This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Ingegneria tissutale cardiaca ha avanzato enormemente negli ultimi dieci anni, con più gruppi editoriali risultati completamente funzionale, tessuti battendo realizzati da entrambi i cardiomiociti murini 1-6 e, più recentemente, umani cellule staminali derivate miociti cardiaci 7-12. Il campo di ingegneria dei tessuti cardiaco è guidata da due obiettivi primari e sostanzialmente indipendenti: 1) per sviluppare innesti esogeni che possono essere trapiantate in mancanza di cuori per migliorare la funzione 4-6; e 2) sviluppare modelli in vitro per lo studio fisiologia e malattie, o come strumenti di screening per sviluppo terapeutico 2,7.
Tridimensionale (3-D) coltura cellulare è considerata essenziale per lo sviluppo di strumenti di screening di nuova generazione, come la matrice 3-D riflette un microambiente cardiaco più naturale di coltura cellulare monostrato 2-D tradizionali; infatti alcuni aspetti della biologia cellulare sono fondamentalmente differenti in 2-D vs 3-D culture 13,14 </sup>. Inoltre, i tessuti cardiaci ingegnerizzati sono costruiti da componenti completamente definite: una matrice extracellulare, e una popolazione di cellule. Per i tessuti cardiaci umani ingegnerizzati tradizionali, mentre la composizione della matrice extracellulare (solitamente fibrina 9 o collagene 7,8,10) è strettamente controllato, la composizione cella di input è meno ben definita, con l'intera miscela di cellule da una differenziazione cardiaca diretto di entrambi le cellule staminali embrionali (ESC 7,9) o di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC 10,12) che viene aggiunto ai tessuti. A seconda della linea cellulare specifica e l'efficienza del protocollo differenziazione utilizzato, la percentuale risultante dei cardiomiociti può variare da meno del 25% a oltre il 90%, il fenotipo specifico cardiomiociti (cioè, ventricular-, atrial- o pacemaker-like) può anche variare, anche la frazione non cardiomiociti può essere molto eterogenea 15,16 e alterare la maturità del differenziata m cardiacoyocytes 17.
Recenti cardiaco lavoro ingegneria dei tessuti ha tentato di controllare la popolazione di ingresso di cellule, sia con un reporter cardiaco linea di cellule staminali embrionali umane 8 o cellule superficie marcatori 18 viene utilizzato per isolare la componente dei miociti cardiaci della differenziazione. Mentre inizialmente un tessuto composto da sole miociti cardiaci sembra essere l'ideale, questo è infatti il caso; hECTs composte unicamente da miociti cardiaci non riescono a compattare nei tessuti funzionali, con alcuni gruppi di trovare un rapporto 3: 1 di miociti cardiaci: fibroblasti che producono la più alta forza di contrazione 8. Utilizzando diversi metodi di selezione delle cellule, compresi marcatori di superficie per l'ordinamento delle cellule vive, è possibile creare hECTs con popolazioni cellulari definiti. Mentre marcatori di cellule stromali non cardiaci sono stati disponibili per un certo tempo, come il marcatore CD90 fibroblasti putativo 19,20, marcatori di superficie di miociti cardiaci sono stati più difficiliper identificare. SIRPα è stato tra i primi marcatori di superficie cardiaci identificati per miociti cardiaci umani 18 e ha dimostrato di essere altamente selettivo per il lignaggio cardiaco. Recentemente, abbiamo scoperto che in doppio ordinamento per SIRPα + e CD90 – cellule rese cardiomiociti quasi puro, con il CD90 + popolazione che presenta una fibroblasti simile fenotipo (Josowitz, osservazioni non pubblicate). Sulla base di questi risultati raccolti, qui descriviamo la creazione hECTs con un 3: 1 combinazione di SIRPα + / CD90 – cardiomiociti e fibroblasti CD90 +.
La capacità di progettare un tessuto cardiaco umano completamente definita è essenziale non solo per la creazione di solidi strumenti di screening, ma anche per lo sviluppo di sistemi modello per indagare cellulo emergente e le terapie cardiache gene-based. In particolare, numerose terapie cellulari per insufficienza cardiaca, utilizzando tipi di cellule tra cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) 21 </sup>, le cellule staminali cardiache 22 e cellule mononucleari del midollo osseo 23-25, sono stati testati in studi clinici. Mentre molti dei risultati iniziali sono stati promettenti 21,23,25, il vantaggio iniziale, spesso diminuisce nel tempo 26-29. Una tendenza simile è stata riportata in murini ingegnerizzato tessuto cardiaco, che mostrano un significativo beneficio funzionale a causa di supplementazione di MSC, ma il beneficio non è sostenuta durante la coltura a lungo termine 1. Alla base le prestazioni sub-ottimali è la nostra limitata conoscenza dei meccanismi che regolano terapie cellulari. Una più profonda comprensione di come le cellule terapeutico esercitare la loro influenza benefica, nonché possibili conseguenze negative delle interazioni miociti-nonmyocyte, consentirebbe lo sviluppo di terapie migliorate ottenendo benefici clinicamente significativi e sostenuti, con effetti collaterali minimi, per i pazienti con insufficienza cardiaca.
Qui, descriviamo l'uso di hECTs definite a Esamate meccanismi di terapia cellulare. La composizione del tessuto controllato è essenziale per identificare i fattori specifici che influenzano le prestazioni dei cardiomiociti. Direttamente integrazione hECTs con il tipo di cellule terapeutiche di interesse (ad esempio, MSC), può rivelare gli effetti sulle prestazioni dei miociti cardiaci, come abbiamo dimostrato in crediti ECTS ratto 1.
Il seguente protocollo multi-step inizia con diretto differenziazione delle cellule staminali cardiache, seguita dalla realizzazione del bioreattore multi-tessuto, e concludere con una descrizione di costruzione dei tessuti e analisi funzionale. I nostri esperimenti vengono eseguiti utilizzando la linea NIH-approvato H7 cellule staminali embrionali umane (hESC). Tuttavia, i seguenti protocolli sono anche stati testati utilizzando una linea hESC aggiuntivo e tre linee di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) con risultati simili. Abbiamo scoperto che l'efficienza nella differenziazione dei cardiomiociti e il successo in hect fabbricazione può essere linea cellulare dipendente, in particolare folinee r hiPSC derivati da singoli pazienti. Seguendo questo protocollo, due piatti 6 pozzetti sono placcati con un totale di 1,68 milioni di hESC (140.000 cellule per pozzetto), che produce circa 2,5 milioni di miociti dopo differenziazione per 20 giorni e l'ordinamento, abbastanza per fare sei tessuti definiti.
Costruzione di tessuti umani ingegnerizzati definiti cardiaci (hect) in grado di fornire un modello più coerente e affidabile della funzione dei miociti cardiaci umana. Criticamente, tutti componenti cellulari ed extracellulari nel sistema sono noti e possono essere manipolati come desiderato, eliminando così l'influenza confondenti di altri tipi di cellule sconosciuti risultanti dal processo di differenziazione. Per bilanciare la crescita cellulare rapida e ad alto rendimento, è preferibile che la differenziazio…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (1F30HL118923-01A1) per TJC, NIH / NHLBI PEN contratto HHSN268201000045C al KDC, il consiglio assegno di ricerca di Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) per BDG, l'americano heart Association (12PRE12060254) per RJ, e Research Council Concessione di RAS (TBRS, T13-706 / 11) a RL finanziamento aggiuntivo è stato fornito a TJC dal NIH DRB 5T32GM008553-18 e come tirocinio per la formazione nel NIDCR-interdisciplinare in Sistemi e Sviluppo biologia e difetti di nascita T32HD075735. Gli autori hanno anche desiderano riconoscere con gratitudine Arthur Autz presso il Zahn centro del City College di New York per l'assistenza con la lavorazione del bioreattore e Mamdouh Eldaly per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Boheler per consigli sulla differenziazione cardiaca, e il dottor Joshua Hare per fornire generosamente cellule staminali mesenchimali umane.
Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
Polysulfone | McMaster-Carr | ||
Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |