Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ingegneria tissutale cardiaca ha avanzato enormemente negli ultimi dieci anni, con più gruppi editoriali risultati completamente funzionale, tessuti battendo realizzati da entrambi i cardiomiociti murini 1-6 e, più recentemente, umani cellule staminali derivate miociti cardiaci 7-12. Il campo di ingegneria dei tessuti cardiaco è guidata da due obiettivi primari e sostanzialmente indipendenti: 1) per sviluppare innesti esogeni che possono essere trapiantate in mancanza di cuori per migliorare la funzione 4-6; e 2) sviluppare modelli in vitro per lo studio fisiologia e malattie, o come strumenti di screening per sviluppo terapeutico 2,7.

Tridimensionale (3-D) coltura cellulare è considerata essenziale per lo sviluppo di strumenti di screening di nuova generazione, come la matrice 3-D riflette un microambiente cardiaco più naturale di coltura cellulare monostrato 2-D tradizionali; infatti alcuni aspetti della biologia cellulare sono fondamentalmente differenti in 2-D vs 3-D culture 13,14 9 o collagene 7,8,10) è strettamente controllato, la composizione cella di input è meno ben definita, con l'intera miscela di cellule da una differenziazione cardiaca diretto di entrambi le cellule staminali embrionali (ESC 7,9) o di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC 10,12) che viene aggiunto ai tessuti. A seconda della linea cellulare specifica e l'efficienza del protocollo differenziazione utilizzato, la percentuale risultante dei cardiomiociti può variare da meno del 25% a oltre il 90%, il fenotipo specifico cardiomiociti (cioè, ventricular-, atrial- o pacemaker-like) può anche variare, anche la frazione non cardiomiociti può essere molto eterogenea 15,16 e alterare la maturità del differenziata m cardiacoyocytes 17.

Recenti cardiaco lavoro ingegneria dei tessuti ha tentato di controllare la popolazione di ingresso di cellule, sia con un reporter cardiaco linea di cellule staminali embrionali umane 8 o cellule superficie marcatori 18 viene utilizzato per isolare la componente dei miociti cardiaci della differenziazione. Mentre inizialmente un tessuto composto da sole miociti cardiaci sembra essere l'ideale, questo è infatti il ​​caso; hECTs composte unicamente da miociti cardiaci non riescono a compattare nei tessuti funzionali, con alcuni gruppi di trovare un rapporto 3: 1 di miociti cardiaci: fibroblasti che producono la più alta forza di contrazione 8. Utilizzando diversi metodi di selezione delle cellule, compresi marcatori di superficie per l'ordinamento delle cellule vive, è possibile creare hECTs con popolazioni cellulari definiti. Mentre marcatori di cellule stromali non cardiaci sono stati disponibili per un certo tempo, come il marcatore CD90 fibroblasti putativo 19,20, marcatori di superficie di miociti cardiaci sono stati più difficiliper identificare. SIRPα è stato tra i primi marcatori di superficie cardiaci identificati per miociti cardiaci umani 18 e ha dimostrato di essere altamente selettivo per il lignaggio cardiaco. Recentemente, abbiamo scoperto che in doppio ordinamento per SIRPα + e CD90 - cellule rese cardiomiociti quasi puro, con il CD90 + popolazione che presenta una fibroblasti simile fenotipo (Josowitz, osservazioni non pubblicate). Sulla base di questi risultati raccolti, qui descriviamo la creazione hECTs con un 3: 1 combinazione di SIRPα + / CD90 - cardiomiociti e fibroblasti CD90 +.

La capacità di progettare un tessuto cardiaco umano completamente definita è essenziale non solo per la creazione di solidi strumenti di screening, ma anche per lo sviluppo di sistemi modello per indagare cellulo emergente e le terapie cardiache gene-based. In particolare, numerose terapie cellulari per insufficienza cardiaca, utilizzando tipi di cellule tra cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) 21 22 e cellule mononucleari del midollo osseo 23-25, sono stati testati in studi clinici. Mentre molti dei risultati iniziali sono stati promettenti 21,23,25, il vantaggio iniziale, spesso diminuisce nel tempo 26-29. Una tendenza simile è stata riportata in murini ingegnerizzato tessuto cardiaco, che mostrano un significativo beneficio funzionale a causa di supplementazione di MSC, ma il beneficio non è sostenuta durante la coltura a lungo termine 1. Alla base le prestazioni sub-ottimali è la nostra limitata conoscenza dei meccanismi che regolano terapie cellulari. Una più profonda comprensione di come le cellule terapeutico esercitare la loro influenza benefica, nonché possibili conseguenze negative delle interazioni miociti-nonmyocyte, consentirebbe lo sviluppo di terapie migliorate ottenendo benefici clinicamente significativi e sostenuti, con effetti collaterali minimi, per i pazienti con insufficienza cardiaca.

Qui, descriviamo l'uso di hECTs definite a Esamate meccanismi di terapia cellulare. La composizione del tessuto controllato è essenziale per identificare i fattori specifici che influenzano le prestazioni dei cardiomiociti. Direttamente integrazione hECTs con il tipo di cellule terapeutiche di interesse (ad esempio, MSC), può rivelare gli effetti sulle prestazioni dei miociti cardiaci, come abbiamo dimostrato in crediti ECTS ratto 1.

Il seguente protocollo multi-step inizia con diretto differenziazione delle cellule staminali cardiache, seguita dalla realizzazione del bioreattore multi-tessuto, e concludere con una descrizione di costruzione dei tessuti e analisi funzionale. I nostri esperimenti vengono eseguiti utilizzando la linea NIH-approvato H7 cellule staminali embrionali umane (hESC). Tuttavia, i seguenti protocolli sono anche stati testati utilizzando una linea hESC aggiuntivo e tre linee di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) con risultati simili. Abbiamo scoperto che l'efficienza nella differenziazione dei cardiomiociti e il successo in hect fabbricazione può essere linea cellulare dipendente, in particolare folinee r hiPSC derivati ​​da singoli pazienti. Seguendo questo protocollo, due piatti 6 pozzetti sono placcati con un totale di 1,68 milioni di hESC (140.000 cellule per pozzetto), che produce circa 2,5 milioni di miociti dopo differenziazione per 20 giorni e l'ordinamento, abbastanza per fare sei tessuti definiti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nota: eseguire tutte le manipolazioni di cellule in condizioni asettiche con una classe II cappa di sicurezza biologica HEPA filtrata e sterilizzare tutte le soluzioni da filtrandoli attraverso un filtro 0,2 micron. Esegui creazione tessuti e collaudo funzione sia stesse condizioni asettiche o una cappa a flusso laminare.

