Summary
زرع الطعوم العظمية ذاتي وخيفي تشكل قبول النهج لعلاج الرئيسية فقدان العظام القحفي. ومع ذلك، فإن تأثير تكوين الكسب غير المشروع على التفاعل بين اتساع الأوعية الدموية، تمايز الخلايا وتكوين العظام غير واضح. نقدم بروتوكول التصوير المتعدد الوسائط التي تهدف إلى إلقاء الضوء على الترابط الأوعية الدموية، تكون العظم في القرب الكسب غير المشروع.
Abstract
معلمة الرئيسية التي تحدد نجاح أي إجراء ترقيع العظام هي الأوعية الدموية للمنطقة المحيطة الكسب غير المشروع. افترضنا أن غرس الطعم الذاتي عظم شأنه إحداث أكبر تجديد العظام التي فيرة تشكيل الأوعية الدموية. للتحقيق في تأثير الكسب غير المشروع على اتساع الأوعية الدموية في موقع الخلل، وضعنا التصوير المقطعي (μCT) نهج احتساب الدقيقة لتوصيف حديثا تشكيل الأوعية الدموية، الذي ينطوي على نضح النظامية للحيوان مع وكيل تبلمر التباين. تمكن هذه الطريقة تحليل الأوعية الدموية مفصل للجهاز في مجملها. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم نضح الدم باستخدام التصوير مضان (FLI) وكيل الفلورسنت التي تنتقل عن طريق الدم. وكان كميا تكوين العظام التي FLI باستخدام مسبار استهداف هيدروكسيباتيت وتحليل μCT. تم رصد تجنيد الخلايا الجذعية عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن luciferase المراسل تحت سيطرة المروج أوستيوكالسين.نحن هنا وصف وشرح إعداد المزروع، جراحة عيب قبي، μCT بروتوكولات المسح لدراسة اتساع الأوعية الدموية وتحليل تكوين العظام (بما في ذلك التروية في الجسم الحي من وكيل النقيض)، وبروتوكول لتحليل البيانات.
أظهر عالية الدقة 3D تحليل الأوعية الدموية أكبر بكثير الأوعية الدموية في الحيوانات مع طعم ذاتي زرع، وخاصة فيما يتعلق بتشكيل شرين. وفقا لذلك، ونضح الدم أعلى بكثير في المجموعة الطعم الذاتي قبل اليوم ال 7 بعد الجراحة. لاحظنا تمعدن العظام متميز ويقاس تكوين العظام أكبر في الحيوانات التي تلقت طعم ذاتي. الطعم الذاتي زرع المقيم الناجم عن تجنيد الخلايا الجذعية للخياطة العظام الكسب غير المشروع في استضافة، حيث خلايا متمايزة في الخلايا المكونة للعظام بين ال 7 و ال 10 يوم بعد العملية الجراحية. هذه النتيجة تعني أن تكوين العظام تعزيز يمكن أن يعزى إلىتغذية الأوعية الدموية المعزز الذي يميز الطعم الذاتي الزرع. الطرق المرسومة قد تكون بمثابة أداة مثلى لدراسة تجديد العظام من حيث تكوين العظام يحدها بإحكام واتساع الأوعية الدموية.
Introduction
فقدان العظام القحفي بسبب الصدمة، ورم استئصال، حج القحف ازالة الضغط، وعيب خلقي نادرا ما يشفى من تلقاء نفسه ويعرض الحاجة غير الملباة السريرية واضحة. تستخدم الطعوم العظمية ذاتي وترقيع العظام خيفي على نطاق واسع لعلاج هذه الظروف 1.
ومن المسلم به على نطاق واسع أن تكون العظم يقترن بشكل وثيق مع الأوعية الدموية 2،3. وبالتالي، يجب على دراسة كاملة من العلاج المقترحة لتجديد العظام تشمل تحقيق شامل الشجرة الوعائية تشكيل جميع أنحاء الموقع عيب بأكمله. هناك العديد من الطرق المتاحة لتوصيف الأوعية الدموية في النماذج البحثية. الشجرة الوعائية يمكن التحقيق فيها من قبل التحليل النسيجي. منذ الأنسجة تعتمد على باجتزاء الأنسجة، وهناك احتمال كبير أن يتم تشويه الصورة الناتجة. لمعالجة هذه المشكلة، intravital المجهري يمكن أن يؤديها للسفن صورة سليمة الدم (4)؛ ومع ذلك، وهذه الطريقةتقتصر على التصوير طائرة واحدة. μCT مسح العينات التي تم الحصول عليها من حيوان مع perfused عامل تباين يسمح التصوير 3D من شبكة الأوعية الدموية التي تغذي موقع تجديد 5. هذا النهج يسمح مظاهرة مفصلة للغاية من الأوعية الدموية جهازا ككل، فضلا عن التحليل الدقيق لتوزيع الأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، μCT يمكن التفريق بين أقطار متنوعة من الأوعية الدموية، التي تميز أنواع فرعية مختلفة من الأوعية الدموية.
افترضنا أن غرس الطعم الذاتي قبة القحف سوف تحفز اتساع الأوعية الدموية أكبر من زرع لالمزروع، وهذه الزيادة سوف اتساع الأوعية الدموية يؤدي، بدوره، إلى تعزيز العظام formation.To متابعة هذه الفرضية قمنا بتوظيف مجموعة متنوعة من التقنيات. نحن التحقيق أنماط من شجرة الأوعية الدموية التي شكلت حديثا عن طريق إجراء تحليل يستند μCT. قسنا التروية الدموية باستخدام بركة الدم الفلورسنت التحقيق. المقبلة، ونحن حميرسد تمعدن العظام من قبل FLI من تحقيق الموجهة هيدروكسيباتيت وتحليل μCT. وأخيرا، فإننا مراقبة تجنيد الخلايا الجذعية والتمايز، وأداء BLI في الفئران المعدلة وراثيا والتي يتم التعبير luciferase المراسل في خلايا أوستيوكالسين إيجابي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام (IACUC) من الجامعة العبرية في القدس، إسرائيل (طلب رقم MD-12-13524-4)، منشأة AAALAC المعتمدة، والتي سيناي المركز الطبي IACUC (طلب رقم 3770). تم علاج الحيوانات في الالتزام الصارم بالمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد المغايرة العظام
- الموت ببطء الفئران BALB / C القديمة 8 أسابيع 7- ل، أو أي سلالة مختلفة من المتلقي، وذلك باستخدام أسلوب قياسي من CO 2 الاستنشاق أو الحقن داخل الصفاق من 50 الفينوباربيتال ميكرولتر (65 ملغ / مل؛ 100 ملغ / كلغ). تأكيد غياب نبضات القلب وتنفيذ خلع عنق الرحم. بدلا من ذلك، حصاد المغايرة من الجثث التي تم الاحتفاظ بها في -20 ° C وإذابة قبل الحصاد.
- حلق المنطقة قبي باستخدام المقص الشعر، وتطبيق ذلك في عكس اتجاه نمو الشعر. تطهير رأس الذبيحة عن طريق تطبيق 70٪ isopropanoل. قطع جلد فروة الرأس باستخدام مشرط رقم 11 و إزالة السمحاق.
- باستخدام حفر الأسنان و4.5 ملم قطرها الداخلي منقب، فصل جزء دائري من عظم قبة القحف. نقل جزء العظام إلى صحن البلاستيك 100 ملم تحتوي على محلول ملحي. في هذه المرحلة، ومراقبة الدم والأنسجة الرخوة التي تعلق على قطعة عظم (الشكل 1A). الحصول على شظايا العظام بهذه الطريقة من 22 جهة مانحة.
- عقد جزء العظام في وقت واحد باستخدام الملقط المنحنية. مسحة بدقة باستخدام القطن يميل قضيب وإزالة أي أنسجة المخ والأنسجة الرخوة، والدم (الشكل 1B). خفض بلطف بعيدا أي رقائق العظام التي لا تزال تعلق على الكسب غير المشروع باستخدام مقص غرامة بحيث الكسب غير المشروع سيكون له شكل مستدير الكمال.
- تغمس كل الكسب غير المشروع مرة واحدة في أنبوب 15 مل تحتوي على 70٪ من الإيثانول ومرتين في 15 مل أنابيب تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة لغسل الايثانول.
- تجميد المغايرة في C الثلاجة -80 درجة في cryotubes لفي1 أسبوع على الأقل. عند هذه النقطة، تأكد من أن المغايرة تظهر شفافة (الشكل 1C).
جراحة 2. قبي عيب
- للمتلقين استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن luciferase المراسل تحت سيطرة المروج أوستيوكالسين 6.
- تعقيم نصائح من الأدوات الجراحية باستخدام سخان الزجاج حبة لمدة 30 ثانية. نقل الأدوات اللازمة لزجاجة تحتوي على 70٪ الأيزوبروبانول للحفاظ على ظروف معقمة. استخدام قفازات معقمة.
- تخدير ماوس الإناث من العمر 8 أسابيع 7- لعن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط ketamine- medetomidine (75 ملغ / كغ و 1 ملغ / كغ على التوالي). قرصة الطرف الحيوان للتأكد من تخدير بعمق. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- حلق المنطقة قبي باستخدام المقص الشعر عن طريق تطبيقه ضد اتجاه نمو الشعر. تطبيق إزالة الشعر كريم لإزالة أي بقايا الفراء والقضاء عليها بعد عملية الشراءص لم يعد من 2 دقيقة باستخدام شاش جافة تليها المالحة غارقة الشاش. يجب توخي الحذر لتجنب الحصول عليه في العينين. بدلا من ذلك، مرهم العين الطبيب البيطري يمكن تطبيقها قبل إزالة الشعر باعتبارها طبقة إضافية من الحماية للعيون. ومن الضروري أن كل آثار كريم مزيل الشعر يمكن إزالتها من أجل تجنب تهيج ممكن من التعرض المفرط لمادة كيماوية. تطهير فروة الرأس من خلال تطبيق 5٪ الكلورهيكسيدين (1D الشكل).
- حقن تحت الجلد 5 ملغ / كغ كاربروفين مخففة في 200 ميكرولتر المالحة. تطبيق البيطري مرهم العين لمنع جفاف والحفاظ على الحيوان على وسادة الحرارية في جميع الأوقات. وضع الحيوان تحت المنظار التشغيل.
- اجراء خفض البيضاوي 1-سم طويلة في جلد فروة الرأس باستخدام مقص غرامة وملاقط (الشكل 1E). عقد السمحاق باستخدام الملقط المنحنية وقطع باستخدام مقص غرامة.
- حفر قبة القحف عيب 2 مم الأمامي إلى الدرز اللامي باستخدام الأسنان حفر لالثانية 5 ملم القطر الخارجي منقب (الشكل 1F وG). لتجنب اختراق جافية، حفر ثلاثة أرباع الطريق إلى العظام وفصل جزء العظام باستخدام ملعقة.
- لزرع والطعم الذاتي، استرداد جزء العظام، وأغسلها في 10 ملم لوحة بلاستيكية تحتوي على 10 مل ملحي معقم لإزالة الحطام. لا تقم بإزالة الأنسجة الرخوة. لزرع والمزروع، ذوبان الجليد في وقت مبكر والمزروع وتطبيع لRT، ثم غسله.
- وضع طعم عظمي في الخلل باستخدام الملقط المنحنية لذلك لن أتطرق هامش عيب (الشكل 1H). الغراء الكسب غير المشروع حتى العظم المضيف باستخدام هلام الليفين (5 ميكرولتر من 46 ملغ / مل الفيبرينوجين مختلطة مع 5 ميكرولتر من 25 U / الثرومبين مل).
- خياطة الجلد باستخدام 4-0 VICRYL خياطة (الشكل 1I). تطبيق بوفيدون اليود إلى قطع جراحي. ينبغي توخي الحذر لمنع التلوث من قبل خياطة الفراء. علامة الأذن الماوس وحقن 0.25 مغ / كغ Antisedan رس عكس تأثير مخدر من medetomidine.
- إذا كان هذا الحيوان لا يستيقظ في 10 دقيقة، تأكد من أنها تقع على وسادة حرارة. ضخ 200 ميكرولتر ملحي معقم، وإذا لزم الأمر حقن 0.1 ملغ / كغ Antisedan. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- الحفاظ على الحيوانات في أقفاص فصل لمدة اسبوع لمنعهم من فتح الغرز. ضع الماوس طعام ينقع في الماء في طبق بتري في الطابق قفص لبضعة أيام بعد العملية. حقن تحت الجلد 200 ميكرولتر من 1mg / مل من محلول كاربروفين مخففة في ملحي معقم مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام بعد الجراحة لعلاج الألم بعد العمليات الجراحية.
الشكل 1. قبي إعداد المزروع وقبة القحف عيب جراحة. وعزل جزء العظم من منطقة قبة القحف (A). منديل ناعم، وممسوح نخاع العظام والدم (B)، ويتم شطف الكسب غير المشروع في الايثانول 70٪ تليها اثنين يغسل في الفوسفات مخزنة المالحة (C، AG = المزروع). يتم إعداد الماوس المتلقي للجراحة قبل الحلاقة وتطهير الجلد في المنطقة قبي (D). يتم إنشاء قطع بيضاوية في جلد فروة الرأس، ويتم إزالة السمحاق (E). بعد ذلك، تم حفر الخلل قبة القحف باستخدام منقب 5 ملم قطرها (F). يتم فصل جزء العظام باستخدام ملعقة على شكل ملعقة، وترك الجيب السهمي العلوي سليمة (G). ثم يتم وضع المزروع في العيب وتأمينها باستخدام هلام الليفين (H). وأخيرا، خياطة الجلد (I). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. مايكرو التصوير المقطعي لتوصيفشجرة الأوعية الدموية
- إعداد المالحة heparinized. الوزن 2000 U الهيبارين الصوديوم ووضعه في أنبوب بلاستيكي 50ML. إضافة 20 مل المالحة ويهز جيدا الأنبوب. ملء 20 مل لور قفل المحاقن مع 15 مل تحسنت المالحة heparinized وتوصيل حقنة ل23-G مجموعة المنوال فروة الرأس. يضعوا الحقنة إلى ضخ حقنة، ووضعه على ضخ 10 مل في 1 مل / دقيقة.
- رزين الماوس باستخدام حقن داخل الصفاق من الفينوباربيتال 50μl (65 ملغ / مل؛ 100 ملغ / كلغ). قرصة أطرافهم الحيوان للتأكد من مخدرا بعمق. تأمين الماوس على ظهرها إلى لوحة تثبيت ملفوفة مع بطانة السطحية ماصة (الشكل 2A). ضع الماوس ثابتة في غطاء الدخان لمنع التعرض لدخان شؤون الموظفين.
- قطع الجلد من البطن في الرقبة باستخدام مقص الجميلة وملاقط (الشكل 2B). قطع جدار البطن يصل إلى عملية الخنجري (الشكل 2C). قطع القفص الصدري على طول جانبها الجانبي. تجنب إصابة الرئتين لد القلب، وتأكد يتعرض لها القلب بشكل كامل. استخدام مرقئ لسحب القص (الشكل 2D).
- ادخال الإبرة فراشة 3 مم إلى البطين الأيسر (الشكل 2E). الغراء الإبرة إلى جدار القلب والصدر باستخدام الغراء 3-ثانية (الشكل 2F).
- تنشيط المضخة على الفور. بعد دقيقة واحدة، تشريح الوريد الأجوف السفلي من أجل أزال الضغط على الأوعية الدموية (الشكل 2G). إمالة لوحة بحيث السوائل سوف تتدفق بعيدا عن الرأس. سوف الناجح نضح يؤدي إلى تطهير الأوعية الكبد والدم.
- عند اكتمال المالحة نضح heparinized، يروي 10 مل من 4٪ الفورمالديهايد. تجنب الاختراق من فقاعات الهواء داخل الأوعية الدموية وتجنب التعرض لأبخرة الفورمالدهايد. سوف الناجح الفورمالديهايد نضح يؤدي إلى تشنج الذيل. طرد الفورمالديهايد مع 10 مل heparinized المالحة.
- إعداد عامل تباين معتمة وفقا لالتصنتعليمات urer. عادة، وسوف تحتاج إلى خلط المجمع، مخفف، وكيل المعالجة. استخدام ماصات المصلية وتخلط الحل في أنبوب بلاستيكي 15 مل.
- يروي هذا الحيوان مع الخليط عامل تباين بمعدل 1 مل / دقيقة. مراقبة التاجية، المعوية والكبدية الأوعية الدموية وتأكد من أنهم يتحولون الأصفر بعد نضح من 2-3 مل، مشيرا إلى نضح ناجحة (الشكل 2H). عند الانتهاء من نضح، وقطع أنابيب الإبرة فراشة، والحصول على الذبيحة وحده، وألفه مع ورق التواليت لمنع التسرب من الحل في المنطقة قبي. السماح البلمرة في 4 درجات CO / N.
- تشريح المنطقة قبي (الشكل 2I)؛ أولا استخدام مشرط لقطع الجلد كما الوحشي ممكن، وتجنب الإضرار منطقة الجمجمة من الفائدة. موقع الكسب غير المشروع العظام ومن ثم استخدام مقص غرامة لقطع العظام في الجمجمة 10 ملم بعيدا عن الكسب غير المشروع.
- مسح calv معزولةعينة العظام اريال باستخدام ماسح ضوئي μCT. ضبط مجال الرؤية إلى 20.5 ملم، والطاقة الأشعة X 55 KVP، كثافة 145 أمبير، وذلك باستخدام 1000 التوقعات في 360 درجة والتكامل الوقت 200 مللي ثانية. ضبط المعلمات μCT 7 إلى صورة أخرى نماذج عيب العظام.
- مراقبة 2D بناؤها شرائح التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج μCT. تأكد لمسح المنطقة من الفائدة بشكل صحيح ومن ثم تحديد موقع الخلل قبة القحف. تقييم جودة نضح. بعد تحديد الناجح الأوعية الدموية (الشكل 2J)، مواصلة ويزيل الكلس العينة باستخدام 6٪ حمض التريكلوروسيتيك (TCA) المخفف في الماء المقطر مزدوجة (أحواض دبي الجافة العالمية).
- إعادة تفحص العينة باستخدام المعلمات المشار إليها في القسم 3.10. موقع الدرز اللامي في شرائح 2D إعادة بنائها. تحديد حجم أسطواني الفائدة (أصوات العراق) في ارتفاع 2 مم و 8 مم، وهذا هو الظل الى خياطة - وهذا هو الموقع التشريحي للعيب.
- عشر الجزءالأنسجة ه العظام من الأنسجة اللينة باستخدام إجراء العتبة العالمي؛ تعيين عتبة أدنى إلى 130، وتطبيق 3D مرشح جاوس مقيدة (سيغما [σ] = 2.0 ودعم = 2) لقمع جزئيا الضوضاء في وحدات التخزين. توليد إعادة الإعمار 3D وتأكد يتم وضع أصوات العراق بشكل صحيح (الشكل 2K).
- إنشاء مخطط سمك باستخدام برنامج IPL وظيفة "dt_object_param" (الشكل 2L).
ملاحظة: توضح هذه الوظيفة وحجم الوعاء لكل قطر السفينة.
الشكل 2. الإرواء باستخدام عامل معتمة عبر نهج القلب. تم تثبيت الماوس إلى لوحة التثبيت (A)، وقطع الجلد على طول البطن حتى العنق (B). يتم قطع جدار البطن على طول الخط حتى وسطي لصناعة تج الخنجرييتم قطع SS (C)، والقفص الصدري أفقيا (D). يتم إدخال إبرة فراشة في البطين الأيسر، وتجنب الإدراج إلى البطين الأيمن، والذي هو أكثر قتامة بشكل ملحوظ (E، يشار إلى البطين الأيمن من قبل أبيض خط متقطع)، وتثبت الإبرة إلى جدار القلب والصدر (F) . ويتم ضخ المياه المالحة Heparinized (2-3 مل) في القلب، ويتم تشريح الوريد الأجوف السفلي (G، السهم الأبيض يشير إلى الوريد الأجوف السفلي). وperfused الفورمالديهايد (4٪) وجرفت؛ هذا تبعتها نضح الصفراء مصبوغ عامل تباين معتمة. سوف الناجح نضح يكون واضحا من خلال إزالة الأوعية الدموية، مما يؤدي إلى تغيير اللون إلى اللون الأصفر (H). بعد البلمرة، يتم عزل المنطقة قبي (I، AG = المزروع) وتصويرها باستخدام ماسح ضوئي μCT لتأكيد نضح الصحيح (J، ويتميز حجم المصالح مع البرتقالي). الالعينة decalcified وإعادة فحص (K)، تليها جيل من خريطة سمك الملونة (L). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. الإسفار التصوير من العظام التعدين والدم الإرواء
- إعادة التحقيقات إلى تركيز 2 نانومول / 100 ميكرولتر PBS في أنبوب 1.5 مل (استخدام مسبار فلوري البايفوسفونيت مترافق لمراقبة تمعدن العظام وكيل الفلورسنت المنقولة عن طريق الدم لقياس التروية الدموية). ماصة بلطف عدة مرات لضمان تذويب متجانسة من لجنة التحقيق.
- 24 ساعة قبل دورة التصوير المعينة تأخذ صورة الساعة الصفر. تخدير 3 الفئران باستخدام 2 لتر / دقيقة استنشاق 100٪ الطبية الصف الأكسجين تستكمل مع 3٪ الأيزوفلورين في غرفة الاستقراء. بعد أن تم تأسيس التخدير السليم، وانخفاض تركيز الأيزوفلورين إلى 1.5٪ - 2٪.
- تطبيق البيطري مرهم العين لمنع جفاف وجعل يتم تبديل وسادة حرارية المؤكد في جميع الأوقات. قرصة الطرف الحيوان للتأكد من تخدير بعمق. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- حلق المنطقة قبي باستخدام المقص الشعر تطبيقه ضد اتجاه نمو الشعر. إزالة بقايا الفراء باستخدام إزالة الشعر كريم. فإن أي بقايا الفراء تتداخل مع التصوير الضوئي. إزالة الغرز باستخدام مقص الجميلة وملاقط.
- وضع ثلاثة حيوانات على المسرح IVIS تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة كل دورة التصوير. تعيين وقت التعرض لصناعة السيارات، عرض ميدانية لC، وضبط المرشحات. على سبيل المثال، لتحقيق-البايفوسفونيت مترافق فلوري تتميز مع الإثارة القصوى عند الطول الموجي للضوء من 680 نانومتر، واستخدام عامل تصفية الإثارة من 675 نانومتر وعامل تصفية انبعاث Cy5.5 . وبالمثل، عند استخدام وكيل المنقولة عن طريق الدم الفلورسنت مع ذروة الإثارة في الطول الموجي للضوء 750 نانومتراستخدام عامل تصفية الإثارة من 710 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 780 نانومتر.
- صورة الفئران من خلال المعيشة البرمجيات الصورة عن طريق الضغط على زر "اكتساب". تأكد من المنطقة قبي مرئية تماما (الشكل 3B) للحصول على المشورة دليل شامل ليم وآخرون 2009 8.
- السماح للفئران ليستيقظ استنشاق الأكسجين 100٪.
- حقن 2-نانومول التحقيق الفلورسنت عن طريق الحقن في الوريد الذيل. في دورة التصوير المعينة، نفذ التصوير كما هو موضح أعلاه.
5. الصغرى التصوير المقطعي للتجديد العظام
- لالكمي لتكوين العظام، تخدير الماوس عن طريق الاستنشاق من 3٪ الأيزوفلورين، كما هو مبين في الخطوة 4،2-4،3. نقل الماوس إلى السرير الماسح الضوئي μCT، ووضعه في الماسح الضوئي.
- وضع أنبوب الأشعة السينية الطاقة الماسح الضوئي μCT المحتملة ل55 KVP وكثافة 145 أمبير قرار المتوسط. باستخدام مجال الرؤية من 20.5 ملم، تنفيذالكشفية (واحد الأشعة السينية) مسح وتحديد المنطقة ذات الاهتمام تمتد من عيون الماوس على الجزء الخلفي من الجمجمة لها. إجراء فحص CT، وذلك باستخدام 1000 التوقعات في 360 درجة والتكامل الوقت 200 مللي ثانية.
- إعادة بناء شرائح 2D باستخدام التحليل المكاني الاسمي من 20 ميكرون. محاذاة هوامش ينضم الى موقف موحد باستخدام برنامج μCT 9.
- على غرار الخطوة 3.20، تحديد حجم أسطواني من الفائدة وتطبيق قيود 3D مرشح جاوس (σ = 0.8 ودعم = 1) لقمع جزئيا الضوضاء في وحدات التخزين. جزء من النسيج العظمي من الأنسجة اللينة باستخدام إجراء العتبة العالمي.
- تحديد حجم أنسجة العظام المعدنية في حجم الفائدة.
6. التصوير ضوء بارد من توظيف الخلايا الجذعية والتمايز
- إعداد الماوس للتصوير كما هو مبين في أقسام 4،2-4،4 ومستيقظا في الفئران عن طريق استنشاق الأكسجين 100٪.
- إدارة 126 ملغ / كغ وسيفيرين خنفساء لكل الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق، ويعود الحيوان إلى غرفة الاستقراء. بعد 2 دقيقة، تخدير الحيوان باستخدام 3٪ الأيزوفلورين. وضع الفئران في IVIS تحسنت المرحلة.
- عبر المعيشة البرمجيات صورة، ضبط الوقت التعرض ل"السيارات"، ومجال الرؤية لC. صورة الفئران 5 دقائق بعد تناوله وسيفيرين. صورة الحيوانات كما هو مبين في الخطوة 4.6، وذلك باستخدام "ضوء بارد" طريقة عرف المناطق ذات الاهتمام لأن التحوير التعبير يختلف بين الفئران. تطبيع إشارة قبي الى الذيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تقييم اتساع الأوعية الدموية عن طريق μCT التحليل الحجمي وFLI باستخدام عامل المنقولة عن طريق الدم الفلورسنت لتحديد نضح الدم. بعد سبعة أيام من الجراحة، تظاهر μCT مسح حجم أكبر بكثير من الأوعية الدموية الصغيرة والمتوسطة في قطر الفئران التي تلقت طعم ذاتي من في الفئران التي تلقت المغايرة التي تحصد من C57BL / 6 (الشكل 3A). ومن المثير للاهتمام، في المجموعة الطعم الذاتي ظهرت شجرة الأوعية الدموية التي شكلت حديثا من الوصول إلى المنطقة عيب بأكملها، بينما في المجموعة المزروع ظهرت الأوعية الدموية لاختراق موقع الخلل من الحواف الخارجية وامتدت إلى الداخل فقط على نطاق محدود. وFLI دعم هذه الملاحظة، والتي تبين أعلى بكثير نضح الدم في الحيوانات المعالجة الطعم الذاتي (الشكل 3B). وبحلول اليوم ال 14، في المجموعة المزروع الشجرة الوعائية وصلت كل القرب الكسب غير المشروع، ومع ذلك كان حجم الوعاء أقل بكثير مقارنةإلى مجموعة الطعم الذاتي في معظم أقطار السفينة التي درسنا (الشكل 3C). ملاحظة: كانت الاختلافات في حجم الوعاء أبرز عندما تمت مقارنة سفن بأقطار 0.08- 0.1 ملم. بعد ثمانية وعشرين يوما جراحة عاد حجم الأوعية الدموية في الأساس (الشكل 3D).
بعد سبعة أيام من الجراحة، يقوم FLI باستخدام أثبت التحقيق الموجه هيدروكسيباتيت أكبر بكثير تمعدن العظام في المجموعة الطعم الذاتي (الشكل 4A). وبحلول ذلك الوقت، كان العظم شكلت في جميع أنحاء القرب الكسب غير المشروع في الحيوانات زرع الطعم الذاتي. في المقابل، قد العظام في الفئران مزروع المزروع شكلت فقط على هامش العيب وتميزت شكل حلقة. وتم قياس كمية مجلدات من تكوين العظام بعد 56 أيام من الجراحة، في نقطة النهاية لعملية التجدد، عن طريق إجراء تحليل μCT (الشكل 4B). وبلغ حجم العظام أعلى بكثير (الشكل 4C) والكسب غير المشروع ثيckness أكبر بكثير في الحيوانات التي تلقت طعم ذاتي (الشكل 4D). وقد استخدم BLI في أوستيوكالسين luciferase المراسل الفئران المعدلة وراثيا لرصد تجنيد الخلايا الجذعية وتمايز نحو النسب بانية للعظم (الشكل 4E). في الفئران مزروع مع المغايرة، بلغت ذروتها في إشارة BLI 4-7 أيام بعد الجراحة، عندما كانت إشارة قياس في calvaria أعلى 15 مرة من تلك التي تقاس في الذيل. في الفئران مزروع الطعم الذاتي، بلغت ذروتها في إشارة BLI في وقت لاحق قليلا، 7 - 10 أيام بعد الجراحة، وكانت أعلى بكثير، لتصل إلى 2 أضعاف أعلى calvaria-الذيل إلى نسبة (الشكل 4F).
تم إنشاؤها الشكل 3. العيوب بأسلوب الطعم الذاتي زرع يسهل الأوعية الدموية. قبي في الفئران. تلقى نصف الحيوانات المغايرة وتلقى النصف الآخر طعم ذاتي. التم perfused الفئران مع وكيل النقيض تبلمر بعد 7 أيام من الجراحة. كانت المنطقة قبي معزولة، وكانت العينات decalcified وتصويرها باستخدام ماسح ضوئي μCT. تم إنشاء خريطة سمك الحجمية باستخدام برنامج IPL (A، ن = 3، وأشرطة تمثل ± المؤسسات الصغيرة، والنجمة تشير قيمة P <0.05). تم حقن الفئران مع لجنة التحقيق التي تنتقل عن طريق الدم الفلورسنت بعد 6 أيام من الجراحة. بعد 24 ساعة تعرض الحيوانات إلى FLI وكان يقوم على التحليل الكمي (B، ن = 5، والحانات تمثل ± المؤسسات الصغيرة، والنجمة تشير قيمة P <0.05). وأجري تحليل الوعائي يستند μCT-14 (C) و 28 (D) أيام بعد الجراحة (C و D: ن = 3، وأشرطة تمثل ± المؤسسات الصغيرة، والنجمة تشير قيمة P <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر هاءrsion من هذا الرقم.
الرقم 4. زرع وبأسلوب الطعم الذاتي يعزز تلقى المزيد تكون العظم ثان زرع لالمزروع. الفئران يزرع لطعم ذاتي قبي أو المغايرة. تم حقن الفئران في وقت لاحق مع لجنة التحقيق التي تستهدف هيدروكسيباتيت عن طريق الحقن الرابع بعد 6 أيام من الجراحة. بعد 24 ساعة أجريت FLI والتحليل النوعي (A، ن = 5، والحانات تمثل ± المؤسسات الصغيرة، والنجمة تشير قيمة P <0.05). أجري في الجسم الحي μCT التحليل بعد 56 أيام من الجراحة، وحجم اسطوانية ذات الاهتمام ملحوظ مع وقد تم تعريف البرتقال (B). وتم قياس كمية حجم العظام (C) وسمك الكسب غير المشروع (D) (ن = 8 والحانات تمثل ± المؤسسات الصغيرة، والنجمة تشير P قيمة <0.05) الفئران .Transgenic معربا عن luciferase المراسل حديد الاختزال المباشرفين من قبل المروج أوستيوكالسين أعطيت المغايرة أو طعم ذاتي. تم تنفيذ BLI بعد 10 أيام من الجراحة (E)، وكذلك في نقطة زمنية معينة إضافية. كانت إشارة قياس في المنطقة قبي تطبيع لأن مستوى التعبير تختلف بين الفئران (F، ن = 8 والحانات تمثل ± المؤسسات الصغيرة، والنجمة تشير قيمة P <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهدف من النهج التصوير المتعدد الوسائط الموصوفة هنا هو تمكين التحقيق الدقيق للمحور الأوعية الدموية، تكون العظم في سياق الجمجمة ترقيع العظام. تم تصوير اتساع الأوعية الدموية باستخدام بروتوكول μCT، مما سمح مظاهرة دقيقة 3D عالية الدقة من شجرة الأوعية الدموية المغذية للعيب الجمجمة بأكمله. البيانات μCT يمكن تحليلها بسهولة باستخدام أدوات متقدمة مثل برنامج IPL. على سبيل المثال، كشف تحليل سمك هو مبين في الشكل 3C أن الاختلافات الرئيسية بين الطعم الذاتي الجمجمة والمزروع هي في الأوعية تتراوح ،1-0،08 مم في القطر، والذي يميز الشرايين الدم 10. هذه النتيجة تتفق مع الدراسات التي أجريت في نموذج العظام الطويلة (11). وتجدر الإشارة إلى أن أضيق الأوعية اكتشافها من 0.02mm قطر لا محمل بالكامل بسبب لزوجة وكيل معتمة. العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو حقيقة ما تنطوي عليهالقتل الرحيم للحيوان، والتصوير الطولي وبالتالي من المستحيل. تتوفر في الجسم الحي الأوعية الدموية μCT التصوير عدة تحقيقات معتمة. ومع ذلك، فهي ليست كما معتمة كما المسبار تبلمر كثيفة، ولا يفي دقة وضوح الصورة التي تقدمها طريقة فيفو السابقين يصور هنا 12. قرار μCT محدودة ولن يكون من المفيد دراسة الشعيرات الدموية، على سبيل المثال. بخلاف ذلك، وساعد على يد ماهرة ويوفر هذا الأسلوب أسلوب استنساخه لدراسة الأوعية الدموية العظام في التفاصيل.
خطوة حاسمة في بروتوكولات يصور هي تحديد موقع الخلل (الخطوة 2.7). سوف إصابة في الدرز اللامي أن يؤدي إلى نزيف حاد. عندما حفر عيب قبة القحف، ينبغي الحرص على عدم تعطيل جافية تلميذه والجيب السهمي العلوي. الماضي، إدخال الإبرة فراشة في البطين الأيسر هو إجراء الدقيق (الخطوة 3.4). إذا كانت الإبرة إدراجإد إلى البطين الأيمن، وكيل وسوف المقابل يروي الرئتين وينتقل إلى الأوردة، مما يؤدي إلى ضعف التروية من calvaria. إذا تم إدخال إبرة عميق جدا، وسوف خرم الجدار الخلفي القلب؛ وإذا لم يتم إدخال الإبرة بعيدا بما فيه الكفاية، فإنه قد تمزق بسهولة بعيدا عن القلب. لا تحاول إعادة ضبط الموقف الإبرة كما كنت قد تتداخل مع الارواء. طريقة يمكن تعديلها باستخدام مجموعة من تحقيقات الفلورسنت المتاحة؛ إنتغرين-α 3 β ضد التحقيق -targeted يمكن استخدامها للتأكيد على الأوعية الدموية التي شكلت حديثا، في حين أن التحقيق كاتيبسين-K المستهدفة يمكن أن تستخدم لقياس النشاط ناقضة العظم.
وفقا لفرضية لدينا، لاحظنا أن طعم ذاتي قبي لديها إمكانات عظمية أعلى من المغايرة. وهذا ينطبق على العظام الطويلة وكذلك 13 ويمكن أن يعزى إلى عدة عوامل. أولا، الطعم الذاتي يحتوي على الخلايا المكونة للعظام، والتي تنتج مصفوفة العظام في جميع أنحاء الكسب غير المشروعالسطح، كما يتضح على الموجه تمعدن FLI (الشكل 4A)؛ في حين المغايرة تحفز تكوين العظام نادرة فقط على هامش عيب. ثانيا، كشفت BLI من الفئران أوستيوكالسين لوك المزيد من النشاط عظمي المنشأ في المجموعة الطعم الذاتي، والتي يمكن أن يفسر وجود عوامل النمو التي يتم إزالتها في عملية إعداد المزروع (الشكل 4F). ومن المثير للاهتمام، وكان تمعدن العظام أعلى بكثير في أيام 6 و 7، عندما كانت تدار لجنة التحقيق التي تستهدف هيدروكسيباتيت، وكان تمايز الخلايا يمثله النشاط BLI واضحا في وقت لاحق، بين يوم 7 ويوم 10. يمكننا أن نستنتج من هذا أن أكثر اتساعا تمعدن العظام يمكن تفسيره جزئيا على الأقل عن طريق الأوعية الدموية الطيب الذي يميز ذاتي ترقيع العظام.
نتائجنا تشير إلى أن الطعم الذاتي لديه القدرة المكونة للعظم متفوقة. ومع ذلك، لا بد من الأخذ بعين الاعتبار أن الغازي ترقيع العظام لديها العديد من غرفة المعيشةwbacks. حصاد العظام محدودة في الحجم ويستتبع الاعتلال إلى موقع المانحة 14-16. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حالات الطعم الذاتي العظام ارتشاف هو لا يستهان 17-19. هي المغايرة المتاحة للغاية وتقدم حلا الجاهزة للالطبيب. وقد أظهرت العديد من الأعمال كيف يمكن تعزيز أستيو للاندماج من المغايرة في الجمجمة بوسائل مختلفة، بدءا من طلاء المزروع مع BMP2 ترميز الغدة المرتبطة بفيروس 20،21 إلى العلاجات المساعدة مثل العلاج الغدة الدرقية متقطع 22. في النهاية، بمجرد الكمال قدرة المزروع لدمج مع العظم، فإن المزروع تصبح مادة تطعيم المفضلة.
في ضوء هذه النتائج، اهتماما خاصا تكمن في السؤال كيف لتعديل اتساع الأوعية الدموية في موقع تجديد العظام. تم العثور على النهج المباشر للVEGF الإفراط في التعبير غير فعالة، والأوعية الدموية هي تشكيل راشح ولا تشكل functiاونال شبكة 23،24. ومن المثير للاهتمام، فقد وجد أن إشارة BMP تنبيغ يؤدي إلى تشكيل استهدافا من الأوعية الدموية 25،26. وعلاوة على ذلك، تم عرض وكلاء الصيدلانية 11 و العلاج بالخلايا 27 إلى تغيير أنماط الأوعية الدموية في العظام الكسب غير المشروع عن قرب. كل من يقترب الاستراتيجيات الواعدة الحالية لتعزيز الجمجمة عيب العظام الشفاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
