Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjärtvävnad engineering har avancerat kraftigt under det senaste decenniet, med flera grupper publicera resultaten av fullt fungerande, slå vävnader tillverkad av både murina cardiomyocytes 1-6 och, på senare tid, mänskliga stamceller härledda hjärtmyocyter 7-12. Hjärtvävnadsteknik fält drivs av två primära och väsentligen oberoende mål: 1) att utveckla exogena transplantat som kan transplanteras in inte hjärtan för att förbättra funktionen 4-6; och 2) att utveckla in vitro-modeller för att studera fysiologi och sjukdom, eller som screeningverktyg för terapeutisk utveckling 2,7.

Tredimensionell (3-D) cellodling anses nödvändig för att utveckla nästa generations analysverktyg, som 3-D matris återspeglar en mer naturlig hjärtmikro än traditionella 2-D monolager cellodling; faktiskt vissa aspekter av cellbiologi är fundamentalt olika i 2-D vs 3-D kulturer 13,14 9 eller kollagen 7,8,10) är strikt kontrollerad, ingångscellkomposition är mindre väl definierad, med hela blandningen av celler från en riktad hjärt differentiering av antingen embryonala stamceller (ESC 7,9) eller inducerade pluripotenta stamceller (IPSC 10,12) läggs till vävnaderna. Beroende på den specifika cellinjen och effektiviteten i differentieringsprotokoll som används, kan den resulterande andel av kardiomyocyter variera från mindre än 25% till över 90%, den specifika cardiomyocyte fenotyp (dvs ventricular-, atrial- eller pacemaker-liknande) kan också variera, även icke-cardiomyocyte fraktion kan vara mycket heterogen 15,16 och ändra löptiden för den differentierade hjärt myocytes 17.

Senaste hjärtvävnad ingenjörsarbete har försökt att styra ingångs population av celler, med antingen en hjärt reporter human embryonal stamcellslinje 8 eller cellytmarkörer 18 används för att isolera hjärt myocyte komponenten av differentiering. Även initialt en vävnad som består av endast hjärtmyocyter verkar vara den idealiska, är detta i själva verket inte fallet; hECTs som består endast av hjärtmyocyter misslyckas med att kompaktera i funktionella vävnader, med vissa grupper att hitta en 3: 1 förhållande av hjärtmyocyter: fibroblaster som producerar den högsta rycka kraft 8. Genom att använda olika urvals cell metoder, inklusive ytmarkörer för levande cellsortering, är det möjligt att skapa hECTs med definierade cellpopulationer. Medan markörer för icke-hjärt stromaceller har funnits under en längre tid, såsom den förmodade fibroblast markören CD90 19,20, har ytmarkörer av hjärtmuskelceller varit svårareatt identifiera. SIRPα var bland de första hjärt ytmarkörer identifierats för mänskliga hjärtmuskelceller 18 och har visat sig vara mycket selektiva för hjärt härstamning. Nyligen har vi funnit att dubbelsortering för SIRPα + och CD90 - celler ger nästan rena kardiomyocyter, med CD90 + populationen som uppvisar en fibroblast-liknande fenotyp (Josowitz, opublicerade observationer). Baserat på dessa insamlade fynd, här beskriver vi skapar hECTs med hjälp av en 3: 1 blandning av SIRPα + / CD90 - hjärtmuskelceller och CD90 + fibroblaster.

Förmågan att konstruera en helt definierad human hjärtvävnad är viktigt inte bara för att skapa robusta screeningverktyg, men även för att utveckla modellsystem för att undersöka nya cell- och genbaserade hjärt terapier. I synnerhet många cellterapi för hjärtsvikt, utnyttjar celltyper inklusive mesenkymala stamceller (MSC) 21 22 och benmärgsmononukleära celler 23-25, testats i kliniska prövningar. Även om många av de första resultaten har varit lovande 21,23,25, minskar den initiala fördel ofta över tiden 26-29. En liknande trend har rapporterats i murina konstruerad hjärtvävnader, som visar en betydande funktionell fördel på grund av MSC tillskott, men fördelen är inte upprätt under långtidsodling en. Bakom sub-optimal prestanda är vår begränsade kunskap om de mekanismer som styr cellterapier. En djupare förståelse av hur terapeutiska celler utöva sin välgörande inflytande, liksom eventuella negativa konsekvenser av myocyt-nonmyocyte interaktioner, skulle göra det möjligt att utveckla förbättrade behandlingar ger kliniskt signifikanta och varaktiga fördelar, med minimala biverkningar för patienter med hjärtsvikt.

Här beskriver vi användningen av definierade hECTs att interrogåt mekanismerna för cellbaserad terapi. Den kontrollerade vävnadssammansättning är viktigt att identifiera specifika faktorer som påverkar cardiomyocyte prestanda. Direkt komplettera hECTs med den terapeutiska celltypen av intresse (t.ex. MSC) kan avslöja effekterna på hjärt myocyte prestanda, som vi har visat i rått ECT 1.

Följande flerstegsprotokoll börjar med riktad hjärtstamcellsdifferentiering, följt av tillverkning av flervävnads bioreaktor, och sluta med en beskrivning av vävnads konstruktion och funktionell analys. Våra experiment utförs med hjälp av NIH-godkända H7 mänskliga embryonala stamceller (hESC) linje. Emellertid har följande protokoll också testats med användning av en ytterligare hESC linje och tre inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer med liknande resultat. Vi har funnit att effektiviteten i cardiomyocyte differentiering och framgång i Hect tillverkning kan vara cellinje beroende, särskilt for hiPSC linjer som härrör från enskilda patienter. Genom att följa detta protokoll, två 6-brunnar pläterad med totalt 1,68 miljoner hESCs (140.000 celler per brunn), vilket ger cirka 2,5 miljoner myocyter efter differentiering i 20 dagar och sortering, tillräckligt för att göra sex definierade vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Obs: Utför alla cell manipulationer i aseptiska betingelser med användning av ett HEPA-filtrerad klass II biologiskt säkerhetsskåp och sterilisera alla lösningar genom att filtrera dem genom ett 0,2 pm filter. Utföra vävnads uppbyggnad och funktion testning i antingen samma aseptiska förhållanden eller ett dragskåp med laminärt flöde.