1. Semina di H7 hESC in preparazione differenziazione cardiaca

  1. (Giorno 1) Preparazione della matrice di membrana basale
    1. Scongelare 150 ml aliquota di hESC matrice membrana basale qualificata su ghiaccio durante la notte a 4 ° C.
  2. (Giorno 0-4) placcatura di hESC su piastre rivestite
    1. Diluire la matrice scongelata in 12 ml di ghiacciata DMEM / F12 e mescolare bene.
    2. Trasferire 1 ml della soluzione / F12-matrice DMEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6-trattati bene. Ogni aliquota di matrice può cappotto due 6 pozzetti.
    3. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
      Nota: Innostra esperienza, piatti rivestiti sigillati con paraffina può essere conservato in soluzione di matrice a 4 ° C per 10 giorni prima dell'uso.
    4. A circa il 75% di confluenza, dissociare il H7 hESC dal 10 centimetri piatto con 6 ml del reagente di dissociazione non enzimatica. Dopo 5 min, raschiare delicatamente le cellule dalla superficie coltura usando un raschietto cellulare e getta e trasferire la sospensione cellulare ad una sterile 15 ml provetta da centrifuga.
    5. Rimuovere 0,5 ml della soluzione di dissociazione con le cellule dal tubo 15 ml e ad una nuova sterile 15 ml di tubo (lasciando 5,5 ml del reagente di dissociazione di dissociare ulteriormente la hESC) per la linea di cellule staminali propagazione.
    6. Pellet 0,5 ml di cellule a 300 xg per 5 min a 20 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente in 8 ml di mezzi di cellule staminali pluripotenti contenente 1% di penicillina-streptomicina poi trasferire in un nuovo, spalmati, 10 centimetri piatto di coltura di tessuti e di mantenere 37 ° C e 5% di CO 2 per mantenere la linea di cellule staminali.
      Nota: Tenere i supporti di cellule staminali pluripotenti in ghiaccio durante i cambi di media.
    7. Nel frattempo, aggiungere 5,5 ml di 10 mM inibitore ROCK Y-27632 al 5,5 ml di dissociazione soluzione rimanente e continuare ad incubare a temperatura ambiente per un'altra 5-10 min. Mescolare delicatamente le cellule con un 5 ml pipetta sierologica. Continuare ad incubare fino ad ottenere una sospensione di cellule singole, quindi agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    8. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzi di cellule staminali pluripotenti ed eseguire una conta delle cellule utilizzando un emocitometro.
    9. Seme ciascun pozzetto del piatto 6 pozzetti ad una densità di 140.000 cellule per pozzetto. Seme due piastre da 6 pozzetti per creare un totale di sei tessuti definiti. Smaltire le cellule residue dopo la placcatura.
    10. Riempire i bene a 1 ml con supporto di cellule staminali pluripotenti e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Ventiquattro ore dopo, rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di mezzi di cellule staminali pluripotenti fresco ad ogni pozzetto (Figura 1A
    11. Controllare la confluenza delle piastre ogni giorno e iniziare la differenziazione una volta che le cellule raggiungono circa il 75% di confluenza (Figura 1B - D).

2. (giorno 4-24) Differenziazione delle cellule staminali embrionali umane a cardiomiociti 30,31

  1. (Giorno 4-7, differenziazione Giorno 0-3) Mesoderma induzione
    1. Preparare RPMI differenziazione dei media I (tabella 1) mediante la combinazione di 500 ml RPMI 1640 con 10 ml di B27 supplemento (senza insulina) e 5 ml di soluzione madre di penicillina-streptomicina (10.000 UI / ml di penicillina; 10.000 mg / ml di streptomicina). Aliquota, sul ghiaccio, in provette da 50 ml e conservare a 4 ° C.
    2. (Giorno 4, differenziazione Giorno 0) Preparare i media induzione mesoderma con l'aggiunta di 2,4 ml di CHIR99021 piccolo inibitore di GSK3 molecola (10 mM magazzino, 6 micron concentrazione finale) a 12 ml di mezzi di differenziazione RPMI I. rimuovere il supporto di cellule staminali pluripotenti da ogni pozzetto unND sostituirlo con 2 ml di media mesoderma di induzione per pozzetto. Riportare la piastra per l'incubatore.
      Nota: morte cellulare significativa verifica in genere con l'aggiunta di CHIR99021 (Figura 1E). Il monostrato si riprenderà, ma è importante risciacquare le cellule morte via con il risciacquo DMEM / F12.
    3. (5 ° giorno, differenziazione Giorno 1) Preparare i media mesoderma induzione freschi come descritto sopra. Rimuovere i vecchi media da ciascun pozzetto e lavare una volta con 1 ml di DMEM / F12 per pozzetto. Aggiungere 2 ml di media mesoderma induzione fresco in ogni pozzetto.
      Nota: risciacquo ogni giorno dalle 0-10 giorni aumenta notevolmente la resa e la purezza dei miociti cardiaci.
    4. (Giorno 6, differenziazione Giorno 2) Rimuovere il supporto di induzione cardiaci e lavare una volta con 1 ml DMEM / F12 per pozzetto. Sostituire il risciacquo con 2 ml RPMI differenziazione dei media I (non piccole molecole aggiunto, ma ancora con la B27 (senza insulina) supplemento) e tornare alla incubatore.
  2. (Giorno 7-13, differenziazione Day 3-10) Cardiac Mesoderma induzione
    1. (7 ° giorno, differenziazione Giorno 3) Preparare i media mesoderma induzione cardiaco con l'aggiunta di 6 ml di piccola molecola inibitore Wnt IWR-1 (10 mM magazzino, 5 mM finale) a 12 ml di RPMI mezzi differenziazione I.
    2. Rimuovere il supporto da ogni pozzetto, lavare una volta con 1 ml DMEM / F12 per pozzetto e sostituirlo con 2 ml di mezzi mesoderma induzione cardiaco per pozzetto.
    3. (Giorno 8, differenziazione Giorno 4) Preparare ulteriori 12 ml di mezzi di induzione mesoderma cardiaca come descritto sopra. Rimuovere il supporto aggiunto il giorno prima, lavare una volta con 1 ml DMEM / F12 per pozzetto e sostituirlo con 2 ml di media differenziazione mesoderma cardiaco fresco per bene e tornare alla incubatore.
    4. (Giorno 9-10, differenziazione Giorno 5-6) In entrambe le giornate, rimuovere i media mesoderma induzione cardiaci e risciacquare bene con ciascuno 1 ml di DMEM / F12.
    5. Aggiungere 2 ml di fresca mezzi differenziazione RPMI I (non piccole molecole aggiunto, ma ancora con la B27 (senza insulina) supplemento)a ciascun pozzetto e riportare la piastra per l'incubatore.
  3. Cardiaca miociti Organizzazione / maturazione (Giorno 11-24, differenziazione Giorno 7-20) HES-derivato
    1. Preparare il supporto RPMI differenziazione II (Tabella 1) mediante la combinazione di 500 ml RPMI 1640 con 10 ml di B27 supplemento (con insulina) e 5 ml di soluzione madre di penicillina-streptomicina. Aliquota, sul ghiaccio, in provette da 50 ml e conservare a 4 ° C.
    2. (Giorno 11, differenziazione Giorno 7) Rimuovere RPMI mezzi differenziazione (senza insulina) da ogni pozzetto e risciacquare con 1 ml DMEM / F12. Sostituire con 2 ml di nuova differenziazione dei media RPMI II (con l'insulina) in ciascun pozzetto e tornare alla incubatore.
      Nota: deve prima essere osservato battito spontaneo tra i giorni 7 e 10. Se battito non viene rispettata in questo periodo, in genere indica scarsa efficienza differenziazione. Il protocollo può essere continuato fino al giorno 15 in uno sforzo per osservare battitura, ma se non battitura è osservato da giorno 15 è meglio start una nuova differenziazione.
    3. (Giorno 12-24, differenziazione Giorno 8-20) Ogni giorno, rimuovere i vecchi media differenziazione e sostituirlo con 2 ml di fresco RPMI differenziazione dei media II per pozzetto per permettere la maturazione delle cellule e l'organizzazione del monostrato pestaggio (Figura 1F, video figura 1 ).
      Nota: A seconda della morte cellulare residuo, può essere necessario risciacquare con 1 ml di DMEM / F12 attraverso la differenziazione giorno 10.

