Introduction
High performance liquid chromatografie (HPLC) in combinatie met post column derivatisering (PCD) is een krachtige tool die nuttig zijn bij het oplossen van een aantal zaken in het analytisch laboratorium is. Het kan worden gebruikt om verbindingen die anders ondetecteerbaar de reeks detectoren verkrijgbaar zijn 1,2 detecteren, verhogen het signaal van het doelanalyt, waarbij ondergrenzen van detectie en kwantificering 3-5 toelaat of selectief derivatiseren een doelanalyt ter voorkoming matrixeffecten 6. Algemeen gebruikte PCD reacties omvatten de omzetting van amines, zoals aminozuren, met ortho-phthaladehyde 7-9, ninhydrine 9,10 of 11,12 fluorescamine, de derivatisering van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met de 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil groep (DPPH •) 13,14 of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) 15,16 en het gebruik van de jodide-azide reagens zwavel c derivatiserenontaining verbindingen 17,18.
Er zijn echter vele nadelen aan het gebruik van PCD reacties met HPLC systemen 6. Voornamelijk hiervan is het gebruik van spoelen reactie tussen het punt van toevoeging van het derivatiseringsreagens (s) en de detector, welke tijd mogelijk maken voor het mengen en de reactie plaatsvinden 8. Deze reactie lussen vaak volumes van 500 ul of meer, die significant in vergelijking met het volume van de rest van het HPLC-systeem 19. Het gebruik van deze hoge reactievolume lussen resulteert in verhoogde piekverbreding vergeleken met wat zou worden waargenomen zonder de aanwezigheid van de reactielus. Dit resulteert in kortere, bredere pieken die hoger kwantificeringsgrenzen en detectie hebben en negatief beïnvloedt chromatografische resolutie. Figuren 1 en 2 benadrukken de verslechtering van piekvorm die resulteren uit de toevoeging van verschillende postkolom reactielus volumes. deze analysewerd uitgevoerd met een mobiele fase mengsel van 94% methanol en 6% Milli-Q water. De stroomsnelheid van de mobiele fase was 1 ml / min, het injectievolume was 20 ui en de golflengte analyse was 265 nm. Spoelen van verschillende dode volume van 20 pl tot 1000 ul werden ingevoegd tussen de kolom en de detector om de effecten van reactielus dood volume in PCD werkwijzen simuleren. Deze lussen werden uit roestvrij stalen buis van 0,5 mm inwendige diameter. Het experiment werd uitgevoerd op een HPLC-systeem dat bestaat uit een regelaar (SCL-10AVP), een lage druk Gradient klep (FCL-10ALVP), een pomp (LC-20AD), een injector (SIL-10ADVP), en een PDA detector ( SPD-M10ADVP). De mobiele fase werd door een ontgasser gepompt voorafgaand aan het inbrengen in het HPLC-systeem. De scheiding werd uitgevoerd met een 250 mm x 4,6 mm ID kolom 5 urn. Proefomstandigheden werden gekozen typisch PCD reacties die onlangs in de literatuur bekend zijn.
Deeenvoudigste, het meest voorkomende postkolom reactor opstelling wordt aangeduid als een niet-gesegmenteerde buisvormige reactor die in feite een lange, dunne buis waardoor de vloeistof kan stromen en de reactie kan plaatsvinden. In dit systeem piekverbreding is afhankelijk niet alleen het dode volume toegevoegd aan het systeem, maar ook de inwendige diameter van de buis zoals door Iijima et al. 8. Bovendien spoelgeometrie een rol speelt bij de waargenomen merk verbreding. Stewart 20 verklaard dat het wikkelen van de reactor verandert de secundaire stroom profielen, wat resulteert in betere menging, waardoor het dode volume geminimaliseerd worden. Men heeft gezegd dat de piek verbreding niet significant is bij het gebruik van een open rond gebreide spoel 21. Wanneer de piekverbreding overmatig groot, kunnen andere soorten reactoren ook worden overwogen 20,22. Deze kunnen onder meer bed reactoren of gesegmenteerde stroom reactoren. Deze reactoren zijn in het bijzonder bruikbaar voor langzame reacties die anders require grote reactie loops. Als niet-gesegmenteerde buisvormige reactoren zijn de meest voorkomende soorten reactoren worden gebruikt in PCD-toepassingen, de rest van dit artikel gaat met dit type reactor setup.
Het ontwerp van de reactiekolom stroom (RF) omvat een multi-poort eindfitting waarmee mobiele fase om de kolom af te sluiten (of voer) met een enkele poort aan het radiale centrale gebied van de kolom of drie poorten aan de buitenste wandgebied van de kolom (zie figuur 3). Beide stromen worden gescheiden onder toepassing van een eindfitting die een centrale poreuze frit die wordt omgeven door een ondoordringbare ring die op zijn beurt omgeven door een buitenste poreuze frit die zich uitstrekt naar de kolomwand. Door de centrale ondoordringbare ring dwarsstroom niet tussen de twee poreuze gebieden.
Tijdens de reactie stroom chromatografie, worden de derivatiseringsreagens (s) tegen de richting van de mobiele fasestroom gepompt in een of two van de buitenste poorten van de reactiekolom stroom. De kolom eluent wordt gemengd met het derivatiseringsreagens (s) in de buitenste frit en doorgegeven aan de detector via een buitenmantel poort. Reactie stroom kan worden gebruikt voor een enkele reagens derivatisering (1 poort voor het derivatiseringsreagens, 1 poort naar de kolom eluent doorgeven aan de detector en 1 poort geblokkeerd) of een dubbele reagenssysteem (2 poorten voor de derivatisering reagentia en 1 poort langs de kolom elutiemiddel waardoor de detector). De stroom uit de centrale stroom kan worden gebruikt om de gederivatiseerde kolom eluent effectief multiplexing detectie 23, of doorgegeven aan afval detecteren.
Een belangrijke tuning techniek die beschikbaar is bij het uitvoeren van RF-PCD chromatografie is de verhouding tussen de centrale en perifere stromen. De optimale verhouding voor elke derivatisering afhankelijk van een aantal factoren als de centrale stroom wordt gedetecteerd of doorgegeven aan afval. Derhalve opnieuw de optimale verhouding is vastgesteld, Moet ervoor worden gezorgd dat de juiste stroom verhouding voorafgaand aan elke run wordt uitgevoerd wordt bereikt.
Gebleken is dat het gebruik van een frit op de kolom eluent stroom en derivatiseringsreagens RF-PCD leidt tot meer efficiënte menging in vergelijking met traditionele mengtechnieken die gebruiken typisch een dood volume nul T-stuk of klein dood volume meng W- piece de twee stromen te mengen. Dit heeft het gebruik van relatief kleine lussen reactie, of zelfs de eliminatie van de reactielus geheel. De vermindering van de reactielus formaat leidt tot scherpere pieken in vergelijking met traditionele postkolom derivatisering methoden. Dit betekent dat, hoewel niet alle van de kolom eluent gederivatiseerd, grotere signaal-ruisverhoudingen worden waargenomen en dus lagere detectiegrenzen en kwantificatie worden verkregen.
Reactie stroom chromatografie ontwikkeld om problemen met de aanpassing van PCD reactie overwinnens moderne HPLC kolommen en systemen, met name het rendementsverlies door bandverbreding door grote postkolom dode ruimten als gevolg van de noodzaak om gebruik grote reactievolume lussen. Hoe efficiënter mengprocessen in RF-PCD vergelijking met conventionele PCD dat kleinere reactielus volume worden gebruikt leidt tot een toename waargenomen scheidingsefficiëntie. Verder RF-PCD chromatografie toont beide verhoogd signaal en verminderde ruis in vergelijking met conventionele technieken PCD resulteert in lagere grenzen van de detectie en kwantificering in vergelijking met conventionele methoden PCD. Een bijkomend voordeel van RF-PCD PCD vergelijking met conventionele werkwijzen is de mogelijkheid om de gederivatiseerde stroom die elueert uit de centrale poort van de RF kolom en het gederivatiseerde stroom die elueert uit het omtreksgebied van de kolom te volgen. RF-PCD is een relatief nieuwe, maar veelbelovende techniek die veel voordelen ten opzichte van traditionele methoden PCD weergeeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen).
Opmerking: Dit protocol beschrijft 3 methoden reactie stroming post-column derivatisering (RF-PCD) technieken, elk met een ander reagens eigen aan de aard van een chemische verbinding van belang. Voor de analyse van ROS naar de sectie "1. Detectie van ROS gebruik DPPH •", voor de analyse van primaire amines zie rubriek "2. Detectie van primaire amines met behulp van fluorescamine", en voor de analyse van fenolverbindingen ga naar de sectie "3 . Detectie van fenolenhet gebruik van 4-aminoantipyreen en kalium ferricyanide ". Gebruik ultrapuur water (bv, Milli-Q-water) in de gehele.
Noot: aansluiting van de RF kolom wordt bereikt bijna dezelfde wijze als een gebruikelijke HPLC-kolom met als belangrijkste verschil het aantal eindfittingen een RF kolom. Fittingen gebruikt om een standaard HPLC-kolom HPLC systeem verbinding kunnen worden gebruikt om een RF kolom sluiten op het HPLC systeem.
1. Detectie van ROS gebruik van DPPH •
- Opzetten van HPLC instrument
- Bereid de HPLC instrument met 100% water op lijn A en 100% methanol op lijn B als de mobiele fase. Spoel de pomp volgens de eisen van de fabrikant.
- Stel de HPLC instrumentele elementen en de aanvullende derivatisering pomp zoals weergegeven in figuur 4A.
- Stel de UV-Vis detector geanalyseerd bij een golflengte van 520 nm.
- Opzetten vanRF column
- Sluit de inlaat van de RF kolom HPLC instrument.
- Sluit een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang aan de centrale poort van de RF-kolom uitlaat.
- Sluit een uitlaatopening periferiepoort de UV-Vis detector met een 15 cm lengte van 0,13 mm id buis.
- Sluit de DPPH • pompstreng een periferiepoort aan de uitgang van de RF kolom.
- Blokkeer de ongebruikte periferiepoort aan de uitgang van de RF-kolom onder toepassing van een kolom stopper.
- Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp 1 ml min-1 bij 100% lijn B - 100% methanol.
- Equilibreren van de kolom met 100% methanol mobiele fase gedurende 10 min bij 4,6 mm ID x 100 mm kolomlengte. Deze tijd moet worden geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken.
- Bereiding van DPPH • reagens
- Bereid een 0,1 mg / ml oplossing van DPPH • in methanol. Ultrasone trillingen de kolf die de DPPH • reagens gedurende 10 min.
- Bedek de kolf in folie ter voorkoming van blootstelling aan licht.
- Spoel de DPPH • pomp met de voorbereide DPPH • reagens volgens de eisen van de fabrikant.
- Tuning van de kolom stopcontact RF
- Weeg nauwkeurig twee schone en droge vaten. Label ene vat als de centrale en de andere als perifere.
- Verzamel de effluent verlaat de centrale poort in het vat gelabelde centraal voor 1,0 min.
- Weeg de centrale poort vaartuig en bereken het gewicht van de stroom vanaf de centrale poort als volgt:
Gewicht van de Central Port (g) = eindgewicht van Central Port Vessel (g) - De aanvankelijke gewicht van Central Port Vessel (g) - Herhaal stap 1.4.2 en 1.4.3 van het effluent verlaat de UV-Vis dat voor het periferiepoort van de RF kolom wordt bevestigd en bereken gewicht voor de periferiepoort vaartuigvolgt:
Gewicht van perifere Port (g) = eindgewicht van Peripheral Port Vessel (g) - De aanvankelijke gewicht van perifere Port Vessel (g) - Bereken het percentage van de stroom uit de centrale en perifere poorten als volgt:
% Central Port = gewicht van het Centraal-Port (g) / (gewicht van Centraal-Port (g) + Gewicht van perifere Port (g)) x 100
% Perifere Port = gewicht van perifere Port (g) / (gewicht van Centraal-Port (g) + Gewicht van perifere Port (g)) x 100 - Zorg ervoor dat de segmentatie verhouding tussen de centrale stroming en de perifere stroom 30:70 (centraal: perifere). Als de centrale stroom boven 30%, verminderen de hoeveelheid stroom uittredend toevoegen van een lengte van 0,13 mm id slang aan de uitlaat van de centrale poort. Als de centrale stroom minder dan 30% verminderen de lengte van 0,13 mm slang van de centrale poort.
- Herhaal stap 1.4.1 tot 1.4.6 tot een segmentatie verhouding van 30:70 (CV: perifere) wordt bereikt.
- Stel het debiet van de DPPH • pomp reagens 0,5 ml min -1.
Opmerking: De RF kolom met DPPH • reagens is nu klaar voor analyse. Monsters kunnen nu worden geïnjecteerd.
- Bericht run shutdown voorwaarden
- Zodra alle van de monsters werden geïnjecteerd, wat aangeeft dat de run is voltooid, stopt de derivatiseringsreagens pomp flow.
- Verwijder de DPPH • reagens pomp lijn uit het perifere poort en sluit de poort.
- Equilibreren van de kolom met de mobiele fase waarin het wordt opgeslagen doordat de mobiele fase door de kolom stroomt in 1 ml min-1 gedurende 10 min.
- Stop de stroom van de mobiele fase pomp op de HPLC instrument.
- Vervang de DPPH • reagens met methanol en zuiveren de extra pomp.
Opmerking: Het HPLC-systeem kunnen nu worden afgesloten.
2. Detectie van primaire amines met behulp van tlamine
- Bereiding van de mobiele fase
- Bereid 1 L van een 10 mM ammoniumacetaat oplossing, de pH van de oplossing tot 9,0 met 5 M ammoniumhydroxide vóór verdunning volume.
- Voeg 52,6 ml acetonitril (ACN) voor de ammoniumacetaatbuffer een voorgemengde mobiele fase van 95:05 (buffer: ACN) bereiken.
- Opzetten van HPLC instrument
- Bereid de HPLC instrument de voorgemengde bereid buffer lijn A als de mobiele fase. Spoel de pomp volgens de eisen van de fabrikant.
- Stel de HPLC instrumentele elementen en de aanvullende derivatisering pomp zoals weergegeven in figuur 4A.
- Bevestig een pulsdemper spoel de derivatisering pomp.
- Set-up van de fluorescentie detector (FLD) met een golflengte van 390 nm en emissie golflengte van 475 nm.
- Opzetten van RF-kolom
- Sluit the inlaat van de RF kolom HPLC instrument.
- Sluit een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang aan de centrale poort van de RF-kolom uitlaat.
- Sluit een uitlaat perifere poort van de RF-kolom om de FLD detector met behulp van een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang.
- Sluit de derivatisering pompstreng een periferiepoort aan de uitgang van de RF kolom.
- Blokkeer de ongebruikte periferiepoort aan de uitgang van de RF-kolom onder toepassing van een kolom stopper.
- Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp 1 ml min-1 bij 100% lijn A - 10 mM ammoniumacetaat buffer pH 9, voorgemengd met 5% ACN.
- Equilibreren de kolom met de 100% lijn A mobiele fase gedurende 10 min voor een 4,6 mm ID x 100 mm lengte van de kolom. Deze keer kan worden geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken.
- Bereiding van fluorescamine reagens
- Voeg 100 ml van een 0,1 mg ml -1 fluorescamine reagens. <li> Sonificeer 1 min.
- Dek af met folie om de blootstelling aan licht.
- Spoel de reagens pomp met de voorbereide fluorescamine reagens volgens de eisen van de fabrikant.
- Weeg nauwkeurig twee schone en droge vaten. Label ene vat als de centrale en de andere als perifere.
- Verzamel de effluent verlaat de centrale poort in het vat gelabelde centraal voor 1,0 min.
- Weeg het centrale vat en bereken het gewicht van de stroom vanaf de centrale poort als volgt in stap 1.4.3.
- Herhaal stappen 2.5.2 tot 2.5.3 van het effluent verlaat de FLD dat voor het periferiepoort van de RF kolom wordt bevestigd en bereken gewicht perifere als volgt in stap 1.4.4.
- Bereken het percentage van de stroom uit de centrale en perifere havens als volgt in stap 1.4.5.
- Zorgen de segmentering verhouding tussen de centrale stroming en de perifereflow is 43:57 (centraal: perifere). Als de centrale stroom boven 43%, verminderen de hoeveelheid stroom uittredend toevoegen van een lengte van 0,13 mm id slang aan de uitlaat van de centrale poort. Als de centrale stroom onder 43%, verminderen de lengte van 0,13 mm slang van de centrale poort.
- Herhaal stap 2.5.1 tot 2.5.6 tot een segmentatie verhouding van 43:57 (CV: perifere) wordt bereikt.
- Stel het debiet van de mobiele fase pomp 0,7 ml min -1.
- Stel de derivatisering pomp stroomt bij 0,1 ml min -1.
Opmerking: De RF kolom met fluorescamine reagens is nu klaar voor analyse. Monsters kunnen nu worden geïnjecteerd.
- Zodra alle van de monsters werden geïnjecteerd, wat aangeeft dat de run is voltooid, stopt de derivatisering pomp.
- Verwijder de derivatisering pomp lijn uit het perifere haven en de stopper.
- Equilibreren van de kolom met de mobiele fasedie moet worden opgeslagen doordat de mobiele fase door de kolom stroomt in 1 ml min-1 gedurende 10 min.
- Stop de stroom van de mobiele fase pomp.
- Vervang de fluorescamine reagens met acetonitril en zuiveren de derivatisering pomp.
Opmerking: Het HPLC-systeem kunnen nu worden afgesloten.
3. Detectie van fenolen gebruik van 4-aminoantipyreen en kaliumferricyanide
- Bereiding van de mobiele fase
- Bereid 1 liter van een 100 mM ammoniumacetaat oplossing, de pH van de oplossing tot 9,0 met 5 M ammoniumhydroxide vóór verdunning volume.
- Voeg 52,6 ml methanol aan ammoniumacetaat buffer tot een voorgemengde mobiele fase van 95 bereiken: 5 (buffer: methanol).
- Opzetten van HPLC instrument
- Bereid de HPLC instrument de voorgemengde bereid buffer lijn A als de mobiele fase. Spoel de pomp volgens de fabrikant '; S eisen.
- Stel de HPLC instrumentele componenten en de twee extra reagens pompen zoals weergegeven in figuur 4B.
- Bevestig een pulsdemper spoel aan elk van de reagens pompen.
- Stel de UV-Vis detector geanalyseerd bij een golflengte van 500 nm.
- Opzetten van RF-kolom
- Sluit de inlaat van de RF kolom HPLC instrument.
- Sluit een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang aan de centrale poort van de RF-kolom uitlaat.
- Sluit een uitlaat periferiepoort van de RF kolom om de UV-Vis detector met een 15 cm lengte van 0,13 mm id buis.
- Sluit elke reagens (dat wil zeggen 4-aminoantipyreen en kalium ferricyanide) pompstreng een periferiepoort aan de uitgang van de RF kolom.
- Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp 1 ml min-1 bij 100% lijn A - 100 mM ammoniumacetaat buffer pH 9, voorgemengd met 5% methanol.
- Equilibreren van de kolom wet de 100% lijn A mobiele fase gedurende 10 min voor een 4,6 mm ID x 100 mm lengte van de kolom. Deze keer kan worden geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken.
- Bereiding van 4-aminoantipyreen reagens
- Bereid een ammonium acetaat buffer met een pH van 9 door stap 3.1.1.
- Weeg 150 mg 4-aminoantipyreen en los op in 100 ml bereide ammoniumacetaat-buffer (pH 9).
- Sonificeer 1 min.
- Dek af met folie om de blootstelling aan licht.
- Ontlucht het eerste reagens pomp met de bereide 4-aminoantipyreen reagens volgens voorschriften van de fabrikant.
- Bereiding van kalium ferricyanide reagens
- Weeg 150 mg kalium ferricyanide en los op in 100 ml ammoniumacetaat buffer (pH 9) bereid volgens stap 3.1.1.
- Sonificeer 1 min.
- Bedek in folie ter voorkoming van blootstelling aan licht.
- Purge het tweede reagens pomp met de bereide kalium ferricyanide reagens volgens voorschriften van de fabrikant.
- Afstemmen van de RF-kolom
- Weeg nauwkeurig twee schone en droge vaten. Label ene vat als de centrale en de andere als perifere.
- Verzamel de effluent verlaat de centrale poort in het vat gelabelde centraal voor 1,0 min.
- Weeg het centrale vat en bereken het gewicht van de stroom vanaf de centrale poort als volgt in stap 1.4.3.
- Herhaal stappen 3.6.2 tot 3.6.3 van het effluent verlaat de UV-Vis dat voor het periferiepoort van de RF kolom wordt bevestigd en bereken gewicht perifere als volgt in stap 1.4.4.
- Bereken het percentage van de stroom uit de centrale en perifere havens als volgt in stap 1.4.5.
- Zorg ervoor dat de segmentatie verhouding tussen de centrale stroming en de perifere stroom 50:50 (centraal: perifere). Als de centrale stroom boven 50%, verminderen devochtverlies uittredend toevoegen van een lengte van 0,13 mm id slang aan de uitgang centrale poort. Als de centrale stroming dan 50%, verminderen de lengte van 0,13 mm slang van de centrale poort.
- Herhaal stap 3.6.1 tot 3.6.6 tot een segmentatie verhouding van 50:50 (CV: perifere) wordt bereikt.
- Stel het debiet van de 4-aminoantipyreen pomp 0,5 ml min -1.
- Stel het debiet van het kalium- ferricyanide pomp 0,25 ml min -1.
Opmerking: De RF kolom met de tweecomponenten reagentia is nu klaar voor analyse. Monsters kunnen nu worden geïnjecteerd.
- Bericht run shutdown voorwaarden
- Zodra alle van de monsters werden geïnjecteerd de run is voltooid, wat aangeeft dat de run is voltooid, stopt zowel van het reagens pompen.
- Verwijder de reagens pomp lijnen uit het perifere havens en ze te vervangen door een 15 cm stuk van 0,13 mm buis.
- Equilibreren van de kolom met de mobiele fase in which moet worden opgeslagen doordat de mobiele fase door de kolom stroomt in 1 ml min-1 gedurende 10 min.
- Stop de stroom van de mobiele fase pomp op de HPLC instrument.
- Vervang beide reagentia op het reagens pompen met methanol en zuiveren de extra pompen volgens eis fabrikant.
Opmerking: Het HPLC-systeem kunnen nu worden afgesloten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste PCD methode die werd aangepast voor RF-PCD is de derivatisering van antioxidanten met de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil groep (DPPH •) 24. Deze reactie werd geïntroduceerd door Koleva et al. 25 en is op grote schaal gebruikt sinds. De detectie is gebaseerd op de ontkleuring van de DPPH • radicalen in aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies, vandaar de aanwezigheid van antioxidanten leidt tot een daling van de absorptie waargenomen. De DPPH • reactiemengsel werken vaak grote lussen reactie van 500 ul of meer 13-15, werd echter gevonden dat bij gebruik van de RF-kolom PCD geen reactielus was vereist. Figuur 5 toont twee chromatogrammen van een monster van Ristretto koffie gederivatiseerd met de DPPH • radicale gebruik van zowel conventionele PCD en RF-PCD instrumentatie.
De tweede PCD methode die is aangepast voor gebruik door RF-PCD is de derivatization van vier aminozuren (glycine, leucine, fenylalanine en tryptofaan) via fluorescamine als derivatiseringsreagens 23. De methode werd aangepast van het werk van Udenfriend et al. 11 met de mobiele fase samenstelling, concentratie en fluorescamine fluorescami- debiet geoptimaliseerd voor RF kolommen. De conventionele werkwijze gebruikt twee reagentia derivatisering systeem waarbij pH 9,0 buffer om de effluentstroom toegevoegd vóór de toevoeging van de fluorescamine-reagens, terwijl de RF-PCD werkwijze gebruik gemaakt van een mobiele fase die reeds gebufferd, dus slechts één reagens derivatisering systeem nodig was. Voor deze toepassing werd gederivatiseerd stroom 390 nm geanalyseerd met UV-zichtbaar-detector, die overeenkomt met de excitatiegolflengte gebruikt voor detectie door fluorescentie. De derivaten van stroom kon worden gedetecteerd met behulp van een fluorescentiedetector, waardoor een grotere signaal-ruis en dus lagere detectielimieten en quantitation, volgens het werk van Udenfriend et al. 11. Voorts het eluens uit de centrale poort van de RF-PCD opstart werd geanalyseerd met een tweede UV-zichtbaar-detector.
De prestaties van de RF-PCD werkwijze voor de derivatisering van aminozuren vergeleken met de conventionele methode PCD. Tabel 1 vermeldt de berekende grens van kwantificering en detectie voor elk van de aminozuren in beide RF-PCD en PCD conventionele wijzen geanalyseerd. De detectiegrens werd gedefinieerd als de concentratie waarbij een signaal-ruisverhouding van 2 werd verkregen onder de limiet van kwantificatie werd gedefinieerd als de concentratie waarbij een signaal-ruisverhouding van 10 werd bereikt plaatsvindt. Figuur 6 toont een chromatogram van de vier aminozuren geanalyseerd met de gebruikelijke werkwijze PCD, de RF-PCD werkwijze en het gederivatiseerde stroom uit de RF-PCD werkwijze. Figuur 7 is een vergelijking van de signalen verkregen van de erwtks door glycine en leucine zowel met de conventionele methode PCD en de RF-PCD methode. Figuur 8 vergelijkt het piekbreedte van de tryptofaan piek bij de analyse met de conventionele methode PCD, de RF-PCD werkwijze en het gederivatiseerde stroom uit de RF- PCD methode.
De uiteindelijke PCD methode die is aangepast voor gebruik door RF-PCD 26 is de derivatisering van vier fenolen (fenol, 4-methoxyfenol, p-cresol en tocoferol). De methode werd aangepast van het werk door Bigley en Grob 27 met kleine wijzigingen in de methode voor gebruik met RF kolommen optimaliseren. Dit werk gebruikt een tweecomponenten derivatiseringsreactie waarbij oplossingen van zowel 4-amionantiprine en kalium ferricyanide aan de kolom eluent werd toegevoegd aan het eindstuk van de RF kolom. Het bleek dat bij gebruik van een RF-kolom voor de reactie zonder extra post reactiekolom lussen moest worden gebruikt. Figuur 9 toont een voorbeeld van een chromatogram waarbijeen 21-component testmonster dat sommige componenten die een reactie op de derivatisering regeling en andere niet werden gescheiden hebben, gederivatiseerd en gedetecteerd (zwarte sporen) tonen bevatte. Hetzelfde mengsel werd gescheiden en gedetecteerd gederivatiseerd ter vergelijking (rood sporen). In figuur 9 is de RF-PCD respons is aangegeven als een negatief antwoord voor eenvoudiger visuele markering (de detectorresponsie verkregen positief). Figuur 10 toont een vergelijking van de vorm van de piek van p-cresol zowel gederivatiseerd met de kolom RF-PCD en gederivatiseerd.
Figuur 1. Chromatografische overlay van hexylbenzeen geïnjecteerd op een HPLC-systeem met diverse dode volumes toegevoegd tussen de kolom en de detector. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Chromatografische overlay tolueen, ethylbenzeen en propylbenzeen geïnjecteerd op een HPLC-systeem met diverse dode volumes toegevoegd tussen de kolom en de detector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Illustratie van Reaction Flow kolom ontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg "/>
Figuur 4. Instrumentale opzetten van RF-PCD. (A) enkele reagens (dat wil zeggen, DPPH • of fluorescamine derivatisatie reagentia) en (B) de dubbele reagens (dat wil zeggen, 4-aminoantipyreen en kaliumferricyanide derivatisatie reagentia). Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Figuur 5. Chromatogrammen van de scheiding van Ristretto koffie met detectie na postkolom derivatisering met het 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil groep (DPPH •). De derivatisering werd uitgevoerd met een gebruikelijke kolom met een 500 pl reactie spoel (A) en een reactie stroom column (B rong>). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Chromatografische overlay van vier aminozuren (glycine (G), leucine (L), fenylalanine (P) en tryptofaan (T)) over het bereik van 10 tot 1000 dpm gedetecteerd door postkolom derivatisering met behulp fluorescamine als PCD reagens na scheiding door HPLC. De chromatogrammen zijn als volgt: (A) conventioneel PCD, (B) RF-PCD, en (C) centraal (gederivatiseerd) poort van RF-PCD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
_upload / 53462 / 53462fig7.jpg "/>
Figuur 7. Vergelijking van de verkregen signalen voor glycine (eerste piek) en leucine (tweede piek) van conventionele PCD (rood sporen) en RF-PCD (zwart trace). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. piekbreedte vergelijking van de piek als gevolg van tryptofaan op basis van (A) en retentietijd (B) piekvolume. The black trace toont de conventionele werkwijze PCD rood tracering toont RF-PCD werkwijze en de groene tracering toont gederivatiseerd stroom uit de centrale poort van de RF-PCD-methode. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Chromatografische scheiding van een kunstmatige monster. De componenten omvatten fenol (P), 4-methoxyfenol (M), p-cresol (C) en tocoferol (T) en talrijke alkylbenzenen, meerkernige aromatische koolwaterstoffen, anisool, phentanole, cafeïne, fenylalanine en benzamide. De pieken gemerkte i, ii en iii zijn alkylbenzenen die onverwacht reageerde op de derivatisering regeling. De zwarte trace vertegenwoordigt het gederivatiseerde reactie met behulp van een UV-detector bij 254 nm, terwijl de rode trace het gederivatiseerde reactie bij 500 nm vertegenwoordigt. Noot voor visuele helderheid van de gederivatiseerde reactie is omgekeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
![figuur 10]("/files/ftp_upload/53462/53462fig10.jpg")
Figuur 10. Chromatografische reactie van p-cresol. De zwarte trace vertegenwoordigt de gederivatiseerde reactie met behulp van een UV-detector bij 254 nm, terwijl de rode trace de gederivatiseerde (RF-PCD) respons bij 500 nm vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
| type reactie | glycine | leucine | fenylalanine | tryptofaan | ||||
| LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | |
| RF-PCD | 6 | 25 | 10 | 100 | 25 | 250 | 50 | 250 |
| RF-PCD centrale poort (gederivatiseerd) | Niet gedetecteerd | Niet gedetecteerd | Niet gedetecteerd | 1 | 10 | |||
| conventionele PCD | 10 | 100 | 50 | 500 | 50 | 500 | 100 | 500 |
Tabel 1. detectiegrenzen en kwantificering van vier verschillende aminozuren gedetecteerd door verschillende postkolom derivatisering systemen met fluorescamine als derivatiseringsreagens na scheiding door HPLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RF-PCD maakt het efficiënt mengen van het derivatiseringsreagens het effluent na de kolom HPLC zonder gebruik van reactie spoelen, het minimaliseren van de effecten van bandverbreding en verbetering scheidend vermogen. RF-PCD werkwijzen hebben ook aangetoond verbeterd signaal respons met betrekking tot detectie methode. Camenzuli et al. 28 was de eerste die de toepassing van reactie stroom kolommen met DPPH • voor de detectie van ROS in een espresso monster melden. Hun studie omvatte de analyse en optimalisatie van RF voorwaarden voor maximale prestaties te bereiken, het testen van een reeks van DPPH • concentraties met diverse DPPH • reagens debieten. Geconcludeerd werd dat een DPPH • concentratie van 0,1 mg ml-1 met een DPPH • reagens stroomsnelheid van 0,5 ml min-1 is optimaal voor een verbeterd scheidend vermogen (dwz efficiëntie en gevoeligheid) onder RF-PCDvoorwaarden vergelijking met de conventionele methode PCD DPPH • derivatisering. Figuur 5 toont twee chromatogrammen gebruikmaking van de DPPH • bepaling van antioxidantia in een espresso monster. Bijzonder interessant zijn de hoge intensiteit pieken met retentietijden van ongeveer 5 minuten. Te zien is dat bij gebruik van een 500 gl reactie lus, die typisch zijn DPPH • derivatisering werkwijzen kunnen een enkele, brede piek worden waargenomen. Wanneer de RF-PCD methode wordt gebruikt zonder dat een reactielus, wordt duidelijk dat de enkele piek waargenomen met een 500 gl lus inderdaad twee pieken. Bovendien kunnen extra detail worden gezien na 5,5 min bij gebruik van de RF-PCD setup. Dus voor de analyse van ROS in monsters met behulp DPPH • de techniek van RF-PCD bleek beter dan de gebruikelijke werkwijzen van ROS analyse met DPPH • zijn.
RF-PCD metfluorescamine reagens is gebruikt voor de analyse van primaire aminozuren en vergeleken met de conventionele PCD met fluorescamine 20. Omdat de RF kolom end-fitting ook een platform voor gemultiplexte detectie, werd het gederivatiseerde middenuitstromer bewaakt via UV-Vis, terwijl de derivatisering tussen effluent en fluorescamine in het buitengebied van het RF-end fitting werd uitgevoerd en gedetecteerd via UV- Vis. Een testreeks standaarden met vier aminozuren werden geanalyseerd in gemultiplexte RF-PCD omstandigheden. Figuur 6 vergelijkt het chromatografische profiel van de conventionele methode van PCD (figuur 6A) en RF-PCD (detectie van gederivatiseerd (figuur 6B) en gederivatiseerd (fig 6C)) van de reeks aminozuren. Figuur 7 is een overlay van twee aminozuren signalen verkregen door middel van conventionele RF-PCD en PCD. Te zien is dat de efficiëntere scheiding waargenomen door tHij verwijdering van de reactielus heeft verhoogde signaal respons, hoewel niet al het kolomeffluent werd gederivatiseerd. Bovendien, hoe efficiënter derivatiseringsreagens mengschema tot lagere basislijnruis, verdere verhoging van de signaal-ruisverhouding. Dit effect wordt bevestigd in de ondergrenzen van detectie en kwantificering berekend voor de RF-PCD gebruiken, vergeleken met de conventionele PCD werkwijze in Tabel 1. Deze trend is ook te zien in figuur 5, waar de antioxidantreactie op DPPH • is groter voor de RF-PCD gebruiken, vergeleken met de conventionele methode PCD. Significante piek nadelige beïnvloeding waarneembaar in de chromatogrammen wanneer geen conventionele PCD opstelling werd gebruikt wat leidt tot lagere signaal respons van deze werkwijze.
Figuur 8 vergelijkt de piek profiel van tryptofaan wanneer geanalyseerd door RF-PCD (zowel gederivatiseerd en gederivatiseerd beken) en conventionele PCD. Als de piek profiel wordt uitgezet tegen de tijd van de piek breedtes lijken allemaal in grote lijnen vergelijkbaar (zie figuur 8A) zijn. De verbeteringen die in RF-PCD in vergelijking met conventionele PCD zijn duidelijk wanneer de piek profiel is uitgezet tegen de piek volume (figuur 8B). Wanneer uitgezet tegen piekvolume, is het duidelijk dat terwijl de RF-PCD hoogtepunt blijkt een kleine hoeveelheid afbraakproducten in vergelijking met de gederivatiseerde piek, de afbraak is echter minimaal vergeleken met dat van de conventionele methode PCD. De verbeteringen in scheidend vermogen van RF-PCD vergelijking met conventionele PCD worden ook getoond in figuur 7 waarin de piekvormen van glycine en leucine vergelijkt na derivatisering van zowel conventionele PCD en RF-PCD. Te zien is dat bij conventionele PCD modus glycine en leucine pieken nauwelijks basislijn gescheiden terwijl RF-PCD modus het signaal bij aanvang voor een veel langere periode tussen de twee pieken.
Eenextra voordeel van RF-PCD PCD vergelijking met conventionele werkwijzen is het vermogen om gederivatiseerde effluent bewaken van de centrale poort van de RF kolom mogelijk gemultiplexte detectie. Dit is mogelijk omdat het ontwerp van de frit in de RF koppelstuk niet kunnen doorstromen in radiale centrale gebied te mengen met de stroom in het omtreksgebied van de eindfitting, waardoor controle van de gederivatiseerde stroom uit de buitenste regio de fitting en de monitoring van de gederivatiseerde stroom uit de centrale poort. Dit vermogen wordt benadrukt door de verkregen tryptofaan in Tabel 1, waarvan bekend is dat slecht signaal respons na derivatisering hebben gevonden door fluorescamine 20 echter, in tegenstelling tot andere aminozuren het een reactie op UV-detectie toont wanneer gederivatiseerd (bij 280 nm) . Zowel derivatisering systemen de detectielimieten en kwantificering relatief hoog, maar de grenzen van detectie en kwantificering waren veel lager tHij gederivatiseerd stream. Met de mogelijkheid om zowel gederivatiseerde en gederivatiseerd effluentstromen de detectie parameters worden geoptimaliseerd om de hoogste prestatieniveau voor elk aminozuur, worden nageleefd.
De multiport ontwerp van de RF-end-fitting zorgt voor dual derivatiseringsreagens analyse. Selim et al. 23 onderzochten de prestaties van twee reagentia (4-aminoantipyreen en kalium ferricyanide) via RF-PCD omstandigheden voor onderzoek van fenolische verbindingen in vergelijking met de conventionele techniek van PCD gebruik 4-aminoantipyreen en kalium ferricyanide. Dergelijke PCD techniek vereist twee pompen en reactie lussen per derivatiseringsreagens in plaats van een pomp en reactielus voor DPPH •. Diverse fenolische en alkylbenzeen verbindingen werden geanalyseerd onder gebruikelijke omstandigheden en RF PCD. Interessant, niet-fenolische verbindingen die niet volgens de klassieke methode werden gedetecteerd in feite ontdekt under RF-PCD omstandigheden. Figuur 9 toont het UV-Vis chromatografische respons en de RF-PCD colorimetrische reactie op standaardtest mix. RF-PCD voorzien van een vereenvoudigde PCD techniek op het gebied van instrumentatie, zonder compromissen van de scheiding prestaties zoals waargenomen in figuur 10. Figuur 10 vergelijkt de piek profiel van p-cresol bij analyse door RF-PCD en ook zonder derivatisering. Te zien is dat de piekbreedte van de RF-PCD chromatogram is zeer vergelijkbaar met die van het gederivatiseerde chromatogram. Het belangrijkste verschil tussen de twee chromatogrammen is dat de RF-PCD chromatogram is iets breder bij de basis. Hieruit blijkt dat er weinig tot geen piek dispersie door de RF-PCD techniek. Een vergelijkbare reactie werd waargenomen in figuur 9, waaruit blijkt dat het niet alleen de p-cresol piek die soortgelijke piekbreedte bij gederivatiseerd door RF-PCD vergelijking met zijn gederivatiseerd maximum had, maar alle fenolen en alkylbenzenes die reageerden op de derivatisering regeling toonde deze zelfde trend. Hoewel RF-PCD met het gebruik van twee derivatisering reagentia tot een soortgelijk scheidingsprestatie met de conventionele niet-derivatisatie methode, de RF-PCD toegestaan voor de selectieve detectie van fenolische verbindingen, waarvan er één die niet onder niet-gederivatiseerde condities gedetecteerd .
Als RF-PCD is een ontwikkeling van conventionele HPLC-methoden PCD, alle tuningtools in het algemeen HPLC werkwijzen zoals mobiele fase samenstelling en debiet, injectievolume en golflengte analyse toepassing op RF-PCD methoden. Bovendien tuningtools in conventionele HPLC-PCD methoden, zoals de mobiele fase PCD reagens debietverhouding en de PCD reagenssamenstelling gelden voor RF-PCD methoden. Een extra tuning tool beschikbaar wanneer RF-PCD die in conventionele werkwijzen PCD is niet de verhouding van stromen afkomstig van de centrale en periferepoorten van de kolom. De stromingen worden geregeld door het veranderen van de relatieve tegendruk op elk van de lijnen door het regelen van de lengte en / of inwendige diameter van de paal detector (of post kolom als de productstroom vanuit de centrale poort niet gedetecteerd) buizen. De optimale verhouding tussen de centrale perifere stromen afhankelijk van de reactie in kwestie, evenals andere factoren, zoals of de centrale poort wordt niet gedetecteerd of. Een stroom verhouding van 60% perifere en 40% centrale is vaak een goed uitgangspunt.
Zoals met de tuning parameters, veel van de problemen die kunnen ontstaan bij het gebruik van de RF-kolom PCD gewoonlijk ook met gebruikelijke werkwijzen PCD. Een bepaalde parameter die de chromatographer moet zich bewust zijn van bij het uitvoeren van RF-PCD analyse is de stabiliteit van de stroming en druk in het systeem, met name van het reagens pomp (en). Als de stroming in het systeem is niet stabiel, kan dat leiden tot instabiliteit basislijn daarom verminderend designaal-ruisverhouding en vervolgens van kwantificering en detectie.
RF-PCD chromatografie ontwikkeld om aanpassingsmoeilijkheden PCD reacties moderne HPLC kolommen en te overwinnen. Het grote voordeel van RF-PCD PCD vergelijking met conventionele werkwijzen efficiënter mengen vanwege zijn plaats in een frit binnen het eindstuk van de RF kolom en deze menging op een iets hogere tegendruk. Dit maakt de minimalisatie of eliminatie van de grote reactievolume lussen die worden gebruikt in veel conventionele werkwijzen PCD. Met deze minimalisering van postkolom dode volume, kan efficiënter scheidingen met een grotere chromatografische resolutie worden uitgevoerd.
RF-PCD-modus heeft geleid tot verbeteringen in de scheidend vermogen, piek vorm en de signaal-ruis in vergelijking met conventionele methoden PCD. Het is echter belangrijk op te merken dat signaal verbeteringen detector afhankelijk. Bijvoorbeeld detectorsdat monster bedrag afhankelijk is misschien niet een verhoging van de signaal reactie onder RF-PCD omstandigheden in vergelijking met conventionele methoden vertonen. Dit is zo omdat volgens gebruikelijke werkwijzen van 100% op de kolom monster wordt gedetecteerd, waarbij onder RF-PCD omstandigheden slechts een bepaald percentage van de betreffende kolom monster wordt gedetecteerd afhankelijk van de segmentatie ratio. Er wordt echter verwacht dat RF-PCD reacties kunnen worden aangepast om een of twee reagens wordt (zolang beide reagentia worden toegevoegd tegelijk) PCD reactie met minimale re-optimalisatie en dat de voordelen waargenomen voor alle drie reacties tot nu toe getest wordt vertaald naar alle andere PCD reacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatization system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method. | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
References
- Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
- Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
- Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
- Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
- Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
- Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
- Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
- Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
- Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
- Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
- Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
- Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
- Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
- Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
- Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
- Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
- Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
- Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
- Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
- Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
- Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
- Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
- Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