1. Sådd av H7 hESCs i Förberedelse för hjärt differentiering

  1. (Dag 1) Förberedelse av Basement Membrane Matrix
    1. Tina 150 pl alikvot av hESC kvalificerade basalmembranmatrisen på is över natten vid 4 ° C.
  2. (Dag 0-4) Plätering av hESCs på belagda plattor
    1. Späd den tinade matrisen i 12 ml iskall DMEM / F12 och blanda väl.
    2. Överföring 1 ml av DMEM / F12-matrislösning i varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsbehandlade skålen. Varje portion av matrisen kan päls två 6-brunnsplattor.
    3. Inkubera de belagda plattorna vid rumstemperatur i minst 1 timme.
      Obs!vår erfarenhet, kan belagda rätter förseglade med paraffin lagras i matrislösning vid 4 ° C i upp till 10 dagar före användning.
    4. Vid ungefär 75% konfluens, dissociera H7 hESCs från 10 cm skål med användning av 6 ml av den icke-enzymatisk dissociation reagens. Efter 5 min, försiktigt skrapa cellerna från odlingsytan med användning av en engångscellskrapa och överföra cellsuspensionen till en steril 15 ml centrifugrör.
    5. Ta bort 0,5 ml dissociationslösningen med cellerna från 15 ml rör och överför till en ny steril 15 ml rör (vilket lämnar 5,5 ml av dissociation reagens för att ytterligare dissociera hESCs) för stamcellslinje förökning.
    6. Pelletera 0,5 ml av cellerna vid 300 xg under 5 min vid 20 ° C. Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera i 8 ml pluripotenta stamcellmedia innehållande 1% penicillin-streptomycin sedan överföra till en ny, belagd, 10 cm vävnadsodlingsskål och bibehålla 37 ° C och 5% CO2 för att bibehålla stamcellslinje.
      Obs: Håll pluripotenta stamcellsmedier på is under medie förändringar.
    7. Under tiden, tillsätt 5,5 | il av 10 mM ROCK-inhibitor Y-27632 till återstående 5,5 ml dissociationslösning och fortsätta att inkubera vid rumstemperatur i ytterligare 5 till 10 min. Blanda försiktigt cellerna med en 5 ml serologisk pipett. Fortsätta att inkubera tills en enkelcellsuspension åstadkoms, därefter pelletera cellerna vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    8. Resuspendera cellerna i 5 ml pluripotenta stamceller media och utför en cellräkning med användning av en hemocytometer.
    9. Utsäde varje brunn i 6-brunnsskål vid en densitet av 140.000 celler per brunn. Utsäde två 6-brunnsplattor för att skapa en totalt sex definierade vävnader. Avyttra eventuella kvarvarande celler efter plätering.
    10. Fyll de väl till 1 ml med pluripotenta stamceller media och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Tjugofyra timmar senare, ta bort media och tillsätt 2 ml färsk pluripotenta stamceller media till varje brunn (figur 1 A
    11. Kontrollera sammanflödet av plattorna varje dag och börja differentiering när väl cellerna når approximativt 75% konfluens (Figur 1B - D).

2. (dag 4-24) Differentiering av mänskliga embryonala stamceller till Cardiomyocytes 30,31

