Summary
Otolog ve allojenik kemik greft implantasyonu önemli kraniofasial kemik kaybını tedavi yaklaşımları kabul teşkil. Oysa neovaskülarizasyon, hücre farklılaşması ve kemik oluşumu arasındaki etkileşime greft bileşiminin etkisi belirsizdir. Biz greft yakınlık anjiyogenez-osteogenesis bağımlılığın aydınlatmak için amaçlandığı multimodal görüntüleme protokol mevcut.
Abstract
Bir kemik greft prosedürün başarısını belirlemede önemli bir parametre greft çevredeki vaskularizasyon olduğunu. Biz bol kan damarı oluşumu ile daha kemik rejenerasyonu teşvik edecek bir kemik otogreftin o implantasyonu varsaydık. Defekt yerinde neovaskülarizasyon üzerinde greft etkisini araştırmak için, bir polimerizasyon kontrast madde ile hayvanın sistemik perfüzyon içeren kan damarlarını oluşturan yeni karakterize bir mikro-bilgisayarlı tomografi (uCT) yaklaşımını geliştirdi. Bu yöntem bütünüyle bir organın detaylı damar analiz sağlar. Buna ek olarak, kan perfüzyon kan yoluyla bulaşan bir flüoresan madde flüoresan görüntüleme (FLI) kullanılarak değerlendirildi. Kemik oluşumu, bir hidroksiapatit hedefli bir prob ve uCT analizi kullanılarak FLI ile nicelendirildi. Kök hücre alımı osteokalsin promoterinin kontrolü altında lusiferaz ifade eden bir transjenik farelerin biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile izlenmiştir.Burada tarif ve allogreft hazırlanması, kalvarial kusur ameliyatı göstermek, neovaskülarizasyon çalışma ve (kontrast madde in vivo perfüzyon dahil) kemik oluşum analizi ve veri analizi için protokol için uCT tarama protokolleri.
Damar 3D yüksek çözünürlüklü analizi, özellikle arteriol oluşumu ile ilgili olarak, implante greftli hayvanlarda önemli ölçüde daha büyük bir anjiyojenez gösterdi. Buna göre, kan perfüzyon ameliyat sonrası 7. gün otogreft grubunda anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Biz autograf alınan hayvanlarda üstün kemik mineralizasyonu ve ölçülen büyük kemik oluşumunu gözlendi. Hücreler 7. ve 10. günde arasındaki kemik oluşturan hücrelerin içine farklılaşan greft-konak kemik sütür için otogreft implantasyonu uyarılmış ikamet kök hücre alımı. Bu bulgu, gelişmiş kemik oluşumu atfedilebilir anlamındadırotogreft implantasyonu karakterize artar vasküler beslenmesi. Yöntemler sıkı sınırlı kemik oluşumu ve neovaskülarizasyon açısından kemik rejenerasyonu incelemek için en uygun araç olarak hizmet edebilir tasvir.
Introduction
Travma, tümör rezeksiyonu, dekompressif kraniyotominin ve konjenital defekte Kraniyofasiyal kemik kaybı nadiren tek başına iyileşir ve net bir klinik çözüm sunuyor. Otolog kemik grefti ve allojenik kemik grefti yoğun bu koşulları 1 tedavi etmek için kullanılır.
Bu yaygın osteogenesis sıkı anjiyojenez 2,3 ile birleştirilir kabul edilmektedir. Böylece, kemik rejenerasyonu için önerilen tedavinin tam çalışma, tüm kusur site genelinde oluşturan damar ağacının kapsamlı bir soruşturma içermelidir. Araştırma modellerinde damarlanmayı karakterize birkaç müsait yöntem vardır. Damar ağacı histolojik analizi ile incelenebilir. Histoloji doku kesit dayanır yana, ortaya çıkan görüntünün bozulmayacağı bir yüksek ihtimal. Bu sorunu çözmek için, intravital mikroskopi görüntü bozulmadan kan damarları 4 yapılabilir; Bununla birlikte, bu yöntemtek düzlemli görüntüleme sınırlayıcı. Kontrast madde ile perfüze edilmiş bir hayvandan elde edilen örneklerin uCT tarama yenilenmesi sitesi 5 besleyen damar ağının 3D görüntü sağlar. Bu yaklaşım bir bütün olarak organının damar oldukça detaylı gösteri yanı sıra, kan damarı dağılımının titiz analiz sağlar. Ayrıca, uCT kan damarlarının farklı alt tipleri karakterize kan damarlarının çeşitli çaplarda arasındaki farklılaşma sağlar.
Biz allogreft implantasyonu daha büyük neovaskülarizasyonu tetikleyecek bir kalvaryal otogreft bu implantasyonu hipotezi, ve bu, çeşitli teknikler kullanılabilir, bu hipotezi devam formation.To gelişmiş kemik da, yeni damar oluşumu yol açacaktır artmıştır. Biz uCT tabanlı analiz yaparak yeni oluşan damar ağacın desenleri araştırıldı. Biz kan havuzu floresan prob kullanılarak kan perfüzyonunu ölçülür. Sonra, eşekBir hidroksiapatit yönettiği prob ve uCT analizi FLI tarafından sed kemik dokusu mineralizasyonu. Son olarak, lusiferaz osteokalsin-pozitif hücrelerde ifade edildiği transjenik farelerde BLI performans, kök hücre farklılaşması işe alım ve izlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol Kudüs, İsrail (Request No. MD-12-13524-4), bir AAALAC onaylı tesis ve tarafından Cedars-Sinai Tıp Merkezi'nde Hebrew Üniversitesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) kuralları takip IACUC (Request No. 3770). Hayvanlar NIH kurallarına sıkı sıkıya bağlı kalmanın tedavi edildi.
Kemik allogreft 1. Hazırlık
- CO2 inhalasyon veya 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu standart yöntem kullanılarak, alıcının farklı 7- ila 8 haftalık Balb / C fareleri, ya da herhangi bir suşu ile öldürülür. Bir kalp atışı yokluğunu onaylayın ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, -20 ° C'de muhafaza ve hasattan önce çözülmüş olan leşleri gelen alograftlan hasat.
- Tüylerin çıkış yönünün tersine uygulayarak, saç kesme makinesi kullanılarak kalvarial bölgeyi tıraş. % 70 uygulanarak karkas kafasını dezenfekte izopropanoll. Bir No. 11 neşter kullanılarak kafa derisi cilt kesin ve periosta çıkarın.
- Bir diş matkap ve bir 4.5 mm iç çaplı trefin kullanarak, kalvarial kemik dairesel fragmanını ayırmak. Steril tuzlu su ihtiva eden bir 100 mm'lik plastik tabak kemik parçası aktarın. Bu noktada, kan ve kemik parçası (Şekil 1A) bağlı yumuşak doku dikkate alınmalıdır. 22 vericiden bu şekilde kemik parçaları elde edilir.
- Kavisli cımbız kullanarak bir kerede bir kemik parçası tutun. Iyice pamuk uçlu aplikatör kullanarak çubukla ve herhangi bir beyin dokusu, yumuşak doku ve kan (Şekil 1B) çıkarın. Yavaşça greft mükemmel bir yuvarlak şekle sahip olacak şekilde ince makas kullanarak greft bağlı kalır herhangi bir kemik cips kesip.
- % 70 etanol ve etanol yıkamak için fosfat tamponlu tuzlu su ihtiva eden iki kez 15 ml tüpler ihtiva eden bir 15 ml tüp içinde bir kez, her greft batırın.
- Değerleriyle kriyotüplerde -80 ° C buzdolabında allograft FreezeEn az 1 hafta. Bu noktada, allogreftler (Şekil 1C) saydam görünmesini emin olun.
2. Kalvaryum Kusur Cerrahisi
- Alıcı için osteokalsin promoteri 6 kontrolü altında lusiferaz eksprese eden transgenik fareler kullanır.
- 30 saniye boyunca cam boncuk ısıtıcı kullanılarak cerrahi aletlerin sterilize ipuçları. Steril koşulları sağlamak için% 70 izopropanol içeren bir kavanoza araçları aktarın. Steril eldiven kullanın.
- Bir ketamine- medetomidin karışımı (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) intraperitoneal enjeksiyonu ile bir 7 ila 8 haftalık dişi fare anestezisi. Derinden anestezi olduğundan emin olmak için, hayvanın ayağını sıkıştırın. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine gözetimsiz kadar bir hayvan bırakmayın.
- Tüylerin çıkış yönünün tersine uygulayarak saç kesme makinesi kullanılarak kalvarial bölgeyi tıraş. Herhangi bir kürk kalıntıları çıkarmak ve onu afte silmek için saç kremleri sürünr tuzlu batırılmış gazlı bez ardından kuru gazlı bez kullanarak artık daha 2 dk. Bakım gözlerinde önlemek için alınmalıdır. Seçenek olarak ise, veteriner göz merhemi gözler için ekstra bir koruma tabakası olarak önceden epilasyon uygulanabilir. Bu tüy dökücü krem tüm izlerini kimyasal maddeye aşırı maruz kalmanın olası tahrişi önlemek için kaldırılmış olması zorunludur. % 5 klorheksidin (Şekil 1D) uygulayarak saç derisini dezenfekte edin.
- Deri altına 5 mg / kg karprofen 200 ul tuzlu su içinde seyreltildi enjekte edilir. Kuruluğunu önlemek ve her zaman bir termal pad üzerinde hayvan tutmak için veteriner göz merhemi sürün. Işletim dürbün altında hayvan yerleştirin.
- Ince makas ve cımbız (Şekil 1E) kullanılarak kafa derisi cilt 1 cm uzunluğundaki oval kesim olun. Kavisli cımbız kullanarak periost tutun ve ince makas kullanılarak kesip.
- Bir diş matkap a kullanarak lambdoid sütür kalvarial kusur 2 mm anterior Matkapnd 5 mm dış çaplı trefin (Şekil 1F ve G). Dura mater penetrasyonunu önlemek için, kemik içine yol dörtte üç matkap ve bir spatula kullanılarak kemik fragmanı ayırın.
- Bir otogreft implant, kemik parçasını almak ve enkaz kaldırmak için 10 ml steril tuzlu su içeren 10 mm plastik plaka yıkayın. Yumuşak dokuları çıkarmayın. Önceden bir allogreft bir allogreft, çözülme implante ve RT için normalleştirmek ve sonra yıkayın.
- Bu yüzden kusur marjları (Şekil 1H) dokunmaz kavisli cımbız kullanarak defekt kemik grefti yerleştirin. Fibrin jel kullanılarak konak kemik grefti (25 U / ml trombin 5 ul ile karıştırılmış / ml fibrinojen 46 mg 5 ul) Tutkal.
- 4-0 Vicryl dikiş (Şekil 1I) kullanarak cilt dikin. Cerrahi kesim povidon-iyot uygulayın. Bakım kürk dikiş kirlenmeyi önlemek için alınmalıdır. Mark fare kulak ve enjekte 0.25 mg / kg Antisedan to medetomidin'den anestezik etkisini tersine.
- Hayvan 10 dakika içinde uyanmak yoksa, bir ısındı pad üzerinde yer olduğundan emin olun. Steril tuzlu su 200 ul enjekte ve 0.1 mg / kg Antisedan iğne gerekirse. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
- Sütürler açmasını önlemek için bir hafta ayrı kafeslerde hayvanlar tutun. Bir kaç gün sonrası op kafes katta bir petri suya batırılmış fare yemi yerleştirin. Deri altına, ameliyat sonrası ağrının tedavi edilmesi için ameliyat sonrası 3 gün boyunca günde bir kez, steril tuzlu su içinde seyreltilmiş 1 mg / ml Carprofen çözeltisi 200 ul enjekte edilir.
Şekil 1. Kalvaryal Allogreft Hazırlama ve Kalvaryal Hata Cerrahi. Kemik parçası kalvaryal bölge (A) izole edilir. Yumuşak dokuKemik iliği, kan (B) swabbed edilir ve greft, fosfat tamponlu salin (Cı, AG = allograft) 'de iki yıkama ve ardından% 70 etanol içinde çalkalanır. Alıcı fare kalvaryal bölge (D) 'de tıraş ve derinin dezenfeksiyonunda Ameliyat için hazırlanmıştır. Bir oval kesim kafa derisi cilt oluşturulur ve periost (E) çıkarılır. Sonra, kalvarial kusur, 5 mm çaplı trefin (F) kullanılarak delinir. Kemik fragmanı sağlam superior sagittal sinüs (G) bırakarak, bir kaşık şekilli spatula kullanılarak ayrılır. Allogreft sonra defekt yerleştirilir ve fibrin jel (H) ile güvence altına alınmıştır. Son olarak, cilt (I) dikilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Karakterizasyonu için 3. Mikro Bilgisayarlı TomografiVasküler ağacı
- Heparinli tuz çözeltisini hazırlayın. Ağırlık 2000 U sodyum heparin ve 50ml plastik tüp içine koyun. 20 ml serum fizyolojik ekleyin ve iyice tüp sallayın. 15 ml ile 20 ml Luer lock şırınga heparinlenmiş tuzlu ısındı doldurun ve bir 23-G kafa derisi ven seti şırınga bağlayın. Bir şırınga pompası şırınga Yapıştırmayın ve 1 ml / dakika 10 ml pompa ayarlayın.
- 50ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile Oturaklı fare. Derinden sedasyon olduğundan emin olmak için hayvanın ekstremite sıkıştırın. Emici yüzey astarı (Şekil 2A) ile sarılmış bir tespit kuruluna sırtında fare sabitleyin. Duman için personel maruz kalmasını önlemek için davlumbaz sabit fare yerleştirin.
- Ince makas ve cımbız (Şekil 2B) kullanarak boyun karın cildi kesin. Kılıç şeklinde bir süreç (Şekil 2C) kadar karın duvarı kesti. Onun lateral boyunca göğüs kafesini kesin. Akciğerleri bir zarar kaçınınd kalp ve kalp tamamen açık olduğundan emin olun. Sternumu (Şekil 2D) geri çekilmesi için bir hemostat kullanın.
- Kelebek iğne sol ventrikül (Şekil 2E) içine 3 mm yerleştirin. 3-sek tutkal (Şekil 2F) kullanılarak kalp ve göğüs duvarına iğne Tutkal.
- Hemen Pompayı etkinleştirin. Bir dakika sonra, damarsal (Şekil 2G) basıncını için inferior vena kava teşrih. Sıvıları uzak başından akacak şekilde kurulu eğin. Başarılı perfüzyon, karaciğer ve kan damarlarını temizleme neden olur.
- Heparinize salin perfüzyon tamamlandığında,% 4 formaldehit, 10 ml serpmek. Damar sistemine hava kabarcıklarının nüfuz kaçının ve formaldehit dumanlara maruz kalmaktan kaçının. Başarılı formaldehid perfüzyon kuyruk takviye neden olur. Tuzlu heparinize 10 ml formaldehit yıkayın.
- İmalat göre olan radyo-opak kontrast ajanı hazırlamakÜrer talimatları. Tipik haliyle, bu bileşik bir seyreltici ve bir kürleme ajanının karıştırılmasını gerektirir. Serolojik pipetler kullanın ve 15 ml plastik tüp çözüm karıştırın.
- 1 ml / dakika bir hızda kontrast maddesi karışımı ile hayvan serpmek. Koroner bağırsak ve karaciğer kan damarları gözlemleyin ve 2 perfüzyon sonrası sarı dönüyor emin olun - Başarılı perfüzyon (Şekil 2H) gösteren, 3 ml. Perfüzyon tamamlanmasıyla, kelebek iğne boru kesmek yalnız karkas elde etmek ve kalvarial bölgeye çözümün sızmasını önlemek için tuvalet kağıdı ile sarın. 4 ° CO / N polimerizasyonu izin verin.
- Kalvarial bölgesini (Şekil 2I) teşrih; İlk ilgi kranial bölgeyi zarar kaçınarak, mümkün olduğunca yan olarak deriyi kesmek için bir neşter kullanabilirsiniz. 10 mm uzakta greft kafatası kemiği kesmek için ince makas kullanın, sonra kemik grefti bulun ve.
- Izole calv TaramaBir uCT tarayıcı kullanarak arial kemik örneği; 200 msn 360 ° ve entegrasyon zaman başına 1000 projeksiyonları kullanılarak, 20.5 mm, 55 kVp X-ışını enerjisi, 145 uA Şiddeti görüş alanını ayarlayın. Görüntü diğer kemik defekti modelleri uCT parametreleri 7 ayarlayın.
- UCT yazılım tarafından oluşturulan 2B yeniden dilimleri dikkate alınmalıdır. Ilgi bölgesi düzgün, tarama ve daha sonra kalvarial kusur bulmak için emin olun. Perfüzyon kalitesini değerlendirmek. Kan damarlarının başarılı kimlik (Şekil 2J) sonra devam ve çift distile su (DDW) seyreltilmiş% 6 Trikloroasetik Asit (TCA) kullanarak örnek kirecini.
- Bölüm 3,10 belirtilen parametreler kullanılarak örnek yeniden tara. Yeniden 2D dilim lambdoid sütür bulun. 2 mm ile 8 mm çapında yüksekliği daki (VOI) silindirik bir hacim tanımlar, bu dikiş teğet - bu kusur anatomik edilir.
- Segment inciKüresel eşikleme prosedürü kullanılarak yumuşak dokulardan e kemik dokusu; 130 alt eşiğini ayarlamak ve kısıtlı 3D Gauss filtresi (sigma [σ] = 2.0 ve destek = 2) kısmen hacimlerde gürültü bastırmak için geçerlidir. 3D rekonstrüksiyon oluşturun ve VOI düzgün (Şekil 2K) yerleştirildiğinden emin olun.
- IPL yazılım ve "dt_object_param" fonksiyonu (Şekil 2L) kullanarak bir kalınlık haritası oluşturmak.
NOT: Bu fonksiyon her damar çapı için damar hacmini açıklamaktadır.
Kalp yaklaşımı ile bir radyo-opak madde kullanarak Şekil 2. Perfüzyon. Fare sabitleme kurulu (A) tutturulur ve cilt boyun (B) karın yukarı boyunca kesilir. Karın duvarı kılıç şeklinde proce medial yukarı çizgi boyunca kesilirp (C), ve göğüs kafesi yanal olarak (D) kesilir. Bir kelebek iğne (E, sağ ventrikül beyaz kesikli çizgi ile belirtilir) belirgin koyu sağ ventrikül içine sokulmasına kaçınarak, sol ventrikül içine yerleştirilir ve iğne kalp ve göğüs duvarına yapıştırılmış olan (F) . Heparinize salin (2-3 ml) kalp içine pompalanır ve vena kava inferior disseke edilir (G, beyaz ok inferior vena kava gösterir). Formaldehit (% 4) perfüze yıkanır; bu sarı boyalı radyo-opak kontrast maddenin bir perfüzyon ile takip edilir. Başarılı perfüzyon san (H) rengini değiştirmek, kan damarları, temizlenmesi ile aşikâr olacaktır. Polimerizasyondan sonra, kalvarial bölge (I, AG = allogreft) izole edildi ve (J, faiz hacmi turuncu işaretlenmiş) uygun perfüzyon onaylamak için uCT tarayıcı kullanarak görüntülü.örneği (K) sertliği alınmış ve taranmamış olan renkli bir kalınlık haritası (L) nesil tarafından izledi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kemik Mineral ve Kan Perfüzyon 4. Floresans Görüntüleme
- 1.5 ml bir tüp içinde 2 nmol / 100 ul PBS bir konsantrasyonda (kan perfüzyonunun ölçülmesinde kemik mineralizasyonunu ve kan yoluyla bulaşan bir flüoresan madde izlemek için bir bisfosfonat-konjüge flüoresan probun kullanın) probları sulandırın. Yavaşça birkaç kez Pipet probunun homojen çözülmesini sağlamak.
- Belirlenmiş görüntüleme oturumundan önce 24 saat bir zaman sıfır görüntü almak; indüksiyon odasında% 3 izofluran ile desteklenmiş% 100 medikal dereceli oksijen 2 L / dk inhalasyon kullanmadan 3 fareler uyutmak. Doğru anestezi kurulduktan sonra,% 1.5 izofluran konsantrasyonunu düşürmek - 2%.
- Kuruluğunu önlemek ve emin termal ped her zaman açık olmak için veteriner göz merhemi sürün. Derinden anestezi olduğundan emin olmak için, hayvanın ayağını sıkıştırın. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine gözetimsiz kadar bir hayvan bırakmayın.
- Tüylerin çıkış yönünün tersine uygulayarak saç kesme makinesi kullanılarak kalvarial bölgeyi tıraş. Saç kremleri kullanarak kürk kalıntıları çıkarmak. Herhangi bir kürk kalıntısı optik görüntüleme ile müdahale edecektir. Ince makas ve cımbız kullanarak dikişlerle çıkarın.
- IVIS aşamada üç hayvan yerleştirin Her bir görüntüleme oturumu için 37 ° C'ye kadar ısıtıldı. , Otomatik pozlama süresini ayarlayın C alanını görüntüleyebilir ve filtreleri ayarlayın. Örneğin, 680 nm dalga boyunda ışık maksimum uyarma ile karakterize bir bifosfonat-konjuge floresan prob için, 675 nm'lik bir uyarma filtresi ve Cy5.5 bir emisyon filtresi kullanın . Benzer bir şekilde, ışık dalga boyunda 750 nm pik uyarma ile kan yoluyla bulaşan bir flüoresan madde kullanarak710 nm'lik bir eksitasyon filtre ve 780 nm'lik bir emisyon filtresi kullanılır.
- Görüntü "Acquire" düğmesine basarak Image yazılımı Living yoluyla fareler. Emin kalvarial bölge kapsamlı bir rehber tavsiye Lim ve ark 2009 için 8 (Şekil 3B) tamamen görünür olduğundan emin olun.
- Fareler% 100 oksijen teneffüs uyanık izin verin.
- Bir damar içi yükleme enjeksiyon yoluyla 2-nmol flüoresan probun enjekte edilir. Yukarıda açıklandığı gibi belirlenmiş görüntüleme oturumunda, görüntüleme gerçekleştirmek.
Kemik Rejenerasyon için 5. Mikro Bilgisayarlı Tomografi
- 4.3 - 4.2 adımda gösterildiği gibi kemik oluşumu ölçümü için,% 3 izofluran inhalasyon yoluyla fare uyutmak. UCT tarayıcı yatağına fare aktarın ve tarayıcıya yerleştirin.
- UCT tarayıcının X-ışını tüpü potansiyel 55 kVp enerji ve 145 uA orta çözünürlükte yoğunluğunu ayarlayın. 20.5 mm bir görüş alanını kullanarak gerçekleştirmekİzci (tek röntgen) tarama ve kafatasının arkasına farenin gözlerinin uzanan bir ilgi bölgeyi tanımlamak. 200 msn 360 ° ve entegrasyon zaman başına 1000 projeksiyonları kullanılarak, CT taraması gerçekleştirin.
- 20 um nominal uzaysal çözünürlüğü kullanarak 2D dilim yeniden yapılandırma. UCT yazılımını 9 kullanarak standart bir konuma kusur marjları hizalayın.
- Benzer şekilde, 3.20 adım ilgi silindirik hacmi tanımlamak ve kısıtlı 3D Gauss filtre uygulamak için (σ = 0.8 ve destek = 1) kısmen hacimlerde gürültü bastırmak için. Segment küresel eşikleme prosedürü kullanılarak yumuşak dokulardan kemik dokusu.
- Ilgi hacmindeki mineralize kemik dokusunun hacmini belirleyin.
Kök Hücre İşe Alım ve Farklılaşma 6. Biyoparlaklık Görüntüleme
- Bölüm 4,2-4,4 tasvir ve% 100 oksijen inhalasyon yoluyla farelerin uyanık olarak görüntüleme için fare hazırlayın.
- 1 yönetme26 mg / hayvan intraperitonel enjeksiyon ile her bir farenin kg böcek lusiferazı ve indüksiyon odasına hayvan dönün. 2 dakika sonra,% 3 izofluran ile anestetize hayvan. IVIS üzerinde fareler sahne ısındı yerleştirin.
- Image yazılımı Yaşam Via, pozlama süresini için "auto" ve C. Image görüş alanını luciferin uygulamasından sonra fareler 5 dk ayarlayın. Transgen ifade fareler arasında değişmektedir çünkü Image "Biyoparlaklık" yöntem kullanılarak adımda 4.6 de görüldüğü gibi hayvanlar, ilgi alanları tanımlayın. Kuyruk kalvarial sinyali Normale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neovaskülarizasyon Kan perfüzyonunun ölçmek için bir flüoresan kan kaynaklı madde kullanılarak uCT hacim analiz ile ve FLI ile değerlendirildi. Yedi gün ameliyat sonrası, uCT tarama C57BL / 6 (Şekil 3A) hasat allograft almış farelerde daha Otogreft almış farelerde küçük ve orta çapı kan damarlarının önemli ölçüde daha yüksek bir ses gösterdi. İlginç bir şekilde, otogreft grubundaki yeni oluşan damar ağacı allogreft grubunda kan damarları, dış kenarlarından kusur sitesi nüfuz ortaya çıktı ve sadece sınırlı bir dereceye kadar içeri doğru uzatılmış ise tüm kusur alanına ulaşmak için ortaya çıktı. FLI otogreft ile tedavi edilen hayvanlarda (Şekil 3B) daha yüksek kan perfüzyon gösterdiği, bu gözlemi desteklenir. 14. güne gelindiğinde, allogreft grubunda vasküler ağaç greft yakınlığı tüm ulaştı, ancak damar hacmi göre anlamlı oranda düşük olduğuİncelediğimiz en damar çaplarında otogreft grubunda (Şekil 3C) için. Not: 0.08- 0.1 mm çaplarında gemiler karşılaştırıldığında damar hacmi farklılığının en önemli idi. Yirmi sekiz gün sonra, damar hacmi cerrahi taban (Şekil 3D) geri dönmüştür.
Yedi gün ameliyattan sonra, FLI hidroksiapatit yönettiği prob otogreft grubunda (Şekil 4A) anlamlı olarak daha yüksek kemik mineralizasyonu göstermiştir kullanılarak yapılan. O zamana kadar, kemik otogreft implante hayvanlarda greft yakınlık boyunca oluşmuş. Buna karşılık, allogreft implante farelerde kemik sadece kusur kenarlarında kurmuştu ve bir halka şekli ile kutlandı. Kemik oluşumu, Cilt uCT analizi (Şekil 4B) gerçekleştirerek, rejeneratif işleminin son noktada, 56 gün ameliyat sonrası ölçüldü. Kemik hacmi önemli ölçüde (Şekil 4C) daha yüksek ve greft thi olduautograf (Şekil 4D) ile muamele edilmiş hayvanların önemli ölçüde daha ckness. BL osteoblastik soy (Şekil 4E) doğru kök hücre alımını ve farklılaşmasını izlemek için osteokalsin-lusiferaz transgenik fareler kullanılmıştır. Calvaria ölçülen sinyal kuyruk ölçülen daha 15 kat daha yüksek iken, ameliyat sonrası 7 gün - allogreft ile implante farelerde, BLI sinyali 4 yükseldi. Otogreft implante farelerde, BLI sinyal biraz sonra zirveye, 7-10 gün ameliyat sonrası ve ulaşan anlamlı derecede yüksek olduğu bir 2 kat daha yüksek calvaria-kuyruk oranı (Şekil 4F).
Şekil 3. Otogreft İmplantasyonu kolaylaştırır Anjiyogenez. Kalvaryum kusurlar farelerde oluşturulmuştur. Hayvanların yarısı allograftlar uygulanmıştır ve diğer yarısı Otogreft aldı.farenin 7 gün ameliyattan sonra polimerizasyon kontrast madde ile perfüze edildi. Kalvarial bölgesi izole edildi ve örnekleri dekalsifiye edildi ve uCT tarayıcı kullanılarak görüntülendi. Bir hacimsel kalınlık haritası IPL yazılımı kullanılarak oluşturulan (A, n = 3, barlar ± SES temsil etmekte ve yıldızlar P değeri <0.05 belirtiniz) oldu. Fareler 6 gün ameliyattan sonra bir flüoresan kan yoluyla prob ile enjekte edilmiştir. 24 saat sonra hayvanlar FLI tabi tutuldu ve kantitatif analizi yapıldı (B, n = 5, barlar ± SE temsil etmekte ve yıldızlar P değeri <0.05 belirtiniz). Bir uCT merkezli damar analizi yapılmıştır 14 (C) ve 28 (D) gün ameliyattan sonra.: (C ve D n = 3, barlar ± SE temsil etmekte ve yıldızlar P değeri <0.05 belirtiniz) bir büyük görmek için tıklayınız A.Ş.Bu rakamın rsion.
Bir otogreftin Şekil 4. implantasyonu bir Allogreft. Fare fazlası Osteogenezis Daha İmplantasyonu kalvaryal otogreftler veya allogreft implant aldı arttırır. Farenin sonra 6 gün ameliyattan sonra, IV enjeksiyonu olarak, bir hidroksiapatit hedefli bir prob ile enjekte edilmiştir. 24 saat sonra FLI ve nitel analiz in vivo uCT analizi 56 gün ameliyattan sonra yapıldı. (A, n = 5, barlar ± SES temsil etmekte ve yıldızlar P değeri <0.05 belirtiniz) yapıldı ve ilgi silindirik hacim ile işaretlenmiş turuncu (B) tanımlanmıştır. Kemik hacmi (C) ve greft kalınlığı (D) (8, barlar ± SES temsil n = ve yıldız P değeri <0.05 belirtiniz) ölçüldü lusiferaz dri ifade .Transgenic farelerosteokalsin organizatörü tarafından ven allogrefleri veya otogreft verildi. BLI Ameliyattan 10 gün (E) sonra ve ek belirlenmiş zaman noktalarında uygulandı. Ekspresyon düzeyi (n = 8, barlar ± SES temsil etmekte ve yıldızlar P değeri <0.05 göstermektedir F) farelerde arasında değişir çünkü kalvarial bölgede ölçülen sinyal. Normalize oldu bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan multimodal görüntüleme yaklaşımlarının amacı kafatası kemik grefti bağlamında anjiyogenez-osteogenesis ekseninin titiz bir soruşturma sağlamaktır. Neovaskülarizasyon tüm kranial kusur besleyen damar ağacın doğru yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu gösteri izin uCT protokolü kullanılarak görüntülendi. uCT veriler kolayca gibi IPL yazılımı gibi gelişmiş araçlar kullanılarak analiz edilebilir. Örneğin, Şekil 3C'de gösterildiği kalınlık analizi kraniyal otogreft ve allogreft arasındaki temel farklar, 0.1 kan arteriyoller 10 karakterize çapı 0,08 mm arasında değişen damarlarda olduğunu ortaya koymuştur. Bu sonuç, uzun kemik modelinde 11 gerçekleştirilen çalışmalarla uyumludur. Bu 0.02mm çapında en dar tespit edilebilir kaplar tam olarak bağlı radyo-opak maddenin viskozitesine döküm olmadığı not edilmelidir. Bu yöntemin ana dezavantajı gerektirir gerçektirhayvanın ötenazi ve böylece boyuna görüntüleme imkansızdır. Birçok radyo-opak sondalar in vivo vasküler uCT görüntüleme için kullanılabilir; Bununla birlikte, bu, radyo-opak yoğun polimerizasyon prob olarak değildir ve resim çözünürlüğü burada 12 tasvir ex vivo yöntem ile sağlanan uygun değildir. uCT çözünürlüğü sınırlıdır ve örneğin, kan kılcal damarları incelemek için yararlı olmayacaktır. Bir usta eliyle destekli Bunun dışında bu yöntem ayrıntılı olarak kemik damarsal incelemek için tekrarlanabilir teknik sunmaktadır.
Tasvir protokoller biri kritik bir adım kusur konumu (adım 2.7) belirlenmesidir. Lambdoid sütür yaralanması masif kanamaya yol açacaktır. Kalvarial kusur delerken, bakım ast duramateri ve superior sagittal sinüs bozmak için değil alınmalıdır. Sol ventrikül içine kelebek iğne Son sokma hassas bir prosedür (adım 3.4) 'dir. İğne ekleme iseed sağ ventrikül içine kontrast madde akciğerlere serpmek ve calvaria zayıf perfüzyon neden damarlar geçmek. İğne çok derine takılırsa, o arka kalp duvarı delmek olacak; İğne yeteri kadar takılı değilse ve kolayca kalp uzak gözyaşı olabilir. Eğer perfüzyon engel olabilecek iğne konumunu yeniden ayarlamak için çalışmayın. Yöntem mevcut floresan problar bir dizi kullanarak modifiye edilebilir; İntegrin-α 3 β v -targeted prob katepsin K hedefli prob osteoklast aktivitesi ölçmek için kullanılabilir iken, yeni oluşan kan damarlarını vurgulamak için kullanılabilir.
Bizim hipotezi ile uygun olarak, kalvaryal otogreftleri allogreft daha yüksek bir osteojenik potansiyeline sahip olduğu görülmüştür. Bu da uzun kemikler için 13 doğrudur ve çeşitli faktörlere bağlı olabilir. İlk olarak, otogreft greft boyunca kemik matriks üreten kemik yapıcı hücreleri içerirYüzey, mineralizasyon yönettiği FLI (Şekil 4A) üzerine kanıtladığı gibi; Allogreftlerden ise sadece kusur kenarlarında kıt kemik oluşumunu teşvik. İkinci olarak, osteokalsin-luc farelerin BLI allograft hazırlama işleminin (Şekil 4F) çıkarılır büyüme faktörlerinin varlığı ile açıklanabilir otogreft grubu, daha osteojenik aktivitesi saptandı. İlginçtir, kemik mineralizasyonu hidroksiapatit hedefli sonda uygulandı Gün 6 ve 7, de anlamlı derecede yüksek olduğu, ve BLI aktivitesi ile temsil edilen hücre farklılaşması Biz bundan çıkarabileceği Gün 7 ve 10 arasında Gün, daha sonra açıktı daha kapsamlı olduğunu Kemik mineralizasyonu en azından kısmen otolog kemik grefti karakterize olumlu damarsal ile açıklanabilir.
Bizim sonuçlarımız otogreft üstün osteojenik kapasiteye sahip olduğunu gösterir; Ancak, tek bir otojen kemik grefti birkaç dra olduğu dikkate almalıdırwbacks. Kemik hasat hacminde sınırlıdır ve donör saha 14-16 morbidite gerektirir. Buna ek olarak, kemik erimesinin otogreft insidansı 17-19 göz ardı edilemez. Allogreftlerde yüksek oranda kullanılabilir ve klinisyen için bir off-the-raf çözüm sunmak. Çeşitli çalışmalar kranyal allogreftlerin osteo-entegrasyon adjuvan tedavilere BMP2 kodlayan adeno bağlantılı virüs 20,21 ile allogreft kaplama böyle intermitan paratiroid tedavi 22 olarak değişen farklı araçlar ile artırılabilir nasıl göstermiştir. Kemik ile birleştirme allogreft yeteneği mükemmel bir kez Sonunda, allogreft tercih aşılama malzemesi haline gelecektir.
Bu sonuçların ışığında, özel bir ilgi kemik rejenerasyonu yerinde neovaskülarizasyon modüle nasıl söz konusu bulunmaktadır. Şekillendirme kan damarları sızan ve bir fonksiyonel formu yok gibi aşırı ifadesi VEGF doğrudan yaklaşım verimsiz bulundu23,24 net Önal. İlginç bir şekilde, BMP sinyal transdüksiyon damar 25,26 hedeflenmiş oluşumuna neden olduğunu bulunmuştur. Ayrıca, farmasötik maddeler 11 ve hücre tedavisi 27 kemik grefti yakınlık anjiyojenez şablonlarını değiştirmek gösterilmiştir; Her iki kafatası kemik defekti iyileşmesini geliştirmek için mevcut umut verici stratejiler yaklaşır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