3. (Giorno 24, differenziazione Giorno 20) Isolamento dei miociti cardiaci e fibroblasti-like

  1. Separa celle dal monostrato
    1. Rimuovere i supporti di differenziazione e lavare una volta con 1 ml di PBS.
    2. Dissociare il monostrati di 1 ml di soluzione dissociazione enzimatica (0,04% tripsina / EDTA 0,03%) a ciascun pozzetto.
    3. Spostare piastra in incubatore per 10 minuti. Nel frattempo, aggiungere 12 ml di inibitore ROCK a 6 ml di soluzione tripsina neutralizzazione.
    4. Gently aggiungere 1 ml di soluzione tripsina di neutralizzazione contenente l'inibitore ROCK a ciascun pozzetto della piastra per neutralizzare la soluzione tripsina.
    5. Usando una pipetta sterile, mescolare delicatamente ogni pozzetto di spezzare i gruppi di cellule.
    6. Trasferire tutti i 12 ml dal 6 pozzetti in una provetta da centrifuga da 15 ml.
      Nota: Dal momento che due 6 pozzetti sono utilizzati in questo protocollo, saranno necessari due tubi da 15 ml.
    7. Trasferimento 3 ml di PBS per un pozzetto della piastra, e quindi sequenzialmente trasferire gli stessi 3 ml per ogni successivo e per raccogliere le cellule residue sul piatto. Trasferire le restanti 3 ml dalla finale e nella stessa 15 ml tubo da centrifuga contenente le cellule.
    8. Pellet a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  2. Preparare cellule per Live cellulare Ricerca per FACS
    1. Preparare il buffer di colorazione con l'aggiunta di 5 ml di siero fetale bovino al 45 ml di PBS su ghiaccio con 50 ml di inibitore ROCK.
    2. Rimuovere il surnatante dal pel cellularelasciare (a 3.1.8) e risospendere in 1,2 ml di tampone colorazione.
    3. Trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare a un nuovo, pre-raffreddata, 50 ml tubo da centrifuga su ghiaccio. Questo sarà il controllo della colorazione negativa.
    4. Trasferire il restante 1 ml di sospensione cellulare per un nuovo, pre-raffreddata, 50 ml tubo da centrifuga su ghiaccio e aggiungere 2 microlitri SIRPα-PE / Cy7 (diluizione 1: 500) e 4 ml di CD90-FITC (1: 250 diluizione) . Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta e ritornare al ghiaccio.
    5. Incubare sia il controllo negativo e campione, su un agitatore bilanciere, su ghiaccio, a 4 ° C per 1 ora.
    6. Preparare provette per il prelievo del campione con l'aggiunta di 3 ml di RPMI supporto (con insulina) per due 15 ml provette da centrifuga. Aggiungere 3 ml di inibitore ROCK a ciascuna provetta e memorizzare sul ghiaccio.
    7. Agglomerare le cellule colorate a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e lavare due volte con almeno 10 ml di PBS ghiacciato per risciacquo.
    8. Aggiungere 1 ml di DAPI (1 mg / ml) per 5 ml di tampone colorazione. Delicatamenterisospendere il pellet campione con 1-3 ml di tampone colorazione DAPI contenenti usando una pipetta di trasferimento.
    9. Aggiungere 500 microlitri di tampone colorazione (senza DAPI aggiunto) per il controllo negativo.
    10. filtrare delicatamente sia il controllo negativo e campione attraverso un colino 40 micron cella per rimuovere grumi di cellule e di trasferire al polistirolo tubi FACS sul ghiaccio. Immediatamente portare i campioni al cell sorter.
    11. Simili a cellule vive stabilito metodi di ordinamento 18, usa il controllo negativo per impostare le porte, selezionare per le cellule vive (DAPI negativo) e raccogliere sia la FITC + (vale a dire, CD90 + fibroblasti) e PE / Cy7 + (vale a dire, SIRPα + cardiomiociti ) le popolazioni in modo indipendente a 20 psi (Figura 2).
      Nota: Dopo aver impostato i cancelli, il controllo negativo può essere fissato in 4% PFA per determinare l'efficienza differenziazione dalla colorazione per troponina cardiaca-T.
      Nota: Alcuni ricercatori preferiscono utilizzare unisotipo di controllo piuttosto che il controllo senza macchia per impostare le porte al fine di compensare il legame degli anticorpi non specifico. Un controllo cosiddetta fluorescenza meno uno (FMO) è un'altra possibilità. A causa della chiara distribuzione bimodale del FITC, DAPI e segnali PE-Cy7, abbiamo gated dalla popolazione positiva, prudenzialmente puntando lontano nel cancello di positivo, che forse esclude alcuni veri positivi, ma aiuta a ridurre al minimo eventuali falsi positivi.
  3. Cellulare riaggregazione in preparazione Tissue Engineering
    1. Dopo l'ordinamento delle cellule, pellet entrambi i tubi di raccolta e risospendere in 1 ml di DMEM contenente 10% di siero bovino neonatale, 1% di penicillina-streptomicina e 0,2% amfotericina B ( "NBS media").
    2. Ricombinare il SIRPα + e cellule CD90 + in un rapporto 3: 1 e piastra le cellule combinati in una cultura non-tessuto trattato capsula di Petri con una densità di 2 milioni di cellule per 60 centimetri 2 (10 centimetri piatto). Aggiungere 10 ml di supporti NBS e 101; l di inibitore ROCK Y-27632.
    3. Mettere sospensione cellulare nel tessuto culturale incubatore per 48 ore per permettere riaggregazione delle cellule in piccoli gruppi.

4. cardiache umane Tissue Engineering

  1. Realizzare il bioreattore Multi-tessuto
    Nota: per integrare le illustrazioni in figura 3A, file CAD con schemi di progettazione bioreattori dettagliate sono disponibili su richiesta dagli autori.
    1. Macchina del maestro stampo PDMS con la perforazione di sei fori equidistanti di 0,5 mm di diametro in un parallelepipedo 9 x 33 x 3,25 millimetri di politetrafluoroetilene.
    2. L'utilizzo di un fresa, macchina di un fotogramma di polisulfone misura 25 x 35 x 11 mm 3. Lo scopo del telaio è di mantenere i montanti PDMS (costruite dal calco sopra) in allineamento con i pozzetti nella piastra di base.
    3. Utilizzando una fresa a 1 mm, macchina 6 pozzetti (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm disparte, in 20 x 40 x 5 mm 3 pezzi di poli neratetrafluoroetilene per formare la piastra di base.
    4. Miscelare la base elastomerica e agente indurente per polidimetilsilossano (PDMS) in un 10: 1 w / w rapporto e aggiungere allo stampo politetrafluoroetilene personalizzato (fase 4.1.1) per creare due file di sei posti di forza in grado di rilevare, e incubare durante la notte e sotto vuoto a 80 ° C. Dopo la polimerizzazione, rimuovere delicatamente il PDMS dallo stampo master e marcare attentamente le cime di ogni post con un pennarello nero permanente per una maggiore contrasto e automatizzato di monitoraggio dopo deformazione in tempo reale.
      Nota: Politetrafluoroetilene è abbastanza morbido e può essere danneggiato facilmente. Prestare attenzione durante la pulizia dello stampo maestro prima di PDMS fusione per garantire la longevità del sistema e della geometria PDMS messaggio coerente. Un conduttori 0,5 mm può essere utilizzato per pulire i fori per i posti dopo ogni utilizzo, ma fare attenzione a non raschiare l'interno dei fori.
      Nota: Un'alternativa è degassare il PDMS sotto vuoto per diverse ore a temperatura ambiente, poi lasciare la cura miscela a pressione ambiente.Questo può portare ad un minor numero di bolle di gas residui che formano nei PDMS durante il processo di polimerizzazione.
    5. Sterilizzare tutti i componenti in autoclave a vapore.
      Nota: Lo stampo PDMS master (fase 4.1.1) e il telaio polisulfone (fase 4.1.2) sono entrambi riutilizzabili. Il PDMS posti creati dal cast (fase 4.1.4) è anche riutilizzabile, ma solo per circa 10 impieghi. Tuttavia, più PDMS messaggi possono essere creati in base alle esigenze utilizzando lo stampo maestro.
  2. Raccogliere le cellule cardiache Reaggregated
    1. Rimuovere le cellule reaggregated dal termostato e trasferire tutti i 10 ml di media riaggregazione in una provetta da centrifuga da 50 ml.
    2. Lavare la piastra con 3 ml di PBS e trasferire il risciacquo allo stesso 50 ml tubo da centrifuga contenente il supporto riaggregazione.
    3. Aggiungere 3 ml di 0,04% tripsina / EDTA 0,03% al piatto da 10 cm e tornare alla incubatore per 5 min.
    4. Dopo 5 minuti, esaminare il piatto con un microscopio composto invertito a 10X di ingrandimento per garantire la completa dissociazione delle cellulezione dal piatto. Se alcuni gruppi residui sono ancora attaccate, agitare delicatamente la piastra per staccare i grumi. Se i cluster rimangono attaccati, tornare alla incubatore per altri 2-3 minuti. Non incubare più di dieci minuti o significativa la morte delle cellule possono verificarsi.
    5. Una volta che tutte le cellule sono staccati, aggiungere 3 ml di soluzione tripsina neutralizzazione. Mescolare delicatamente la soluzione di neutralizzazione con la soluzione tripsina-cellula e trasferimento al tubo da centrifuga da 50 ml contenente i mezzi di riaggregazione e risciacquare una volta con PBS.
    6. Risciacquare l'intera piastra con 5 ml di PBS e trasferimento stesso tubo 50 ml contenente le cellule.
    7. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di NBS dei media, poi il trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
    9. Pellet a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Le cellule cardiache (cellule CD90 + stromali e SIRPα + myocYtes) sono ora pronti per la costruzione dei tessuti.
  3. (Opzionale) raccogliere le cellule supplementari di interesse
    Nota: Oltre ai tessuti definiti contenente esclusivamente SIRPα + cardiomiociti e fibroblasti-like CD90 +, è possibile aggiungere celle aggiuntive di interesse per interrogare loro effetto sulla funzione del tessuto. Per esempio hanno dimostrato MSC di ratto per migliorare la funzione di ratto ingegnerizzato tessuto cardiaco 1. Il seguente passaggio facoltativo descrive la raccolta di cellule supplementari per il sistema definito.
    1. Raccogliere il tipo di cellula supplementare di interesse (ad esempio, le cellule staminali mesenchimali) con 0,25% tripsina / EDTA 0,1%.
    2. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente poi risospendere in 5 ml di appropriati mezzi di coltura cellulare per il tipo cellulare di interesse. Ad esempio per MSC, utilizzare DMEM integrato con 20% siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina e 0,2% anfotericina-B alla cultura cells.
    3. Eseguire una conta di cellule utilizzando un emocitometro, poi pellet di nuovo le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di mezzi di coltura cellulare e trasferire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
    5. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    6. Rimuovere il surnatante. Le cellule supplementari sono ora pronti per la costruzione dei tessuti.
      Nota: se le cellule supplementari vengono aggiunti ad una concentrazione del 10% del numero totale di cellule nel tessuto, poi per i tessuti definiti, ciò richiederà 50.000 cellule supplementari per tessuti come ogni tessuto contiene 500.000 cellule cardiache (sia cellule stromali CD90 + e miociti SIRPα +).
  4. Creare le umane Engineered cardiache tessuti
    Nota: Conservare tutte le soluzioni su ghiaccio e le celle a temperatura ambiente. Tutti i volumi elencati di seguito si intendono per tessuti. Tipicamente, circa sei tessuti possono essere costruiti da due 6-ben plAtes di differenziazioni cardiaci.
    1. Diluire 60,0 ml di 5 mg / ml di collagene stock da 3,125 mg / ml con 1,5 ml di 1 M NaOH, 9,6 microlitri di PBS 10x e 24,9 microlitri di acqua sterile deionizzata ultrapura.
      passaggio fondamentale: evitare l'introduzione di bolle d'aria per ogni soluzione durante la preparazione come bolle d'aria interferiscono con la formazione di tessuto corretta.
    2. Aggiungere 12,0 ml di MEM sia 10x e 0,2 N HEPES pH 9 alla miscela collagene diluita per creare il mix collagene. Aggiungere entrambe le soluzioni lungo la parete della provetta 15 ml centrifuga al fine di evitare l'introduzione di bolle d'aria nella miscela di collagene.
    3. Aggiungere la matrice membrana basale ad una concentrazione finale di 0,9 mg / ml alla miscela di collagene e memorizzare sul ghiaccio per creare il mix tessuto finale. La concentrazione finale di collagene dovrebbe essere di 2 mg / ml.
    4. Aggiungere 500.000 delle cellule reaggregated al mix di tessuto (miociti + concentrazione dei fibroblasti è di 20 milioni / ml) e riempire ad un volume finale di 25 pl peril tessuto sia con mezzi NBS cell-free o 50.000 cellule del tipo di cellula supplementare di interesse (ad esempio, hMSCs) e mescolare bene per formare una sospensione di cellule ancora.
      Nota: Il numero di cellule integrati varierà da per diverse applicazioni. Qui il 10% supplementazione viene utilizzato.
    5. Con cura, pipetta 25 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle sei pozzetti della piastra di base bioreattore, senza introdurre bolle d'aria nel pozzo.
    6. Premere due file di sensori di forza PDMS su entrambi i lati del telaio polisulfone, formando 6 coppie di perni contrapposti, poi invertire la cornice in cima alla piastra di base in modo che una coppia di montanti entra ciascun pozzetto contenente la sospensione cellulare.
      Nota: Il telaio polisulfone include schede per aiutare nella allineamento delle PDMS.
    7. posizionare con cura il bioreattore, piastra di base verso il basso, in un piatto 60 mm, quindi inserire il piatto senza la sua copertina di un piatto 10 cm e posizionare il coperchio 10 centimetri sulla parte superiore, e spostare l'intero gruppo bioreattore aalla cultura incubatore tessuti, aspettare due ore per il tessuto di gel.
    8. Dopo 2 ore, togliere il bioreattore dal termostato e aggiungere 14 ml di NBS media per l'intero gruppo, sufficienti a coprire la piastra di base. Rientro in incubatrice, e cambiare la metà dei media ogni giorno.
    9. Quarantotto ore dopo, rimuovere con attenzione la piastra di base, spostando leggermente entrambi i lati della piastra di base dal telaio di qualche millimetro alla volta, cambiare i mezzi di comunicazione, per poi tornare il bioreattore, tessuti rivolto verso il basso, ai media.
    10. Continuare a cambiare la metà dei terreni di coltura NBS ogni giorno.
      Nota: le contrazioni spontanee del tessuto può essere osservato a partire da 3 giorni dopo la costruzione dei tessuti, generando forze di contrazione misurabili fin dal giorno 5 a 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Per ottenere miociti cardiaci, una versione leggermente modificata dei metodi di differenziazione Boheler e Lian viene utilizzata 30,31. È indispensabile che la differenziazione inizia durante il log-fase di crescita delle cellule, ma anche che la popolazione di partenza è sufficientemente confluenti di ottenere un numero utilizzabile di celle dopo ordinamento (circa il 75% è ottimale). Tipicamente, per H7 hESCs, placcatura con una densità di 140.000 hESC per pozzetto di un piatto 6 pozzetti in essenziali 8 media e 5% CO 2 incubatore mantenuto a 37 ° C produce culture sufficientemente confluenti dopo 4 giorni per iniziare la differenziazione, come illustrato in figura 1A - D. Dal momento che l'insulina inibisce specifiche cardiaco durante il processo di differenziazione 32, l'insulina media liberi (differenziazione dei media I, tabella 1) è usato per i primi 10 giorni di differenziazione. Una volta differenziazione viene avviata tramite l'applicazione del CHIR99021 inibitore GSK3,la morte delle cellule significativo si verificherà (Figura 1E). Di conseguenza, è essenziale per cambiare i mezzi di ogni giorno. Il giorno 2 di differenziazione, le cellule vengono rimosse dal CHIR99021 e riposato nei media differenziazione I (senza aggiunta di piccole molecole) per 24 ore. Dopo il riposo 24 ore nei media differenziazione, le cellule vengono trattate con IWR-1 per 48 ore, dopo di che cominciano ad auto-organizzarsi in cluster (Figura 1F) che battono già a sette giorni dalla partenza della differenziazione. Dal momento che le specifiche cardiaca si è verificato dopo l'applicazione di IWR-1, il supporto viene modificato in supporti contenenti insulina (differenziazione dei media II, tabella 1). Con 18 giorni di differenziazione, le colonie di cellule che battono sono connessi e in parte staccato dalla superficie cellulare, formando robustamente battendo "reti" in tutto il piatto (Video Figura 1).

Il giorno 20, il monostrato pestaggio è leggermente dissociato VIa metodi enzimatici per ottenere cellule singole per lampade fluorescenti cella associata dal vivo (FACS). Utilizzando il metodo differenziazione sopra descritto, abbiamo prudenzialmente raccogliamo circa il 65% della popolazione SIRPα + e il 10% come CD90 + (Figura 2). Generalmente 1-2 milioni SIRPα + cellule sono ottenute per 6 pozzetti.

Dopo riaggregazione per 48 ore in un rapporto 3: 1 di SIRPα +: CD90 + cellule, gli aggregati di cellule definiti vengono mescolati con un idrogel a base di collagene e pipettati nei pozzetti stretti nella piastra base del bioreattore multi-tessuto. Tipicamente, prima della rimozione dal piatto, piccoli gruppi di 5-10 cellule saranno visibili battendo sulla superficie del piatto. Il bioreattore tessuto definito costituito da tre componenti: uno stampo master per lanciare i posti PDMS; un telaio per contenere due PDMS rack di posti; e un politetrafluoroetilene piastra di base nera contenente sei pozzi per il mix di tessuto (figure 3A). L'intero processo di costruzione del tessuto è eseguita su ghiaccio e in condizioni asettiche. Dopo aver aggiunto il liquido miscele cellula-matrice ai pozzi nel basamento, i montanti PDMS sono fissati al telaio polisulfone, e poi invertita in modo che i messaggi siano allineati con i pozzi della piastra di base (Figura 3B). Dopo 48 h di incubazione, i tessuti dovrebbero essere sufficientemente compattato che la piastra di base può essere rimossa. La piastra di base è più facilmente staccato estraendo l'intero sistema da parte dei media e la rimozione delicatamente ogni eccesso mezzi di tra le PDMS e piastra di base. Se tutti i media non viene rimosso, la tensione superficiale del liquido rimanente può tirare i tessuti fuori i pali. Una volta che il supporto è stato rimosso, spingere delicatamente la piastra di base contro i pali PDMS per contribuire ad allentare il tessuto dalla piastra di base. Poi spingere gradualmente la piastra di base fuori spostando delicatamente una parte di qualche millimetro, poi l'altro lato la stessa quantità. Ripetere questo processo fino a quando il baseplate viene rimosso, con tutti i 6 hECTs attaccati alle loro rispettive PDMS finali messaggi (figura 4a). Rimozione della piastra di base non dovrebbe richiedere più di un minuto. Sostituire il sistema nel mezzo di coltura cellulare, invertita, in modo che tutti i tessuti sono coperti dal mezzo di coltura.

Circa un giorno dopo la rimozione della piastra di base, deboli contrazioni localizzate dovrebbero essere osservabile nelle hECTs definiti al microscopio in campo chiaro. Dopo 7 giorni, i tessuti hanno maturato e compattato (Figura 4B-C) con sarcomeres allineati (Figura 4D). I tessuti visibilmente deviano i posti PDMS con una media di 5-15 μN di forza (Figura 4E). Twitch misure di forza per i tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti possono essere misurati con monitoraggio in tempo reale della deflessione palo punta con un software di acquisizione dati della telecamera e personalizzati ad alta velocità, e applicando la deflessione post per fascio flessione teoria dopo aver determinato laIl modulo di Young dei posti in silicone con un trasduttore di forza, come spiegato più in dettaglio in precedenza. 1,7 Mantenere la sterilità durante l'acquisizione dei dati garantisce la possibilità di misurare i cambiamenti nella funzione dei tessuti nel corso del tempo. Abbiamo mantenuto i tessuti funzionali per diverse settimane, come spiegato più in dettaglio altrove 1. I nostri risultati preliminari indicano un miglioramento sostanziale della hect forza contrattile quando i tessuti sono integrate con le cellule staminali mesenchimali umane 10% sia a 1 Hz e 2 frequenze Hz stimolazione (Figura 4F).

Figura 1
Figura 1: Immagini rappresentative della H7 hESC durante l'espansione e il processo di differenziazione cardiaca. La fase di espansione dovrebbe durare 4 giorni, con la crescita delle colonie in espansione da 24 (A), a 48 (B), 72 (C (D). Dopo 96 ore di crescita della differenziazione è iniziata, con conseguente morte delle cellule sostanziale durante la prima 48 ore di trattamento CHIR99021 (E). Dopo due giorni di IWR-1 trattamento, la riorganizzazione si verifica (F) per formare gruppi di cellule che battono fin dal giorno 7. Ulteriori organizzazione in un "web" robusto battendo avviene dal giorno 7 al giorno 20, quando i monostrati sono dissociati per la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati.

Video Figura 1:. Monostrato cardiaca Rappresentante dopo 17 giorni di differenziazione . Cliccate qui per vedere il video battito spontaneo entro il monostrato di solito è osservata la prima volta tra il giorno 7 e il giorno 10, e 17 giorni di differenziazione del monostrato è formata reti interconnesse " "che ha battuto con fermezza.

Nome Composizione Giorni di differenziazione usati
Differenziazione Media I RPMI 1640
B27 Supplemento (meno insulina)
Penicillina-streptomicina
D0-D1 (con CHIR99021)
D2
D3-D5 (con IWR-1)
D5-D7
Differenziazione Media II RPMI 1640
B27 Supplement (con insulina)
Penicillina-streptomicina
D7-D20

Tabella 1: Composizione della differenziazione Medias.

figura 2
Figura 2: Rappresentante vivo sorta cellulareing risultati Due campioni sono stati preparati:. un controllo non colorato e un controllo colorati con diluizione 1: 500 di anticorpi SIRPα-PE / Cy7 e 1: 250 diluizione anticorpo CD90-FITC. Dopo la colorazione, le cellule sono state filtrate a 20 psi a classificare tampone composto di PBS, 10% di siero bovino neonatale, 10 pM inibitore ROCK Y-27632, e 1 mg / ml DAPI. Entrambe le popolazioni cellulari sono stati gated nei profili in avanti e scatter lato di escludere detriti (A, linea blu), poi le singole cellule sono stati selezionati confrontando la larghezza di impulso e l'altezza (impulso analisi larghezza) sia nel scatter in avanti (B, linea blu) e canali laterali scatter (C, linea blu). Successivamente, le cellule vive sono stati selezionati dal gating il DAPI - popolazione (D, linea blu). Le popolazioni cellulari finali di raccolta sono stati determinati esaminando i livelli di espressione FITC e PE-Cy7 delle popolazioni vivi. Il controllo senza macchia (E, sinistra) è stato utilizzato perstabilire il cancello appropriato per selezionare per il FITC + (CD90) e-SIRPα PE / Cy7 + popolazione (cardiomiociti) presente nel campione macchiato (E, a destra). La FITC e SIRPα-PE / Cy7 + poplations sono stati raccolti in provette separate centrifuga da 15 ml.

Figura 3
Figura 3:. Schema del bioreattore multi-tessuto e cardiaco processo ingegneria tissutale costruzione del bioreattore multi-tessuto richiede tre componenti (A): 1) un politetrafluoroetilene maestro stampo 9 x 33 x 5 mm 3, con 6 fori equidistanti 0,5 mm di diametro; 2) a 25 x 35 x 11 mm 3 cornice polisulfone per tenere il PDMS messaggi durante la costruzione e la coltura di tessuti; e 3) a 20 x 40 x 5 mm 3 nero politetrafluoroetilene piastra di base con 6 pozzi di 6 x 1 x 1 mm 3 dimensioni, spaced 4 mm l'una dall'altra lungo la sua lunghezza. Per creare i tessuti cardiaci ingegnerizzati umani (B), i posti PDMS sono fabbricati da PDMS litografia soffice utilizzando lo stampo maestro politetrafluoroetilene, due dei quali sono poi pressato sulle linguette del telaio polisulfone per formare 6 paia di posti a sbalzo della forza-sensing. La soluzione tessuto è pipettati nei pozzetti della piastra di base politetrafluoroetilene nero. Il telaio e posti sono quindi invertiti e allineati sulla piastra di base politetrafluoroetilene in modo che un paio di messaggi entra ogni pozzetto contenente il mix di tessuti. Dopo 48 ore, la piastra di base viene rimosso e tessuti definiti sono coltivati ​​su i pali, rimanendo invertita in NBS media.

Figura 4
Figura 4:. Immagini rappresentative e misurazioni funzionali del tessuto cardiaco ingegnerizzato umani definiti Il bioreact multi-tessutoo il sistema contiene sei tessuti in parallelo (A, frecce). Tessuti definiti sono auto-assemblati entro sette giorni dopo la creazione del tessuto (vista dall'alto, B e vista laterale obliquo, C). (D). Porzione di hect definito macchiato di troponina cardiaca T-(cTnT). (E) Rappresentante contrazione tracciamento mostra forza bruta nel tempo durante 1 Hz stimolazione mediante stimolazione campo elettrico. (F) Twitch rintracciamento durante la stimolazione ad 1 Hz (0-2 sec) e 2 Hz (2-4 sec) stimolazione con marcatura cambiamento di frequenza, sia per hECTs definite non integrate (linea continua) freccia e tessuti supplementato con 10% hMSCs (linea tratteggiata).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Costruzione di tessuti umani ingegnerizzati definiti cardiaci (hect) in grado di fornire un modello più coerente e affidabile della funzione dei miociti cardiaci umana. Criticamente, tutti componenti cellulari ed extracellulari nel sistema sono noti e possono essere manipolati come desiderato, eliminando così l'influenza confondenti di altri tipi di cellule sconosciuti risultanti dal processo di differenziazione. Per bilanciare la crescita cellulare rapida e ad alto rendimento, è preferibile che la differenziazione inizia al 75% di confluenza dei hESC, idealmente quattro giorni dopo la placcatura. Inoltre, l'uso di inibitore ROCK Y-27632 sia durante la dissociazione cellulare e riaggregazione dopo la cernita migliora notevolmente la vitalità cellulare. La presenza di battito spontaneo dei miociti durante il processo di differenziazione è un indicatore importante dell'efficienza e della salute della differenziazione. Se battito spontaneo non si osserva questo può indicare scarsa efficienza differenziazione, sia a causa di reagenti inefficaci o una perditadella pluripotenza delle cellule staminali.

Durante la costruzione del tessuto, i PDMS messaggi devono essere allineati correttamente con i canali nella piastra di base per creare tessuti ben formate che durano abbastanza a lungo per la misurazione della funzione contrattile. Per migliorare la facilità di allineamento dispositivo, e rafforzare la formazione di tessuto intorno ai posti in cui sono suscettibili di rottura, è possibile aggiungere larghezza supplementare (approssimativamente un diametro post su ciascun lato del post) alle estremità dei canali, come dimostrato dal "osso di cane" canali in Figura 3A a forma. Senza allineamento dispositivo corretta tessuto sarà o staccarsi dai messaggi poco dopo coltura, o rimarrà nel pozzo quando la piastra di base viene rimosso. Se un tessuto ben formata cade durante la rimozione piastra di base, è possibile ricollegare delicatamente il tessuto ai montanti mediante pinza sottile sotto un microscopio da dissezione, anche se è facile danneggiare i delicati hECTs se la sufficiente non è preso cura. </ P>

Un punto di forza del sistema definito descritto è la capacità di interrogare il contributo dei meccanismi diretti interazione cellula-cellula in terapie cellulari cardiache basato su controllo specifico della composizione cellulare. L'iniezione di cellule negli animali è imprecisa e soggetta a bassa redditività e la ritenzione 33. Inoltre, l'effetto delle cellule iniettate sul tessuto bersaglio è complicata da interazioni con altri sistemi fisiologici, come il sistema immunitario. Come tale, la comprensione del contributo delle interazioni cellula-cellula diretti a terapie con cellule cardiache è difficile da affrontare in organismi modello. Pertanto, un vantaggio per il metodo descritto è che le interazioni cellula-cellula vengono analizzati in un ambiente tridimensionale biomimetico, conservando aspetti chiave della nicchia cardiaca, e in presenza di specifici tipi di cellule di interesse - cioè, i miociti cardiaci e fibroblasti. L'utilità di utilizzare il sistema HECT definito è demonstrated con la supplementazione di 10% hMSCs derivate dal midollo umano 34,35 e usati in studi clinici per la miscela di cellule durante la creazione dei tessuti. Quei tessuti che sono stati integrati con le hMSCs esposti più grande forza contrattile rispetto ai non integrate tessuti umani definito (Figura 4F). Dal momento che l'ambiente dei tessuti e la composizione è stata controllata, la valorizzazione della funzione del tessuto con la supplementazione MSC riflette un effetto intrinseco di hMSCs sulla funzione dei cardiomiociti. Un'altra forza al sistema è che, poiché i tessuti sono più piccole di quelle utilizzate in precedenza, 1,7 uso cellula è più efficiente, una considerazione importante quando si utilizza differenziazioni diretto di cellule staminali pluripotenti come fonte cellulare.

Al di là di studiare meccanismi di terapia cellulare, il sistema hect definito consentirebbe l'esame delle basi cellulari di interazioni cellula-cellula cardiovascolari. Perturbazione della biologia delle cellule prima di const tessutiruction, per esempio con shRNAs, avrebbe permesso l'indagine dei meccanismi molecolari che regolano le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Un ulteriore vantaggio del sistema di ingegneria dei tessuti è la formazione di miofibrille allineati capaci di contrazioni funzionali. Pertanto, utilizzando il sistema HECT definito, le dinamiche di formazione myofibril, sviluppo cardiomiociti e l'organizzazione della architettura dei tessuti possono essere studiati mediante modifica dei componenti della matrice extracellulare o manipolazione molecolare delle cellule. La natura umana e 3-D del sistema hect aumenta ulteriormente la traducibilità dei risultati.

Mentre il sistema descritto offre un metodo potente per comprendere questioni fondamentali della biologia cardiovascolare, non è senza limitazioni. In primo luogo, i tessuti ingegnerizzati mostrano un fenotipo immaturo, in linea con i dati della forza contrazione pubblicati da campioni del miocardio neonati 7. Mentre laimmaturità fenotipica potrebbe essere un fattore di confusione nella valutazione meccanismi di interazione delle cellule, ci sono prove che cardiomiociti malati ritornano ad un programma gene fetale 7,36-38. Se i risultati dal sistema HECT rivelarsi utili nel contesto di un cuore scompensato, ciò può essere vantaggioso per testare terapie cardiache. Il protocollo utilizza anche una matrice di membrana basale qualificato hESC durante la costruzione dei tessuti. La composizione di questa matrice può variare da lotto a lotto, e mentre definite alternative matrice seminterrato sono disponibili devono ancora essere valutati nel contesto di hECTs.

Altre limitazioni comprendono la mancanza di un sistema vascolare e senza sistemi di livello effetti di interazione. Date le dimensioni dei tessuti, richieste metaboliche sono soddisfatte da sola diffusione quindi nessun sistema vascolare è necessario per garantire la vitalità cellulare. Tuttavia, segnalazione cellulare endoteliale può essere un fattore importante in specifiche terapie cellulari. Se questo è il caso, un numero specifico di endocellule thelial possono essere semplicemente aggiunti alla miscela cella definita durante la costruzione del tessuto. Mentre le interazioni sistemi di livello sono importanti per la completa comprensione dei meccanismi cellulari, il sistema di ingegneria tessutale offre un approccio riduzionista per semplificare il problema al fine di affrontare in modo sistematico il meccanismo. La complessità può essere aggiunto al sistema tessuto definito come necessario attraverso l'introduzione di sistemi relativi effetti, quali leucociti per incorporare una risposta immunitaria, oppure aggiungendo tipi di tessuto adiacenti interrogare segnalazione paracrina.

Come strumento di indagine, il sistema di tessuto cardiaco ingegnerizzato umana definiti offre i vantaggi di cellule umane specie-specifici, un biomimetico ambiente culturale in 3-D con biocomplessità controllo, il monitoraggio diretto e longitudinale della funzione contrattile, e una composizione cellulare e della matrice definita. Direzioni future per il sistema HECT includono manipolare il tipo di cellule terapeutiche di interesse ingegnoh siRNA o shRNA prima dell'introduzione nel tessuto al fine di indagare i dettagli molecolari specifici di interazione cellula-cellula. Inoltre, piuttosto che utilizzare hESCs per formare le cellule cardiache, è possibile utilizzare cellule indotte pluripotenti staminali (iPSCs) di pazienti con una mutazione ereditaria in uno sforzo per modellare relative manifestazioni della malattia cardiaca nei tessuti ingegnerizzati. Così, il nostro metodo di creazione di tessuti cardiaci umani ingegnerizzati con popolazioni di cellule definite promette di aprire nuove strade per lo studio di terapie con cellule cardiache per contribuire ad accelerare lo sviluppo di nuovi trattamenti per i pazienti con malattie cardiache.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal NIH (1F30HL118923-01A1) per TJC, NIH / NHLBI PEN contratto HHSN268201000045C al KDC, il consiglio assegno di ricerca di Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) per BDG, l'americano heart Association (12PRE12060254) per RJ, e Research Council Concessione di RAS (TBRS, T13-706 / 11) a RL finanziamento aggiuntivo è stato fornito a TJC dal NIH DRB 5T32GM008553-18 e come tirocinio per la formazione nel NIDCR-interdisciplinare in Sistemi e Sviluppo biologia e difetti di nascita T32HD075735. Gli autori hanno anche desiderano riconoscere con gratitudine Arthur Autz presso il Zahn centro del City College di New York per l'assistenza con la lavorazione del bioreattore e Mamdouh Eldaly per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Boheler per consigli sulla differenziazione cardiaca, e il dottor Joshua Hare per fornire generosamente cellule staminali mesenchimali umane.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter