- myocytes 17.

Nylige hjertevæv ingeniørarbejde har forsøgt at styre input population af celler, med enten en human embryonal stamcelle linje kardial reporter 8 eller celleoverflademarkører 18 er anvendt til at isolere den hjertemyocyt komponent af differentiering. Mens det i begyndelsen et væv sammensat af kun hjertemyocytter synes at være det ideelle, dette er i virkeligheden ikke tilfældet; hECTs udelukkende består af hjertemyocytter undlader at komprimere i funktionelle væv, med nogle grupper finde en 3: 1-forhold mellem hjertemyocytter: fibroblaster producerer den højeste ryk kraft 8. Ved hjælp af forskellige celleadskillelsesmetoder, herunder overflademarkører for levende cellesortering, er det muligt at skabe hECTs med definerede cellepopulationer. Mens markører for ikke-kardiale stromaceller har været tilgængelige i nogen tid, såsom det formodede fibroblast markør CD90 19,20, har overflademarkører af hjertemyocytter været vanskeligereat identificere. SIRPα var blandt de første kardiale overflademarkører identificeret for humane hjertemyocytter 18 og har vist sig at være yderst selektiv for hjertets afstamning. For nylig har vi fundet, at dobbelt-sortering for SIRPα + og CD90 - celler giver næsten rene cardiomyocytter, med CD90 + population udviser en fibroblastlignende fænotype (Josowitz, upublicerede observationer). Baseret på disse indsamlede resultater, heri beskriver vi skabe hECTs anvendelse af en 3: 1 blanding af SIRPα + / CD90 - cardiomyocytter og CD90 + fibroblaster.

Evnen til at konstruere en helt defineret menneske hjertevæv er afgørende ikke kun for at skabe robuste screening-værktøjer, men også for at udvikle modelsystemer til at undersøge nye celle- og genbaserede hjerte- behandlinger. Især talrige celleterapi til hjertesvigt, udnytte celletyper, herunder mesenchymstamceller (MSC) 21 22 og knoglemarvsceller mononukleære celler 23-25, er blevet testet i kliniske forsøg. Mens mange af de første resultater er lovende 21,23,25, den oprindelige ydelse ofte mindskes med tiden 26-29. En lignende udvikling er blevet rapporteret i murine manipuleret hjertevæv, som viser en betydelig funktionel fordel på grund af MSC tilskud, men fordelen er ikke opretholdes under langvarig kultur en. Underliggende sub-optimal ydeevne er vores begrænsede viden om de mekanismer, der styrer celleterapi. En dybere forståelse af, hvordan terapeutisk celler udøve deres gavnlige indflydelse, såvel som potentielle negative konsekvenser af myocyt-nonmyocyte interaktioner, ville muliggøre udviklingen af ​​bedre behandlinger giver klinisk signifikante og vedvarende fordele, med minimale bivirkninger, for patienter med hjertesvigt.

Her beskriver vi brugen af ​​definerede hECTs at interrogspiste mekanismer for celle-baseret behandling. Den kontrollerede væv sammensætning er afgørende for at identificere specifikke faktorer, der påvirker cardiomyocyte ydeevne. Direkte supplere hECTs med den terapeutiske celletype af interesse (f.eks MSC), kan afsløre virkningerne på hjertemyocyt ydeevne, som vi har vist i rotte ECTS 1.

Følgende multi-trins protokol begynder med rettet cardiac stamcelle differentiering, efterfulgt af fremstilling af multi-væv bioreaktor, og afsluttende med en beskrivelse af væv konstruktion og funktionel analyse. Vores eksperimenter udføres ved hjælp af NIH-godkendte H7 humane embryonale stamceller (embryonale) linje. Imidlertid har de følgende protokoller også blevet testet under anvendelse af en yderligere embryonale linje og tre induceret pluripotente stamcelle (hiPSC) linjer med lignende resultater. Vi har fundet, at effektiviteten i cardiomyocyte differentiering og succes i hek fabrikation kan være cellelinje afhængig, især for hiPSC linjer afledt af individuelle patienter. Ved at følge denne protokol, er to 6-brønds skåle belagt med i alt 1,68 mio hESCs (140.000 celler per brønd), hvilket giver ca. 2,5 millioner myocytter efter differentiering i 20 dage og sortering, nok til at gøre seks definerede væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: Udfør alle celle manipulationer i aseptiske betingelser ved hjælp af et HEPA-filtreret klasse II biologiske sikkerhed kabinet og sterilisere alle løsninger ved at filtrere dem gennem et 0,2 um filter. Udfør væv konstruktion og funktion test i enten den samme aseptiske betingelser eller en laminar flow hætte.

