Summary
Implantation de greffons osseux autologues et allogéniques constituent accepté approches pour traiter importante perte osseuse cranio-facial. Pourtant, l'effet de la composition de greffe sur l'interaction entre la néovascularisation, la différenciation cellulaire et la formation osseuse est claire. Nous présentons un protocole d'imagerie multimodale visant à élucider l'interdépendance angiogenèse ostéogenèse à la proximité de la greffe.
Abstract
Un paramètre important qui détermine le succès d'une procédure de greffe osseuse est la vascularisation de la zone entourant la greffe. Nous émettons l'hypothèse que l'implantation d'une autogreffe osseuse induirait une plus grande régénération osseuse par abondante formation de vaisseaux sanguins. Pour étudier l'effet de la greffe sur la néovascularisation au site du défaut, nous avons développé une tomographie (μCT) approche micro-calculée pour caractériser nouvellement former des vaisseaux sanguins, ce qui implique la perfusion systémique de l'animal avec un agent de contraste de polymérisation. Cette méthode permet une analyse détaillée vasculaire d'un organe dans son intégralité. De plus, la perfusion sanguine a été évaluée en utilisant l'imagerie de fluorescence (FLI) d'un agent fluorescent par le sang. La formation osseuse a été quantifiée par FLI utilisant une sonde d'hydroxyapatite ciblée et analyse μCT. Recrutement de cellules souches a été suivie par l'imagerie par bioluminescence (BLI) de souris transgéniques qui expriment la luciférase sous le contrôle du promoteur de l'ostéocalcine.Ici nous décrire et démontrer la préparation de l'allogreffe, la chirurgie des défauts crânienne, les protocoles de numérisation μCT pour l'étude de la néovascularisation et l'analyse de la formation osseuse (y compris la perfusion in vivo de l'agent de contraste), et le protocole d'analyse des données.
La 3D analyse à haute résolution de la vascularisation démontré significativement plus angiogenèse chez les animaux avec des autogreffes implantés, en particulier en ce qui concerne la formation de l'artériole. En conséquence, la perfusion sanguine était significativement plus élevée dans le groupe d'autogreffe par la 7 ème jour après la chirurgie. Nous avons observé la minéralisation osseuse supérieure et une plus grande mesure la formation osseuse chez les animaux qui ont reçu des autogreffes. Autogreffe implantation résident induit le recrutement de cellules souches à la suture de la greffe osseuse-hôte, où les cellules différenciées en cellules osseuses formant entre le 7 e et 10 e jour postopératoire. Cette constatation signifie que le renforcement de la formation osseuse peut être attribuée àl'alimentation vasculaire augmentée qui caractérise autogreffe implantation. Les procédés décrits peuvent servir d'outil optimal pour étudier la régénération osseuse en termes de formation osseuse étroitement délimitée et la néovascularisation.
Introduction
Craniofaciale perte osseuse due à un traumatisme, résection de la tumeur, craniotomie de décompression, et malformation congénitale guérit rarement par elle-même et présente un besoin clinique non satisfait clair. Greffes osseuses autologues et allogéniques greffes osseuses sont largement utilisés pour traiter ces conditions 1.
Il est largement admis que l'ostéogenèse est étroitement couplé à l'angiogenèse 2,3. Ainsi, l'étude complète d'une thérapie proposée pour la régénération osseuse devrait inclure une enquête approfondie de l'arbre vasculaire de formation à travers le site du défaut entier. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour caractériser la vascularisation dans les modèles de recherche. L'arbre vasculaire peut être étudiée par l'analyse histologique. Depuis l'histologie repose sur le tissu de sectionnement, il ya une forte probabilité que l'image résultante sera déformée. Pour résoudre ce problème, la microscopie intravitale peut être effectuée à des vaisseaux sanguins intacts d'image 4; toutefois, cette méthode estlimité à une formation d'image plan. μCT balayage d'échantillons obtenus à partir d'un animal perfusé avec un agent de contraste permet l'imagerie 3D du réseau vasculaire qui alimente le site de régénération 5. Cette approche permet une démonstration très détaillée de la vasculature un organe dans son ensemble, ainsi que d'une analyse minutieuse de la distribution des vaisseaux sanguins. En outre, μCT permet la différenciation entre les diamètres variés des vaisseaux sanguins, qui caractérisent les différents sous-types de vaisseaux sanguins.
Nous émettons l'hypothèse que l'implantation d'une autogreffe crânienne va induire une plus grande néovascularisation que l'implantation d'une allogreffe, et cette néovascularisation accrue entraînera, à son tour, à l'os amélioré formation.To poursuivre cette hypothèse, nous avons utilisé une variété de techniques. Nous avons étudié les modèles de l'arbre vasculaire nouvellement formé en effectuant une analyse comparative-μCT. Nous avons mesuré la perfusion sanguine en utilisant une sonde fluorescente sang-piscine. Ensuite, nous ânessed minéralisation du tissu osseux par FLI d'une sonde d'hydroxyapatite dirigée et l'analyse μCT. Enfin, nous avons suivi le recrutement de cellules souches et la différenciation, d'effectuer BLI chez des souris transgéniques dans lesquelles la luciférase est exprimée dans des cellules d'ostéocalcine positif.
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Protocol
Le protocole suit les lignes directrices de la protection des animaux et l'utilisation comité (IACUC) de l'Université hébraïque de Jérusalem, en Israël, une installation de approuvée AAALAC (Requête n ° MD-12-13524-4), et par les Cedars-Sinai Medical Center IACUC (demande n o 3770). Les animaux ont été traités dans le strict respect des directives du NIH.
1. Préparation des allogreffes
- Euthanasier 7 à 8 semaines d'âge des souris Balb / C, ou de toute souche différente du receveur, en utilisant la méthode standard de CO 2 inhalation ou injection intrapéritonéale de 50 ul phénobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confirmer l'absence d'un battement de coeur et d'effectuer dislocation cervicale. Alternativement, récolter les allogreffes à partir de carcasses qui ont été conservés dans -20 ° C et décongelés avant la récolte.
- Rasez la région crânienne en utilisant une tondeuse à cheveux, en l'appliquant contre la direction de la croissance des cheveux. Désinfectez la tête de la carcasse en appliquant 70% isopropanol. Couper la peau du cuir chevelu à l'aide d'un scalpel n ° 11 et enlever le périoste.
- Utiliser une fraise de dentiste et d'un diamètre intérieur de 4,5 mm trépan, détacher un fragment circulaire d'os crânienne. Transférer le fragment d'os dans un plat en plastique de 100 mm contenant une solution saline stérile. À ce stade, d'observer du sang et des tissus mous attaché au fragment d'os (figure 1A). Obtenir des fragments d'os de cette manière à partir de 22 donneurs.
- Maintenez un fragment d'os à la fois en utilisant des pinces courbes. Badigeonner soigneusement à l'aide de coton-tige et enlever tout tissu du cerveau, des tissus mous, et le sang (figure 1B). Couper délicatement pour enlever des éclats d'os qui restent attachés à la greffe à l'aide de ciseaux fins sorte que la greffe aura une forme parfaite arrondie.
- Tremper chaque greffon, une fois dans un tube de 15 ml contenant 70% d'éthanol et deux fois dans 15 ml de solution saline contenant des tubes tamponnée au phosphate pour laver l'éthanol.
- Geler les allogreffes dans un réfrigérateur C -80 ° dans des cryotubes pour aumoins 1 semaine. À ce stade, assurez-vous que les allogreffes apparaissent transparent (figure 1C).
2. Défaut de chirurgie crânienne
- Pour les bénéficiaires utiliser des souris transgéniques qui expriment la luciférase sous le contrôle du promoteur de l'ostéocalcine 6.
- Stériliser les pointes des outils chirurgicaux à l'aide d'un cordon chauffant en verre pendant 30 secondes. Transférer les outils pour un pot contenant 70% d'isopropanol pour maintenir des conditions stériles. Utilisez des gants stériles.
- Anesthésier un 7 à 8 semaines d'âge souris femelle par injection intraperitoneale d'un mélange ketamine- de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement). Pincez la branche animale pour vous assurer qu'il est profondément anesthésié. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
- Rasez la région crânienne en utilisant une tondeuse à cheveux en l'appliquant contre la direction de la croissance des cheveux. Appliquer la crème d'épilation pour enlever les restes de fourrure et essuyez-AFTEr pas plus de 2 minutes en utilisant de la gaze sèche suivie de gaze imbibée de solution saline. Des précautions doivent être prises pour éviter de tomber dans les yeux. Alternativement, la pommade vétérinaire de l'œil peut être appliqué avant l'épilation comme une couche supplémentaire de protection pour les yeux. Il est impératif que toutes les traces de la crème dépilatoire être enlevés afin d'éviter l'irritation possible d'une exposition excessive à l'agent chimique. Désinfecter le cuir chevelu en appliquant 5% de chlorhexidine (figure 1D).
- Injecter par voie sous- cutanée à 5 mg / kg carprofène dilué dans 200 ul de solution saline. Appliquer vétérinaire pommade oculaire pour prévenir la sécheresse et de garder l'animal sur un pad thermique à tout moment. Placez l'animal dans les jumelles d'exploitation.
- Faire un 1 cm de long taille ovale dans la peau du cuir chevelu à l'aide de ciseaux fins et une pince à épiler (figure 1E). Maintenez le périoste avec des pincettes courbes et couper avec des ciseaux fins.
- Percer le crânienne défaut 2 mm en avant de la suture lambdoïde en utilisant une fraise de dentiste unend un trépan de diamètre externe de 5 mm (figure 1F et G). Pour éviter la pénétration de la dure-mère, forer trois-quarts du chemin dans l'os et détacher le fragment d'os à l'aide d'une spatule.
- Pour implanter une autogreffe, récupérer le fragment d'os et de le laver dans une plaque de plastique de 10 mm contenant 10 ml de solution saline stérile pour enlever les débris. Ne retirez pas les tissus mous. Pour implanter une allogreffe, dégel à l'avance une allogreffe et de normaliser à RT, puis laver.
- Placez la greffe osseuse dans le défaut en utilisant des pinces courbes afin de ne pas toucher les marges de défauts (Figure 1H). Coller le greffon à l'os hôte en utilisant du gel de fibrine (5 ul de 46 mg / ml de fibrinogène mélangés avec 5 pl de 25 UI / ml de thrombine).
- Suturer la peau en utilisant 4-0 vicryl (Figure 1I). Appliquer povidone-iode à la coupe chirurgicale. Des précautions doivent être prises pour éviter la contamination de la suture par la fourrure. Mark l'oreille de la souris et injecter 0,25 mg / kg Antisedan to inverser l'effet anesthésiant de la médétomidine.
- Si l'animal ne se réveille en 10 min, assurez-vous qu'il est situé sur un tampon réchauffé. Injecter 200 ul de solution saline stérile, et si nécessaire injecter 0,1 mg / kg Antisedan. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
- Gardez les animaux dans des cages séparées pour une semaine pour les empêcher d'ouvrir les points de suture. Placez la souris chow trempées dans l'eau dans une boîte de Pétri sur le sol de la cage pour un post-op quelques jours. Injecter par voie sous cutanée 200 pi de 1 mg / ml solution Carprofène dilué dans une solution saline stérile une fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour traiter la douleur post-chirurgicale.
Figure 1. Préparation et crânienne allogreffe Défaut chirurgie crânienne. Le fragment d'os est isolé de la région crânienne (A). Mouchoir doux, La moelle osseuse et le sang sont tamponnées (B), et le greffage est rincé dans de l'éthanol à 70% suivie par deux lavages dans une solution saline tamponnée au phosphate (C, AG = allogreffe). La souris receveuse est préparé pour la chirurgie par le rasage et désinfection de la peau dans la région crânienne (D). Une coupe ovale est créée dans la peau du cuir chevelu, et le périoste est éliminé (E). Ensuite, le défaut crânienne est foré au moyen d'un trépan 5 mm de diamètre (F). Le fragment d'os est détachée à l'aide d'une spatule en forme de cuillère, en laissant le sinus sagittal supérieur intact (G). L'allogreffe est ensuite placé dans le défaut et sécurisé à l'aide gel de fibrine (H). Enfin, la peau est suturée (I). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
3. Micro-tomodensitométrie pour la caractérisation desl'arbre vasculaire
- Préparer une solution saline héparinée. Poids 2000 de l'héparine de sodium U et le placer dans le tube 50ml en plastique. Ajouter 20 ml de solution saline et bien agiter le tube. Remplissez un 20-ml verrouillage seringue Luer avec 15 ml de solution saline chauffée héparine et connecter la seringue à un 23-G ensemble du cuir chevelu veine. Fixez la seringue à une pompe seringue, et le mettre à la pompe de 10 ml à 1 ml / min.
- Sedate une souris en utilisant une injection intraperitoneale de 50 ul phénobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Pincez le membre de l'animal pour vous assurer qu'il est profondément sous sédation. Fixer la souris sur son dos à un conseil de fixation enveloppé avec un revêtement de surface absorbante (figure 2A). Placer la souris fixé dans une hotte de laboratoire pour empêcher l'exposition du personnel à des fumées.
- Couper la peau de l'abdomen à l'aide de ciseaux fins cou et une pince à épiler (figure 2B). Couper la paroi abdominale jusqu'à la pointe du sternum (figure 2C). Couper la cage thoracique le long de sa face latérale. Éviter de blesser les poumons uned cœur, et assurez-vous que le cœur est pleinement exposé. Utilisez une pince hémostatique pour rétracter le sternum (figure 2D).
- Insérez l'aiguille papillon 3 mm dans le ventricule gauche (figure 2E). Collez l'aiguille vers la paroi du coeur et la poitrine avec de la colle 3-sec (figure 2F).
- Activer immédiatement la pompe. Après une minute, disséquer la veine cave inférieure, afin de dépressuriser le système vasculaire (figure 2G). Inclinez le conseil afin que les liquides iront loin de la tête. Perfusion succès se traduira par compensation le foie et les vaisseaux sanguins.
- Lorsque la solution saline perfusion héparine est terminée, perfuser 10 ml de 4% de formaldéhyde. Éviter la pénétration de bulles d'air dans le système vasculaire et éviter l'exposition à des vapeurs de formaldéhyde. Le succès formaldéhyde perfusion se traduira par raidissement de la queue. Rincez le formaldéhyde avec 10 ml de sérum physiologique hépariné.
- Préparer l'agent de contraste radio-opaque selon manufactinstructions de rier. En règle générale, il faudra mélange du composé, un diluant, et un agent de durcissement. Utilisez pipettes sérologiques et mélanger la solution dans un tube en plastique de 15 ml.
- Perfuser l'animal avec le mélange d'agent de contraste à un débit de 1 ml / min. Observez les vaisseaux sanguins coronaires, intestinaux et hépatiques et assurez-vous qu'ils se tournent jaune après perfusion de 2 - 3 ml, indiquant perfusion succès (Figure 2H). À la fin de la perfusion, couper le tube de l'aiguille de papillon, d'obtenir la carcasse seul et l'envelopper avec du papier toilette pour empêcher la fuite de la solution à la région crânienne. Autoriser polymérisation dans 4 ° CO / N.
- Disséquer la région crânienne (Figure 2I); Première utiliser un scalpel pour couper la peau comme latéral que possible, en évitant d'endommager la région crânienne d'intérêt. Localisez la greffe osseuse et ensuite utiliser des ciseaux fins pour couper l'os crânien de 10 mm de la greffe.
- Scannez le Calv isolééchantillon d'os arial aide d'un scanner μCT; définir le champ de vision à 20,5 mm, l'énergie des rayons X de 55 kV, l'intensité de 145 pA, en utilisant 1.000 projections par 360 ° et temps d'intégration de 200 ms. Réglez les paramètres μCT 7 à l'image d'autres modèles de défaut osseux.
- Respecter les tranches 2D reconstruite qui ont été générés par le logiciel μCT. Assurez-vous de balayer la région d'intérêt est correctement et puis recherchez le défaut crânienne. Évaluer la qualité de la perfusion. Après une identification réussie de vaisseaux sanguins (Figure 2J), poursuivre et détartrer l'échantillon en utilisant 6% acide trichloroacétique (TCA) dilué dans de l'eau distillée deux fois (DDW).
- Réanalyser l'échantillon en utilisant les paramètres indiqués dans la section 3.10. Localisez la suture lambdoïde dans les tranches 2D reconstruits. Définir un volume cylindrique d'intérêt (VOI) en hauteur de 2 mm et 8 mm de diamètre, qui est tangente à la suture - ce qui est le site anatomique de défaut.
- E sectorielse tissus osseux de tissus mous en utilisant une procédure globale de seuil; définir le seuil inférieur à 130, et appliquer un filtre gaussien contrainte 3D (sigma [σ] = 2.0 et support = 2) pour supprimer partiellement bruit dans les volumes. Générer une reconstruction 3D et assurez-vous que le VOI est correctement positionné (Figure 2K).
- Générer une carte d'épaisseur en utilisant le logiciel IPL et la fonction "dt_object_param" (Figure 2L).
Remarque: Cette fonction décrit le volume de la cuve pour chaque diamètre du vaisseau.
Figure 2. Perfusion utilisant un agent radio-opaque par l'intermédiaire de l'approche cardiaque. La souris est apposé sur le conseil de fixation (A), et la peau est découpée le long de l'abdomen jusqu'au cou (B). La paroi abdominale est coupée le long de la ligne médiane à la procé xiphoidSS (C), et la cage thoracique est coupée latéralement (D). Une aiguille de papillon est inséré dans le ventricule gauche, ce qui évite l'insertion dans le ventricule droit, qui est nettement plus foncé (E, le ventricule droit est indiquée par la ligne en pointillé blanc), et l'aiguille est fixée à la paroi du coeur et de la poitrine (F) . Une solution saline héparinée (3.2 ml) est pompé dans le cœur, et la veine cave inférieure est disséqué (G, flèche blanche indique la veine cave inférieure). Formaldéhyde (4%) est perfusé et lavé; ceci est suivi par une perfusion d'agent de contraste radio-opaque jaune teints. Perfusion succès sera évident par apurement des vaisseaux sanguins, qui changent de couleur au jaune (H). Après polymérisation, la région crânienne est isolé (I, AG = allogreffe) et imagée en utilisant un scanner de μCT pour confirmer perfusion appropriée (J, le volume d'intérêt est marqué à l'orange). lel'échantillon est adoucie et réanalysés (K), suivie par la production d'une carte d'épaisseur de couleur (L). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4. imagerie de fluorescence de la minéralisation osseuse et le sang de perfusion
- Reconstituer sondes à une concentration de 2 nmol / 100 ul de PBS dans un tube de 1,5 ml (en utilisant une sonde fluorescente bisphosphonate conjugué à surveiller la minéralisation osseuse et d'un agent fluorescent par le sang afin de mesurer la perfusion sanguine). Pipeter doucement plusieurs fois pour assurer la dissolution homogène de la sonde.
- 24 heures avant la séance d'imagerie désigné prendre une image temps zéro; anesthésier 3 souris à l'aide de 2 L / min inhalation de 100% d'oxygène de qualité médicale complété avec 3% d'isoflurane dans une chambre d'induction. Après anesthésie appropriée a été établie, l'isoflurane abaisser la concentration de 1,5% - 2%.
- Appliquer vétérinaire pommade oculaire pour prévenir la sécheresse et assurez-pad thermique est allumé en tout temps. Pincez la branche animale pour vous assurer qu'il est profondément anesthésié. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
- Rasez la région crânienne en utilisant une tondeuse à cheveux de l'appliquer contre la direction de la croissance des cheveux. Retirer les restes de fourrure utilisant la crème dépilatoire. Tous les restes de fourrure va interférer avec l'imagerie optique. Retirer les sutures à l'aide de ciseaux fins et pincettes.
- Placez trois animaux sur la scène IVIS chauffé à 37 ° C pour chaque session d'imagerie. Réglez le temps d'exposition à l'auto, voir champ à C, et ajuster les filtres. Par exemple, pour une sonde fluorescente bisphosphonate conjugué caractérisé avec une excitation maximale à la longueur d'onde de lumière de 680 nm, utiliser un filtre d'excitation de 675 nm et un filtre d'émission de Cy5.5 . De même, lorsque vous utilisez un agent fluorescent par le sang, avec un pic d'excitation à 750 nm de longueur d'onde de lumièreutiliser un filtre d'excitation de 710 nm et un filtre d'émission de 780 nm.
- L'image de la souris à travers Vivre logiciel d'image en appuyant sur le bouton "Acquérir". Assurez-vous que la région crânienne est complètement visible (figure 3B) Pour un guide complet conseiller Lim et al 2009 8.
- Autoriser les souris se réveillent à l'inhalation de 100% d'oxygène.
- Injecter la sonde fluorescente 2 nmol via une injection intraveineuse de queue. Lors de la session de formation d'image désigné, effectuer l'imagerie comme décrit ci-dessus.
5. Micro-tomodensitométrie pour la régénération osseuse
- Pour la quantification de la formation osseuse, anesthésier les souris par inhalation de 3% d'isoflurane, comme représenté à l'étape 4,2 - 4,3. Transférer la souris pour la vitre du scanner μCT, et placez-le dans le scanner.
- Réglez le tube à rayons X énergie potentielle du scanner μCT à 55 kV et une intensité de 145 pA de résolution moyenne. L'utilisation d'un champ de vision de 20,5 mm, effectuerun éclaireur (simple x-ray) analyse et définir une région d'intérêt étendant aux yeux de la souris à l'arrière de son crâne. Effectuez un balayage de CT, en utilisant 1.000 projections par 360 ° et temps d'intégration de 200 ms.
- Reconstruire les tranches 2D à l'aide une résolution spatiale nominale de 20 um. Alignez les marges de défauts à une position normalisé en utilisant un logiciel μCT 9.
- Similaire à l'étape 3.20, définir un volume cylindrique d'intérêt et appliquer le filtre gaussien 3D contrainte (σ = 0,8 et support = 1) pour supprimer partiellement bruit dans les volumes. Le segment de tissu osseux de tissus mous en utilisant une procédure globale de seuil.
- Déterminer le volume de tissu osseux minéralisé dans le volume d'intérêt.
6. La bioluminescence imagerie des cellules souches et différenciation Recrutement
- Préparer la souris pour l'imagerie comme décrit dans les sections 4,2-4,4 et réveiller les souris par inhalation de 100% d'oxygène.
- Administrer 126 mg / kg luciférine de coléoptère à chaque souris par injection intraperitoneale, et retourner de l'animal à la chambre d'induction. Après 2 min, anesthésier l'animal en utilisant 3% d'isoflurane. Placez la souris sur l'IVIS réchauffés scène.
- Via Vivre logiciel d'image, réglez le temps d'exposition à "auto", et le champ de vision à C. image de la souris 5 minutes après l'administration de la luciférine. Image les animaux comme représenté à l'étape 4.6, en utilisant le "bioluminescence" modalité définir des régions d'intérêt parce que l'expression du transgène varie entre souris. Normaliser le signal crânienne à la queue.
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Representative Results
La néovascularisation a été évaluée par analyse volumétrique par FLI μCT et en utilisant un agent transmissible par le sang fluorescent à quantifier la perfusion sanguine. Sept jours après la chirurgie, μCT balayage a démontré un volume sensiblement plus élevé de vaisseaux sanguins de petite et moyenne en diamètre souris qui avaient reçu des autogreffes que chez les souris qui avaient reçu des allogreffes récoltées à partir de souris C57BL / 6 (figure 3A). Fait intéressant, dans le groupe autogreffe l'arbre vasculaire nouvellement formé est apparu à atteindre l'ensemble de la zone de défaut, alors que dans le groupe d'allogreffe vaisseaux sanguins semblent pénétrer le site du défaut à partir des bords et prolongées vers l'intérieur que dans une mesure limitée. Le FLI soutenu cette observation, montrant nettement plus élevé perfusion sanguine chez les animaux de autogreffe-traitée (figure 3B). Par la 14 ème jour, dans le groupe d'allogreffe l'arbre vasculaire atteint tout de la proximité de la greffe, mais volume de l'enceinte est significativement plus faible sont comparéspour le groupe autogreffe dans la plupart des diamètres de vaisseaux que nous avons examiné (figure 3C). Remarque: les différences de volume de la cuve étaient plus important lorsque les navires avec des diamètres 0.08- à 0,1 mm ont été comparés. Vingt-huit jours après une intervention chirurgicale du volume de système vasculaire est retourné à l'état initial (figure 3D).
Sept jours après la chirurgie, FLI effectuée en utilisant la sonde d'hydroxyapatite dirigée montré significativement plus élevée de la minéralisation osseuse dans le groupe autogreffe (figure 4A). En ce moment, l'os avait formé tout au long de la proximité de la greffe chez les animaux autogreffe-implanté. En revanche, les os chez les souris allogreffe implantée avait formé uniquement sur les marges de défauts et a été marquée par une forme d'anneau. Les volumes de la formation osseuse ont été quantifiés 56 jours après la chirurgie, à la fin du point du processus de régénération, en effectuant une analyse μCT (figure 4B). Volume osseux était significativement plus élevé (figure 4C) et du greffon thickness significativement plus élevée chez les animaux qui ont reçu des autogreffes (Figure 4D). BLI a été utilisée dans les souris transgéniques ostéocalcine-luciférase pour surveiller le recrutement de cellules souches et la différenciation vers la lignée ostéoblastique (figure 4E). Chez les souris implantées avec des allogreffes, le signal de pic BLI 4 - 7 jours après la chirurgie, lorsque le signal mesuré à la calotte crânienne a été 15 fois supérieure à celle mesurée à la queue. Chez les souris autogreffe-implanté, le signal BLI a culminé un peu plus tard, 7 - 10 jours après la chirurgie, et était significativement plus élevée, atteignant un 2 fois calvaria-à-queue ratio supérieur (Figure 4F).
Figure 3. défauts autogreffe Implantation Facilite angiogenèse. Crânienne ont été créés chez la souris. La moitié des animaux ont reçu des allogreffes les et l'autre moitié a reçu des autogreffes. leles souris ont été perfusées avec un agent de contraste de polymérisation de 7 jours après la chirurgie. La région crânienne a été isolé, et les échantillons ont été adoucie et imagée en utilisant un scanner de μCT. Une carte de l'épaisseur volumétrique a été généré en utilisant un logiciel IPL (A, n = 3, barres représentent ± SE, et les astérisques indiquent P valeur <0,05). Les souris ont été injectées avec une sonde par le sang fluorescent 6 jours après la chirurgie. 24 heures plus tard, les animaux ont été soumis à FLI et une analyse quantitative a été réalisée (B, n = 5, barres représentent ± SE, et les astérisques indiquent P valeur <0,05). Une analyse vasculaire basé μCT a été réalisée 14 (C) et 28 (D) jours après la chirurgie (C et D: n = 3, barres représentent ± SE, et les astérisques indiquent P valeur <0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 4. Implantation d'une autogreffe Favorise Plus ostéogenèse Than Implantation d'une allogreffe. Les souris ont reçu des implants de autogreffes ou allogreffes la voûte du crâne. Les souris ont ensuite été injecté avec une sonde d'hydroxyapatite ciblée par injection IV 6 jours après la chirurgie. 24 h plus tard FLI et une analyse qualitative ont été effectuées (A, n = 5, barres représentent ± SE, et les astérisques indiquent P valeur <0,05). L'analyse in vivo μCT a été effectué 56 jours après la chirurgie, et un volume cylindrique d'intérêt marqués avec orange a été défini (B). Volume osseux (C) et l'épaisseur de la greffe (D) ont été quantifiés (n = 8, barres représentent ± SE, et les astérisques indiquent valeur <0,05 P) .Transgenic souris exprimant la luciférase driême par le promoteur de l'ostéocalcine ont reçu des allogreffes ou des autogreffes. BLI a été effectué 10 jours après la chirurgie (E) ainsi que des points supplémentaires de temps désignés. Le signal mesuré à la région crânienne a été normalisée parce que le niveau d'expression varie selon les souris (F, n = 8, barres représentent ± SE, et les astérisques indiquent P valeur <0,05). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le but de l'approche de l'imagerie multimodales décrits ici est de permettre minutieux enquête de l'axe angiogenèse ostéogenèse dans le cadre de la greffe osseuse du crâne. Néovascularisation a été imagée en utilisant un protocole de μCT, ce qui a permis une haute résolution de démonstration 3D précise de l'arbre vasculaire alimentant l'ensemble du défaut crânien. μCT données peuvent être facilement analysés en utilisant des outils avancés tels que les logiciels IPL. Par exemple, l'analyse de l'épaisseur représentée sur la figure 3C a révélé que les principales différences entre autogreffe et allogreffe crânienne sont dans des récipients allant de 0,1 à 0,08 mm de diamètre, qui caractérise les artérioles de sang 10. Ce résultat est cohérent avec les études effectuées dans le modèle 11 d'os long. Il convient de noter que les vaisseaux étroits détectables de 0,02 mm de diamètre ne sont pas complètement coulés en raison de la viscosité de l'agent radio-opaque. Le principal inconvénient de cette méthode réside dans le fait qu'elle comporteeuthanasie de l'animal, et l'imagerie ainsi longitudinale est impossible. Plusieurs sondes radio-opaques sont disponibles pour l'imagerie in vivo dans μCT vasculaire; cependant, ils ne sont pas aussi radio-opaque que la sonde de polymérisation dense, et la résolution de l'image ne remplit pas cette condition par la méthode ex vivo représenté ici 12. μCT résolution est limitée et ne sera pas utile d'étudier les capillaires sanguins, par exemple. Autre que cela, aidé par une main habile cette méthode offre une technique reproductible pour étudier la vascularisation de l'os en détail.
Une étape critique dans les protocoles décrits est la détermination de l'emplacement du défaut (étape 2.7). Blessure à la suture lambdoïde va conduire à une hémorragie massive. Lors du forage de l'anomalie crânienne, il faut prendre soin de ne pas perturber la dure-mère sous-fifre et le sinus longitudinal supérieur. Enfin, l'insertion de l'aiguille à ailettes dans le ventricule gauche est une procédure délicate (étape 3.4). Si l'aiguille est inserted dans le ventricule droit, l'agent de contraste sera perfuser les poumons et de passer à des veines, conduisant à une mauvaise perfusion de la voûte du crâne. Si l'aiguille est insérée trop profond, il sera perforer la paroi cardiaque postérieure; et si l'aiguille est pas inséré assez loin, il peut facilement arracher le cœur. Ne tentez pas de réajuster la position de l'aiguille comme vous pouvez interférer avec la perfusion. La méthode peut être modifiée à l'aide d'un ensemble de sondes fluorescentes disponibles; Intégrine α-β 3 v sonde -targeted peut être utilisée pour souligner les vaisseaux sanguins nouvellement formés, tandis que la sonde cathepsine K-ciblée peut être utilisée pour quantifier l'activité des ostéoclastes.
Conformément à notre hypothèse, nous avons observé que les autogreffes crânienne ont un potentiel ostéogénique plus élevé que les allogreffes. Cela est vrai pour les os longs ainsi 13 et peut être attribuée à plusieurs facteurs. Tout d'abord, l'autogreffe osseuse contient des cellules formant matrice, qui produisent de l'os à travers la greffesurface, comme le montre sur la minéralisation dirigée FLI (figure 4A); alors que les allogreffes induire la formation osseuse rare qu'à la marge de défauts. Deuxièmement, BLI de souris d'ostéocalcine-luc a révélé une activité ostéogénique plus dans le groupe d'autogreffe, qui peut être expliquée par la présence de facteurs de croissance qui sont éliminés dans le processus de préparation d'une allogreffe (figure 4F). Fait intéressant, la minéralisation osseuse était significativement plus élevée aux jours 6 et 7, lorsque la sonde d'hydroxyapatite ciblée a été administrée, et la différenciation cellulaire représenté par l'activité BLI était évident plus tard, entre les jours 7 et 10. Nous pouvons en déduire que la plus étendue la minéralisation osseuse peut être au moins partiellement expliqué par le système vasculaire favorable qui caractérise la greffe osseuse autologue.
Nos résultats indiquent que l'autogreffe a la capacité ostéogénique supérieur; cependant, il faut prendre en considération que greffe osseuse autogène a plusieurs DRAwbacks. Récolte osseuse est limitée en volume et entraîne une morbidité au site donneur 14 à 16. En outre, l'incidence de la résorption de l'os autogreffe ne sont pas négligeables 17-19. Les allogreffes sont hautement disponibles et présentent une solution off-the-shelf pour le clinicien. De nombreux travaux ont mis en évidence la façon dont le ostéo-intégration des allogreffes du crâne peut être améliorée par des moyens différents, allant de revêtement de l'allogreffe avec BMP2 codant le virus adéno-associé à 20,21 traitements adjuvants tels que la thérapie intermittente 22 parathyroïdienne. En fin de compte, une fois la capacité de l'allogreffe de fusionner avec l'os est parfait, l'allogreffe va devenir le matériau de greffe préféré.
À la lumière de ces résultats, un intérêt particulier réside dans la question de savoir comment moduler la néovascularisation sur le site de la régénération osseuse. Approche directe de VEGF sur-expression a été trouvé inefficace, car les vaisseaux sanguins de formage sont fuit et ne forment pas un functional net 23,24. Chose intéressante, on a constaté que le signal transduction BMP conduit à la formation ciblée d'un vaisseau sanguin 25,26. En outre, des agents pharmaceutiques 11 et thérapie cellulaire 27 ont été montrés à modifier les modèles de l'angiogenèse au greffe osseuse proximité; deux approches stratégies prometteuses présentes pour améliorer la guérison crânienne de défaut osseux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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