  1. (Dag 4-7, Differentiation dag 0-3) mesoderm Induktion
    1. Förbereda RPMI differentieringsmedia I (tabell 1) genom att kombinera 500 ml RPMI 1640 med 10 ml B27 supplement (utan insulin) och 5 ml penicillin-streptomycin stamlösning (10000 lU / ml penicillin, 10000 | ig / ml streptomycin). Alikvot, på is, i 50 ml rör och förvaras vid 4 ° C.
    2. (Dag 4, Differentiation Dag 0) Preparera mesoderm induktionsmedier genom att tillsätta 2,4 | il av den lilla molekylen GSK3 inhibitor CHIR99021 (10 mM lager, 6 ^ M slutkoncentration) till 12 ml RPMI differentieringsmedia I. Avlägsna pluripotenta stamcellmedia från varje brunn ennd ersätt med 2 ml av mesoderm induktionsmedia per brunn. Returnera plattan till inkubatorn.
      Notera: Signifikant celldöd sker typiskt med tillsats av CHIR99021 (figur 1E). Monoskiktet kommer att återhämta, men det är viktigt att skölja de döda celler bort med DMEM / F12 sköljning.
    3. (Dag 5, Differentiation Dag 1) Bered nya mesoderm induktionsmedia som beskrivits ovan. Ta bort de gamla medier från varje brunn och skölj en gång med 1 ml av DMEM / F12 per brunn. Tillsätt 2 ml färskt mesoderm-induktion media till varje brunn.
      Notera: Sköljning varje dag från dag 0-10 i hög grad ökar utbytet och renheten av de hjärtmyocyter.
    4. (Dag 6, Differentiation Dag 2) Ta bort hjärtinduktions media och skölj en gång med 1 ml DMEM / F12 per brunn. Byt ut sköljningen med 2 ml RPMI differentiering medier I (inga små molekyler tillsätts men fortfarande med B27 (utan insulin) tillägg) och återgå till inkubatorn.
  2. (Dag 7-13, Differentiation Day 3-10) Cardiac mesoderm Induktion
    1. (Dag 7, Differentiation Dag 3) Preparera cardiac mesoderm induktionsmedier genom att tillsätta 6 | il av den lilla molekylen Wnt inhibitor IWR-1 (10 mM lager, 5 ^ M slutlig) till 12 ml RPMI differentieringsmedia I.
    2. Ta bort materialet från varje brunn, skölj en gång med 1 ml DMEM / F12 per brunn och ersätta med 2 ml av hjärt mesoderm induktionsmedia per brunn.
    3. (Dag 8, Differentiation Dag 4) Förbered ytterligare 12 ml av hjärt mesoderm induktions medier som beskrivits ovan. Ta bort materialet lagt dagen före, skölj en gång med 1 ml DMEM / F12 per brunn och ersätta med 2 ml färsk hjärt mesoderm differentiering media per brunn och återgå till inkubatorn.
    4. (Dag 9-10, Differentiation dag 5-6) På båda dagarna, ta bort hjärt mesoderm induktions media och skölj varje brunn med 1 ml DMEM / F12.
    5. Tillsätt 2 ml färskt RPMI differentieringsmedia I (inga små molekyler tillsätts men fortfarande med B27 (utan insulin) tillägg)till varje brunn och återföra plattan till inkubatorn.
  3. (Dag 11-24, Differentiation dag 7-20) hES-derived Cardiac myocyt Organisation / Mognad
    1. Förbered RPMI differentieringsmedia II (tabell 1) genom att kombinera 500 ml RPMI 1640 med 10 ml B27 supplement (med insulin) och 5 ml av penicillin-streptomycin stamlösning. Alikvot, på is, i 50 ml rör och förvaras vid 4 ° C.
    2. (Dag 11, Differentiation Dag 7) Ta RPMI differentieringsmedia (utan insulin) från varje brunn och skölj med 1 ml DMEM / F12. Ersätt med 2 ml av den nya RPMI differentieringsmedia II (med insulin) till varje brunn och återgå till inkubatorn.
      Obs: Spontan stryk bör först observeras mellan dag 7 och 10. Om stryk inte observeras under den här tiden, betyder det oftast dålig differentiering effektivitet. Protokollet kan fortsätta fram till dag 15 i ett försök att observera stryk, men om ingen stryk observeras dag 15 är det bäst att stkonst en ny differentiering.
    3. (Dag 12-24, Differentiation Dag 8-20) Varje dag, ta bort de gamla differentiering media och ersätt med 2 ml färsk RPMI differentieringsmedia II per brunn för att tillåta cellmognad och organisation av misshandeln monolager (Figur 1F, Video Figur 1 ).
      Obs! Beroende på den återstående celldöd, kan det vara nödvändigt att skölja med en ml DMEM / F12 genom differentiering dag 10.

3. (Dag 24, Differentiation Dag 20) Isolering av hjärtmuskelceller och fibroblastliknande celler

  1. Dela upp cell från monolager
    1. Ta differentiering media och skölj en gång med 1 ml PBS.
    2. Dissociera monoskikten med 1 ml av den enzymatiska dissociation lösning (0,04% trypsin / 0,03% EDTA) till varje brunn.
    3. Flytta plattan i inkubatorn i 10 minuter. Samtidigt till 12 pl ROCK-inhibitor till 6 ml trypsin neutralisering lösning.
    4. Gently tillsätt 1 ml av trypsin neutralisering lösningen innehållande ROCK inhibitorn till varje brunn på plattan för att neutralisera trypsin lösning.
    5. Med användning av en steril överföringspipett och blanda försiktigt varje brunn för att bryta isär de cellkluster.
    6. Överföra alla 12 ml från 6-brunnar till ett 15 ml centrifugrör.
      Obs: Eftersom två 6-brunnsplattor används i detta protokoll, kommer två 15-ml rör behövas.
    7. Överföring 3 ml PBS till en brunn i plattan, och sedan i tur och ordning överföra samma 3 ml till varje efterföljande väl för att samla alla kvarvarande celler på skålen. Överföra de återstående 3 ml från den slutliga bra bit in i samma 15 ml centrifugrör innehållande cellerna.
    8. Pellet vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
  2. Förbered celler för Live cellsortering genom FACS
    1. Förbered färgning buffert genom att tillsätta 5 ml fetalt bovint serum till 45 ml PBS på is med 50 pl av ROCK-inhibitor.
    2. Avlägsna supernatanten från cell pellåt (i 3.1.8) och återsuspendera i 1,2 ml färgningsbuffert.
    3. Överföra 200 fil av cellsuspensionen i ett annat, i förväg kyld, 50 ml centrifugrör på is. Detta kommer att vara negativ färgning kontroll.
    4. Överföra den återstående 1 ml cellsuspension i ett annat, i förväg kyld, 50 ml centrifugrör på is och tillsätt 2 pl SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 utspädning) och 4 pl av CD90-FITC (1: 250 spädning) . Blanda försiktigt cellsuspensionen med en överföringspipett och återvända till isen.
    5. Inkubera både den negativa kontrollen och provet, på en rocker shaker, på is, vid 4 ° C under 1 timme.
    6. Förbereda provuppsamlingsrören genom tillsats av 3 ml av RPMI-medium (med insulin) till två 15 ml centrifugrör. Tillsätt 3 | il av ROCK-inhibitor till varje rör och förvara på is.
    7. Pelletera de färgade cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och skölj två gånger med minst 10 ml iskall PBS per sköljning.
    8. Lägg ett pl av DAPI (1 | j, g / ml) till 5 ml färgningsbuffert. Försiktigtresuspendera provet pelleten med 1-3 ml av DAPI-innehållande färgningsbuffert med användning av en överföringspipett.
    9. Tillsätt 500 | il färgningsbuffert (utan DAPI tillsatt) till den negativa kontrollen.
    10. filtrera försiktigt både den negativa kontrollen och provet genom en 40 ìm cell sil för att avlägsna klumpar av celler och överföra till polystyren FACS rör på is. Omedelbart ta prover till cellsorterare.
    11. Liknande fast levande cell sorteringsmetoder 18, använd den negativa kontrollen för att ställa in portarna väljer för levande celler (DAPI negativ) och samla båda FITC + (dvs CD90 + fibroblaster) och PE / Cy7 + (dvs. SIRPα + cardiomyocytes ) populationer oberoende vid 20 psi (Figur 2).
      Obs: Efter att grindarna, kan den negativa kontrollen fastställas i 4% PFA för att bestämma differentieringseffektiviteten genom färgning för kardiellt troponin-T.
      Obs: Vissa forskare föredrar att använda enisotypkontroll snarare än ofärgade kontroll för att ställa portarna i syfte att kompensera för icke-specifik antikroppsbindning. En så kallad fluorescens minus ett (FMO) kontroll är en annan möjlighet. På grund av den tydliga bimodala fördelningen av FITC, DAPI och PE-Cy7 signaler vi gated från den positiva populationen, konservativt siktar långt in i positiva porten, som eventuellt utesluter några sanna positiva men hjälper till att minimera eventuella falska positiva.
  3. Cell återaggregering i Förberedelse för Tissue Engineering
    1. Efter elementet sortera, pelletera både uppsamlingsrören och återsuspendera i 1 ml DMEM innehållande 10% Neonatal bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 0,2% amfotericin B ( "NBS media").
    2. Rekombinera den SIRPα + och CD90 + celler i en 3: 1-förhållande och plattan de kombinerade cellerna i en icke-vävnadsodlingsbehandlade petriskål vid en densitet av 2 miljoner celler per 60 cm 2 (10 cm skål). Tillsätt 10 ml NBS media och 101; l ROCK-hämmare Y-27.632.
    3. Placera cellsuspensionen i vävnadsodlingsinkubator under 48 timmar för att tillåta cell återaggregering i små kluster.