1. Såning af H7 hESCs i Forberedelse til Cardiac Differentiering

  1. (Dag 1) Forberedelse basalmembranen Matrix
    1. Tø 150 pi alikvot af embryonale kvalificeret basalmembranmatrix på is natten over ved 4 ° C.
  2. (Dag 0-4) Plating af hESCs på plader
    1. Fortynd den optøede matrix i 12 ml iskold DMEM / F12 og bland godt.
    2. Transfer 1 ml af DMEM / F12-matrix-opløsning i hver brønd i en 6-brønds vævskulturbehandlet skålen. Hver alikvot af matrix dåse coat to plader med 6 brønde.
    3. Inkubér coatede plader ved stuetemperatur i mindst 1 time.
      Bemærk: Ivores erfaring, kan coatede retter forseglet med paraffin opbevares i matrix-opløsning ved 4 ° C i op til 10 dage før brug.
    4. På cirka 75% sammenløb, dissociere H7 hESCs fra 10 cm skål under anvendelse af 6 ml af den ikke-enzymatisk dissociation reagens. Efter 5 minutter forsigtigt skrabe cellerne fra kulturen overflade under anvendelse af en engangs celleskraber og overføre cellesuspensionen til et sterilt 15 ml centrifugerør.
    5. Fjern 0,5 ml af dissocieringsopløsning med cellerne fra 15 ml rør og overføres til en ny steril 15 ml rør (forlader 5,5 ml af dissociation reagens til yderligere dissociere hESCs) til stamcellelinie formering.
    6. Pelletere 0,5 ml celler ved 300 xg i 5 minutter ved 20 ° C. Fjern supernatanten og forsigtigt resuspender i 8 ml pluripotente stamcelle medium indeholdende 1% penicillin-streptomycin derefter overføre til en ny, overtrukket, 10 cm vævskulturskål og opretholde 37 ° C og 5% CO2 for at opretholde stamcellelinje.
      Bemærk: Hold pluripotente stamceller medier på is under medieændringer.
    7. I mellemtiden tilsættes 5,5 pi 10 mM ROCK inhibitor Y-27632 til den resterende 5,5 ml dissocieringsopløsning og fortsætte med at inkubere ved stuetemperatur i yderligere 5-10 min. Bland forsigtigt cellerne med en 5 ml serologisk pipette. Fortsæt med at inkubere, indtil en enkelt cellesuspension opnås, derefter pelletere cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    8. Resuspender cellerne i 5 ml pluripotente stamceller medier og udføre en celletælling under anvendelse af et hæmocytometer.
    9. Frø hver brønd i 6-brønds skål med en tæthed på 140.000 celler pr. Seed to 6-brønds plader for at skabe alt seks definerede væv. Bortskaf eventuelle resterende celler efter plating.
    10. Fyld godt til 1 ml med pluripotente stamceller medier og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Fireogtyve timer senere, fjernes mediet og tilsæt 2 ml frisk pluripotente stamceller medier til hver brønd (figur 1A
    11. Check sammenløbet af pladerne hver dag og begynder differentieringen når cellerne når ca. 75% konfluens (figur 1B - D).

2. (dag 4-24) Differentiering af humane embryonale stamceller til cardiomyocytter 30,31

  1. (Dag 4-7, Differentiering Day 0-3) Mesoderm Induktion
    1. Forbered RPMI differentiering medier I (tabel 1) ved at kombinere 500 ml RPMI 1640 med 10 ml B27 supplement (uden insulin) og 5 ml penicillin-streptomycin-stamopløsning (10.000 IE / ml penicillin, 10.000 pg / ml streptomycin). Alikvot, på is, i 50 ml rør og opbevares ved 4 ° C.
    2. (Dag 4 Differentiering dag 0) Forbered mesoderm induktion medier ved tilsætning 2,4 pi af lille molekyle GSK3 inhibitor CHIR99021 (10 mM stamopløsning, 6 uM slutkoncentration) til 12 ml RPMI differentieringsfaktorer medier I. Fjern pluripotente stamcelle medier fra hver brønd -ennd erstatte med 2 ml af mesoderm induktion medier per brønd. Returnere pladen til inkubatoren.
      Bemærk: Signifikant celledød forekommer typisk med tilsætning af CHIR99021 (figur 1E). Monolaget vil komme sig, men det er vigtigt at skylle de døde celler væk med DMEM / F12 skyl.
    3. (Dag 5, Differentiering dag 1) Friske mesoderm induktion medier som beskrevet ovenfor. Fjern de gamle medier fra hver brønd og skylles en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønd. Tilsæt 2 ml frisk mesoderm induktion medier til hver brønd.
      Bemærk: Skylning hver dag fra dag 0-10 øger udbytte og renhed af de hjertemyocytter.
    4. (Dag 6, Differentiering Dag 2) Fjern de kardiale induktion medier og skyl gang med 1 ml DMEM / F12 per brønd. Udskift skylning med 2 ml RPMI differentiering medier I (ingen små molekyler tilføjet, men stadig med B27 (uden insulin) supplement) og vende tilbage til inkubatoren.
  2. (Dag 7-13, Differentiation Day 3-10) Cardiac Mesoderm Induktion
    1. (Dag 7, Differentiering Dag 3) Forbered cardiac mesoderm induktion medier ved at tilføje 6 pi af det lille molekyle Wnt inhibitor IWR-1 (10 mM lager, 5 uM endelig) til 12 ml RPMI differentiering medier I.
    2. Fjern mediet fra hver brønd, skylles en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønd og erstatte med 2 ml hjerte-mesoderm induktion medier per brønd.
    3. (Dag 8, Differentiering Dag 4) Forbered yderligere 12 ml hjerte-mesoderm induktion medier som beskrevet ovenfor. Fjern mediet tilsat dagen før, skylles en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønd og erstatte med 2 ml frisk kardial mesoderm differentiering medier per brønd og vende tilbage til inkubatoren.
    4. (Dag 9-10, Differentiering Day 5-6) På begge dage, fjerne hjerte-mesoderm induktion medier og skyl hver godt med 1 ml DMEM / F12.
    5. Tilsæt 2 ml frisk RPMI differentiering medier I (ingen små molekyler tilføjet, men stadig med B27 (uden insulin) supplement)til hver brønd og returnere pladen til inkubatoren.
  3. (Dag 11-24, Differentiering Day 7-20) hES afledt hjertemyocyt Organization / Modning
    1. Forbered RPMI differentiering medier II (tabel 1) ved at kombinere 500 ml RPMI 1640 med 10 ml B27 supplement (med insulin) og 5 ml penicillin-streptomycin-stamopløsning. Alikvot, på is, i 50 ml rør og opbevares ved 4 ° C.
    2. (Dag 11, Differentiering Dag 7) Fjern RPMI differentiering medier (uden insulin) fra hver brønd og skyl med 1 ml DMEM / F12. Udskift med 2 ml af den nye RPMI differentiering medier II (med insulin) til hver brønd og vende tilbage til inkubatoren.
      Bemærk: skal først bemærkes Spontan slå mellem dag 7 og 10. Hvis ikke overholdes slå i løbet af denne tid, er det typisk indikerer dårlig differentiering effektivitet. Protokollen kan fortsættes indtil dag 15 i et forsøg på at observere slå, men hvis ingen bankende overholdes af dag 15 er det bedst at stteknik Et nyt differentiering.
    3. (Dag 12-24, Differentiering Dag 8-20) Hver dag, fjerne de gamle differentiering medier og erstatte med 2 ml frisk RPMI differentiering medier II per brønd for at tillade celle modning og organisering af det bankende monolag (figur 1F, Video Figur 1 ).
      Bemærk: Afhængigt af den resterende celledød, kan det være nødvendigt at skylle med 1 ml DMEM / F12 gennem differentiering dag 10.

3. (dag 24, Differentiering Dag 20) Isolering af hjertemyocytter og fibroblast-lignende celler

  1. Dissociere celler fra monolaget
    1. Fjern differentierings- medier og skyl en gang med 1 ml PBS.
    2. Dissociér monolagene med 1 ml af den enzymatiske dissociation opløsning (0,04% trypsin / 0,03% EDTA) til hver brønd.
    3. Flyt pladen i kuvøse i 10 min. I mellemtiden tilsættes 12 pi ROCK inhibitor til 6 ml trypsin neutralisering opløsning.
    4. gently tilsættes 1 ml af trypsin neutralisering opløsningen indeholdende ROCK inhibitor til hver brønd i pladen for at neutralisere trypsin opløsning.
    5. Ved hjælp af en steril overførsel pipette, bland forsigtigt hver brønd for at bryde ud af celleklynger.
    6. Overfør alle 12 ml fra 6-brønds plade til en 15 ml centrifugerør.
      Bemærk: Da to 6-brønds plader anvendes i denne protokol, vil der være behov for to 15-ml rør.
    7. Transfer 3 ml PBS i en brønd i pladen, og derefter sekventielt overføre de samme 3 ml til hver efterfølgende brønd til opsamling eventuelle resterende celler på skålen. Overfør de resterende 3 ml fra endelige brønd i det samme 15 ml centrifugerør indeholdende cellerne.
    8. Pellet ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  2. Forbered Celler til Live Cell Sorting ved FACS
    1. Forbered farvning puffer ved tilsætning af 5 ml føtalt bovint serum til 45 ml PBS på is med 50 pi af ROCK inhibitor.
    2. Fjern supernatanten fra cellen pelLad (i 3.1.8) og resuspender i 1,2 ml farvningsbuffer.
    3. Overfør 200 pi af cellesuspensionen i et nyt, præ-kølet, 50 ml centrifugerør på is. Dette vil være den negativ farvning kontrol.
    4. Overfør den resterende 1 ml cellesuspension til en ny, præ-kølet, 50 ml centrifugerør på is, og der tilsættes 2 pi SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 fortynding) og 4 pi CD90-FITC (1: 250 fortynding) . Bland forsigtigt cellesuspensionen med en overførsel pipette og vende tilbage til isen.
    5. Inkuber både den negative kontrol og prøve, på en rocker shaker, på is ved 4 ° C i 1 time.
    6. Forbered prøvetagningsrør ved tilsætning 3 ml RPMI medier (med insulin) til to 15 ml centrifugerør. Tilsæt 3 pi ROCK inhibitor til hvert rør og opbevares på is.
    7. Pelletere farvede celler ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C og skylles to gange med mindst 10 ml iskold PBS pr skylning.
    8. Tilsæt 1 pi DAPI (1 ug / ml) til 5 ml farvning puffer. forsigtigtresuspender prøven pellet med 1-3 ml af DAPI-holdige farvning puffer under anvendelse af en overførselspipette.
    9. Der tilsættes 500 pi farvning puffer (uden DAPI tilsat) til den negative kontrol.
    10. foretage forsigtigt både den negative kontrol og prøve gennem en 40 um cellefilter at fjerne klumper af celler og overførsel til polystyren FACS-rør på is. Straks bringe prøver til cellen sorteringsanlæg.
    11. Lignende til etablerede levende celle sortering metoder 18, bruge den negative kontrol til at indstille portene, skal du vælge for levende celler (DAPI negativ) og indsamle både FITC + (dvs. CD90 + fibroblaster) og PE / Cy7 + (dvs. SIRPα + cardiomyocytter ) populationer uafhængigt ved 20 psi (figur 2).
      Bemærk: Efter indstilling portene, kan den negative kontrol fastsættes i 4% PFA at bestemme differentiering effektivitet ved farvning for kardial troponin-T.
      Bemærk: Nogle forskere foretrækker at bruge enisotypekontrol snarere end ufarvet kontrol over indstillingen portene for at kompensere for ikke-specifik antistofbinding. En såkaldt fluorescens minus én (FMO) kontrol er en anden mulighed. På grund af den klare bimodale fordeling af FITC, DAPI og PE-Cy7 signaler, vi gated fra den positive population, konservativt sigter langt ind i positive port, der muligvis udelukker nogle sande positive, men er med til at minimere eventuelle falske positiver.
  3. Cell reaggregation i Forberedelse til Tissue Engineering
    1. Efter celle sortering, pelletere både opsamlingsrør og resuspender i 1 ml DMEM indeholdende 10% Neonatal Bovine Serum, 1% penicillin-streptomycin og 0,2% amphotericin B ( "NBS media").
    2. Rekombinere den SIRPα + og CD90 + celler i en 3: 1-forhold og plade de kombinerede celler i en ikke-vævskulturbehandlet petriskål med en tæthed på 2 millioner celler pr 60 cm2 (10 cm skål). Der tilsættes 10 ml NBS medier og 101 l af ROCK inhibitor Y-27632.
    3. Placer cellesuspension i vævskultur inkubator i 48 timer for at tillade celle reaggregation i små klynger.

