Summary

Computed Tomography og optisk billeddannelse af Osteogenesis-angiogenese Kobling at Vurdere Integration af kranieknogler autografter og Allografter

Published: December 22, 2015
doi:

Summary

Implantation af autologe og allogene knogletransplantater udgør accepterede tilgange til behandling af svære kraniofacial knogletab. Endnu virkningen af ​​graft sammensætning på samspillet mellem neovaskularisering, celledifferentiering og knogledannelse er uklar. Vi præsenterer en multimodal billedbehandling protokol til formål at belyse angiogenese-osteogenese indbyrdes afhængighed på graft nærhed.

Abstract

En stor parameter bestemme succes af en knogle-podning procedure er vaskularisering af området omkring transplantatet. Vi antager, at implantation af en knogle autotransplantat ville fremkalde en større knogle regeneration af rigelige blodkar formation. For at undersøge virkningen af ​​implantatet på neovaskularisering ved defektstedet, udviklede vi en mikro-computertomografi (μCT) tilgang til karakterisering nydannede blodkar, hvilket indebærer systemisk perfusion af dyret med en polymeriserende kontrastmiddel. Denne metode gør det muligt detaljeret vaskulær analyse af et organ i sin helhed. Derudover blev blod perfusion vurderet ved anvendelse fluorescensimagografi (FLI) af en blodbåren fluorescerende middel. Knogledannelse blev kvantificeret ved anvendelse af en FLI hydroxyapatit-målrettet probe og μCT analyse. Stamceller rekruttering blev overvåget ved bioluminescens imaging (BLI) af transgene mus, som udtrykker luciferase under styring af osteocalcin promotoren.Her beskriver og demonstrerer forberedelse af allotransplantatet, calvariale defekt kirurgi vi, μCT scanning protokoller for neovaskularisering studiet og knogledannelse analyse (herunder in vivo perfusion af kontrastmiddel), og protokollen til dataanalyse.

3D høj opløsning analyse af vaskulatur signifikant større angiogenese i dyr med implanterede autotransplantater, navnlig med hensyn til arteriole formation. Følgelig blodperfusion var signifikant højere i autograft gruppen af den 7. dag efter operationen. Vi observerede overlegen knoglemineralisering og måles større knogledannelse hos dyr, der modtog autotransplantater. Autograft implantation induceret resident stamcelle rekruttering til graft-værtsknoglen sutur, hvor cellerne differentieret til knogledannende celler mellem 7. og 10. postoperative dag. Dette fund betyder, at øget knogledannelse kan tilskrivesaugmented vaskulære fodring, der kendetegner autotransplantat implantation. Fremgangsmåderne afbildet kan tjene som et optimalt værktøj til at studere knogleregenerering i form af tæt afgrænset knogledannelse og neovaskularisering.

Introduction

Craniofacial knogletab på grund af traumer, tumorresektion, dekompressiv kraniotomi og medfødt defekt sjældent helbreder sig selv og præsenterer et klart udækket behandlingsbehov. Autologe knogletransplantater og allogene knogletransplantater er flittigt brugt til at behandle disse tilstande 1.

Det er almindeligt accepteret, at osteogenese tæt er kombineret med angiogenese 2,3. Således bør fuldstændig undersøgelse af en planlagt terapi for knogleregenerering indeholde en omfattende undersøgelse af vaskulære træ danner hele defektstedet. Der er flere tilgængelige metoder til at karakterisere vaskularisering i forsknings-modeller. Den vaskulære træ kan undersøges ved histologisk analyse. Da histologi afhængig sektionering væv, er der stor sandsynlighed for, at det resulterende billede vil blive forvrænget. For at løse dette problem, kan intravital mikroskopi udføres for at billedet intakt blodkar 4; Men denne metode erbegrænset til en plan afbildning. μCT scanning af prøver taget fra et dyr perfunderet med kontrastmiddel giver 3D-afbildning af det vaskulære netværk, der giver næring til regenerering site 5. Denne fremgangsmåde giver mulighed for en meget detaljeret demonstration af et organ s kar som helhed, samt en omhyggelig analyse af blodkar distribution. Endvidere μCT muliggør differentiering mellem forskellige diametre af blodkar, der kendetegner de forskellige undertyper af blodkar.

Vi antager, at implantation af en calvarial autograft vil inducere større neovaskularisering end implantation af en allograft, og dette tal steg neovaskularisering vil føre til gengæld til øget knogle formation.To forfølge denne hypotese anvendte vi en række teknikker. Vi undersøgte mønstre af nydannede vaskulære træ ved at udføre en μCT-analyse. Vi målte blodperfusion anvendelse af et blod-pool fluorescerende probe. Næste, vi æslersed knoglevæv mineralisering af FLI en hydroxyapatit-rettet probe og μCT analyse. Endelig har vi overvåget stamcelle rekruttering og differentiering, der udfører BLI i transgen mus, hvor luciferase udtrykkes i osteocalcin-positive celler.

Protocol

Protokollen følger retningslinjerne i den institutionelle dyr pleje og brug udvalg (IACUC) i Det hebraiske Universitet i Jerusalem, Israel (Request nr MD-12-13524-4), en AAALAC godkendt anlæg, og af Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request nr 3770). Dyrene blev behandlet i streng overholdelse NIH retningslinjer. 1. Fremstilling af Bone Allografter Euthanize 7- til 8 uger gamle Balb / C-mus, eller hvilken som helst stamme forskellige fra modtageren under anvendelse af standardm…

Representative Results

Neovaskularisering blev vurderet ved μCT volumetrisk analyse og ved hjælp af en FLI fluorescerende blodbårne agent at kvantificere blodperfusion. Syv dage efter operationen, μCT scanning viste en signifikant højere volumen af små og mellemstore diameter blodkar hos mus, der havde modtaget autotransplantater end i mus, der havde modtaget allotransplantater høstet fra C57BL / 6 (figur 3A). Interessant nok i autograft-gruppen den nydannede vaskulære træ syntes at nå hele defekte område, mens blo…

Discussion

Formålet med multimodale billedteknik er beskrevet her, er at gøre det muligt omhyggelig undersøgelse af angiogenese-osteogenese aksen i forbindelse med kraniel knogletransplantation. Neovaskularisering blev filmede med en μCT protokol, som tillod en nøjagtig høj opløsning 3D demonstration af det vaskulære træ fodring hele kranie defekt. μCT data kan let analyseres under anvendelse af avancerede værktøjer såsom IPL software. For eksempel er tykkelsen analyse vist i figur 3C viste, at de væ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).

Materials

C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
uCT40 scanner Scanco uCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

References

  1. Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
  2. Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
  3. Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
  4. Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
  5. Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
  6. Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
  7. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  8. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  9. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
  10. Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
  11. Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
  12. Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
  13. Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
  14. Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
  15. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
  16. Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
  17. Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
  18. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
  19. Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
  20. Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
  21. Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
  22. Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
  23. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
  24. Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
  25. Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
  26. Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
  27. Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).

Play Video

Cite This Article
Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., Gazit, D., Gazit, Z. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

View Video