4. Human hjärtvävnad Engineering

  1. Fabricera multivävnads Bioreactor
    Obs: För att komplettera illustrationerna i figur 3A, CAD-filer med detaljerad bioreaktor konstruktion scheman finns tillgängliga på begäran från författarna.
    1. Maskin PDMS mästare mögel genom att borra sex jämnt fördelade hål på 0,5 mm diameter i en 9 x 33 x 3,25 mm kub av polytetrafluoretylen.
    2. Med hjälp av en pinnfräs, maskin en ram från polysulfon mäter 25 x 35 x 11 mm 3. Syftet med ramen är att hålla de PDMS tjänster (konstruerade från den gjutna gjorts ovan) i inriktning med brunnarna i bottenplattan.
    3. Med hjälp av en 1-mm pinnfräs, maskin 6 brunnar (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm från varandra i en 20 x 40 x 5 mm 3 bit svart polytetrafluoreten för att bilda bottenplattan.
    4. Blanda elastomer bas och härdare för polydimetylsiloxan (PDMS) i en 10: 1 vikt / vikt-förhållande och lägg till anpassade polytetrafluoretylen formen (steg 4.1.1) för att skapa två rader med sex kraftkännande inlägg och inkubera över natten och under vakuum vid 80 ° C. Efter härdning försiktigt bort PDMS från master mögel och försiktigt markera toppar varje stolpe med en svart märkpenna för ökad kontrast och automatiserad realtid efter böjning spårning.
      Obs: Polytetrafluoretylen är ganska mjuk och kan lätt skadas. Var försiktig vid rengöring av huvud formen före PDMS gjutning för att säkerställa livslängden för systemet och konsekvent PDMS post geometri. En 0,5 mm tråd kan användas för att rengöra hålen för stolparna efter varje användning, men vara noga med att inte skrapa insidan av hålen.
      Notera: Ett alternativ är att avgasa PDMS under vakuum under flera timmar vid rumstemperatur, sedan låta blandningen härda vid omgivande tryck.Detta kan leda till färre rest gasbubblor bildas i PDMS under härdningsprocessen.
    5. Sterilisera alla komponenter i en ångautoklav.
      Obs! PDMS mästare mögel (steg 4.1.1) och polysulfon ram (steg 4.1.2) är båda återanvändbara. PDMS inlägg som skapats från den gjutna (steg 4.1.4) är också återanvändas, men endast ca 10 användningar. Emellertid kan fler PDMS inlägg skapas efter behov med hjälp av huvudformen.
  2. Samla Reaggregated hjärtceller
    1. Ta bort reaggregated celler från inkubatorn och överföra alla 10 ml av återaggregering media till en 50 ml centrifugrör.
    2. Skölj plattan med 3 ml PBS och överför skölj till samma 50 ml centrifugrör innehållande återaggregering media.
    3. Tillsätt 3 ml av 0,04% trypsin / 0,03% EDTA till 10 cm skål och återgå till inkubatorn under 5 min.
    4. Efter 5 minuter, undersöks plattan med ett inverterat mikroskop vid 10X förstoring för att säkerställa fullständig cell dissociation från skålen. Om vissa kvarvarande kluster fortfarande fäst, försiktigt skaka plattan loss klumpar. Om kluster sitter kvar, återvända till inkubatorn för ytterligare 2-3 minuter. Inte inkubera längre än tio minuter eller betydande celldöd kan inträffa.
    5. När alla celler är fristående, tillsätt 3 ml trypsin neutralisering lösning. Blanda försiktigt neutraliseringen lösning med trypsin-cellen lösningen och överföring till 50 ml centrifugrör innehållande återaggregering media och skölj en gång med PBS.
    6. Spola hela skålen med 5 ml PBS och överför till samma 50 ml rör innehållande cellerna.
    7. Pelletera cellerna vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    8. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml NBS media sedan överföra till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    9. Pellet vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten. De hjärtceller (CD90 + stromaceller och SIRPα + myocytes) är nu redo för vävnadskonstruktion.
  3. (Tillval) Samla Kompletterande celler av intresse
    Obs: Förutom de definierade vävnader som innehåller endast SIRPα + cardiomyocytes och CD90 + fibroblastliknande celler, är det möjligt att lägga till ytterligare celler av intresse att förhöra deras effekt på vävnadsfunktion. Till exempel råtta MSC har visat sig förbättra funktionen av rått konstruerad hjärtvävnader 1. Följande valfria steg beskriver insamling av kompletterande celler för det definierade systemet.
    1. Samla kompletterande celltypen av intresse (t.ex. mesenkymala stamceller) med 0,25% trypsin / 0,1% EDTA.
    2. Pelletera cellerna vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur och därefter återsuspendera i 5 ml lämplig cellkulturmedier för celltypen av intresse. Till exempel, för MSCs, använda DMEM kompletterat med 20% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 0,2% amfotericin-B till kultur på calnar.
    3. Utföra en cellräkning med användning av en hemocytometer, sedan pellets cellerna igen vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    4. Avlägsna supernatanten, återsuspendera i 1 ml cellodlingsmedia och överföring till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    5. Pelletera cellerna vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    6. Avlägsna supernatanten. De supplementära celler är nu redo för vävnadskonstruktion.
      Obs! Om de kompletterande cellerna tillsätts i en koncentration av 10% av det totala antalet celler i vävnaden, därefter för de definierade vävnader, detta kommer att kräva 50.000 kompletterande celler per vävnad som varje vävnad innehåller 500.000 hjärtceller (både CD90 + stromaceller och SIRPα + myocyter).
  4. Skapa Human Engineered hjärtvävnader
    Obs! Förvara alla lösningar på is och cellerna vid rumstemperatur. Alla volymer som anges nedan är per vävnad. Typiskt kan cirka sex vävnader konstrueras från två 6-väl plates om hjärtdifferentieringar.
    1. Späd 60,0 pl av 5 mg / ml kollagen lager till 3,125 mg / ml med 1,5 | il av 1 M NaOH, 9,6 ^ il 10 x PBS och 24,9 | il av sterilt ultrarent avjoniserat vatten.
      Kritiskt steg: Undvik att införa luftbubblor till varje lösning under beredning som luftbubblor kommer att störa korrekt vävnadsbildning.
    2. Lägg 12,0 pl av både 10x MEM och 0,2 N HEPES pH 9 till den utspädda kollagenblandningen för att skapa kollagen mix. Lägg båda lösningarna ner sidan av 15 ml centrifugrör för att undvika införandet av luftbubblor i kollagenblandningen.
    3. Lägga basalmembranet matris till en slutlig koncentration av 0,9 mg / ml till kollagenet blanda och lagra på is för att skapa den slutliga vävnadsblandningen. Den slutliga koncentrationen av kollagen bör vara 2 mg / ml.
    4. Lägga 500,000 av de reaggregated cellerna till vävnadsblandning (myocyt + fibroblast-koncentrationen är 20 miljoner / ml) och fyll till en slutlig volym av 25 pl pervävnad med antingen cellfria NBS media eller 50000 celler av kompletterande celltypen av intresse (t.ex. hMSCs) och blanda väl för att bilda en jämn cell suspension.
      Obs: Antalet kompletterade celler kommer att variera från olika applikationer. Här 10% tillskott används.
    5. Med omsorg, pipett 25 ul av cellsuspensionen i var och en av de sex brunnar i bioreaktorn bottenplatta, utan att införa luftbubblor i brunnen.
    6. Driva två rader av PDMS kraftsensorer på vardera sidan av polysulfon ram, som bildar 6 par motstående stolpar och sedan invertera ram ovanpå bottenplattan, så att ett par av stolpar kommer in varje brunn innehållande cellsuspension.
      Obs! Polysulfon ramen omfattar flikar för att hjälpa i anpassningen av PDMS.
    7. Placera försiktigt bioreaktorn, basplattan nedåt i en 60 mm skål och placera skålen utan omslaget inne i en 10 cm skål, placera 10 cm locket på toppen, och flytta hela bioreaktor enheten itill vävnadsodlingsinkubator, väntar två timmar för vävnaden att gela.
    8. Efter 2 timmar, ta bort bioreaktorn från inkubatorn och tillsätt 14 ml NBS media till hela aggregatet, tillräckligt för att täcka bottenplattan. Återgå till inkubatorn och ändra hälften av media varje dag.
    9. Fyrtioåtta timmar senare, försiktigt bort bottenplattan genom att försiktigt flytta varje sida av bottenplattan från ramen några millimeter i taget, ändra media, sedan tillbaka bioreaktorn, vävnader nedåt, till media.
    10. Fortsätta ändra hälften av NBS odlingsmedier varje dag.
      Notera: Spontana kontraktioner av vävnaden kan observeras så tidigt som tre dagar efter vävnads konstruktion, genererar mätbara rycka krafter så tidigt som dag 5-7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att få hjärtmuskelceller, är en något modifierad version av Boheler och Lian differentieringsmetoder som används 30,31. Det är absolut nödvändigt att differentieringen startar under log-fasen av celltillväxt, men också att utgångspopulationen är tillräckligt konfluent för att erhålla en användbar antal celler efter sortering (ca 75% är optimalt). Typiskt för H7 hESCs, plätering vid en densitet av 140.000 hESCs per brunn i en 6-brunnsskål i väsentlig 8 medier och 5% CO2 inkubator som hölls vid 37 ° C ger tillräckligt konfluenta kulturer efter 4 dagar för att påbörja differentiering, såsom illustreras i figur 1A - D. Eftersom insulin hämmar hjärt specifikation under differentieringsprocessen 32, insulin fria medier (differentiering media I tabell 1) används för de första 10 dagarna av differentiering. När differentiering initieras genom tillämpning av GSK3-hämmare CHIR99021 den,signifikant celldöd kommer att inträffa (figur 1E). Som en konsekvens är det nödvändigt att ändra media varje dag. På dag 2 av differentiering, cellerna avlägsnas från CHIR99021 och vilade i differentiering medier I (utan tillsatt små molekyler) under 24 timmar. Efter 24 timmar vila i differentiering media, cellerna behandlas med IWR-1 under 48 timmar, varefter de börjar själv organisera sig i kluster (Figur 1F) som slår så tidigt som sju dagar från start av differentiering. Eftersom hjärt specifikation har inträffat efter det att tillämpningen av IWR-1, mediet ändras till media innehållande insulin (differentiering medier II, tabell 1). Med 18 dagar av differentiering, har de kolonier av slå celler anslutna och delvis fristående från cellytan och bildar kraftigt slå "banor" i hela skålen (Video Figur 1).

På dag 20, är ​​att slå monoskiktet försiktigt dissocierade VIen enzymatiska metoder för att erhålla enstaka celler för levande fluorescerande associerad cellsortering (FACS). Använda differentieringen ovan beskrivna metoden vi konservativt skörda cirka 65% av befolkningen som SIRPα + och 10% som CD90 + (Figur 2). Generellt 1-2 miljoner SIRPα + celler erhålls per 6-brunnar.

Efter återaggregering under 48 h i ett 3: 1 förhållande av SIRPα +: CD90 + celler, är de definierade cellaggregat blandas med en kollagenbaserad hydrogel och pipetterades in i smala brunnar i basplattans av flervävnads bioreaktor. Typiskt, före avlägsnande från skålen, små kluster av 5-10 celler kommer att ses att slå på ytan av skålen. Den definierade vävnads bioreaktorn består av tre delar: en mästare mögel att kasta PDMS inlägg; en ram för att hålla två PDMS rack inlägg; och en svart polytetrafluoretylen basplatta, som har sex brunnar för vävnadsblandningen (Figure 3A). Hela vävnad byggprocessen utförs på is och under aseptiska förhållanden. Efter tillsats av de flytande cell-matris blandningar till brunnarna i basplattan, är PDMS inlägg fäst på polysulfon ramen och sedan inverteras så att stolparna i linje med brunnarna i basplattan (figur 3B). Efter 48 h inkubation bör vävnaderna vara tillräckligt packad att bottenplattan kan tas bort. Bottenplattan är lättast loss genom att extrahera hela systemet från media och försiktigt avlägsna överflödigt material från mellan PDMS och bottenplattan. Om allt material inte tas bort, kan ytspänningen av den kvarvarande vätska dra vävnaderna utanför stolparna. När media tas bort, tryck försiktigt bottenplattan tillbaka mot PDMS inlägg att hjälpa till att lossa vävnad från bottenplattan. Sedan gradvis skjuta basplattan bort genom att försiktigt flytta en sida upp några millimeter, sedan den andra sidan upp samma belopp. Upprepa denna process tills baseplate tas bort, med alla 6 hECTs fästa vid sina respektive PDMS slut inlägg (Figur 4A). Ta bort bottenplattan bör inte ta mer än en minut. Ersätta systemet in i cellodlingsmedia, inverterad, så att alla vävnader täcks av cellodlingsmedia.

Ungefär en dag efter avlägsnande av basplattan bör svaga lokala sammandragningar kunna observeras i de definierade hECTs enligt ljusfältsmikroskopi. Efter 7 dagar, har vävnaderna och ersattes med kompakterad (figur 4B-C) med i linje liggande sarkomerer (Figur 4D). Vävnaderna synligt avleda PDMS inlägg med i genomsnitt 5-15 μN kraft (Figur 4E). Rycka kraftmätningar för de definierade tekniska hjärtvävnad kan mätas genom spårning i realtid av inlägget spetsen nedböjning med en höghastighetskamera och anpassade datainsamling programvara, och applicera efter böjning till balkböjning teori efter att bestämmaYoungs modul av silikon inlägg med hjälp av en kraftomvandlare, såsom förklaras mer i detalj tidigare. 1,7 Att upprätthålla sterilitet under datainsamling säkerställer förmågan att mäta förändringar i vävnadsfunktion med tiden. Vi har behållit funktionella vävnader i flera veckor, vilket förklaras mer i detalj på annat håll 1. Våra preliminära resultat visar en betydande förbättring av Hect sammandragande kraft när vävnaderna kompletteras med 10% humana mesenkymala stamceller både en Hz och 2 Hz stimuleringsfrekvenser (Figur 4F).

Figur 1
Figur 1: Bilderna av H7 hESCs under expansion och hjärtdifferentieringsprocess. Expansionsfasen ska pågå 4 dagar, med en tillväxt på kolonierna expanderar från 24 (A), till 48 (B), 72 (C (D). Efter 96 h av tillväxt differentieringen påbörjas, vilket resulterar i avsevärd celldöd under den första 48 h av CHIR99021 behandling (E). Efter två dagars IWR-en behandling sker omorganisation (F) för att bilda kluster av celler som slår så tidigt som dag 7. Ytterligare organisation i en robust slå "web" förekommer från dag 7 till dag 20, då mono dissocieras för skapa engineered hjärtvävnader.

Video Figur 1. Representant hjärtmonoskikt efter 17 dagar av differentiering . Klicka här för att se filmen Spontan stryk i monoskiktet är vanligtvis först observeras mellan dag 7 och dag 10, och 17 dagar av differentiering monolagret har bildat sammankopplade "banor "som slår kraftigt.

Namn Sammansättning Differentierings dagar används
Differentiering Media I RPMI 1640
B27 Supplement (minus insulin)
Penicillin-streptomycin
D0-D1 (med CHIR99021)
D2
D3-D5 (med IWR-1)
D5-D7
Differentiering Media II RPMI 1640
B27 Supplement (med insulin)
Penicillin-streptomycin
D7-D20

Tabell 1: Sammansättning av differentiering medier.

figur 2
Figur 2: Representant levande cell sorting resultat Två prover framställdes. en ofärgade kontroll och ett målat kontroll med 1: 500 utspädning av SIRPα-PE / Cy7 antikropp och 1: 250 utspädning av CD90-FITC-antikropp. Efter färgning ades cellerna sorteras vid 20 psi i sorteringsbuffert bestående av PBS, 10% neonatalt bovinserum, 10 | iM ROCK inhibitor Y-27632, och 1 | ig / ml DAPI. Båda cellpopulationer gated i fram- och sidospridningsprofiler för att utesluta skräp (A, blå linje) då enskilda celler selekterades genom att jämföra pulsbredd och höjd (pulsbredds analys) i både framåtspridning (B, blå linje) och sido scatter kanaler (C, blå linje). Därefter tillsattes levande celler väljs genom grind DAPI - befolkningen (D, blå linje). De slutliga cellpopulationer för insamling bestämdes genom att undersöka FITC och PE-Cy7 uttrycksnivåer av levande populationer. Den ofärgade kontroll (E, vänster) användes för attfastställa lämpliga porten för att välja för FITC + (CD90) och SIRPα-PE / Cy7 + (cardiomyocyte) population som finns i det färgade provet (E, höger). FITC och SIRPα-PE / Cy7 + poplations uppsamlades i separata 15 ml centrifugrör.

Figur 3
Figur 3:. Schematisk av flervävnads bioreaktor och hjärtvävnaden konstruktionsprocessen Konstruktion av flervävnads bioreaktor kräver tre komponenterna (A): 1) en polytetrafluoreten masterform 9 x 33 x 5 mm 3, med 6 jämnt fördelade hål 0,5 mm i diameter; 2) en 25 x 35 x 11 mm 3 polysulfon ram att hålla PDMS inlägg under vävnads konstruktion och kultur; och 3) en 20 x 40 x 5 mm 3 svart polytetrafluoretylen basplatta med 6 brunnar i 6 x 1 x 1 mm 3 dimensioner, spaced 4 mm från varandra längs dess längd. Till skapandet av mänskliga tekniska hjärtvävnad (B), är PDMS inlägg tillverkas genom PDMS mjuk litografi med hjälp av polytetrafluoretylen mästare mögel, varav två är sedan pressas mot flikarna på polysulfon ramen för att bilda 6 par kraftkännande fribärande inlägg. Vävnads lösning pipetteras i brunnar i den svarta polytetrafluoretylen plattan. Ramen och inlägg sedan inverteras och anpassats till polytetrafluoretylen bottenplatta, så att ett par av stolpar in varje brunn innehåller vävnadsblandningen. Efter 48 timmar, är bottenplattan bort och de definierade vävnaderna odlas på stolparna, förblir inverterad i NBS media.

figur 4
Figur 4:. Bilderna och funktionella mätningar av definierade mänskliga konstruerad hjärtvävnader Multi-vävnad bioreacteller systemet har sex vävnader i parallella (A, pilspetsar). Definierade vävnader är själv monterade inom sju dagar efter att skapa vävnad (uppifrån, B och sneda sidan, C). (D). Del av en definierad Hect färgades för kardiellt troponin-T (cTnT). (E) Representant rycka spårning visar rå kraft över tiden under en Hz stimulering av elfältstimulering. (F) Twitch spårning under stimulering vid 1 Hz (0-2 sek) och 2 Hz (2-4 sek) stimulering, med pil märknings förändring i frekvens, för båda okompletterat definierade hECTs (heldragen linje) och vävnader som kompletterats med 10% hMSCs (prickad linje).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Konstruktion av definierade mänskliga tekniska hjärtvävnad (Hect) kan ge en mer konsekvent och tillförlitlig modell av human hjärt myocyte funktion. Kritiskt, är alla cellulära och extracellulära komponenter i systemet är kända och kan manipuleras enligt önskemål, på så sätt avlägsna den confounding påverkan av andra okända celltyper till följd av differentieringsprocessen. Att balansera snabb celltillväxt och hög avkastning, är det att föredra att differentieringen börjar vid 75% sammanflytning av de hESCs, helst fyra dagar efter plätering. Dessutom, användningen av ROCK-inhibitor Y-27632 under både cellen dissociation och återaggregering efter sortering ökar i hög grad cellviabilitet. Förekomsten av spontana misshandel av myocyter under differentieringsprocessen är en viktig indikator på effektivitet och hälsa differentiering. Om spontan slå inte följs kan detta tyda på dålig differentiering effektivitet, antingen på grund av ineffektiva reagens eller en förlustav pluripotens av stamcellema.

Under vävnads konstruktion måste PDMS inlägg anpassa ordentligt med kanalerna i bottenplattan för att skapa välformade vävnader som varar tillräckligt länge för att mäta kontraktila funktion. För att öka lättheten att anordningen justering och förstärka vävnadsbildning runt stolparna där de är känsliga för brytning, är det möjligt att lägga till extra bredd (ungefär en postdiameter på vardera sidan av stolpen) till ändarna av kanalerna, vilket framgår genom "hundbens" -formade kanaler i figur 3A. Utan ordentlig anordning uppriktning vävnaden kommer antingen lossnar från stolparna kort efter odling, eller kommer att finnas kvar i brunnen när basplattan avlägsnas. Om en välformad vävnad faller under bottenplattan bort, är det möjligt att försiktigt sätta tillbaka vävnaden till stolparna med fin pincett under ett dissektionsmikroskop, även om det är lätt att skada den känsliga hECTs om adekvat vård inte vidtas. </ P>

En stor styrka hos den beskrivna definierade systemet är förmågan att förhöra bidraget av direkt interaktion cell-cellmekanismer i hjärtcellterapier baserade på specifik kontroll av cellkompositionen. Injektionen av celler i djur är oprecis och föremål för låg lönsamhet och behålla 33. Dessutom är effekten av de injicerade cellerna på målvävnaden kompliceras av interaktioner med andra fysiologiska system, såsom immunsystemet. Som sådan, är att förstå bidraget från direkta cell-cell-interaktioner i hjärtcellterapier utmanande att ta itu med i modellorganismer. Därför en fördel för den beskrivna metoden är att cell-cell interaktioner analyseras i en biomimetisk tredimensionell miljö, bevara viktiga aspekter av hjärt nisch, och i närvaro av de specifika celltyper av intresse - nämligen de hjärtmyocyter och fibroblaster. Nyttan av att använda det definierade Hect systemet är demonstratörerpade med tillskott av 10% hMSCs härrör från human märg 34,35 och används i kliniska prövningar till cellblandningen under skapandet vävnad. De vävnader som kompletterades med hMSCs uppvisade större sammandragande kraft än de som inte fått definierade mänskliga vävnader (Figur 4F). Eftersom vävnadsmiljön och sammansättning har kontrollerats, förbättring av vävnadsfunktion med MSC tillskott reflekterar en inneboende effekt hMSCs på cardiomyocyte funktion. En annan styrka till systemet är att eftersom vävnaderna är mindre än vad som tidigare använts, är effektivare 1,7 cellsanvändning, en viktig faktor vid användning av riktade differentieringar av pluripotenta stamceller som cellkälla.

Utöver att studera mekanismer för cellterapi, skulle definieras Hect systemet möjliggör undersökning av cellulära grund av kardiovaskulära cell-cell interaktioner. Störning av biologin av cellerna före vävnads constBRÅK, exempelvis med shRNAs, skulle det möjligt att undersöka molekylära mekanismer som reglerar cell-cell- och cell-matrix-interaktioner. En ytterligare fördel för vävnadsteknik systemet är bildningen av inriktade myofibriller med förmåga att funktionella sammandragningar. Således, genom att använda det definierade Hect systemet, dynamiken i myofibrill bildning, cardiomyocyte utveckling och organisation av vävnaden arkitekturen kan alla undersökas via modifiering av komponenterna i den extracellulära matrisen eller molekylär manipulation av cellerna. Den mänskliga och 3-D karaktär Hect systemet dessutom ökar översättbarhet av resultaten.

Medan det beskrivna systemet ger en kraftfull metod för att förstå grundfrågor kardiovaskulär biologi, är det inte utan begränsningar. För det första manipulerade vävnaderna uppvisar en omogen fenotyp, i överensstämmelse med publicerade ryckning kraftdata från nyfödda hjärtprover 7. Medanfenotypisk omognad skulle kunna vara en confounding faktor när man utvärderar cellinteraktionsmekanismer finns det bevis för att sjuka cardiomyocytes återgå till en fetal gen program 7,36-38. Om resultaten från Hect systemet visar sig vara relevant i samband med en sviktande hjärtat, kan detta vara fördelaktigt för att testa hjärt terapier. Protokollet använder också en hESC kvalificerad basalmembranmatrisen under vävnadskonstruktion. Sammansättningen av denna matris kan variera från parti till parti, och när definierade källare matris alternativ finns de har ännu inte utvärderats inom ramen för hECTs.

Andra begränsningar är bristen på en kärlsystemet och inga systemnivå interaktionseffekter. Med tanke på storleken av vävnaderna, är metaboliska krav uppfylls genom diffusion ensam så behövs ingen kärlsystemet för att säkerställa cellviabilitet. Emellertid kan endotelial cellsignalering vara en viktig faktor i specifika cellterapier. Om så är fallet, ett visst antal endothelial celler kan helt enkelt sättas till den definierade cellblandningen under vävnadskonstruktion. Medan systemnivå interaktioner är viktiga för fullständig förståelse av cellmekanismer erbjuder konstruerade vävnadssystem ett reduktionistiskt tillvägagångssätt för att förenkla problemet för att systematiskt ta itu med mekanismen. Komplexitet kan läggas till den definierade vävnadssystem som behövs genom införandet av system-relaterade effekter, såsom leukocyter att införliva ett immunsvar, eller genom att tillsätta angränsande vävnadstyper att förhöra parakrin signalering.

Som ett undersökande verktyg, definierade hjärtvävnadssystem mänsklig konstruerad erbjuder fördelarna med artspecifika humana celler, en biomimetiskt 3-D odlingsmiljö med kontrollerad biokomplexitet, rättfram och längsgående övervakning av kontraktila funktion, och en definierad cellulär och matriskompositionen. Framtida riktningar för Hect systemet inkluderar manipulera den terapeutiska celltypen av intresse with siRNA eller shRNA före införandet i vävnaden för att undersöka specifika molekylära detaljerna av interaktion cell-cell. Dessutom, snarare än att använda hESCs att bilda de hjärtceller, är det möjligt att använda inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från patienter med en ärftlig mutation i ett försök att modellera relaterade manifestationer hjärtsjukdom de manipulerade vävnaderna. Således, vår metod för att skapa mänskliga konstruerad hjärtvävnader med definierade cellpopulationer lovar att öppna nya vägar för att studera hjärtcellterapi för att påskynda utvecklingen av nya behandlingar för patienter med hjärtsjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH (1F30HL118923-01A1) till TJC, NIH / NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C till KDC, forskningsanslaget råd Hongkong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) till BDG, den amerikanska Heart Association (12PRE12060254) till RJ, och forskningsbidrag rådet Hongkong (TBRS, T13-706 / 11) RL Ytterligare finansiering lämnades till TJC av NIH DRB 5T32GM008553-18 och som en praktikplats på NIDCR-tvärvetenskaplig utbildning inom Systems and Develop biologi och fosterskador T32HD075735. Författarna vill också tacksamt erkänna Arthur Autz på The Zahn centrum av staden College of New York för att få hjälp med att bearbeta bioreaktorn och Mamdouh Eldaly för tekniskt stöd. Vi vill också tacka Dr Kenneth Boheler för råd om hjärt differentiering, och Dr Joshua Hare för generöst ger humana mesenkymala stamceller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter