Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cardiale tissue engineering is sterk gevorderd in de afgelopen tien jaar, met meerdere groepen publiceren van resultaten van volledig functioneel, het verslaan van weefsels, vervaardigd van zowel muizen hartspiercellen 1-6 en, meer recentelijk, menselijke stamcel-afgeleide cardiomyocyten 7-12. Het hartweefsel vakgebied dat wordt aangedreven door twee primaire en wezen onafhankelijk doelen: 1) om exogene transplantaten die kunnen worden getransplanteerd in falende harten functioneren 4-6 verbeterd; en 2) de ontwikkeling in vitro modellen voor het bestuderen van de fysiologie en ziekte, of screeningsmethoden voor therapeutische ontwikkeling 2,7.

Drie-dimensionale (3-D) celkweek is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe generatie screeningsmethoden, als de 3-D matrix geeft een natuurlijker cardiale micro dan traditionele 2-D monolaag celcultuur beschouwd; inderdaad een aantal aspecten van celbiologie totaal andere 2-D versus 3-D kweken 13,14 9 of collageen 7,8,10) streng wordt gecontroleerd, de invoercel samenstelling minder goed gedefinieerd, door het hele mengsel van cellen van een gerichte cardiale differentiatie van beide embryonale stamcellen (ESC 7,9) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC 10,12) worden toegevoegd aan de weefsels. Afhankelijk van de specifieke cellijn en de efficiëntie van de differentiatie protocol, kan de resulterende percentage hartspiercellen variëren van minder dan 25% tot meer dan 90%, de specifieke hartspierfenotype (dwz ventricular-, atriaal of gangmaker-achtig) kan ook variëren, zelfs de niet-cardiomyocyt fractie kan zeer heterogeen 15,16 en de looptijd van de gedifferentieerde cardiale m veranderenyocytes 17.

Recente hartweefsel engineering heeft getracht de ingang celpopulatie controleren, met ofwel een cardiale reporter humane embryonale stamcellijn 8 of celoppervlak markers 18 wordt gebruikt om de hartspiercel component van de differentiatie isoleren. Hoewel aanvankelijk een weefsel uit slechts cardiomyocyten lijkt het ideaal zijn, is dit in feite niet het geval; hECTs uitsluitend uit cardiomyocyten niet comprimeren tot functionele weefsels met bepaalde groepen vinden van een 3: 1 verhouding van cardiale myocyten: fibroblasten die de hoogste twitch kracht 8. Via verschillende celselectie methoden, waaronder oppervlakte merkers voor levende celsortering, kan men hECTs met gedefinieerde celpopulaties maken. Terwijl markers van niet-cardiale stromacellen enige tijd beschikbaar CD90 19,20 zijn, zoals de vermeende fibroblast marker zijn oppervlaktemerkers van cardiale myocyten moeilijker geweestte identificeren. SIRPα was een van de eerste cardiale oppervlakte merkers geïdentificeerd voor menselijke cardiale myocyten 18 en blijkt zeer selectief voor de cardiale lijn zijn. Onlangs hebben we gevonden dat dubbel met gescheiden SIRPα + en CD90 - cellen geeft nagenoeg zuiver cardiomyocyten met de CD90 + populatie vertoont een fibroblast-achtige fenotype (Josowitz, ongepubliceerde waarnemingen). Op basis van deze bevindingen verzameld, hierin beschrijven we creëren hECTs met een 3: 1 combinatie SIRPα + / CD90 - CD90 + cardiomyocyten en fibroblasten.

De mogelijkheid om een ​​volledig gedefinieerd menselijk hartweefsel ingenieur is niet alleen essentieel voor het creëren van robuuste screening instrumenten, maar ook voor het ontwikkelen van modellen voor opkomende cel- en gen-gebaseerde cardiale therapieën te onderzoeken. Vooral veel celtherapie voor hartfalen, gebruik celtypen waaronder mesenchymale stamcellen (MSC) 21 22 en beenmerg mononucleaire cellen 23-25, getest in klinische studies. Hoewel veel van de eerste resultaten zijn veelbelovend 21,23,25, de aanvankelijke voordeel vermindert vaak tijd 26-29. Een soortgelijke trend is gemeld bij muizen gemanipuleerde cardiale weefsels, die een belangrijke functionele voordelen te geven als gevolg van MSC suppletie, maar het voordeel is bij langdurige cultuur 1 niet volgehouden. Grondslag liggen aan de sub-optimale prestaties is onze beperkte kennis van de mechanismen die celtherapie. Een dieper begrip van hoe therapeutische cellen hun gunstige invloed, alsmede mogelijke negatieve gevolgen van myocyten-nonmyocyte interacties uit te oefenen, zou de ontwikkeling van verbeterde therapieën waardoor klinisch significante en blijvende voordelen, met minimale bijwerkingen voor patiënten met hartfalen mogelijk te maken.

Hier beschrijven we het gebruik van gedefinieerde hECTs te interrogat mechanismen van cel-gebaseerde therapie. De gecontroleerde weefsel samenstelling is van essentieel belang om specifieke factoren die van invloed zijn cardiomyocyt prestaties te identificeren. Direct vullen hECTs de therapeutische celtype van belang (bijvoorbeeld MSC), kunnen de effecten op de cardiale myocyten prestaties onthullen, zoals we in ratten ECT 1 aangetoond.

De volgende meerdere stappen protocol begint met gerichte cardiale stamcel differentiatie, gevolgd door de vervaardiging van de multi-weefsel bioreactor, en afgesloten met een beschrijving van weefsel constructie en functionele analyse. Onze experimenten worden uitgevoerd met behulp van de NIH-goedgekeurde H7 menselijke embryonale stamcellen (hESC) lijn. Echter, de volgende protocollen ook getest met behulp van een extra hESC lijn en drie geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) lijnen met vergelijkbare resultaten. Wij hebben gevonden dat de efficiëntie bij cardiomyocyt differentiatie en succes in Hect fabricage afhankelijke cellijn kan zijn, met name for iPSC lijnen afgeleid van individuele patiënten. Door dit protocol worden twee 6 putjes bedekt met in totaal 1.680.000 hESCs (140.000 cellen per putje), die ongeveer 2,5 miljoen myocyten na differentiatie gedurende 20 dagen en sorteren, genoeg om zes gedefinieerde tissues oplevert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: Voer alle cel manipulaties in aseptische omstandigheden met behulp van een HEPA-filter klasse II biologische veiligheid kabinet en alle oplossingen te steriliseren door ze te filtreren door een 0,2 pm filter. Voer weefsel bouw en functie van het testen in ofwel dezelfde aseptische omstandigheden of een laminaire stroming kap.

1. Het zaaien van H7 hESCs in voorbereiding voor Cardiac Differentiatie

  1. (Dag 1) De voorbereiding van het basaal membraan Matrix
    1. Dooi 150 pi hoeveelheid van hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix op het ijs 's nachts bij 4 ° C.
  2. (Dag 0-4) Plating van hESCs op gecoate platen
    1. Verdunnen de ontdooide matrix in 12 ml ijskoude DMEM / F12 en meng goed.
    2. Breng 1 ml van DMEM / F12-matrix oplossing in elk putje van een 6-well weefselkweek behandeld schotel. Elk monster van matrix kan jas twee 6-well platen.
    3. Incubeer de beklede platen bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
      Opmerking: InOnze ervaring kan beklede schalen afgedicht met paraffine tot 10 dagen vóór gebruik worden opgeslagen in matrixvorm oplossing bij 4 ° C.
    4. Bij ongeveer 75% confluentie, dissociëren de H7 hESCs van 10 cm schaal met behulp 6 ml van de niet-enzymatische dissociatie reagens. Na 5 minuten zachtjes schrapen van de cellen van het kweekoppervlak met een wegwerp celschraper en breng de celsuspensie naar een steriele 15 ml centrifugebuis.
    5. Verwijderen 0,5 ml dissociatie oplossing met de cellen van de 15 ml buis overgebracht in een nieuwe steriele 15 ml buis (waarbij 5,5 ml van de dissociatie reagens om de hESCs verder dissociëren) voor stamcellijn propagatie.
    6. Pellet de 0,5 ml van cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer zachtjes in 8 ml pluripotente stamcellen medium dat 1% penicilline-streptomycine vervolgens naar een nieuwe, gecoat, 10 cm weefselkweekplaat en behouden 37 ° C en 5% CO 2 de stamcellijn handhaven.
      Opmerking: Bewaar pluripotente stamcellen media op ijs tijdens de media verandert.
    7. Ondertussen, voeg 5,5 pl 10 mM ROCK inhibitor Y-27.632 om de resterende 5,5 ml dissociatie oplossing blijven en incuberen bij kamertemperatuur gedurende nog eens 5-10 minuten. Meng de cellen met een 5 ml serologische pipet. Verder incuberen totdat een enkele celsuspensie wordt verkregen, dan pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Resuspendeer de cellen in 5 ml pluripotente stamcellen media en voer een celtelling met een hemocytometer.
    9. Zaad elk putje van de 6-putjes bij een dichtheid van 140.000 cellen per putje. Zaad twee 6-well platen in totaal zes gedefinieerde weefsel creëren. Gooi de resterende cellen na plating.
    10. Vul de put met 1 ml met pluripotente stamcellen media en incuberen bij 37 ° C, 5% CO2. Vierentwintig uur later, verwijder de media en voeg 2 ml vers pluripotente stamcellen media aan elk putje (Figuur 1A
    11. Controleer de samenvloeiing van de platen elke dag begint de differentiatie zodra de cellen bereikt ongeveer 75% confluentie (Figuur 1B - D).

2. (Dag 4-24) Differentiatie van menselijke embryonale stamcellen te Cardiomyocytes 30,31

  1. (Dag 4-7, Differentiatie Dag 0-3) Mesoderm Inductie
    1. Bereid RPMI media differentiatie I (tabel 1) Door het combineren van 500 ml RPMI 1640 met 10 ml B27 supplement (zonder insuline) en 5 ml penicilline-streptomycine voorraadoplossing (10.000 IU / ml penicilline, 10.000 gg / ml streptomycine). Aliquot, op ijs, in 50 ml buizen en bewaar bij 4 ° C.
    2. (Dag 4, Differentiatie Dag 0) Bereid mesoderm inductie media door het toevoegen van 2,4 ul van de kleine molecule GSK3 remmer CHIR99021 (10 mM voorraad, 6 uM uiteindelijke concentratie) tot 12 ml van RPMI differentiatie media I. Verwijder pluripotente stamcellen media uit elk putje eennd te vervangen door 2 ml van het mesoderm inductie media per goed. Zet de plaat naar de incubator.
      Opmerking: significante celdood treedt meestal onder toevoeging van CHIR99021 (figuur 1E). De monolaag zal herstellen, maar het is belangrijk om de dode cellen te veranderen met de DMEM / F12 spoelen spoelen.
    3. (Dag 5, Differentiatie Dag 1) Bereid deze mesoderm inductie media zoals hierboven beschreven. Verwijder de oude media uit elk putje en een keer spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje. Voeg 2 ml verse mesoderm inductiemedia aan elk putje.
      Opmerking: Spoelen elke dag vanaf dag 0-10 verhoogt de opbrengst en zuiverheid van de cardiomyocyten.
    4. (Dag 6, Differentiatie Dag 2) Verwijder de cardiale inductie media en een keer spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje. Vervang het spoelen met 2 ml RPMI differentiatie medium I (geen kleine moleculen toegevoegd, maar ook met de B27 (zonder insuline) supplement) en terug naar de incubator.
  2. (Dag 7-13, Differentiatie Day 3-10) Cardiac Mesoderm Inductie
    1. (Dag 7, Differentiatie Dag 3) Bereid cardiale mesoderm inductie media door het toevoegen van 6 ul van de kleine molecule Wnt-remmer IWR-1 (10 mM voorraad, 5 pM final) tot 12 ml van RPMI differentiatie media I.
    2. Verwijder de media uit elk putje, een keer spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje en te vervangen door 2 ml van cardiale mesoderm inductie media per goed.
    3. (Dag 8, Differentiatie Dag 4) Bereid een additionele 12 ml cardiaal mesoderm inductie media zoals hierboven beschreven. Verwijder het medium toegevoegd de dag vóór, na spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje en vervangen door 2 ml vers cardiaal mesoderm differentiatie medium per putje en terug naar de incubator.
    4. (Dag 9-10, Differentiatie Dag 5-6) Op beide dagen, verwijder de cardiale mesoderm inductie media en spoel elk putje met 1 ml DMEM / F12.
    5. Voeg 2 ml vers RPMI differentiatie media I (geen kleine moleculen toegevoegd, maar nog steeds met de B27 (zonder insuline) supplement)aan elk putje en de plaat terug naar de incubator.
  3. (Dag 11-24, Differentiatie Dag 7-20) hES-afgeleide hartspiercel Organisatie / rijping
    1. Bereid de differentiatie RPMI medium II (tabel 1) Door het combineren van 500 ml RPMI 1640 met 10 ml B27 supplement (insuline) en 5 ml penicilline-streptomycine voorraadoplossing. Aliquot, op ijs, in 50 ml buizen en bewaar bij 4 ° C.
    2. (Dag 11, Differentiatie Dag 7) Verwijder RPMI differentiatie media (zonder insuline) uit elk putje en spoel af met 1 ml DMEM / F12. Vervangen door 2 ml van de nieuwe media RPMI differentiatie II (met insuline) aan elk putje en terug naar de incubator.
      Let op: Spontane afstraffing moet eerst worden waargenomen tussen dag 7 en 10. Indien kloppen niet gedurende deze tijd wordt waargenomen, betekent dit meestal een slechte differentiatie efficiency. Het protocol kan worden voortgezet tot en met dag 15 in een poging om pak slaag te observeren, maar als er geen afstraffing wordt waargenomen op dag 15 is het het beste om te stzijt een nieuwe differentiatie.
    3. (Dag 12-24, Differentiatie Dag 8-20) Elke dag, verwijder de oude differentiatie media en te vervangen door 2 ml vers RPMI differentiatie media II per putje naar cel rijping en de organisatie van het kloppende monolaag mogelijk te maken (figuur 1F, Video Figuur 1 ).
      Opmerking: Afhankelijk van de resterende celdood, kan het nodig zijn om te spoelen met 1 ml DMEM / F12 door differentiatie dag 10.

3. (Dag 24, Differentiatie Dag 20) Isolatie van hartspiercellen en fibroblast-achtige cellen

  1. Cellen losmaken van de monolaag
    1. Verwijderen differentiatie media en eenmaal spoelen met 1 ml PBS.
    2. Distantiëren de monolagen met 1 ml van de enzymatische dissociatie oplossing (0,04% Trypsine / 0,03% EDTA) aan elk putje.
    3. Verplaats plaat in incubator gedurende 10 minuten. Ondertussen, voeg 12 pl ROCK remmer 6 ml trypsine neutralisatieoplossing.
    4. Gently voeg 1 ml trypsine oplossing die de neutralisatie ROCK inhibitor aan elk putje van de plaat om de trypsine te neutraliseren oplossing.
    5. Met behulp van een steriele overdracht pipet, meng elk putje om uit elkaar te breken de cel clusters.
    6. Breng alle 12 ml van de 6-well plaat een 15 ml centrifugebuis.
      Let op: Omdat twee 6-well platen worden gebruikt in dit protocol, zal twee 15 ml buizen nodig zijn.
    7. Overdracht 3 ml PBS één putje van de plaat en vervolgens achtereenvolgens overbrengen dezelfde 3 ml elke volgende om eventuele resterende cellen te verzamelen op de schotel. Draagt ​​de resterende 3 ml van de uiteindelijke ver in dezelfde 15 ml centrifugebuis die de cellen.
    8. Pellet bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  2. Bereid Cellen voor live cell sorteren FACS
    1. Bereid de kleurbuffer door toevoeging van 5 ml foetaal runderserum met 45 ml PBS op ijs met 50 pi ROCK inhibitor.
    2. Verwijder het supernatant van de cel pellaat (in 3.1.8) en resuspendeer in 1,2 ml vlekken buffer.
    3. Transfer 200 pi van de celsuspensie in nieuw, voorgekoeld, 50 ml centrifugebuis op ijs. Dit zal de negatieve kleuring controle.
    4. Draagt ​​de resterende 1 ml celsuspensie in nieuw, voorgekoeld, 50 ml centrifugebuis op ijs en voeg 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 verdunning) en 4 ui van CD90-FITC (1: 250 verdunning) . Meng de celsuspensie met een transfer pipet en naar het ijs.
    5. Incubeer zowel de negatieve controle en monster op een rocker shaker, op ijs bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    6. Bereid monstername buizen door het toevoegen van 3 ml RPMI media (met insuline) tot twee 15 ml centrifugebuizen. Voeg 3 ul van ROCK-remmer aan elke buis en op te slaan op het ijs.
    7. Pellet de gekleurde cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en tweemaal spoelen met ten minste 10 ml ijskoude PBS per spoelen.
    8. Voeg 1 pl DAPI (1 ug / ml) tot 5 ml vlekken buffer. Voorzichtigresuspendeer de pellet monster met 1-3 ml van de DAPI kleuring bevattende buffer met een transferpipet.
    9. Voeg 500 pl vlekken buffer (zonder toegevoegde DAPI) met de negatieve controle.
    10. Voorzichtig filteren zowel de negatieve controle en monster door een 40 um cel zeef om massa's van cellen te verwijderen en over te dragen aan FACS buizen polystyreen op ijs. Onverwijld monsters naar de cel sorteerder.
    11. Net als bij gevestigde levende cellen sorteermethoden 18, gebruik maken van de negatieve controle aan de poorten instellen, selecteert voor levende cellen (DAPI negatief) en het verzamelen van zowel de FITC + (dat wil zeggen, CD90 + fibroblasten) en PE / Cy7 + (dwz SIRPα + hartspiercellen ) populaties onafhankelijk 20 psi (figuur 2).
      Let op: Na het instellen van de poorten, kan de negatieve controle in 4% PFA worden vastgesteld om differentiatie efficiency te bepalen door kleuring voor cardiaal troponine-T.
      Opmerking: Sommige onderzoekers de voorkeur aan een te gebruikenisotype controle plaats onbesmet controle om de poorten in ter compensatie van niet-specifieke antilichaambinding. Een zogenaamde fluorescentie min één (FMO) controle is een andere mogelijkheid. Vanwege de duidelijke bimodale verdeling van de FITC, DAPI en PE-Cy7 signalen, we afgesloten van de positieve populatie, conservatief gericht tot ver in de positieve poort, die mogelijk uitsluit aantal echte positieven, maar helpt om geen valse positieven te minimaliseren.
  3. Cell Reaggregation in voorbereiding voor Tissue Engineering
    1. Nadat de cel soort, zowel pellet verzamelbuizen en resuspendeer in 1 ml DMEM dat 10% Neonatale runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,2% amfotericine B ( "NBS media").
    2. Recombineren de SIRPα + en CD90 + cellen in een 3: 1 verhouding en de plaat de cellen gecombineerd in een niet-weefselkweek behandelde petrischaal bij een dichtheid van 2 miljoen cellen per 60 cm2 (10 cm schaal). Voeg 10 ml van de NBS media en 101; l van ROCK-remmer Y-27632.
    3. Plaats celsuspensie in de weefselkweek incubator gedurende 48 uur cellen reaggregation in kleine clusters toestaan.

4. Human Cardiac Tissue Engineering

  1. Fabriceren van de Multi-weefsel Bioreactor
    Opmerking: Om de afbeeldingen in figuur 3A aan te vullen, CAD-bestanden met gedetailleerde bioreactor ontwerp schema's zijn op verzoek van de auteurs beschikbaar.
    1. Machine de PDMS meester mal door het boren van zes gelijkmatig verdeelde gaten met een diameter van 0,5 mm in een 9 x 33 x 3,25 mm kubus van polytetrafluorethyleen.
    2. Met behulp van een frees, machine een frame uit polysulfon meet 25 x 35 x 11 mm 3. Het doel van het frame om de PDMS posten (geconstrueerd uit gegoten hierboven geformuleerde) uitgelijnd met de putten in de voetplaat te houden.
    3. Met behulp van een 1-mm endmill, machine 6 wells (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm uit elkaar in een 20 x 40 x 5 mm 3 stuk zwart polytetrafluorethyleen aan de basisplaat te vormen.
    4. Meng de elastomeer basis en verharder voor polydimethylsiloxaan (PDMS) in een 10: 1 w / w-verhouding en toe te voegen aan de aangepaste polytetrafluorethyleen mal (stap 4.1.1) twee rijen van zes force-sensing posten, en incubeer overnacht en onder vacuüm bij 80 ° C. Na het uitharden, voorzichtig de PDMS uit de meester mal en zorgvuldig markeren de toppen van elke post met een zwarte permanent marker voor een betere contrast en geautomatiseerde real-time functie afbuiging tracking.
      Opmerking: Polytetrafluorethyleen is vrij zacht en kunnen gemakkelijk worden beschadigd. Wees voorzichtig bij het reinigen van de meester mal voorafgaand aan het PDMS casting om de levensduur van het systeem en consistente PDMS na geometrie te garanderen. Een 0,5 mm draad kan worden gebruikt om de gaten voor de posten na gebruik te reinigen, maar zorg aan de binnenkant van de gaten niet schrapen.
      Opmerking: Een alternatief is ontgas de PDMS onder vacuüm gedurende enkele uren bij kamertemperatuur, laat het mengsel uitharding bij omgevingsdruk.Dit kan leiden tot minder restgas vorming van luchtbellen in het PDMS tijdens het uithardingsproces.
    5. Steriliseer alle componenten in een stoom autoclaaf.
      Opmerking: de PDMS meester mal (stap 4.1.1) en polysulfon frame (stap 4.1.2) zijn beide herbruikbaar. De PDMS posts gemaakt op basis van de cast (stap 4.1.4) is ook opnieuw te gebruiken, maar alleen voor ongeveer 10 toepassingen. Echter, meer PDMS berichten worden gemaakt als nodig is met behulp van de meester mal.
  2. Verzamel opnieuw geaggregeerde hartcellen
    1. Verwijder het opnieuw geaggregeerde cellen uit de incubator en de overdracht van alle 10 ml van de media reaggregation een 50 ml centrifugebuis.
    2. Spoel de plaat met 3 ml PBS en breng het sop dezelfde 50 ml centrifugebuis die de reaggregation media.
    3. 3 ml 0,04% trypsine / 0,03% EDTA om de 10 cm schaal en terug naar de incubator gedurende 5 min.
    4. Na 5 min, onderzoekt de plaat met een omgekeerde samengestelde microscoop bij 10x vergroting zorgen voor volledige cel dissociatietie van het gerecht. Als enkele resterende clusters nog steeds verbonden zijn, voorzichtig schudden van de plaat om de klonten los te maken. Wanneer de clusters gehecht blijven, terug naar de incubator gedurende nog 2-3 min. Niet broeden langer dan tien minuten of significante celdood kunnen optreden.
    5. Als alle cellen zijn vrijstaand, voeg 3 ml trypsine neutralisatie oplossing. Meng de neutralisatie oplossing met de trypsine-celoplossing en transfer naar de 50 ml centrifugebuis die de reaggregation media en eenmaal spoelen met PBS.
    6. Spoel de volledige schaal met 5 ml PBS en transfer naar dezelfde 50 ml buis met de cellen.
    7. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml NBS media, vervolgens over een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    9. Pellet bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd en de bovenstaande vloeistof. De cardiale cellen (CD90 + cellen en stromale SIRPα + myocYtes) zijn nu klaar voor de bouw weefsel.
  3. (Optioneel) Verzamel Aanvullende cellen van belang
    Opmerking: Naast de gedefinieerde weefsels met alleen SIRPα cardiomyocyten + en CD90 + fibroblast-achtige cellen, is het mogelijk om extra cellen van belang aan hun effect op weefselfunctie ondervragen. Bijvoorbeeld rat MSCs is aangetoond dat de functie van rat gemanipuleerde hartweefsels 1 verbeteren. De volgende optionele stap beschrijft de verzameling van extra cellen voor de gedefinieerde systeem.
    1. Verzamel de aanvullende celtype van belang (bijvoorbeeld, mesenchymale stamcellen) met behulp van 0,25% trypsine / 0,1% EDTA.
    2. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur vervolgens resuspenderen in 5 ml passende celkweekmedia het celtype. Bijvoorbeeld, voor MSCs gebruik DMEM aangevuld met 20% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,2% amfotericine B-cultuur de cells.
    3. Voer een celtelling met een hemocytometer, dan pellet de cellen opnieuw bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml celkweekmedium overgebracht in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    5. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder het supernatant. De aanvullende cellen zijn nu klaar voor de bouw weefsel.
      Opmerking: Als de aanvullende cellen toegevoegd in een concentratie van 10% van het totale aantal cellen in het weefsel, dan de bepaalde weefsels, zal 50.000 aanvullende cellen per weefsel nodig omdat elk weefsel bevat 500.000 hartcellen (zowel CD90 + stromacellen en SIRPα + myocyten).
  4. Maak de Human Engineered hartweefsel
    Let op: alle oplossingen op ijs en de cellen bij kamertemperatuur bewaren. Alle volumes hieronder zijn per weefsel. Meestal kan ongeveer zes weefselmonsters opgebouwd uit twee 6-well plAtes van cardiale differentiaties.
    1. Verdun 60,0 ui van de 5 mg / ml collageen bouillon aan 3,125 mg / ml met 1,5 gl 1 M NaOH, 9,6 ui 10X PBS en 24,9 pl steriel gedeïoniseerd ultrazuiver water.
      Kritische stap: vermijd de introductie van luchtbellen aan elke oplossing tijdens de bereiding als luchtbellen juiste vorming weefsel zal verstoren.
    2. Voeg 12,0 ul van zowel 10x MEM en 0,2 N HEPES pH 9 om de verdunde collageen mengsel aan het collageen mix maken. Naar beide oplossingen langs de zijkant van de 15 ml centrifugebuis om de introductie van luchtbellen in het collageen mix voorkomen.
    3. Voeg de basaalmembraan matrix tot een eindconcentratie van 0,9 mg / ml aan het collageen mix en bewaar op ijs tot het uiteindelijke weefsel mix maken. De eindconcentratie van collageen moet 2 mg / ml.
    4. Voeg 500.000 van opnieuw geaggregeerde cellen aan het weefsel mix (myocyten + fibroblast concentratie 20 miljoen / ml) en vul tot een eindvolume van 25 pl perweefsel met ofwel celvrije NBS media of 50.000 cellen van de aanvullende celtype van belang (bijvoorbeeld, hMSCs) en meng goed om een gelijkmatige celsuspensie te vormen.
      Opmerking: Het aantal aangevuld cellen zullen variëren van voor verschillende toepassingen. Hier 10% suppletie wordt gebruikt.
    5. Voorzichtig Pipetteer 25 ul van de celsuspensie in elk van de zes putjes in de bioreactor basisplaat, zonder dat er luchtbellen in de put.
    6. Duwen twee rijen van de PDMS krachtsensoren aan beide zijdelen van het polysulfon frame vormen 6 paren van tegengestelde posten, keer dan het frame bovenop de basisplaat, zodat een paar posten komt elk putje met de celsuspensie.
      Opmerking: De polysulfon kader bevat tabbladen om te helpen bij de aanpassing van het PDMS.
    7. Plaats voorzichtig de bioreactor, grondplaat naar beneden, in een 60 mm schaal en zet de schaal zonder deksel binnenkant van een 10 cm schotel, leg het deksel van 10 cm op de top, en verplaats het hele bioreactor vergadering inde weefselkweek incubator, wachtend twee uur het weefsel gel.
    8. Na 2 uur werd de bioreactor te verwijderen uit de incubator en voeg 14 ml NBS media om het gehele samenstel, genoeg om de grondplaat te dekken. Terug naar de incubator en wijzigt de helft van de media dagelijks.
    9. Achtenveertig uur later, verwijder voorzichtig de basisplaat door voorzichtig te bewegen elke kant van de bodemplaat van het frame een paar millimeter in een tijd, veranderen de media, dan is de terugkeer van de bioreactor, weefsels naar beneden, naar de media.
    10. Ga door het veranderen van de helft van de NBS cultuur media elke dag.
      Opmerking: Spontane contracties van het weefsel kan reeds na 3 dagen na weefsel constructie genereren meetbare kramp krachten al op dag 5-7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cardiale myocyten te verkrijgen, is een licht gewijzigde versie van de Boheler en Lian differentiatiemethoden gebruikt 30,31. Het is noodzakelijk dat de differentiatie begint tijdens de log-fase van celgroei, maar ook dat de uitgangspopulatie voldoende confluent een bruikbare aantal cellen na sortering (ongeveer 75% is optimaal). Kenmerkend voor H7 hESCs, scheepswand in een dichtheid van 140.000 hESCs per putje van een 6-putjes essentiële 8 media en 5% CO2 incubator bij 37 ° C levert voldoende confluente kweken na 4 dagen om de differentiatie te beginnen, zoals weergegeven in Figuur 1A - D. Aangezien insuline cardiale specificatie tijdens het differentiatieproces 32, insuline vrije media (differentiatie media I, tabel 1) remt gebruikt om de eerste 10 dagen van differentiatie. Zodra differentiatie ingeleid door de toepassing van de GSK3 remmer CHIR99021,significante celdood zal plaatsvinden (figuur 1E). Bijgevolg is het essentieel om de media dagelijks veranderen. Op dag 2 van differentiatie, worden de cellen uit CHIR99021 verwijderd en rustte differentiatie media I (zonder kleine moleculen toegevoegd) gedurende 24 uur. Na 24 uur rusten in differentiatie media, worden de cellen behandeld met IWR-1 gedurende 48 uur, waarna ze beginnen te zelforganisatie in clusters (Figuur 1F) dat reeds zeven dagen sloeg inwerkingstelling van de differentiatie. Aangezien cardiale specificatie heeft plaatsgevonden na het aanbrengen van IWR-1, wordt het medium veranderd in medium dat insuline (differentiatie media II, Tabel 1). Bij 18 dagen van differentiatie zijn de kolonies van cellen slaan verbonden en gedeeltelijk los van het celoppervlak, vormen robuust slaan "webben" gehele schaal (Video figuur 1).

Op dag 20, wordt het kloppende monolaag voorzichtig los vieen enzymatische werkwijzen om afzonderlijke cellen te verkrijgen voor levende fluorescentie geassocieerd celsortering (FACS). Met de differentiatie hierboven beschreven werkwijze, we conservatief oogsten ongeveer 65% van de bevolking SIRPα + en 10% als CD90 + (figuur 2). Over het algemeen 1-2000000 SIRPα + cellen worden verkregen per 6-wells plaat.

Na reaggregation 48 uur in een 3: 1 verhouding van SIRPα +: CD90 + cellen, worden de gedefinieerde celaggregaten gemengd met een collageen gebaseerde hydrogel en gepipetteerd in smalle putjes in de basisplaat van de multi-weefsel bioreactor. Kenmerkend voor verwijdering uit de schotel, kleine clusters van 5-10 cellen zien slaan op het oppervlak van de schaal. De gedefinieerde weefsel bioreactor bestaat uit drie componenten: een meester mal om de PDMS berichten geworpen; een frame twee PDMS rekken van functies vervullen; en een zwarte polytetrafluorethyleen basisplaat met zes putjes weefsel mix (Figure 3A). Het gehele weefsel bouwproces wordt uitgevoerd op ijs en in aseptische omstandigheden. Na toevoeging van de vloeistof celmatrix mengsels aan de putjes in de basisplaat, worden de PDMS posten bevestigd aan het polysulfon kader en omgekeerd zodat de posten uitgelijnd met de putten in de basisplaat (Figuur 3B). Na 48 uur incubatie moet het weefsel voldoende verdicht dat de grondplaat kan zijn verwijderd. De bodemplaat is het meest gemakkelijk los door het extraheren van het hele systeem van de media en voorzichtig verwijderen van de overtollige media uit tussen de PDMS en grondplaat. Als al het papier niet wordt verwijderd, kan de oppervlaktespanning van de overgebleven vloeistof de weefsels van de posten trekken. Zodra de media is verwijderd, duw de basisplaat rug tegen de PDMS berichten te helpen los te maken van het weefsel van de grondplaat. Duw geleidelijk de grondplaat uit door zachtjes bewegen van de ene kant van een paar millimeter, dan is de andere kant van hetzelfde bedrag. Herhaal dit proces tot de bamontageplaat bevinden zich verwijderd, met 6 hECTs gehecht aan hun respectieve PDMS end-berichten (figuur 4A). Het verwijderen van de bodemplaat mag niet meer dan één minuut duren. Plaats het in het celkweekmedium, omgekeerd, zodat alle weefsels onder het celkweekmedium.

Ongeveer een dag na het verwijderen van de grondplaat, moet zwak gelokaliseerde contracties waarneembaar in de gedefinieerde hECTs onder helder veld microscopie zijn. Na 7 dagen, hebben de weefsels gerijpt en verdicht (figuur 4B-C) met uitgelijnde sarcomeres (figuur 4D). De weefsels zichtbaar te buigen de PDMS berichten met een gemiddelde van 5-15 μN van kracht (figuur 4E). Twitch krachtmetingen voor de gedefinieerde gemanipuleerde hartweefsel kan worden gemeten door real-time tracking van de post tip afbuiging met een high speed camera en aangepaste data-acquisitie software, en het toepassen van de post afbuiging naar beam theorie buigen na het bepalen van deYoung's modulus van de siliconen posten met een krachtopnemer, zoals in meer detail is. 1,7 onderhouden steriliteit tijdens de gegevensverwerving verzekert de mogelijkheid om wijzigingen in weefselfunctie tijd te bepalen. We hebben functionele weefsels gedurende een aantal weken, zoals uitgelegd in meer detail elders 1. Onze voorlopige resultaten wijzen op een aanzienlijke verbetering van Hect samentrekkingskracht wanneer weefsels worden gesupplementeerd met 10% menselijke mesenchymale stamcellen zowel 1 Hz en 2 Hz stimulatie frequenties (Figuur 4F).

Figuur 1
Figuur 1: Representatieve beelden van de H7 hESCs tijdens de expansie en cardiale differentiatie proces. Expansiefase moet 4 dagen duurt, met een groei van de kolonies van groeiende 24 (A), 48 (B), 72 (C (D). Na 96 h groei differentiatie wordt begonnen, hetgeen een aanzienlijke celdood gedurende de eerste 48 h CHIR99021 behandeling (E). Na twee dagen van IWR-1 behandeling reorganisatie optreedt (F) om clusters van cellen die al op dag 7. Voorts sloeg ordening in een krachtig slaan "web" plaatsvindt van dag 7 tot dag 20, wanneer de monolagen worden gedissocieerd voor het vormen creëren gemanipuleerde hartweefsels.

Video Figuur 1:. Vertegenwoordiger cardiale monolaag na 17 dagen van differentiatie . Klik hier om deze video te bekijken Spontane kloppend binnen de monolaag wordt meestal eerst waargenomen tussen dag 7 en dag 10, en 17 dagen van differentiatie de monolaag met elkaar verbonden "webs heeft gevormd "dat krachtig te verslaan.

Naam Samenstelling Differentiatie dagen gebruikt
Differentiatie Media I RPMI 1640
B27 Supplement (minus insuline)
Penicilline-streptomycine
D0-D1 (met CHIR99021)
D2
D3-D5 (met IWR-1)
D5-D7
Differentiatie Media II RPMI 1640
B27 Supplement (met insuline)
Penicilline-streptomycine
D7-D20

Tabel 1: Samenstelling van Differentiatie Medias.

figuur 2
Figuur 2: Representatieve live cell sorterening resultaten Twee monsters werden bereid:. een ongekleurde controle en een controle gekleurd met 1: 500 verdunning van de SIRPα-PE / Cy7 antilichaam en 1: 250 verdunning van het CD90-FITC antilichaam. Na kleuring werden de cellen gesorteerd op 20 psi bij het sorteren buffer bestaande uit PBS, 10% neonataal kalfsserum, 10 pM ROCK remmer Y-27632 en 1 ug / ml DAPI. Beide celpopulaties werden afgesloten in de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing profielen vuil (A, blauwe lijn) vervolgens werden afzonderlijke cellen geselecteerd door vergelijking van de breedte en hoogte pulse sluiten (pulsbreedte analyse) in zowel de voorwaartse verstrooiing (B, blauwe lijn) en side scatter kanalen (C, blauwe lijn). Vervolgens werden levende cellen geselecteerd door het poorten van de DAPI - populatie (D, blauwe lijn). De uiteindelijke celpopulaties voor verzameling werden bepaald door onderzoek van de FITC en PE-Cy7 expressieniveaus van de levende populaties. De ongekleurde control (E, links) werd gebruikt omvast te stellen de juiste poort te selecteren voor de FITC + (CD90) en SIRPα-PE / Cy7 + (cardiomyocyten) populatie aanwezig in de gebrandschilderde monster (E, rechts). De FITC en SIRPα-PE / Cy7 + poplations werden verzameld in afzonderlijke 15 ml centrifugebuizen.

figuur 3
Figuur 3:. Schema van de multi-weefsel bioreactor en het hartweefsel engineeringsproces bouw van de multi-weefsel bioreactor vereist drie componenten (A): 1) een polytetrafluorethyleen meester mal 9 x 33 x 5 mm 3, met 6 regelmatig verdeelde gaten 0,5 mm diameter; 2) een 25 x 35 x 11 mm 3 polysulfon kader naar het PDMS berichten tijdens weefsel bouw en cultuur te houden; en 3) een 20 x 40 x 5 mm 3 zwarte polytetrafluorethyleen basisplaat met 6 putjes van 6 x 1 x 1 mm 3 dimensies, spaced 4 mm van elkaar langs de lengte. Voor de menselijke gemanipuleerde cardiale weefsels (B) te maken, worden de PDMS berichten vervaardigd door PDMS zachte lithografie met behulp van de polytetrafluorethyleen meester mal, waarvan er twee zijn vervolgens op de lipjes van de polysulfon raam geklemd tot 6 paren van-force sensing cantilever berichten te vormen. Het weefsel oplossing gepipetteerd in de putjes in de zwarte polytetrafluorethyleen grondplaat. Het frame en de berichten worden vervolgens omgekeerd en aangepast aan de polytetrafluorethyleen basisplaat, zodat een paar van de berichten gaat elk putje bevat het weefsel mix. Na 48 uur werd de basisplaat is verwijderd en de gedefinieerde weefsels gekweekt op de posten, blijft ondersteboven in NBS media.

figuur 4
Figuur 4:. Representatieve beelden en functionele metingen van bepaalde menselijke gemanipuleerde cardiale weefsels De multi-weefsel bioreactof het systeem heeft zes weefsels in parallel (A, pijlpunten). Gedefinieerd weefsels zijn self-assembled binnen zeven dagen na het weefsel schepping (bovenaanzicht, B en schuine zijaanzicht, C). (D). Gedeelte van een gedefinieerde hect gekleurd voor cardiaal troponine-T (cTnT). (E) Vertegenwoordiger twitch tracing toont ruwe kracht in de tijd tijdens de 1 Hz stimulatie door elektrisch veld stimulatie. (F) kramp traceren tijdens stimulatie 1 Hz (0-2 sec) en 2 Hz (2-4 sec) stimulatie, met pijlmarkering verandering in frequentie, zowel niet aangevulde gedefinieerde hECTs (getrokken lijn) en weefsels gesupplementeerd met 10% hMSCs (stippellijn).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De bouw van gedefinieerde menselijke gemanipuleerde cardiale weefsels (hect) kan een meer consistente en betrouwbare model van menselijke hartspiercel functie te geven. Kritisch, alle cellulaire en extracellulaire componenten in het systeem bekend en kunnen als gewenst, waardoor de verstorende invloed van andere onbekende celtypen gevolg van het differentiatieproces verwijderd worden gemanipuleerd. Snelle celgroei en hoge opbrengst evenwicht heeft het de voorkeur dat de differentiatie begint bij 75% samenvloeiing van de hESCs, idealiter vier dagen na plateren. Bovendien kan het gebruik van ROCK inhibitor Y-27.632 tijdens zowel de cel dissociatie en reaggregation na sortering verbetert cellevensvatbaarheid. De aanwezigheid van spontane slaan van myocyten tijdens het differentiatieproces is een belangrijke indicator voor de efficiëntie en de gezondheid van de differentiatie. Als spontane afstraffing niet in acht wordt genomen deze arme differentiatie efficiency kan aangeven, hetzij als gevolg van ineffectieve reagentia of een verliesvan pluripotentie van de stamcellen.

Tijdens weefsel uitgevoerd, moet de PDMS posten goed uitlijnen van de kanalen in de basisplaat goed gevormde weefsels die lang genoeg voor het meten van samentrekkingsfunctie maken. Het gemak inrichting uitlijning verbeteren en versterken weefselvorming rond de palen waar zij gevoelig voor breken, is het mogelijk om extra breedte (ongeveer een paaldiameter aan weerszijden van de paal) aan de einden van de kanalen, zoals aangetoond door de "dog bone" vormige kanalen in figuur 3A. Zonder goede uitlijning apparaat het weefsel of los van de posten kort na het kweken of in de put blijft wanneer de basisplaat wordt verwijderd. Als een goed gevormde weefsel afvalt tijdens voetplaat verwijderen, is het mogelijk om het weefsel aan de staanders met behulp van fijne pincet onder een dissectie microscoop voorzichtig reattach, hoewel het gemakkelijk is om de tere hECTs beschadigen adequate voorzorgsmaatregelen genomen. </ P>

De kracht van de beschreven gedefinieerde systeem is de mogelijkheid om de bijdrage van directe cel-cel interactie mechanismen hartcel therapieën gebaseerd op beheersing van celsamenstelling ondervragen. De injectie van cellen bij dieren is onnauwkeurig en onderworpen aan lage levensvatbaarheid en retentie 33. Bovendien wordt het effect van de geïnjecteerde cellen op het doelweefsel gecompliceerd door interacties met andere fysiologische systemen, zoals het immuunsysteem. Als zodanig begrijpen van de bijdrage van directe cel-cel interacties in cardiale celtherapie vecht in modelorganismen aanpakken. Daarom is een voordeel van de beschreven werkwijze is dat cel-cel interacties worden geanalyseerd in een biomimetische driedimensionale omgeving, behoud belangrijkste aspecten van de cardiale niche, en in aanwezigheid van de specifieke celtypen plaats - namelijk de cardiale myocyten en fibroblasten. Het nut van het gebruik van de gedefinieerde Hect systeem demonstrated met de aanvulling van 10% hMSCs uit menselijk merg 34,35 en gebruikt in klinische proeven om het celmengsel tijdens weefsel creëren. Die weefsels die werden aangevuld met de hMSCs tentoongesteld grotere samentrekkende kracht dan de unsupplemented gedefinieerde menselijke weefsels (Figuur 4F). Aangezien het weefsel milieu en de samenstelling is gecontroleerd, de versterking van weefsel functie met MSC suppletie weerspiegelt een inherent effect van hMSCs op cardiomyocyt-functie. Een ander sterk aan het systeem is dat aangezien de weefsels kleiner dan voorheen, 1,7 cel gebruik efficiënter, een belangrijke overweging bij het ​​gebruik van gerichte differentiatie van pluripotente stamcellen als celbron.

Naast het bestuderen van mechanismen van celtherapie, zou het gedefinieerde systeem Hect het onderzoek van cellulaire basis van cardiovasculaire cel-cel interacties mogelijk. Verstoring van de biologie van de cellen voorafgaand aan weefsel constherrie, bijvoorbeeld met shRNAs, zou het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die cel-cel en cel-matrix interacties mogelijk. Een bijkomend voordeel van het systeem weefselmanipulatie is de vorming uitgelijnde myofibrillen kunnen functionele contracties. Dus, door de gedefinieerde hect systeem, de dynamiek van myofibril vorming cardiomyocyt ontwikkeling en de organisatie van de weefselarchitectuur alle onderzoek via modificatie van de componenten van de extracellulaire matrix of moleculaire manipulatie van de cellen. De menselijke en 3-D karakter van de hect systeem bovendien verhoogt de vertaalbaarheid van de bevindingen.

Hoewel het beschreven systeem biedt een krachtige methode voor het begrijpen van fundamentele vragen van cardiovasculaire biologie, is niet zonder beperkingen. Ten eerste, het gemanipuleerde weefsel vertonen een onrijp fenotype in overeenstemming met gepubliceerde kramp krachtgegevens van pasgeboren myocard monsters 7. Hoewel defenotypische onvolwassenheid kan een verstorende factor bij de beoordeling van de cel interactie mechanismen, zijn er aanwijzingen dat de zieke hartspiercellen terugkeren naar een foetale gen programma 7,36-38. Bevindingen van Hect systeem blijken relevant in de context van een falende hart te zijn, kan dit voordelig zijn voor het testen van cardiale therapieën. Het protocol maakt ook gebruik van een hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix tijdens weefsel bouw. De samenstelling van deze matrix kan variëren van partij tot partij, en terwijl gedefinieerd kelder matrix alternatieven beschikbaar zijn ze nog moeten worden beoordeeld in de context van hECTs.

Andere beperkingen zijn het ontbreken van een vaatstelsel en geen systemen-level interactie-effecten. Gezien de omvang van de weefsels, zijn metabolische eisen voldaan door diffusie alleen dus geen vasculaire systeem nodig om cellevensvatbaarheid te waarborgen. Evenwel endotheelcellen signalering een belangrijke factor in specifieke cel therapieën. Als dit het geval is, een bepaald aantal endothelial cellen kunnen gewoon naar de gedefinieerde cel mix tijdens weefsel bouw worden toegevoegd. Terwijl systeemniveau interacties zijn belangrijk voor volledig begrip van celmechanismen het gemanipuleerde weefsel systeem biedt een reductionistische benadering van het probleem om het mechanisme systematische wijze vereenvoudigen. Complexiteit kan worden toegevoegd aan de gedefinieerde weefselsysteem indien nodig door de invoering van systemen gerelateerde effecten, zoals leukocyten om een ​​immuunreactie of door toevoeging naburige types weefsel paracrienen ondervragen nemen.

Als een onderzoeksinstrument, de gedefinieerde menselijk gemanipuleerde hartweefsel systeem biedt de voordelen van soortspecifieke menselijke cellen, een biomimetische 3-D cultuur omgeving met gecontroleerde biocomplexiteit, ongecompliceerd en longitudinale controle van de contractiele functie en een gedefinieerde cellulaire en matrix samenstelling. Toekomstige richtingen voor de hect systeem omvatten het manipuleren van de therapeutische celtype van belang with siRNA of shRNA voorafgaand aan het inbrengen in het weefsel om specifieke moleculaire details van cel-cel interactie te onderzoeken. Bovendien, in plaats van hESCs de hartcellen te vormen, kan men geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van patiënten te gebruiken met een erfelijke mutatie in een poging om gerelateerde hartziekte uitingen modelleren in de gemanipuleerde weefsels. Aldus onze methode om humane gemanipuleerde hartweefsel met gedefinieerde celpopulaties belooft nieuwe wegen openen voor het bestuderen van cardiale celtherapie te helpen versnellen de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor patiënten met een hartziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH (1F30HL118923-01A1) aan TJC, NIH / NHLBI PEN contract HHSN268201000045C aan KDC, de onderzoeksbeurs Raad van Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) naar BDG, de Amerikaanse Heart Association (12PRE12060254) naar RJ en Research Grant Raad van HKSAR (TBR's, T13-706 / 11) Aanvullende financiering RL werd door de NIH DRB 5T32GM008553-18 en als een stage op NIDCR-Interdisciplinair Training in systemen en Ontwikkelingspsychologie aan TJC voorzien biologie en geboorteafwijkingen T32HD075735. De auteurs willen ook dankbaar erkennen Arthur Autz op de Zahn Centrum van het City College of New York voor hulp bij het bewerken van de bioreactor en Mamdouh Eldaly voor technische ondersteuning. We danken ook Dr. Kenneth Boheler voor advies over cardiale differentiatie en Dr. Joshua Hare voor royaal verstrekken van menselijke mesenchymale stamcellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter