Introduction
Højtryksvæskekromatografi (HPLC) kombineret med post kolonne derivatisering (PCD) er et kraftfuldt værktøj, der er nyttige i at løse en række spørgsmål i analyselaboratoriet. Det kan bruges til at detektere forbindelser, som ellers er målbart med suite af detektorer tilgængelige 1,2, forøge signalet af målanalytten, som tillader nedre grænser for detektion og kvantificering 3-5 eller selektivt derivatisere en målanalyt for at undgå matrixeffekter 6. Almindeligt anvendte PCD reaktioner omfatter omsætningen af aminer, såsom aminosyrer, med ortho-phthaladehyde 7-9, ninhydrin 9,10 eller fluorescamin 11,12, derivatiseringen af reaktive oxygenarter (ROS) med 2,2-diphenyl 1-picrylhydrazil radikal (DPPH •) 13,14 eller 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) 15,16, og brugen af iodidet-azidreagens at derivatisere svovl containing forbindelser 17,18.
Der er imidlertid adskillige ulemper ved anvendelsen af PCD reaktioner med HPLC-systemer 6. Hovedsagelig blandt disse er anvendelsen af reaktionsprodukter spoler mellem punktet for tilsætning af derivatiseringen reagens (er) og detektoren, der give tid til blanding og reaktionen at forekomme 8. Disse reaktion sløjfer ofte volumener af 500 pi eller mere, hvilket er signifikant sammenlignet med volumenet af resten af HPLC-systemet 19. Anvendelsen af disse høj lydstyrke reaktion loops resulterer i forøget topforbredning forhold til hvad der ville blive observeret uden tilstedeværelse af reaktionen loop. Dette resulterer i kortere, bredere toppe, der har højere grænser for kvantificering og detektion og negativt påvirker kromatografisk opløsning. Figur 1 og 2 fremhæve forringelse af topform, der skyldes tilsætning af forskellige indlæg kolonne reaktion loop mængder. denne analyseblev udført med en mobil fase sammensætning på 94% methanol og 6% Milli-Q-vand. Strømningshastigheden af den mobile fase var 1 ml / min, injektionsvolumen var 20 pi og analysen bølgelængde var 265 nm. Spoler af varierende døde mængder fra 20 pi til 1000 pi blev indsat mellem søjlen og detektoren at simulere virkningerne af reaktion loop døde volumen i PCD metoder. Disse sløjfer blev fremstillet af rustfrit stålrør på 0,5 mm indvendig diameter. Eksperimentet blev udført på et HPLC-system bestående af en kontroller (SCL-10AVP), en lav trykgradient Ventil (FCL-10ALVP), en pumpe (LC-20AD), en injektor (SIL-10ADVP), og en PDA detektor ( SPD-M10ADVP). Den mobile fase blev pumpet gennem en afgasser før indføring i HPLC-systemet. Separationen blev udført ved anvendelse af en 250 mm id 5 um kolonne x 4,6 mm. Forsøgsbetingelserne var valgt til at være typisk for PCD reaktioner, er for nylig blevet publiceret i litteraturen.
Detenkleste, er mest almindeligt post kolonnereaktoren setup betegnes en ikke-segmenteret rørformet reaktor, som er effektivt en lang, tynd slange, gennem hvilken væsken kan strømme, og reaktionen kan finde sted. I dette system topforbredning er afhængig af ikke blot den døde volumen tilsat til systemet, men også den indre diameter af røret som fremhævet af Iijima et al. 8. Endvidere spole geometri spiller en rolle i den observerede mærke udvidelse. Stewart 20 anførte, at opvikling af reaktoren ændrer den sekundære strømning profiler, hvilket resulterer i bedre blanding, hvilket betyder, at de døde volumen kan minimeres. Det er blevet oplyst, at topforbredning er ikke signifikant, når der anvendes en åben rørformede spole 21. Når topforbredning er alt for store, kan andre typer af reaktorer også overvejes 20,22. Disse kan omfatte bed reaktorer eller segmenterede flow reaktorer. Disse reaktorer er især nyttige til langsomme reaktioner, der ellers ville require stor reaktion sløjfer. Som ikke-segmenterede rørformede reaktorer er de mest almindelige typer af reaktorer, der anvendes i PCD applikationer, resten af denne artikel omhandler med denne type reaktor setup.
Udformningen af reaktionen flow (RF) søjle indeholder en multi-port endefittingen, der tillader mobile fase for at afslutte (eller enter) søjlen gennem enten en enkelt port placeret ved den radiale midterområdet af søjlen eller tre porte placeret ved den ydre vægområde af kolonnen (se figur 3). Disse to strømme adskilles med en ende fitting indeholdende en central porøs fritte, der er omgivet af en impermeabel ring, der igen er omgivet af en ydre porøs fritte, der strækker sig ud til søjlen væg. På grund af den centrale uigennemtrængelige ring cross flow er ikke mulig mellem de to porøse områder.
Under reaktion flow kromatografi er derivatiseringen reagens (er) pumpes mod retningen af mobile fase flow i en eller two af de ydre havne reaktion flow kolonnen. Søjlen eluent blandes med derivatiseringen reagens (er) i den ydre fritte og ledes til detektoren gennem en fri ydre port. Reaktionen flow kan anvendes til enten et enkelt reagens derivatisering (1 port til derivatiseringen reagens til 1 port passere kolonnen eluent til detektoren og 1 port blokeret) eller et dobbelt reagenssystem (2 porte til derivatiseringen reagenser og 1 port til passere kolonnen eluent til detektoren). Strømmen fra den centrale strøm kan enten anvendes til at detektere den uderivatiserede kolonne elueringsmiddel, effektivt multiplexing detektering 23, eller føres til spilde.
En væsentlig tuning teknik, der er til rådighed, når du kører RF-PCD kromatografi er forholdet mellem det centrale og perifere strømme. Det optimale forhold for hver derivatisering afhænger af en række faktorer, såsom hvorvidt den centrale flow vil blive opdaget eller videregivet til spilde. Derfor endnu det optimale forhold er blevet bestemtDet skal sikres, at den korrekte flow-forhold opnås før hver kørsel, der udføres.
Det har vist sig, at anvendelsen af en fritte at blande kolonnen eluent strøm og derivatiseringen reagens i RF-PCD resulterer i mere effektiv blanding sammenlignet med traditionelle blandingsteknikker, der anvender typisk et nul dødvolumen T-stykke eller lavt dødvolumen W- stykke at blande de to strømme. Dette har muliggjort anvendelsen af relativt små reaktionsprodukter loops, eller endda eliminering af reaktionen loop helt. Reduktionen af de reaktion loop format medfører skarpere toppe i forhold til traditionelle indlæg kolonne derivatisering metoder. Det betyder, at større signal-støj-forhold på trods af, at ikke alle af kolonnen eluent er derivatiseret, overholdes, og kan opnås derfor nedre grænser for detektion og kvantificering.
Reaktion flow kromatografi er udviklet til at overvinde vanskeligheder med tilpasning af PCD reaktions til moderne HPLC kolonner og systemer, især tabet i effektivitet skyldes band udvide på grund af store indlæg kolonne døde volumener forårsaget af behovet for at ansætte store mængder reaktion sløjfer. De mere effektiv blanding processer i RF-PCD sammenlignet med konventionel PCD betyde, at mindre reaktionsprodukter loop rumfang kan anvendes fører til en stigning i den observerede adskillelseseffektivitet. Desuden viser RF-PCD kromatografi både øget signal og nedsat støj sammenlignet med konventionelle PCD teknikker resulterer i lavere detektionsgrænser og kvantificering sammenlignet med konventionelle PCD metoder. En yderligere fordel ved RF-PCD sammenlignet med konventionelle PCD metoder er evnen til at overvåge uderivatiserede stream, der eluerer fra den centrale port af RF kolonnen samt den derivatiserede stream, der eluerer fra det perifere område af kolonnen. RF-PCD er en relativt ny, men lovende teknik, der viser mange fordele frem for traditionelle PCD metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Advarsel: Der henvises til sikkerhedsdatablade (MSDS) for alle materialer og reagenser før brug (dvs. MSDS for methanol). Sørg for brug af alle relevante sikkerhedspraksis ved håndtering opløsningsmidler og højtryksvæskekromatografi (HPLC) elueringsmiddel. Sikre passende anvendelse af tekniske kontroller af HPLC, analysevægt og detektor instrumentering, og sikre anvendelsen af personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel, fuld længde bukser, og lukkede toe sko).
Bemærk: Denne protokol beskriver 3 metoder til reaktion flow post column derivatisering (RF-PCD) teknikker, hver med en forskellig reagens specifikt til arten af en kemisk forbindelse af interesse. Til analysen af ROS gå til afsnittet "1. Påvisning af ROS hjælp DPPH •" for analysen af primære aminer se afsnit "2. Påvisning af primære aminer ved hjælp fluorescamin", og til analyse af phenolforbindelser gå til afsnittet "3 . Påvisning af phenoleranvendelse af 4-aminoantipyren og kaliumferricyanid ". Brug ultrarent vand (f.eks Milli-Q vand) hele vejen igennem.
Bemærk: Forbindelse af RF kolonnen opnås i næsten samme måde som en konventionel HPLC-søjle med den væsentligste forskel er antallet af endestykker på en RF-søjle. Fittings bruges til at tilslutte en standard HPLC-kolonne til HPLC-systemet er i stand til at blive brugt til at forbinde en RF kolonne til HPLC-systemet.
1. Påvisning af ROS Brug DPPH •
- Opsætning af HPLC instrument
- Forbered HPLC instrument med 100% vand på linje A og 100% methanol på linje B som den mobile fase. Rense pumperne i henhold til producentens krav.
- Oprette HPLC instrumentale komponenter og den yderligere derivatisering pumpe som illustreret i figur 4A.
- Indstil UV-Vis detektor til at analysere ved en bølgelængde på 520 nm.
- Opsætning afRF kolonne
- Tilslut indløbet af RF kolonnen med HPLC instrument.
- Tilslut en 15 cm længde på 0,13 mm id slange til udløb central havn af RF kolonnen.
- Tilslut et udløb periferitilslutningen til UV-Vis detektor under anvendelse af en 15 cm længde på 0,13 mm id slange.
- Tilslut DPPH • pumpen linje til en perifer port på udløbet af RF kolonnen.
- Blokere ubrugte periferitilslutningen på udgangen af RF-søjle under anvendelse af en søjle prop.
- Bring strømningshastigheden af HPLC-pumpe til 1 ml min-1 ved 100% linien B - 100% methanol.
- Ækvilibrering af søjlen med 100% methanol mobil fase i 10 minutter for en kolonne, 4,6 mm diameter x 100 mm længde. Denne gang skal skaleres efter dimensionerne af andre kolonner brugeren kan anvende.
- Fremstilling af DPPH • reagens
- Forbered en 0,1 mg / ml opløsning af DPPH • i methanol. Sonikeres kolben med DPPH • reagens i 10 min.
- Dæk kolben i folie for at forhindre udsættelse for lys.
- Rense DPPH • pumpen med den forberedte DPPH • reagens som pr fabrikantens krav.
- Tuning RF kolonneudgang
- Afvejes nøjagtigt to rene og tørre skibe. Mærk et skib som centrale og den anden som perifere.
- Opsaml spildevandet forlader den centrale port ind i beholderen mærket centrale i 1,0 min.
- Vejes igen den centrale port fartøj og beregne vægten af strømmen fra den centrale port som følger:
Vægt på Central Port (g) = slutvægt Central Havn Fartøjs (g) - Indledende vægt Central Havn Fartøjs (g) - Gentag trin 1.4.2 og 1.4.3 for effluenten forlader UV-Vis, som er fastgjort til den perifere port af RF-søjle og beregne vægten for den perifere port fartøj somfølger:
Vægt af perifert Port (g) = slutvægt Peripheral Havn Fartøjs (g) - Indledende vægt Peripheral Havn Fartøjs (g) - Procentdelen af strømmen kommer fra det centrale og perifere porte som følger:
% Central Port = Vægt af Central Port (g) / (Vægt på Central Port (g) + vægt af perifert Port (g)) x 100
% Perifere Port = Vægt af perifert Port (g) / (Vægt på Central Port (g) + vægt af perifert Port (g)) x 100 - Sørg for segmentering forholdet mellem den centrale flow og den perifere flow er 30:70 (central: perifer). Hvis den centrale strømning er over 30%, reducere mængden af strøm der kommer ud ved tilsætning af en længde på 0,13 mm id slange til udgangen af den centrale port. Hvis den centrale strømning er under 30% mindske længden af 0,13 mm rør fra den centrale port.
- Gentag trin 1.4.1 til 1.4.6 indtil en segmentering forhold på 30:70 (central: perifer) er opnået.
- Indstil strømningshastigheden af DPPH • reagens pumpe til 0,5 ml min-1.
Bemærk: RF kolonne oprettet med DPPH • reagens er nu klar til analyse. Prøver kan nu injiceres.
- Indlæg køre lukning betingelser
- Når alle prøverne er blevet injiceret, hvilket viser, at kørslen er afsluttet, stopper derivatiseringsreagens pumpeflow.
- Fjern DPPH • reagens pumpe linje fra perifere havn og tilproppes havnen.
- Ækvilibrering af søjlen med den mobile fase, hvor den skal opbevares ved at tillade den mobile fase til at passere gennem søjlen med 1 ml min-1 i 10 min.
- Stoppe strømmen af den mobile fase pumpen på HPLC instrument.
- Udskift DPPH • reagens med methanol og rense ekstra pumpe.
Bemærk: HPLC-systemet kan nu være shutdown.
2. Påvisning af primære aminer Brug fluoresceramin
- Fremstilling af mobil fase
- Forbered 1 I af en 10 mM ammoniumacetatopløsning, indstilling af pH af opløsningen til 9,0 med 5 M ammoniumhydroxid før fortynding til mærket.
- Tilsættes 52,6 ml acetonitril (ACN) til ammoniumacetatpuffer at opnå en forblandet mobil fase af 95:05 (puffer: ACN).
- Opsætning af HPLC instrument
- Forbered HPLC instrument med forblandet forberedt buffer på linje A som den mobile fase. Rense pumpen i henhold til producentens krav.
- Oprette HPLC instrumentale komponenter og den yderligere derivatisering pumpe som illustreret i figur 4A.
- Vedhæft en pulsdæmper spole til derivatisering pumpen.
- Opsætning fluorescensdetektoren (FLD) med en excitationsbølgelængde på 390 nm og emissionsbølgelængde på 475 nm.
- Opsætning af RF kolonne
- Tilslut the indløb af RF kolonnen med HPLC instrument.
- Tilslut en 15 cm længde på 0,13 mm id slange til udløb central havn af RF kolonnen.
- Tilslut et udløb periferitilslutningen af RF kolonnen til FLD detektoren ved anvendelse af en 15 cm længde på 0,13 mm id slange.
- Tilslut derivatisering pumpe linje til en perifer port på udløbet af RF kolonnen.
- Blokere ubrugte periferitilslutningen på udgangen af RF-søjle under anvendelse af en søjle prop.
- Bring strømningshastigheden af HPLC-pumpe til 1 ml min-1 ved 100% line A - 10 mM ammoniumacetatbuffer, pH 9, forblandet med 5% ACN.
- Ækvilibrering af søjlen med 100% linje A mobile fase i 10 minutter for en kolonne, 4,6 mm diameter x 100 mm længde. Denne gang kan skaleres ifølge dimensionerne af andre kolonner brugeren kan anvende.
- Fremstilling af fluorescamin reagens
- Gør 100 ml af en 0,1 mg ml -1 fluorescamin reagens. <li> sonikeres i 1 min.
- Dæk med folie for at forhindre udsættelse for lys.
- Rense reagens pumpen med det fremstillede fluorescamin reagens som pr fabrikantens anvisninger.
- Afvejes nøjagtigt to rene og tørre skibe. Mærk et skib som centrale og den anden som perifere.
- Opsaml spildevandet forlader den centrale port ind i beholderen mærket centrale i 1,0 min.
- Vejes igen den centrale beholder og beregne vægten af strømmen fra den centrale port som følger i trin 1.4.3.
- Gentag trin 2.5.2 til 2.5.3 for effluenten forlader FLD, som er fastgjort til den perifere port af RF-søjle og beregne vægten til perifer som følger i trin 1.4.4.
- Procentdelen af strømmen kommer fra det centrale og perifere havne som følger i trin 1.4.5.
- Sørg for segmentering forholdet mellem den centrale flow og det perifereflow er 43:57 (central: perifer). Hvis den centrale strømning er over 43%, reducere mængden af strøm der kommer ud ved tilsætning af en længde på 0,13 mm id slange til udgangen af den centrale port. Hvis den centrale strømning er under 43%, reduceres længden af 0,13 mm rør fra den centrale port.
- Gentag trin 2.5.1 til 2.5.6 indtil en segmentering forhold på 43:57 (central: perifer) er opnået.
- Indstil strømningshastighed af den mobile fase pumpe til 0,7 ml min-1.
- Indstil derivatisering pumpe til at strømme med 0,1 ml min-1.
Bemærk: RF kolonne oprettet med fluorescamin reagens er nu klar til analyse. Prøver kan nu injiceres.
- Når alle prøverne er blevet injiceret, hvilket viser, at kørslen er afsluttet, stopper derivatiseringen pumpen.
- Fjern derivatiseringen pumpe linje fra det perifere havn og prop.
- Ækvilibrering af søjlen med den mobile fase isom den skal opbevares ved at tillade den mobile fase til at passere gennem søjlen med 1 ml min-1 i 10 min.
- Stoppe strømmen af den mobile fase pumpen.
- Udskift fluorescamin reagens med acetonitril og rense derivatisering pumpe.
Bemærk: HPLC-systemet kan nu være shutdown.
3. Påvisning af phenoler under anvendelse af 4-aminoantipyren og kaliumferricyanid
- Fremstilling af mobil fase
- Forbered 1 I af en 100 mM ammoniumacetatopløsning, indstilling af pH af opløsningen til 9,0 med 5 M ammoniumhydroxid før fortynding til mærket.
- Tilsættes 52,6 ml methanol til ammoniumacetatpuffer at opnå en forblandet mobil fase af 95: 5 (puffer: methanol).
- Opsætning af HPLC instrument
- Forbered HPLC instrument med forblandet forberedt buffer på linje A som den mobile fase. Rense pumpen som pr fabrikantens; S krav.
- Oprettet HPLC instrumentale komponenter og de to yderligere reagens pumper som vist i figur 4B.
- Vedhæft en pulsdæmper spole til hver af reagenser pumper.
- Indstil UV-Vis detektor til at analysere ved en bølgelængde på 500 nm.
- Opsætning af RF kolonne
- Tilslut indløbet af RF kolonnen med HPLC instrument.
- Tilslut en 15 cm længde på 0,13 mm id slange til udløb central havn af RF kolonnen.
- Tilslut et udløb periferitilslutningen af RF kolonnen til UV-Vis detektor under anvendelse af en 15 cm længde på 0,13 mm id slange.
- Forbinde hver reagens (dvs. 4-aminoantipyren og kaliumferricyanid) pumpe linje til en perifer port på udløbet af RF kolonnen.
- Bring strømningshastigheden af HPLC-pumpe til 1 ml min-1 ved 100% line A - 100 mM ammoniumacetatbuffer pH 9, forblandet med 5% methanol.
- Ækvilibrering af kolonnen wed 100% linje A mobile fase i 10 minutter for en kolonne, 4,6 mm diameter x 100 mm længde. Denne gang kan skaleres ifølge dimensionerne af andre kolonner brugeren kan anvende.
- Fremstilling af 4-aminoantipyren reagens
- Forbered en ammoniumacetatpuffer med en pH-værdi på 9 ved at følge trin 3.1.1.
- Der afvejes 150 mg 4-aminoantipyren og opløses i 100 ml tilberedt ammoniumacetatbuffer (pH 9).
- Lydbehandling i 1 min.
- Dæk med folie for at forhindre udsættelse for lys.
- Rense første reagens pumpen med den fremstillede 4-aminoantipyren reagens som pr fabrikantens anvisninger.
- Fremstilling af kaliumferricyanid reagens
- Afvej 150 mg kaliumferricyanid og opløses i 100 ml ammoniumacetatbuffer (pH 9) fremstillet som pr trin 3.1.1.
- Lydbehandling i 1 min.
- Dæk i folie for at forhindre udsættelse for lys.
- Purge det andet reagens pumpen med det fremstillede kaliumferricyanid reagens som pr fabrikantens anvisninger.
- Tuning af RF-søjle
- Afvejes nøjagtigt to rene og tørre skibe. Mærk et skib som centrale og den anden som perifere.
- Opsaml spildevandet forlader den centrale port ind i beholderen mærket centrale i 1,0 min.
- Vejes igen den centrale beholder og beregne vægten af strømmen fra den centrale port som følger i trin 1.4.3.
- Gentag trin 3.6.2 til 3.6.3 for effluenten forlader UV-Vis, som er fastgjort til den perifere port af RF-søjle og beregne vægten til perifer som følger i trin 1.4.4.
- Procentdelen af strømmen kommer fra det centrale og perifere havne som følger i trin 1.4.5.
- Sørg for segmentering forholdet mellem den centrale flow og den perifere flow er 50:50 (central: perifer). Hvis den centrale strømning er over 50%, sænkemængde strømning kommer ud ved tilsætning af en længde på 0,13 mm id slange til udløbet centrale port. Hvis den centrale strømning er under 50%, reduceres længden af 0,13 mm rør fra den centrale port.
- Gentag trin 3.6.1 til 3.6.6 indtil en segmentering forhold på 50:50 (central: perifer) er opnået.
- Indstil strømningshastigheden af den 4-aminoantipyren pumpe til 0,5 ml min-1.
- Indstil strømningshastigheden af kaliumferricyanid pumpen til 0,25 ml min-1.
Bemærk: RF kolonne oprettet med de to-komponent reagenser er nu klar til analyse. Prøver kan nu injiceres.
- Indlæg køre lukning betingelser
- Når alle prøverne er blevet injiceret kørslen er afsluttet, hvilket indikerer, at kørslen er afsluttet, stopper begge reagens pumper.
- Fjern reagens pumpe linjer fra de perifere porte og erstatte dem med en 15 cm stykke 0,13 mm slange.
- Ækvilibrering af søjlen med den mobile fase i which den skal opbevares ved at tillade den mobile fase til at passere gennem søjlen med 1 ml min-1 i 10 min.
- Stoppe strømmen af den mobile fase pumpen på HPLC instrument.
- Udskift både reagenserne på reagenset pumper med methanol og udrense de ekstra pumper som pr producent krav.
Bemærk: HPLC-systemet kan nu være shutdown.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første PCD metode, der blev tilpasset til anvendelse af RF-PCD var derivatisering af antioxidanter ved hjælp af 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil radikal (DPPH •) 24. Denne reaktion blev introduceret af koleva et al. 25 og har været almindeligt anvendt siden. Påvisningen afhængig af affarvning af DPPH • radikal i nærværelse af reaktive oxygenarter, dermed tilstedeværelsen af antioxidanter resulterer i et fald i den observerede absorbans. Den DPPH • reaktion beskæftiger ofte store reaktion sløjfer af 500 pi eller mere 13-15 men det blev konstateret, at når du bruger RF-PCD søjlen var påkrævet ingen reaktion loop. Figur 5 viser to kromatogrammer af en prøve af Ristretto kaffe derivatiserede ved hjælp af DPPH • radikal ved hjælp af både konventionel PCD og RF-PCD instrumentering.
Den anden PCD metode, der er blevet tilpasset til brug af RF-PCD er derivatization af fire aminosyrer (glycin, leucin, phenylalanin og tryptophan) under anvendelse fluorescamin som derivatiseringsreagens 23. Metoden blev tilpasset fra arbejde af Udenfriend et al. 11 med den mobile fase sammensætning, fluorescamin koncentration og fluorescamin strømningshastighed optimeret til brug med RF-kolonner. Den konventionelle metode anvendes en to-reagens derivatisering system, hvor pH 9,0 puffer blev tilsat til den udløbsstrøm, inden tilsætningen af fluorescamin reagens, medens RF-PCD-metoden anvendte en mobil fase, der allerede var pufret, således kun en enkelt reagens derivatisering systemet var nødvendig. Til denne anvendelse det derivatiserede strøm blev analyseret ved 390 nm under anvendelse af en UV-Visible detektor, som svarer til excitationsbølgelængden anvendt til detektion af fluorescens. Den derivatiserede strøm kunne påvises ved hjælp af en fluorescensdetektor, hvilket giver større signal til støj og dermed lavere detektionsgrænser og quantgrænsning, som pr arbejde af Udenfriend et al. 11. Endvidere blev eluenten kommer fra den centrale port af RF-PCD setup overvåges under anvendelse af et andet UV-Visible detektor.
Udførelsen af RF-PCD fremgangsmåde til derivatisering af aminosyrerne blev sammenlignet med den konventionelle PCD-metoden. Tabel 1 angiver de beregnede grænser for kvantificering og detektion for hver af aminosyrerne analyseret i både RF-PCD og konventionelle PCD modes. Detektionsgrænsen blev defineret som den koncentration, hvor et signal til støj forhold på 2 blev opnået, mens grænsen for kvantificering blev defineret som den koncentration, hvor et signal til støj forhold på 10 var opnået. Figur 6 viser et kromatogram af de fire aminosyrer analyseret under anvendelse af konventionelle PCD-metoden, RF-PCD fremgangsmåde og den derivatiseret strøm fra RF-PCD-metoden. Figur 7 er en sammenligning af signalerne opnået for ærtenks grund glycin og leucin ved anvendelse af både den konventionelle PCD fremgangsmåde og RF-PCD-metoden. Figur 8 sammenligner peak bredde af tryptophan top ved analyse under anvendelse af konventionelle PCD-metoden, RF-PCD fremgangsmåde og den derivatiseret stream fra RF- PCD-metoden.
Den endelige PCD metode, der er blevet tilpasset til anvendelse af RF-PCD 26 er derivatisering af fire phenoler (phenol, 4-methoxyphenol, p-cresol og tocopherol). Metoden blev tilpasset fra arbejde af Bigley og Grob 27 med mindre ændringer for at optimere metoden til brug med RF-kolonner. Dette arbejde blev der anvendt en to-komponent derivatiseringsreaktion hvor opløsninger af både 4-amionantiprine og kaliumferricyanid blev tilsat til søjlen eluenten for enden montering af RF kolonnen. Det blev konstateret, at når der anvendes en RF kolonnen for reaktionen ingen yderligere stolpe reaktionstemperatur loops skulle anvendes. Figur 9 viser et eksempel på et kromatogram, hvoren 21-komponent prøveemne, som indeholdt nogle komponenter, der viser en reaktion på derivatisering ordningen og nogle, der ikke blev skilt fra, derivatiseret og detekteret (sort trace). Den samme blanding blev også adskilt og påvist derivatiseret til sammenligning (rød trace). I figur 9 RF-PCD svar er blevet vist som en negativ reaktion for nemmere visuel skelnen (detektorens respons opnåede positive). Figur 10 viser en sammenligning af toppen form af p-cresol både derivatiseret under anvendelse af RF-PCD-søjle og uderivatiseret.
Figur 1. Chromatografisk overlejring af hexylbenzene injiceret på et HPLC-system med forskellige døde volumener tilføjet mellem søjlen og detektoren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Chromatografisk overlay toluen, ethylbenzen og propylbenzen injiceret på et HPLC-system med forskellige døde volumener tilføjet mellem søjlen og detektoren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Illustration af Reaction Flow kolonne design. Klik her for at se en større version af dette tal.
tp_upload / 53.462 / 53462fig4.jpg "/>
Figur 4. Instrumental oprettet i RF-PCD. (A) enkelt reagens (dvs. DPPH • eller fluorescamin derivatiseringsreagenser) og (B) dobbelt reagens (dvs. 4-aminoantipyren og kaliumferricyanid derivatiseringsreagenser). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Kromatogrammer af opløsningen af Ristretto kaffe med detektion efter post-søjle derivatisering under anvendelse af 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil radikal (DPPH •). Derivatiseringen blev udført under anvendelse af en konventionel søjle med en 500 pi reaktion spole (A) og en reaktionstid flow søjle (B Rong>). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Kromatografisk overlejring af fire aminosyrer (glycin (G), leucin (L), phenylalanin (P) og tryptophan (T)) over området fra 10 til 1.000 ppm detekteret med post-søjle derivatisering under anvendelse af fluorescamin som PCD reagens efter separation ved HPLC. De kromatogrammer er som følger: (A) konventionelt PCD, (B) RF-PCD, og (C) central (derivatiseret) port fra RF-PCD. Klik her for at se en større version af dette tal.
_upload / 53.462 / 53462fig7.jpg "/>
Figur 7. Sammenligning af signalerne opnået for glycin (første top) og leucin (anden top) fra konventionel PCD (rød spor) og RF-PCD (sort trace). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Peak bredde sammenligning af top på grund af tryptophan baseret på (A) retentionstid og (B) peak volumen. Den sorte spor viser den konventionelle PCD-metoden, den røde spor viser RF-PCD fremgangsmåde og den grønne spor viser uderivatiseret strøm fra den centrale havn af RF-PCD metode. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. kromatografisk separation af en kunstig prøve. Komponenterne indbefatter phenol (P), 4-methoxyphenol (M), s-cresol (C) og tocopherol (T) samt talrige alkylbenzener, polycycliske aromatiske carbonhydrider, anisol, phentanole, koffein, phenylalanin og benzamid. Toppene mærket I, II og III alkylbenzener, der uventet reagerede på derivatisering ordningen. Den sorte spor repræsenterer det derivatiserede respons ved anvendelse af en UV-detektor ved 254 nm, mens det røde spor repræsenterer det derivatiserede reaktion ved 500 nm. Note til visuel klarhed den derivatiserede reaktion er blevet vendt om. Klik her for at se en større version af dette tal.
![Figur 10]("/files/ftp_upload/53462/53462fig10.jpg")
Figur 10. Chromatografisk respons p-cresol. Den sorte spor repræsenterer det uderivatiserede respons ved hjælp af en UV-detektor ved 254 nm, mens den røde spor repræsenterer den derivatiserede (RF-PCD) reaktion ved 500 nm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| reaktionstype | Glycine | Leucin | Phenylalanin | tryptophan | ||||
| LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | |
| RF-PCD | 6 | 25 | 10 | 100 | 25 | 250 | 50 | 250 |
| RF-PCD central port (derivatiseret) | Ikke fundet | Ikke fundet | Ikke fundet | 1 | 10 | |||
| Konventionel PCD | 10 | 100 | 50 | 500 | 50 | 500 | 100 | 500 |
Tabel 1. Grænser for detektion og kvantificering af fire forskellige aminosyrer detekteret af forskellige indlæg kolonne derivatisering systemer, der anvender fluorescamin som derivatiseringsreagens efter adskillelse ved HPLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RF-PCD muliggør effektiv blanding af derivatiseringsreagens med HPLC effluenten post column uden anvendelse af reaktionsprodukter spoler, hvilket minimerer effekterne af bandet udvide og forbedre adskillelse ydeevne. RF-PCD metoder har også vist forbedringer i signal respons med hensyn til påvisningsmetoden. Camenzuli et al. 28 var den første til at rapportere brugen af reaktion flow kolonner med DPPH • til påvisning af ROS i en espresso kaffe prøve. Deres undersøgelse omfattede analyse og optimering af RF betingelser for at opnå maksimal ydelse, teste en række DPPH • koncentrationer med forskellige DPPH • reagens strømningshastigheder. Det konkluderedes, at en DPPH • koncentration på 0,1 mg ml -1 med en DPPH • reagens strømningshastighed på 0,5 ml min-1 var optimal for en forbedret adskillelse ydeevne (dvs., effektivitet og følsomhed) under RF- PCDbetingelser sammenlignet med den konventionelle PCD fremgangsmåden ifølge DPPH • derivatisering. Figur 5 viser to chromatogrammer, der anvender den DPPH • assay af antioxidanter i en espressokaffe prøve. Særligt interessante er de høje intensitet toppe med retentionstider på ca. 5 min. Det kan ses, at ved anvendelse af en 500 pi reaktion loop, som er typisk for traditionelle DPPH • derivatisering metoder kan en enkelt, bred top observeres. Men når der anvendes RF-PCD fremgangsmåde uden behov for en reaktion løkke, bliver det klart, at den enkelte top observeret ved anvendelse af en 500 gl loop er i virkeligheden to toppe. Desuden kan yderligere detaljer ses efter 5,5 min ved brug af RF-PCD setup. Således til analyse af ROS i prøver ved anvendelse af DPPH •, teknikken med RF-PCD viste sig at være overlegen i forhold til de konventionelle metoder til ROS-analyse under anvendelse DPPH •.
RF-PCD medfluorescamin reagens er blevet anvendt til analyse af primære aminosyrer og sammenlignet med de konventionelle former for PCD med fluorescamin 20. Da RF kolonne ende-montering også en platform for multiplex detektion blev uderivatiserede centrale flow overvåges via UV-Vis, mens derivatisering mellem spildevand og fluorescamin blev foretaget i den ydre region af RF udgangen montering og opdaget via UV- Vis. En serie af test standarder indeholdende fire aminosyrer blev analyseret under multipleksede RF-PCD betingelser. Figur 6 sammenligner kromatografiske profil for den konventionelle metode i PCD (figur 6A) og RF-PCD (påvisning af derivatiseret (figur 6B) og derivatiseret (figur 6C)) af rækken af aminosyrer. Figur 7 er en overlejring af to aminosyrer signaler opnået gennem konventionelle PCD og RF-PCD. Det kan ses, at jo mere effektiv observerede adskillelse grund than fjernelse af reaktionen sløjfen har ført til større signal respons, selv om ikke alle søjleeffluenten blev derivatiseret. Endvidere, jo mere effektiv derivatiseringsreagens blandeprogram resulterede i lavere baseline støj, yderligere forøger signal-støj-forholdet. Denne virkning bekræftes i de nedre grænser for detektion og kvantificering beregnet for RF-PCD metode sammenlignet med den konventionelle PCD-metoden i tabel 1. Kan denne tendens kan desuden ses i figur 5, hvor antioxidanten respons på DPPH • er større for RF-PCD metode sammenlignet med den konventionelle PCD-metoden. forringelse signifikant top kan observeres i kromatogrammerne hvor en konventionel PCD setup blev anvendt som fører til lavere signal respons af denne fremgangsmåde.
Figur 8 sammenligner peak profil af tryptophan ved analyse ved RF-PCD (både derivatiserede og derivatiserede streams) og konventionel PCD. Når peak profil er afbildet mod tid topbredder alle synes at være stort set ens (figur 8A). De forbedringer, der findes i RF-PCD sammenlignet med konventionelle PCD er indlysende, når den maksimale profilen er afbildet mod peak volumen (figur 8B). Når afbildet mod peak volumen, er det klart, at medens RF-PCD peak viser en lille mængde nedbrydning sammenlignet med den uderivatiserede peak, nedbrydningen imidlertid er minimal sammenlignet med observationerne fra den konventionelle PCD-metoden. Forbedringerne i separationseffektiviteten af RF-PCD sammenlignet med konventionelle PCD er også demonstreret i figur 7 som sammenligner toppene af glycin og leucin efter derivatisering af både konventionelle PCD og RF-PCD. Det kan ses, at glycin og leucin toppe på konventionel PCD tilstand er knapt baseline skilt fra, mens i RF-PCD tilstand signalet er på baseline for en meget længere periode mellem de to toppe.
enyderligere fordel ved RF-PCD sammenlignet med konventionelle PCD metoder er evnen til at overvåge derivatiseret effluent fra den centrale port af RF kolonnen muliggør multipleksede påvisning. Dette er muligt, da udformningen af fritten i RF endefittingen ikke tillader strømmen i den radiale centrale region til at blande med strømmen i det perifere område af endefittingen, hvilket muliggør overvågning af det derivatiserede strøm fra det ydre område af montering samt overvågning af uderivatiseret strøm fra den centrale port. Denne evne er fremhævet af resultaterne opnået for tryptophan i tabel 1, som vides at have dårlig signal respons efter derivatisering med fluorescamin 20 imidlertid i modsætning til de andre aminosyrer det viser en reaktion på en UV-detektor ved derivatiseret (ved 280 nm) . For begge derivatisering systemer detektionsgrænserne og kvantificering var relativt høje, men de detektionsgrænser og kvantificering var meget lavere for than uderivatiseret stream. Brug af evnen til at overvåge både derivatiserede og derivatiserede spildevandsstrømme parametrene påvisning kan optimeres for at give den største grad af ydeevne for hver aminosyre.
Multiport design af RF endefittingen muliggør dobbelt derivatiseringsreagens analyse. Selim et al. 23 undersøgte effektiviteten af to reagenser (4-aminoantipyren og kaliumferricyanid) under anvendelse af RF-PCD betingelser for analysen af phenolforbindelser sammenlignet med den konventionelle teknik med PCD anvendelse af 4-aminoantipyren og kaliumferricyanid. Denne type af PCD teknikken kræver to pumper og reaktionen sløjfer for hver derivatiseringsreagens i modsætning til en pumpe og reaktionen loop for DPPH •. Forskellige phenolforbindelser og alkylbenzen forbindelser blev analyseret under konventionelle og RF PCD betingelser. Interessant ikke-phenolforbindelser der ikke blev opdaget efter den normale metode var faktisk detekteret under RF-PCD betingelser. Figur 9 viser UV-Vis kromatografisk respons og RF-PCD kolorimetriske reaktion på en standard test mix. RF-PCD forudsat en forenklet PCD teknik i form af instrumentering, uden kompromis adskillelse præstation som observeret i figur 10. Figur 10 sammenligner peak profil p-cresol, når analyseret af RF-PCD og også uden derivatisering. Det kan ses, at topbredden af RF-PCD kromatogram er meget lig den for uderivatiseret kromatogram. Den største forskel mellem de to kromatogrammer er, at RF-PCD kromatogram er lidt bredere ved basen. Dette viser, at der er lidt at ingen top dispersion på grund af RF-PCD teknik. Et lignende respons blev observeret i figur 9, der viser, at det ikke kun er p-cresol top, der har lignende topbredde når derivatiseret med RF-PCD sammenlignet med dens uderivatiseret højdepunkt, men alle phenoler og alkylbenzenes der reagerede på derivatisering ordningen viste samme tendens. Selv RF-PCD med anvendelsen af to derivatiseringsreagenser opnået en lignende separation ydeevne til de konventionelle ikke-derivatisering metode, RF-PCD tilladt til selektiv detektering af phenolforbindelser, hvoraf der ikke blev detekteret under ikke-derivatiserede betingelser .
Som RF-PCD er en udvikling af konventionelle HPLC-PCD metoder, alle de tuning værktøjer til rådighed i generelle HPLC-metoder såsom mobil fase sammensætning og strømningshastighed, injektionsvolumen og analyse bølgelængde gælder for RF-PCD metoder. Endvidere tuning værktøjer til rådighed i konventionelle HPLC-PCD fremgangsmåder, såsom den mobile fase til PCD reagens strømningshastighedsforhold samt PCD reagenssammensætningen gælder for RF-PCD metoder. En ekstra tuning værktøj til rådighed, når du bruger RF-PCD, som ikke findes i konventionelle PCD metoder er forholdet mellem strømme, der kommer fra det centrale og periferehavne i kolonnen. Strømningerne styres ved at ændre den relative modtryk på hver af linjerne ved styring af længden og / eller indre diameter af stolpen detektor (eller post kolonne, hvis der ikke detekteres strømmen, der kommer fra den centrale port) rør. Det optimale forhold mellem den centrale til perifere strømme afhænger af pågældende reaktion, samt andre faktorer, såsom, hvorvidt den centrale port bliver detekteret eller ej. En strøm på 60% perifere og 40% centrale er ofte et godt udgangspunkt.
Som med tuning parametre, mange af de problemer, der kan opstå ved brug af RF-PCD søjle er også fælles med konventionelle PCD metoder. En bestemt parameter at chromatographer skal være opmærksom på, når der udføres RF-PCD analyser er stabiliteten af flow og tryk i systemet, og herunder af reagenset pumpe (r). Hvis flowet i systemet ikke er stabilt, kan det forårsage baseline ustabilitet derfor faldendesignal-støjforhold og efterfølgende grænserne for kvantificering og detektion.
RF-PCD kromatografi er udviklet til at overvinde vanskeligheder med at tilpasse PCD reaktioner på moderne HPLC kolonner og systemer. Den største fordel ved RF-PCD sammenlignet med konventionelle PCD metoder er mere effektiv blanding grund af at det finder sted inde i en fritte i endefittingen af RF-søjle, og denne blanding er på et lidt højere modtryk. Dette giver mulighed for minimering eller fjernelse af de store mængder reaktionsprodukter sløjfer, der bruges i mange konventionelle PCD metoder. Med denne minimering af post kolonne døde volumen, kan udføres mere effektive separationer med større kromatografisk opløsning.
RF-PCD-tilstand har medført forbedringer i separation effektivitet, topform og signal til støj sammenlignet med konventionelle PCD metoder. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at signal forbedringer er detektor afhængige. For eksempel detektorerat prøvemængde afhængige kan ikke udvise en forøgelse i signal respons under RF-PCD betingelser sammenlignet med konventionelle metoder. Dette skyldes under konventionelle metoder 100% af den kolonne prøve detekteres, hvor under RF-PCD betingelser kun en vis procentdel af de på søjle prøven detekteres afhængigt af segmentering forholdet. Det er imidlertid forudset, at RF-PCD reaktioner vil kunne tilpasses til en eller to reagens (så længe begge reagenser tilsættes samtidigt) PCD reaktion med minimal re-optimering, og at fordelene observeret for alle tre reaktioner hidtil testet vil oversætte til alle andre PCD reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatization system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method. | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
References
- Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
- Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
- Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
- Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
- Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
- Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
- Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
- Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
- Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
- Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
- Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
- Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
- Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
- Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
- Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
- Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
- Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
- Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
- Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
- Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
- Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
- Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
- Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