4. Humant Cardiac Engineering Tissue

  1. Fabrikere Multi-væv bioreaktor
    Bemærk: Som supplement til de illustrationer i figur 3A, CAD-filer med detaljeret bioreaktor design diagrammer er tilgængelige efter anmodning fra forfatterne.
    1. Maskine PDMS mester mug ved at bore seks jævnt fordelte huller mm i diameter 0.5 i en 9 x 33 x 3,25 mm kasse af polytetrafluorethylen.
    2. Ved hjælp af en endefræser, maskine en ramme fra polysulfon måler 25 x 35 x 11 mm 3. Formålet med rammen er at holde PDMS stillinger (konstrueret ud fra det støbte gjort ovenfor) på linie med brøndene i bundpladen.
    3. Anvendelse af en 1-mm endefræser, machine 6 brønde (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm fra hinanden i en 20 x 40 x 5 mm 3 stykke sort polytetrafluorethylen til dannelse bundpladen.
    4. Bland elastomer base og hærder for polydimethylsiloxan (PDMS) i en 10: 1 vægt / vægt-forhold og tilføje til den tilpassede polytetrafluorethylen formen (trin 4.1.1) for at skabe to rækker af seks trykfølsomme stillinger, og inkuberes natten over og under vakuum ved 80 ° C. Efter hærdning forsigtigt fjerne PDMS fra master mug og omhyggeligt markere toppen af ​​hvert indlæg med en sort permanent markør for øget kontrast og automatiseret realtid indlæg afbøjning tracking.
      Bemærk: polytetrafluorethylen er temmelig bløde og kan nemt blive beskadiget. Vær forsigtig ved rengøring master skimmel før PDMS støbning for at sikre lang levetid af systemet og konsekvent PDMS indlæg geometri. En 0,5 mm tråd kan bruges til at rense hullerne til stolperne efter hver brug, men passe til at skrabe indersiden af ​​hullerne.
      Bemærk: Et alternativ er at afgasse PDMS under vakuum i adskillige timer ved stuetemperatur, derefter lade blandingen hærdning ved omgivelsernes tryk.Dette kan føre til færre residuale gasbobler formning i PDMS under hærdningsprocessen.
    5. Sterilisere alle komponenter i en Steam Autoklave.
      Bemærk: Det PDMS Master skimmel (trin 4.1.1) og polysulfon ramme (trin 4.1.2) er både genanvendelige. PDMS stillinger oprettet fra cast (trin 4.1.4) er også genbruges, men kun i ca. 10 anvendelser. Dog kan oprettes flere PDMS indlæg efter behov ved hjælp master mug.
  2. Saml Reaggregated hjerteceller
    1. Fjern de reaggregated celler fra inkubatoren og overdrager 10 ml af reaggregering medier til et 50 ml centrifugerør.
    2. Skyl pladen med 3 ml PBS og overfør skylning til den samme 50 ml centrifugerør indeholdende reaggregering medier.
    3. Tilsæt 3 ml 0,04% trypsin / 0,03% EDTA til 10 cm skål og vende tilbage til inkubatoren i 5 min.
    4. Efter 5 min, undersøge pladen med en omvendt sammensat mikroskop ved 10X forstørrelse for at sikre fuldstændig celle dissociation fra fadet. Hvis nogle resterende klynger stadig er fastgjort, ryst forsigtigt pladen at frigøre klumper. Hvis klyngerne forbliver fastgjort, vender tilbage til inkubatoren i yderligere 2-3 min. Må ikke inkuberes længere end ti minutter eller betydelig celledød kan forekomme.
    5. Når alle celler er fritliggende, tilsættes 3 ml trypsin neutralisering opløsning. Bland forsigtigt neutralisering opløsning med trypsin-celle-opløsning og overføres til 50 ml centrifugerør indeholdende reaggregering medier og skyl gang med PBS.
    6. Skyl hele skålen med 5 ml PBS og overførsel til den samme 50 ml rør indeholdende cellerne.
    7. Pelletere cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    8. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 1 ml NBS medier, derefter overføre til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    9. Pelletere ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten. De kardiale celler (CD90 + stromale celler og SIRPα + myocytes) er nu klar til væv konstruktion.
  3. (Valgfrit) Saml Supplerende Celler af interesse
    Bemærk: Ud over de definerede væv, der kun indeholder SIRPα + cardiomyocytter og CD90 + fibroblastlignende celler, er det muligt at tilføje yderligere celler af interesse at forhøre deres virkning på vævsfunktion. For eksempel rotte MSC'er er blevet vist at forbedre funktionen af rotte manipuleret hjertevæv 1. Følgende eventuelt trin beskriver samlingen af ​​supplerende celler til det definerede system.
    1. Saml den supplerende celletype af interesse (f.eks mesenkymale stamceller) anvendelse af 0,25% trypsin / 0,1% EDTA.
    2. Pelletere cellerne ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur og derefter resuspenderes i 5 ml passende celledyrkningsmedier for celletypen af ​​interesse. For eksempel for MSC'er, bruge DMEM suppleret med 20% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 0,2% amphotericin-B til kultur calen.
    3. Udfør en celletælling under anvendelse af et hæmocytometer, derefter pelletere cellerne igen ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Fjern supernatanten, resuspender i 1 ml cellekultur medier og overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    5. Pelletere cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    6. Fjern supernatanten. De supplerende celler er nu klar til væv konstruktion.
      Bemærk: Hvis supplerende celler tilsættes i en koncentration på 10% af det samlede celleantal i vævet, så for de definerede væv, dette vil kræve 50.000 supplerende celler pr væv som hvert væv indeholder 500.000 hjerteceller (både CD90 + stromaceller og SIRPα + myocytter).
  4. Opret Human Engineered hjertevæv
    Bemærk: Opbevar alle løsninger på is, og cellerne ved stuetemperatur. Alle nedennævnte mængder er pr væv. Typisk kan ca. seks væv konstrueres af to 6-brønds plater af hjerte-differentieringer.
    1. Fortynd 60,0 pi af 5 mg / ml collagen lager til 3,125 mg / ml med 1,5 pi 1 M NaOH, 9,6 pi 10x PBS og 24,9 pi sterilt ultrarent deioniseret vand.
      Kritisk skridt: Undgå at indføre luftbobler til hver løsning under forberedelse som luftbobler vil forstyrre ordentlig vævsdannelse.
    2. Tilføj 12,0 pi af både 10x MEM og 0,2 N HEPES pH 9 til den fortyndede kollagen blandingen at skabe kollagen mix. Tilføj begge opløsninger ned langs siden af ​​den 15 ml centrifugerør for at undgå indføring af luftbobler i kollagen mix.
    3. Tilsæt basalmembranmatrix til en slutkoncentration på 0,9 mg / ml til kollagen mix og gemme på is for at skabe den endelige væv mix. Den endelige koncentration af kollagen skal være 2 mg / ml.
    4. Tilføj 500.000 af de reaggregated celler til vævet mix (myocyt + fibroblast koncentration er 20 millioner / ml) og fyld til et endeligt volumen på 25 pi prvæv med enten cellefri NBS medier eller 50.000 celler af den supplerende celletype af interesse (f.eks hMSC'er) og blandes godt til dannelse af en jævn cellesuspension.
      Bemærk: Antallet af suppleret celler vil variere fra til forskellige applikationer. Her anvendes 10% tilskud.
    5. Med omhu, pipette 25 pi af cellesuspensionen til hver af de seks brønde i bioreaktoren sokkel, uden at indføre luftbobler i brønden.
    6. Skub to rækker af PDMS kraftsensorer på hver side af polysulfon ramme, som danner 6 par modstående stillinger, derefter vendes rammen oven på basispladen, så det ene par af stillinger kommer ind hver brønd indeholdende den celle suspension.
      Bemærk: polysulfon ramme indeholder faner for at hjælpe i tilpasningen af ​​PDMS.
    7. Placer forsigtigt bioreaktor, bundpladen ned, ind i en 60 mm skål, og derefter placere fadet uden dens dækning inde i en 10 cm skål, placere 10 cm dækslet på toppen, og flytte hele bioreaktor forsamling itil vævskultur inkubator, venter to timer for væv til gel.
    8. Efter 2 timer fjernes bioreaktor fra inkubatoren, og der tilsættes 14 ml NBS medier til hele forsamlingen, nok til at dække bundpladen. Vend tilbage til kuvøsen, og ændre halvdelen af ​​medierne hver dag.
    9. Otteogfyrre timer senere, forsigtigt fjerne bundpladen ved forsigtigt at bevæge hver side af bundpladen af ​​rammen et par millimeter ved en tid ændre mediet, derefter returnere bioreaktoren, væv nedad, til medierne.
    10. Fortsæt skiftende halvdelen af ​​NBS dyrkningsmedier hver dag.
      Bemærk: kan observeres Spontane sammentrækninger af vævet så tidligt som 3 dage efter væv konstruktion, genererer målbare ryk kræfter så tidligt som dag 5 til 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at opnå hjertemyocytter, er en let modificeret version af Boheler og Lian differentiering metoder 30,31. Det er bydende nødvendigt, at differentieringen starter under log-fase af cellevækst, men også at startpopulationen er tilstrækkeligt konfluent at opnå et brugbart antal celler efter sortering (ca. 75% er optimalt). Typisk for H7 hESCs, udpladning med en tæthed på 140.000 hESCs pr brønd af en 6-brønds skål i væsentlig 8 medier og 5% CO2 inkubator holdt ved 37 ° C giver tilstrækkeligt konfluerende kulturer efter 4 dage til at begynde differentieringen, som illustreret i figur 1A - D. Da insulin hæmmer hjerte-specifikation under differentiering processen 32, insulin frie medier (differentiering medier I, tabel 1) anvendes til de første 10 dage af differentiering. Når differentiering er initieret via anvendelsen af ​​GSK3 inhibitor CHIR99021,betydelig celledød vil forekomme (figur 1E). Som en konsekvens er det vigtigt at ændre mediet hver dag. På dag 2 af differentiering cellerne fjernes fra CHIR99021 og (uden tilsat små molekyler) i 24 timer hvilede i differentiering medier jeg. Efter 24 timers hvile i differentiering medier cellerne behandlet med IWR-1 i 48 timer, hvorefter de begynder at selv-organisere sig i klynger (figur 1F), der slog så tidligt som syv dage at starte differentiering. Da cardiac specifikation er opstået efter anvendelsen af IWR-1, er medierne ændret til medier indeholdende insulin (differentiering medier II, tabel 1). Ved 18 dages differentiering, har kolonier af bankende celler forbundet og delvist løsrevet fra celleoverfladen, danner robust slå "webs" i hele skålen (Video Figur 1).

På dag 20 er det bankende monolag forsigtigt dissocieret VIet enzymatiske metoder til at opnå enkelte celler til levende fluorescerende associeret cellesortering (FACS). Brug af differentiering beskrevet ovenfor, vi konservativt høste ca. 65% af befolkningen som SIRPα + og 10% som CD90 + (figur 2). Generelt opnås 1-2 millioner SIRPα + -celler pr plade med 6 brønde.

Efter reaggregation i 48 timer i en 3: 1-forhold mellem SIRPα +: CD90 + celler, bliver de definerede celleaggregater blandet med et collagen-baseret hydrogel og afpipetteret i smalle brønde i bundpladen af multi-væv bioreaktor. Typisk før fjernelse fra skålen, små klynger af 5-10 celler vil blive set slå på overfladen af ​​skålen. Den definerede væv bioreaktor består af tre komponenter: en master støbeform til at afgive de PDMS stillinger; en ramme til at holde to PDMS racks af stillinger; og en sort polytetrafluorethylen basisplade indeholdende seks brønde til vævet mix (Figure 3A). Hele væv byggeprocessen udføres på is og i aseptiske forhold. Efter tilsætning af de flydende celle-matrix-blandinger til brøndene i grundpladen, er PDMS stillinger fastgjort til polysulfon rammen, og omvendt, således at stolperne på linie med brøndene i bundpladen (figur 3B). Efter 48 timers inkubation, bør vævene være tilstrækkeligt komprimeret, at bundpladen kan fjernes. Bundpladen er lettest løsrevet ved at udtrække hele systemet fra medierne og forsigtigt fjerne overskydende medier fra mellem PDMS og bundplade. Hvis alle mediet ikke er fjernet, kan overfladespændingen af ​​den resterende væske trække vævene off stolperne. Når mediet er fjernet, forsigtigt skubbe bundpladen tilbage mod PDMS stillinger for at hjælpe løsne vævet fra bundpladen. Derefter gradvist skubbe bundpladen ud ved forsigtigt at flytte en side op et par millimeter, så den anden side op på samme beløb. Gentag denne proces, indtil baseplate fjernes, med alle 6 hECTs knyttet til deres respektive PDMS endelige stillinger (figur 4A). Fjernelse bundpladen bør ikke tage mere end et minut. Erstat systemet i celledyrkningsmediet, inverteret, således at alle væv er dækket af cellekulturmediet.

Ca. en dag efter fjernelse af bundpladen, bør svage lokaliserede sammentrækninger kunne ses i de definerede hECTs under lysfeltmikroskopi. Efter 7 dage, har vævene modnet og komprimeret (figur 4B-C) med flugtende sarkomerer (figur 4D). Væv synligt afbøje PDMS indlæg med et gennemsnit på 5-15 μN af kraft (figur 4E). Twitch kraftmålinger for de definerede manipuleret hjertevæv kan måles ved real-time tracking af stolpen spids afbøjning med en høj hastighed erhvervelse kamera og brugerdefinerede data software, og anvendelse stillingen afbøjning til stråle bøjning teori, efter at derYoungs modul af silikone stillinger ved hjælp af en krafttransducer, som forklaret mere detaljeret tidligere. 1,7 Opretholdelse sterilitet under dataopsamling sikrer evnen til at måle ændringer i vævsfunktion over tid. Vi har opretholdt funktionelle væv i flere uger, som forklaret mere detaljeret andetsteds 1. Vores foreløbige resultater indicerer en betydelig forøgelse af hek kontraktil kraft, når væv er suppleret med 10% humane mesenchymstamceller ved både 1 Hz og 2 Hz pacing frekvenser (Figur 4F).

Figur 1
Figur 1: Repræsentative billeder af H7 hESCs under ekspansion og hjerte-differentiering proces. Udvidelsen fase skal vare 4 dage, med vækst af kolonierne ekspanderende fra 24 (A), til 48 (B), 72 (C (D). Efter 96 timers vækst differentiering er begyndt, hvilket resulterer i betydelig celledød i den første 48 timers af CHIR99021 behandling (E). Efter to dages IWR-1 behandling, reorganisering forekommer (F) til dannelse af klynger af celler, der slog så tidligt som dag 7. Yderligere organisation til en robust slå "web" sker fra dag 7 til dag 20, når monolagene dissocieres til skabe manipuleret hjertevæv.

Video Figur 1:. Repræsentant cardiac monolag efter 17 dages differentiering . Klik her for at se denne video Spontan slå i monolag er normalt først observeret mellem dag 7 og dag 10, og med 17 dages differentiering monolaget har dannet sammenkoblede "webs "ramte robust.

Navn Sammensætning Differentiering dag bruges
Differentiering Media I RPMI 1640
B27 Supplement (minus insulin)
Penicillin-streptomycin
D0-D1 (med CHIR99021)
D2
D3-D5 (med IWR-1)
D5-D7
Differentiering Media II RPMI 1640
B27 Supplement (med insulin)
Penicillin-streptomycin
D7-D20

Tabel 1: Sammensætning af differentiering Medias.

Figur 2
Figur 2: Repræsentativ levende celle sorteringing resultater To prøver blev fremstillet:. en ufarvet kontrol og en farvede kontrol anvendelse af 1: 500 fortynding af SIRPα-PE / Cy7 antistof og 1: 250 fortynding af CD90-FITC-antistof. Efter farvning blev cellerne sorteret ved 20 psi i sortering puffer sammensat af PBS, 10% neonatalt bovint serum, 10 uM ROCK inhibitor Y-27632, og 1 ug / ml DAPI. Begge cellepopulationer gated i de fremadrettede og sidespredning profiler til at udelukke snavs (A, blå linje) derefter enkeltceller blev selekteret ved at sammenligne puls bredde og højde (puls bredde analyse) i både forward scatter (B, blå linie) og side scatter kanaler (C, blå linje). Dernæst blev levende celler udvalgt af gating af DAPI - befolkning (D, blå linje). De endelige cellepopulationer for indsamling blev bestemt ved at undersøge de FITC og PE-Cy7 ekspressionsniveauer for de levende populationer. Den ufarvede kontrol (E, venstre) blev anvendt til atindføre passende port til at vælge til FITC + (CD90) og SIRPα-PE / Cy7 + (cardiomyocyte) befolkning til stede i den farvede prøve (E, til højre). FITC og SIRPα-PE / Cy7 + poplations blev opsamlet i separate 15 ml centrifugerør.

Figur 3
Figur 3:. Skematisk af multi-væv bioreaktor og hjertevæv engineering proces Opførelse af multi-væv bioreaktor kræver tre komponenter (A): 1) en polytetrafluorethylen mester støbeform 9 x 33 x 5 mm 3, med 6 jævnt fordelt huller 0,5 mm i diameter; 2) en 25 x 35 x 11 mm 3 polysulfon ramme til at holde PDMS indlæg under væv konstruktion og kultur; og 3) en 20 x 40 x 5 mm 3 sort polytetrafluorethylen bundplade med 6 brønde i 6 x 1 x 1 mm 3 dimensioner, spaced 4 mm afstand langs dens længde. For at skabe menneskelige manipuleret hjertevæv (B), er PDMS indlæg fremstillet af PDMS bløde litografi hjælp af polytetrafluorethylen mester skimmel, hvoraf to er så presset på fanerne i polysulfon ramme til at danne 6 par force-sensing cantilever indlæg. Vævet opløsning pipetteres i brøndene i den sorte polytetrafluorethylen bundpladen. Rammen og poster derefter vendes og tilpasset på polytetrafluorethylen bundplade, så et par indlæg kommer ind hver brønd indeholdende vævet mix. Efter 48 timer bundpladen fjernes, og de definerede væv dyrkes på de stillinger, forbliver omvendt i NBS medier.

Figur 4
Figur 4:. Repræsentative billeder og funktionelle målinger af definerede humane manipuleret hjertevæv Den multi-væv bioreacteller systemet holder seks væv i parallelle (A, pilespidser). Definerede væv er selv-samlet inden for syv dage efter oprettelsen væv (ovenfra, B og skrå sidebillede, C). (D). Del af en defineret hek farvet for kardiel troponin-T (cTnT). (E) Repræsentant spjæt sporing viser rå kraft over tid i løbet af 1 Hz pacing ved elektrisk felt stimulation. (F) Twitch sporing under stimulering ved 1 Hz (0-2 sek) og 2 Hz (2-4 sek) pacing, med markeringspil ændring i frekvens, for både ikke-supplerede definerede hECTs (optrukket linje) og væv suppleret med 10% hMSC'er (stiplede linje).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Konstruktion af definerede humane manipuleret hjertevæv (hek) kan give en mere konsekvent og pålidelig model af menneskets hjertemyocyt funktion. Kritisk, er alle cellulære og ekstracellulære komponenter i systemet kendt og kan manipuleres som ønsket, og dermed fjerne den confounding indflydelsen fra andre ukendte celletyper som følge af differentieringsprocessen. Til afbalancering hurtig cellevækst og højt udbytte, er det foretrukket, at differentieringen starter ved 75% sammenløb af hESCs, ideelt fire dage efter udpladning. Derudover er anvendelsen af ​​ROCK inhibitor Y-27632 både under celledissociering og reaggregering efter sortering i høj grad forbedrer cellernes levedygtighed. Tilstedeværelsen af ​​spontan slå af myocytter under differentiering proces er en vigtig indikator for effektiviteten og sundhed differentiering. Hvis spontan slag ikke overholdes kan dette indikere dårlig differentiering effektivitet, enten på grund af ineffektive reagenser eller et tabaf pluripotens af stamcellerne.

Under væv byggeri skal PDMS indlæg justere korrekt med kanalerne i bundpladen til at skabe velformede væv, der holder længe nok til at måle kontraktile funktion. At forbedre den lethed, sidestillingsanordning, og styrke vævsdannelse omkring de stillinger, hvor de er modtagelige for brud, er det muligt at tilføje ekstra bredde (ca. en diameter af skaftet på hver side af stolpen) til enderne af kanalerne, som demonstreret med "kødben" -formet kanaler i figur 3A. Uden korrekt justering enhed vævet vil enten løsnes fra stolperne kort efter kultur eller forbliver i brønden når bundpladen fjernes. Hvis en velformet væv falder af under bundpladen fjernelse, er det muligt at forsigtigt vedhæfte vævet til stolperne ved hjælp af fine tænger under et dissektionsmikroskop, selv om det er let at beskadige sarte hECTs hvis tilstrækkelig pleje ikke er taget. </ P>

En stor styrke i det beskrevne definerede system er evnen til at afhøre bidrag direkte mekanismer celle-celle interaktion i hjerte-celleterapi baseret på specifik kontrol af celle sammensætning. Injektionen af celler i dyr er upræcis og underlagt lav levedygtighed og fastholdelse 33. Derudover er effekten af ​​de injicerede celler på målvævet kompliceret af interaktioner med andre fysiologiske systemer, såsom immunsystemet. Som sådan forståelse bidrag direkte celle-celle interaktioner i hjerte-celleterapi er udfordrende at tage fat i modelorganismer. Derfor en fordel den beskrevne fremgangsmåde er, at celle-celle-interaktioner analyseres i en biomimetisk tredimensionelt miljø, bevare vigtige aspekter af hjerte- niche, og i nærvær af de specifikke celletyper seværdigheder - nemlig de hjertemyocytter og fibroblaster. Nytten af ​​at bruge det definerede hek-systemet er demonstration indated med tilskud af 10% hMSC'er fra humant marv 34,35 og anvendt i kliniske forsøg til celleblandingen under oprettelsen væv. Disse væv, der blev suppleret med hMSC'erne udviste større kontraktile kraft end de ikke-supplerede definerede humane væv (fig 4F). Da vævet miljø og sammensætning er blevet kontrolleret, forbedring af væv funktion med MSC tilskud afspejler en iboende effekt af hMSC'er på cardiomyocyte funktion. En anden styrke til systemet er, at da vævene er mindre end tidligere anvendte, 1,7 celle anvendelse er mere effektiv, en vigtig overvejelse, når der anvendes rettet differentiering af pluripotente stamceller som cellekilde.

Beyond studere mekanismer for celleterapi, ville det definerede hek systemet undersøgelsen af ​​cellulære grundlag af kardiovaskulære celle-celle interaktioner. Forstyrrelse af biologi celler før væv construction, for eksempel med shRNAs, ville gøre det muligt at undersøge molekylære mekanismer, der styrer celle-celle og celle-matrix interaktioner. En yderligere fordel til vævsopbygning system er dannelsen af ​​aligned myofibriller stand til funktionelle sammentrækninger. Ved anvendelse af definerede hek-systemet, dynamikken i myofibrillære dannelse, cardiomyocyte udvikling og organiseringen af ​​vævet arkitektur kan alle blive undersøgt via modifikation af komponenterne i den ekstracellulære matrix eller molekylær manipulation af cellerne. De menneskelige og 3-D karakter af hek-systemet derudover øger oversættelighed af resultaterne.

Mens det beskrevne system giver en kraftfuld metode til forståelse grundlæggende spørgsmål for kardiovaskulær biologi, er det ikke uden begrænsninger. Først de manipulerede væv udviser en umoden fænotype, i overensstemmelse med offentliggjorte spjæt force data fra nyfødte myokardiale prøver 7. Mensfænotypisk umodenhed kunne være en forstyrrende faktor for vurderingen celle interaktion mekanismer, der er bevis for, at syge cardiomyocytter vende tilbage til en føtal gen program 7,36-38. Hvis resultaterne fra hek-systemet vise sig at være relevante i forbindelse med en svigtende hjerte, kan dette være en fordel for afprøvning cardiac behandlingsformer. Protokollen anvender også en embryonale kvalificeret basalmembranmatrix under væv konstruktion. Sammensætningen af ​​denne matrix kan variere fra parti til parti, og mens definerede kælder matrix findes alternativer, de har endnu ikke evalueret i forbindelse med hECTs.

Andre begrænsninger omfatter manglen på en vaskulære system og ingen systemer niveau interaktion effekter. Givet størrelsen af ​​væv, er metaboliske krav opfyldes ved diffusion alene så er der ikke behov vaskulære system for at sikre cellernes levedygtighed. Imidlertid kan endotelcelle signalering være en vigtig faktor i specifikke celleterapi. Hvis dette er tilfældet, et bestemt antal endothelial celler kan simpelthen tilsættes til det definerede celle mix under væv konstruktion. Mens systemer niveau interaktioner er vigtige for fuldstændig forståelse af celle mekanismer, den konstruerede væv system tilbyder en reduktionistisk tilgang til at forenkle problemet med henblik på at imødegå den mekanisme systematisk. Kompleksitet kan tilsættes til den definerede vævssystem efter behov gennem indførelsen af ​​systemer-relaterede virkninger, såsom leukocytter at indarbejde et immunrespons, eller ved at tilsætte tilstødende vævstyper at forespørge parakrin signalering.

Som en undersøgende redskab, den definerede humane manipuleret hjertevæv system tilbyder fordelene ved artsspecifikke humane celler, en biomimetiske 3-D kultur miljø med kontrolleret biokompleksitet, ligetil og langsgående overvågning af kontraktile funktion, og en defineret cellulær og matrix sammensætning. Fremtidige retninger for hek-systemet omfatter manipulere den terapeutiske celletype af interesse with siRNA eller shRNA før indføring i vævet for at undersøge specifikke molekylære detaljer i celle-celle interaktion. Derudover snarere end at bruge hESCs at danne de hjerteceller, er det muligt at anvende inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) fra patienter med en arvelig mutation i et forsøg på at modellere relaterede hjertesygdom manifestationer i de konstruerede væv. Således er vores metode til at skabe menneskelige manipuleret hjertevæv med definerede cellepopulationer lover at åbne nye veje til at studere hjerte-celleterapi til at fremskynde udviklingen af ​​nye behandlinger til patienter med hjertesygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH (1F30HL118923-01A1) til TJC, NIH / NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C til KDC, forskningsbevillingen råd Hongkong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) til BDG, den amerikanske heart Association (12PRE12060254) til RJ, og Research Grant Råd Hongkong (TBR'er, T13-706 / 11) til RL Yderligere finansiering blev givet til TJC af NIH DRB 5T32GM008553-18 og som et praktikophold på NIDCR-Tværfaglig uddannelse i systemer og Developmental Biologi og fødselsdefekter T32HD075735. Forfatterne ønsker også at takker Arthur Autz på The Zahn centrum af byen College of New York for at få hjælp med bearbejdning bioreaktoren og Mamdouh Eldaly til teknisk bistand. Vi takker også Dr. Kenneth Boheler for rådgivning om hjerte-differentiering, og Dr. Joshua Hare for generøst giver humane mesenkymale stamceller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter