Computed Tomography og optisk billeddannelse af Osteogenesis-angiogenese Kobling at Vurdere Integration af kranieknogler autografter og Allografter
Summary
Implantation af autologe og allogene knogletransplantater udgør accepterede tilgange til behandling af svære kraniofacial knogletab. Endnu virkningen af graft sammensætning på samspillet mellem neovaskularisering, celledifferentiering og knogledannelse er uklar. Vi præsenterer en multimodal billedbehandling protokol til formål at belyse angiogenese-osteogenese indbyrdes afhængighed på graft nærhed.
Abstract
En stor parameter bestemme succes af en knogle-podning procedure er vaskularisering af området omkring transplantatet. Vi antager, at implantation af en knogle autotransplantat ville fremkalde en større knogle regeneration af rigelige blodkar formation. For at undersøge virkningen af implantatet på neovaskularisering ved defektstedet, udviklede vi en mikro-computertomografi (μCT) tilgang til karakterisering nydannede blodkar, hvilket indebærer systemisk perfusion af dyret med en polymeriserende kontrastmiddel. Denne metode gør det muligt detaljeret vaskulær analyse af et organ i sin helhed. Derudover blev blod perfusion vurderet ved anvendelse fluorescensimagografi (FLI) af en blodbåren fluorescerende middel. Knogledannelse blev kvantificeret ved anvendelse af en FLI hydroxyapatit-målrettet probe og μCT analyse. Stamceller rekruttering blev overvåget ved bioluminescens imaging (BLI) af transgene mus, som udtrykker luciferase under styring af osteocalcin promotoren.Her beskriver og demonstrerer forberedelse af allotransplantatet, calvariale defekt kirurgi vi, μCT scanning protokoller for neovaskularisering studiet og knogledannelse analyse (herunder in vivo perfusion af kontrastmiddel), og protokollen til dataanalyse.
3D høj opløsning analyse af vaskulatur signifikant større angiogenese i dyr med implanterede autotransplantater, navnlig med hensyn til arteriole formation. Følgelig blodperfusion var signifikant højere i autograft gruppen af den 7. dag efter operationen. Vi observerede overlegen knoglemineralisering og måles større knogledannelse hos dyr, der modtog autotransplantater. Autograft implantation induceret resident stamcelle rekruttering til graft-værtsknoglen sutur, hvor cellerne differentieret til knogledannende celler mellem 7. og 10. postoperative dag. Dette fund betyder, at øget knogledannelse kan tilskrivesaugmented vaskulære fodring, der kendetegner autotransplantat implantation. Fremgangsmåderne afbildet kan tjene som et optimalt værktøj til at studere knogleregenerering i form af tæt afgrænset knogledannelse og neovaskularisering.
Introduction
Craniofacial knogletab på grund af traumer, tumorresektion, dekompressiv kraniotomi og medfødt defekt sjældent helbreder sig selv og præsenterer et klart udækket behandlingsbehov. Autologe knogletransplantater og allogene knogletransplantater er flittigt brugt til at behandle disse tilstande 1.
Det er almindeligt accepteret, at osteogenese tæt er kombineret med angiogenese 2,3. Således bør fuldstændig undersøgelse af en planlagt terapi for knogleregenerering indeholde en omfattende undersøgelse af vaskulære træ danner hele defektstedet. Der er flere tilgængelige metoder til at karakterisere vaskularisering i forsknings-modeller. Den vaskulære træ kan undersøges ved histologisk analyse. Da histologi afhængig sektionering væv, er der stor sandsynlighed for, at det resulterende billede vil blive forvrænget. For at løse dette problem, kan intravital mikroskopi udføres for at billedet intakt blodkar 4; Men denne metode erbegrænset til en plan afbildning. μCT scanning af prøver taget fra et dyr perfunderet med kontrastmiddel giver 3D-afbildning af det vaskulære netværk, der giver næring til regenerering site 5. Denne fremgangsmåde giver mulighed for en meget detaljeret demonstration af et organ s kar som helhed, samt en omhyggelig analyse af blodkar distribution. Endvidere μCT muliggør differentiering mellem forskellige diametre af blodkar, der kendetegner de forskellige undertyper af blodkar.
Vi antager, at implantation af en calvarial autograft vil inducere større neovaskularisering end implantation af en allograft, og dette tal steg neovaskularisering vil føre til gengæld til øget knogle formation.To forfølge denne hypotese anvendte vi en række teknikker. Vi undersøgte mønstre af nydannede vaskulære træ ved at udføre en μCT-analyse. Vi målte blodperfusion anvendelse af et blod-pool fluorescerende probe. Næste, vi æslersed knoglevæv mineralisering af FLI en hydroxyapatit-rettet probe og μCT analyse. Endelig har vi overvåget stamcelle rekruttering og differentiering, der udfører BLI i transgen mus, hvor luciferase udtrykkes i osteocalcin-positive celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med multimodale billedteknik er beskrevet her, er at gøre det muligt omhyggelig undersøgelse af angiogenese-osteogenese aksen i forbindelse med kraniel knogletransplantation. Neovaskularisering blev filmede med en μCT protokol, som tillod en nøjagtig høj opløsning 3D demonstration af det vaskulære træ fodring hele kranie defekt. μCT data kan let analyseres under anvendelse af avancerede værktøjer såsom IPL software. For eksempel er tykkelsen analyse vist i figur 3C viste, at de væ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
