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Chemistry

Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

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Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), gekoppelt mit Nachsäulenderivatisierung (PCD) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das bei der Lösung einer Reihe von Fragen im analytischen Labor nützlich ist. Es kann verwendet werden , um Verbindungen zu detektieren , die ansonsten nicht nachweisbar mit der Suite von 1,2 verfügbaren Detektoren sind, um das Signal des Zielanalyten erhöhen, was niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs 3-5 oder selektiv ermöglicht Derivatisierung eines Zielanalyten , um zu vermeiden , Matrixeffekte 6. Üblicherweise verwendete PCD Reaktionen schließen die Reaktion von Aminen, wie Aminosäuren, mit ortho-phthaladehyde 7-9, Ninhydrin 9,10 oder Fluorescamin 11,12, die Derivatisierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit dem 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) 13,14 oder 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) 15,16, und die Verwendung des Jodids-Azid - Reagenz Schwefel c zu derivatisierenontaining Verbindungen 17,18.

Es gibt jedoch zahlreiche Nachteile bei der Verwendung von PCD Reaktionen mit HPLC - Systemen 6. Hauptsächlich unter diesen ist die Verwendung von Reaktionsspulen zwischen dem Punkt der Zugabe des Derivatisierungsreagenz (n) und dem Detektor, die Zeit für das Mischen und die Reaktion erlauben , 8 auftreten. Diese Reaktionsschleifen haben oft Volumina von 500 & mgr; l oder mehr, was signifikant ist im Vergleich zu dem Volumen der Rest des HPLC - Systems 19. Die Verwendung dieser hohen Volumenreaktionsschleifen führt zu einer erhöhten Spitzenverbreiterung Vergleich zu dem, was ohne die Anwesenheit der Reaktionsschleife beobachtet werden würde. Dies führt zu kürzeren, breiteren Spitzen, die eine höhere Grenzen der Quantifizierung und Detektion haben und negativ bewirkt chromatographische Auflösung. 1 und 2 unterstreichen die Verschlechterung der Peakform , die aus der Zugabe von verschiedenen Nachsäulenderivatisierung Schleife Volumina zur Folge haben . Diese Analysewurde mit einer Zusammensetzung der mobilen Phase von 94% Methanol und 6% Milli-Q-Wasser durchgeführt. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml / min, war das Injektionsvolumen 20 & mgr; l und die Analyse Wellenlänge betrug 265 nm. Spulen unterschiedlicher Totvolumina von 20 & mgr; l bis 1000 & mgr; l wurden zwischen der Säule und dem Detektor eingesetzt, um die Auswirkungen der Reaktionsschleife Totvolumen in PCD Verfahren zu simulieren. Diese Schleifen wurden aus Edelstahlrohr von 0,5 mm Innendurchmesser hergestellt. Das Experiment wurde an einem HPLC-System durchgeführt, bestehend aus einer Steuereinheit (SCL-10AVP), eine Niederdruck-Gradient Ventil (FCL-10ALVP), eine Pumpe (LC-20AD), einem Injektor (SIL-10ADVP) und einem PDA-Detektor ( SPD-M10ADVP). Die mobile Phase war durch einen Entgaser vor der Einführung in das HPLC-System gepumpt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer 250 mm x 4,6 mm ID-Säule 5 um durchgeführt. Versuchsbedingungen wurden gewählt, um die typisch für PCD Reaktionen, die vor kurzem in der Literatur veröffentlicht wurden.

Daseinfachste, am häufigsten Nachsäulenreaktor Aufbau ist eine nicht-segmentierten Rohrreaktor bezeichnet, die die Flüssigkeit fließt, durch die effektiv eine lange, dünne Röhre ist und die Reaktion stattfinden kann. In diesem System Spitze ist Verbreiterung abhängig nicht nur das Totvolumen zu dem System hinzugefügt, sondern auch der Innendurchmesser des Rohres , wie durch Iijima hervorgehoben et al. 8. Darüber hinaus spielt Spulengeometrie eine Rolle bei der Marke Verbreiterung beobachtet. Stewart 20 festgestellt , dass die sekundären Strömungsprofile des Reaktors Aufwickeln ändert, in eine bessere Durchmischung ergibt, was bedeutet , dass das Totvolumen minimiert werden kann. Es wurde festgestellt , dass die Peakverbreiterung nicht signifikant ist , wenn eine offene röhrenförmige Spule 21 gestrickt werden. Wenn die Peakverbreiterung zu große, andere Arten von Reaktoren ist auch 20,22 angesehen werden kann. Diese können Bettreaktoren oder segmentierte Strömungsreaktoren umfassen. Diese Reaktoren sind besonders nützlich für langsame Reaktionen, die sonst require große Reaktionsschleifen. Als nicht-segmentierten Rohrreaktoren sind die häufigsten Arten von Reaktoren in PCD-Anwendungen verwendet werden, der Rest dieses Artikels befasst sich mit diesem Reaktortyp-Setup.

Die Gestaltung der Reaktionsstrom (RF) Spalte enthält einen Multiport-Endanschlußstück, die mobile Phase (oder Eingabe) die Säule entweder durch einen einzelnen Port an dem radialen mittleren Bereich der Kolonne oder drei Öffnungen an der äußeren Lage angeordnet zu verlassen erlaubt Wandbereich der Säule (siehe Abbildung 3). Diese beiden Ströme werden getrennt Endfitting mit einer zentralen porösen Fritte enthält, die durch eine undurchlässige Ring umgeben ist, der wiederum durch eine äußere poröse Fritte umgeben ist, die an der Kolonnenwand heraus erstreckt. Aufgrund der zentralen Strömungs undurchlässige Ringquer ist zwischen den beiden porösen Bereichen nicht möglich.

Während der Reaktionsströmungs Chromatographie das Derivatisierungsreagenz (s) gegen die Strömungsrichtung der mobilen Phase gepumpt in einen oder two der äußeren Öffnungen des Reaktionsstromkolonne. Die Säule wird mit dem Eluens Derivatisierungsreagenz (s) in der äußeren Fritte vermischt und zu dem Detektor durch einen freien Außen Port geleitet. Die Reaktionsstrom kann entweder für ein einzelnes Reagenz Derivatisierung verwendet werden oder einem dualen Reagenzsystem (2 Anschlüsse für die Derivatisierungsreagenzien (1-Port für den Derivatisierungsreagenzes, 1 Anschluss des Säuleneluent an den Detektor und 1 Port blockiert passieren) und 1-Port passieren die Säuleneluent zum Detektor). Die Strömung aus dem zentralen Strom kann entweder verwendet werden , um die nicht derivatisierte Säuleneluent zu erfassen, effektiv Multiplexen Detektions 23 oder Abfall geleitet.

Eine Hauptabstimmungstechnik, die verfügbar ist, wenn ausgeführt RF-PCD-Chromatographie ist das Verhältnis der zentralen und peripheren fließt. Das optimale Verhältnis für jede Derivatisierung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie beispielsweise, ob die zentralen Strömungs wird Abfall nachgewiesen oder übergeben werden. Daher einmal das optimale Verhältnis bestimmt worden istSollte es, dass die richtige Strömungsverhältnis wird jedem Lauf durchgeführt wird, bevor erreicht werden gewährleistet.

Es wurde gefunden, dass die Verwendung einer Fritte in effizienter Vermischung im Vergleich zu herkömmlichen Mischtechniken, verwenden typischerweise einen Null Totvolumen T-Stück oder geringes Totvolumen der Säule Eluentenstrom und das Derivatisierungsreagenz in RF-PCD Ergebnisse zu mischen W- Stück die beiden Ströme zu mischen. Dies hat sich für die Verwendung von relativ kleinen Reaktionsschleifen, oder sogar die Eliminierung der Reaktionsschleife insgesamt erlaubt. Die Reduktion der Reaktionsschleife Größe führt zu schärferen Peaks im Vergleich zu herkömmlichen Nachsäulenderivatisierung Methoden. Das bedeutet, dass, trotz der Tatsache, dass nicht alle der Säule Eluent wird derivatisiert, größeres Signal-Rausch-Verhältnisse eingehalten werden und somit niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs erreicht werden.

Die Reaktionsfluss-Chromatographie wurde Schwierigkeiten bei der Anpassung von PKD-Reaktion zu überwinden entwickelts zu modernen HPLC-Säulen und Systeme, insbesondere der Effizienzverlust durch Band verursachte Verbreiterung aufgrund der großen Post-Säule Toten durch die Notwendigkeit verursacht Volumina großes Volumen Reaktion zu verwenden Schleifen. Die effizientere Mischprozesse in RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD bedeuten, dass kleinere Reaktionsschleife Volumina verwendet werden in beobachteten Abscheideleistung zu einer Erhöhung führt. Weiterhin RF-PCD-Chromatographie zeigt sowohl Signal erhöht und verringert Lärm im Vergleich zu herkömmlichen Techniken PCD in unteren Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden PCD führt. Ein zusätzlicher Vorteil des RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD Methoden ist die Fähigkeit, den underivatisierten Strom zu überwachen, die von dem zentralen Port des RF-Säule sowie der derivatisierten Strom eluiert, die aus dem Umfangsbereich der Säule eluiert. RF-PCD ist ein relativ neues, aber vielversprechende Technik, die viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden PCD zeigt.

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Protocol

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Achtung: Bitte beachten Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) für alle Materialien und Reagenzien vor der Verwendung (dh MSDS für Methanol). Achten Sie darauf, den Einsatz aller geeigneten Praktiken Sicherheit bei Lösungsmitteln und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Eluent Handhabung. Stellen Sie sicher, angemessene Nutzung von Engineering-Kontrollen von HPLC, Analysenwaage und Detektor Instrumentierung, und sorgen für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt 3 Methoden der Reaktionsströmungs Nachsäulenderivatisierung (RF-PCD) -Techniken, die jeweils mit einem anderen Reagenz, spezifisch für die Art einer chemischen Verbindung von Interesse. Gehen Sie für die Analyse von ROS Abschnitt "1. Detektion von ROS mit DPPH •" für die Analyse von primären Aminen Abschnitt "2. Nachweis von primären Aminen unter Verwendung von Fluorescamin" und für die Analyse von phenolischen Verbindungen gehen in Abschnitt "3 sehen . Nachweis von PhenolenVerwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid ". Verwenden von ultrareinem Wasser (zB Milli-Q - Wasser) im gesamten Gebäude .

Hinweis: Der Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden.

1. Nachweis von ROS Mit DPPH

  1. Einrichten von HPLC - Instrument
    1. Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit 100% Wasser auf der Linie A und 100% Methanol auf Linie B als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpen gemäß Herstelleranforderungen.
    2. Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt.
    3. Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 520 nm zu analysieren.
  2. Einrichten vonRF-Säule
    1. Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument.
    2. Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass.
    3. Schließen Sie einen Ausgang Peripherieschnittstelle an die UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
    4. Schließen Sie die DPPH Pumpenleitung an einen Peripherie - Anschluss am Ausgang des HF - Säule.
    5. Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird.
    6. Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie B - 100% Methanol.
    7. Äquilibrierung der Säule mit 100% Methanol mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit sollte entsprechend den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann.
  3. Herstellung von DPPH Reagenz
    1. Bereiten Sie eine 0,1 mg / ml Lösung von DPPH in Methanol. Beschallen den Kolben , der die DPPH Reagenz für 10 min enthält.
    2. Decken Sie den Kolben in Folie Lichteinwirkung zu verhindern.
    3. Spülen Sie die DPPH Pumpe mit dem vorbereiteten DPPH Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen.
  4. Einstellen des HF - Kolonnenauslaß
    1. Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher.
    2. Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert.
    3. Wieder wiegen den Zentralbehälter Port und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie folgt:
      Gewicht des Zentralanschluss (g) = Endgewicht Zentral Hafen Schiffs (g) - Anfangsgewicht von Zentral Hafen Schiffs (g)
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 und 1.4.3 für das Abwasser Austritt aus dem UV-Vis, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für die Peripherieschnittbehälter angebracht ist, wiefolgt:
      Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) = Endgewicht Peripherieschnittbehälter (g) - Anfangsgewicht von Peripherieschnittbehälter (g)
    5. Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie folgt:
      % Zentral Port = Gewicht der Zentralanschluss (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100
      % Peripherieschnitt = Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100
    6. Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 30:70 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb von 30% liegt, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömungs unter 30% ist, die Länge von 0,13 mm Schlauch von dem zentralen Port verringern.
    7. Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 bis 1.4.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 30:70 (Zentral: periphere) erreicht wird.
    8. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des DPPH Reagenzienpumpe auf 0,5 ml min -1.
      Hinweis: Die HF - Säule mit DPPH Reagenz einrichten nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden.
  5. Beitrag laufen Abschaltbedingungen
    1. Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Strömungspumpe Derivatisierungsreagenzes.
    2. Entfernen Sie die DPPH Reagenz Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper auf den Hafen.
    3. Durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min -1 für 10 min Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase , in der sie , indem die mobile Phase gespeichert werden soll.
    4. Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument.
    5. Ersetzen Sie das DPPH Reagenz mit Methanol und spülen Sie das zusätzliche Pumpe.
      Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann.

2. Nachweis von primären Aminen FluorescAmin

  1. Vorbereitung der mobilen Phase
    1. Vorbereitung 1 l einer 10 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird.
    2. In 52,6 ml Acetonitril (ACN) mit dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95:05 (Puffer: ACN) zu erreichen.
  2. Einrichten von HPLC - Instrument
    1. Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe gemäß Herstelleranforderungen.
    2. Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt.
    3. Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an die Derivatisierung Pumpe.
    4. Set-up der Fluoreszenzdetektor (FLD) mit einer Anregungswellenlänge von 390 nm und Emissionswellenlänge von 475 nm.
  3. Einrichten von HF - Säule
    1. Schließen Sie the Einlass der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument.
    2. Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass.
    3. Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem FLD Detektor eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
    4. Verbinden der Derivatisierung Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF-Säule.
    5. Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird.
    6. Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie A - 10 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% ACN.
    7. Äquilibrierung der Säule mit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann.
  4. Herstellung von Fluorescamin Reagenzes
    1. Stellen Sie 100 ml einer 0,1 mg ml -1 Fluorescamin Reagenz.
    2. <li> Ultraschallbad für 1 min.
    3. Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern.
    4. Spülen Sie die Reagenzienpumpe mit dem vorbereiteten Fluorescamin Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen.
  5. Einstellen des HF - Kolonnenauslaß
    1. Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher.
    2. Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert.
    3. Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.2 für das Abwasser zu 2.5.3 die FLD austretende, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für periphere angebracht ist, wie in Schritt 1.4.4 folgt.
    5. Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt.
    6. Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripherenFlow ist 43:57 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb 43% ist, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömung unter 43% ist, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss.
    7. Wiederholen Sie Schritt 2.5.1 bis 2.5.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 43:57 (Zentral: periphere) erreicht wird.
    8. Stellen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase Pumpe auf 0,7 ml min -1.
    9. Stellen Sie die Derivatisierung Pumpe bei 0,1 ml min -1 fließen.
      Hinweis: Die HF-Säule mit Fluorescamin Reagenz eingerichtet für die Analyse ist nun fertig. Proben können nun eingespritzt werden.
  6. Beitrag laufen Abschaltbedingungen
    1. Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Derivatisierung Pumpe.
    2. Entfernen Sie die Derivatisierung Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper.
    3. Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase indie es gespeichert werden soll , indem die mobile Phase durch die Säule passieren bei 1 ml min -1 für 10 min.
    4. Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe.
    5. Ersetzen Sie das Fluorescamin Reagenz mit Acetonitril und spülen Sie das Derivatisierung Pumpe.
      Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann.

3. Nachweis von Phenolen Unter Verwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid

  1. Vorbereitung der mobilen Phase
    1. Vorbereitung 1 l eines 100 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird.
    2. Hinzufügen 52,6 ml Methanol zu dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95 zu erreichen: 5 (Puffer: Methanol).
  2. Einrichten von HPLC - Instrument
    1. Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe nach Hersteller; S Anforderungen.
    2. Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die beiden zusätzlichen Reagenzienpumpen , wie in 4B dargestellt.
    3. Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an jedem der Reagenzienpumpen.
    4. Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 500 nm zu analysieren.
  3. Einrichten von HF - Säule
    1. Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument.
    2. Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass.
    3. Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
    4. Verbinden jedes Reagenz (dh 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid) Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF - Säule.
    5. Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie A - 100 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% Methanol.
    6. Äquilibrieren der Säule wit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 Minuten für eine 4,6 mm ID x 100 mm Länge Spalte. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann.
  4. Herstellung von 4-Aminoantipyren Reagenzes
    1. Vorbereiten eines Ammoniumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 9 durch Schritt 3.1.1 folgende.
    2. Wiegen 150 mg 4-Aminoantipyren und lösen sich in 100 ml der vorbereiteten Ammoniumacetat-Puffer (pH 9).
    3. Beschallen für 1 min.
    4. Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern.
    5. Spülen Sie die erste Reagenz Pumpe mit der hergestellten 4-Aminoantipyren Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen.
  5. Herstellung von Kaliumferricyanid Reagenzes
    1. Wiegen 150 mg Kaliumferricyanid und lösen sich in 100 ml Ammoniumacetatpuffer (pH 9), hergestellt gemäß Schritt 3.1.1.
    2. Beschallen für 1 min.
    3. Decken Sie in Folie Lichteinwirkung zu verhindern.
    4. Purge das zweite Reagenz Pumpe mit dem vorbereiteten Kaliumferricyanid Reagenz nach den Anforderungen des Herstellers.
  6. Tuning von HF - Säule
    1. Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher.
    2. Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert.
    3. Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.6.2 für das Abwasser zu 3.6.3 die UV-Vis-Austritt aus, die an die Peripherieschnitt der HF-Säule angebracht ist, und berechnen Gewicht für periphere wie in Schritt 1.4.4 folgt.
    5. Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt.
    6. Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 50:50 (Zentral: periphere). Wenn der zentrale Strömungs über 50% liegt, verringert sich dieStrömungsmenge durch Addieren einer Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass zentrale Öffnung austritt. Wenn der zentrale Strömung unter 50% liegt, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss.
    7. Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis 3.6.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 50:50 (Zentral: periphere) erreicht wird.
    8. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des 4-Aminoantipyren Pumpe auf 0,5 ml min -1.
    9. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des Kaliumferricyanid Pumpe auf 0,25 ml min -1.
      Hinweis: Die HF-Spalte mit den Zweikomponenten-Reagenzien aufgebaut nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden.
  7. Beitrag laufen Abschaltbedingungen
    1. Sobald alle Proben der Lauf beendet injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, beide der Reagenz Pumpen stoppen.
    2. Entfernen Sie die Reagenzienpumpleitungen von den peripheren Ports und ersetzen Sie sie mit einem 15 cm Stück 0,13-mm-Schlauch.
    3. Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase in WHIch ist es , indem die mobile Phase gespeichert werden , durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min -1 für 10 min.
    4. Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument.
    5. Ersetzen Sie beide die Reagenzien auf dem Reagenz Pumpen mit Methanol und spülen die zusätzlichen Pumpen gemäß Hersteller Anforderung.
      Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann.

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Representative Results

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Die erste PCD - Verfahren, die zur Verwendung von RF-PCD wurde die Derivatisierung von Antioxidantien mit der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) 24 angepasst. Diese Reaktion wurde durch Koleva et al vorgestellt. 25 und seit weit verbreitet ist. Die Detektion beruht auf der Entfärbung des DPPH Radikale in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies, damit die Anwesenheit von Antioxidationsmitteln führt zu einem Abfall in der beobachteten Extinktion. Die DPPH Reaktion setzt oft große Reaktionsschleifen von 500 & mgr; l oder mehr 13-15, aber es wurde gefunden , daß , wenn die RF-PCD Spalte keine Reaktionsschleife erforderlich war. Figur 5 zeigt zwei Chromatogramme einer Probe Ristretto Kaffee derivatisiert unter Verwendung der DPPH Radikal sowohl konventionelle PCD und RF-PCD Instrumentierung mit.

Die zweite Methode, die PCD zur Verwendung durch RF-PCD angepasst wurde, ist die derivatization von vier Aminosäuren (Glycin, Leucin, Phenylalanin und Tryptophan) 23 Fluorescamin als Derivatisierungsreagenz verwenden. Die Methode wurde von der Arbeit von Udenfriend angepasst et al. 11 mit der Zusammensetzung der mobilen Phase, Fluorescamin Konzentration und Fluorescamin Strömungsgeschwindigkeit für die Verwendung mit RF Spalten optimiert. Das herkömmliche Verfahren verwendet, um eine Zwei-Reagenz Derivatisierung System, in dem pH 9,0-Puffer zu dem Abwasserstrom vor der Zugabe des Fluorescamin-Reagens zugegeben wurde, während die RF-PCD-Verfahren eine mobile Phase verwendet, die bereits gepuffert wurde, also nur ein einziges Reagenz Derivatisierung System wurde benötigt. Für diese Anwendung wurde das derivatisierte Strom bei 390 nm unter Verwendung eines UV-Vis-Detektor, der auf die Anregungswellenlänge zur Detektion durch Fluoreszenz verwendet wird, entspricht. Das derivatisierte Strom könnte mit einem Fluoreszenzdetektor, größere Signal-Rausch geben und damit geringere Nachweisgrenzen und Quantitation, gemäß der Arbeit von Udenfried et al. 11. Darüber hinaus wurde das Eluat von dem zentralen Port des Setup-RF-PCD kommenden überwacht einen zweiten UV-Visible Detektor.

Die Leistung des RF-PCD - Verfahren für die Derivatisierung von Aminosäuren wurde mit dem herkömmlichen Verfahren verglichen PCD. In Tabelle 1 sind die berechneten Grenzen der Quantifizierung und Detektion für jede der Aminosäuren in beiden RF-PCD und konventionelle PCD - Modi analysiert. Die Nachweisgrenze wurde definiert , die Konzentration zu sein , wo ein Signal - Rausch - Verhältnis von 2 erhalten wurde , während der Quantifizierungsgrenze definiert wurde , um die Konzentration zu sein , wo ein Signal - Rausch - Verhältnis von 10 erreicht. 6 zeigt ein Chromatogramm der vier Aminosäuren analysiert , um die herkömmlichen PCD Verfahren wird das RF-PCD - Methode und die nicht derivatisierte Strom aus dem RF-PCD - Verfahren, Fig . 7 ein Vergleich der Signale für die pea erhaltensowohl die herkömmlichen PCD - Methode und die RF-PCD Verfahren ks aufgrund Glycin und Leucin verwendet wird . Abbildung 8 vergleicht die Peakbreite des Tryptophan - Spitze bei der Verwendung der herkömmlichen PCD Methode der Analyse der RF-PCD - Methode und der nicht derivatisierten Strom aus dem RF- PCD-Methode.

Die endgültige PCD Verfahren , das 26 für die Verwendung durch RF-PCD angepasst wurde , ist die Derivatisierung von vier Phenolen (Phenol, 4-Methoxyphenol, p - Cresol und Tocopherol). Die Methode wurde von der Arbeit von Bigley und Grob 27 mit geringfügigen Änderungen geeignet ist, das Verfahren zur Verwendung mit RF Spalten zu optimieren. Diese Arbeit eines Zweikomponenten-Derivatisierungsreaktion eingesetzt, wo Lösungen von sowohl 4-amionantiprine und Kaliumferricyanid auf die Säule Eluent am Endbeschlag des RF-Säule gegeben wurden. Es wurde festgestellt , dass , wenn eine RF - Säule für die Reaktion keine zusätzlichen Nachsäulenderivatisierung Schleifen benötigt Verwendung verwendet werden. 9 zeigt ein Beispiel eines Chromatogramms woein 21-Komponenten-Testprobe, die einige Komponenten enthalten, die eine Antwort auf die Derivatisierung Schema und einige zeigen, die (schwarze Kurve) nicht, wurden getrennt, derivatisiert und nachgewiesen. Die gleiche Mischung wurde ebenfalls getrennt und detektiert nicht derivatisierten zum Vergleich (rote Kurve). In Figur 9 ist die RF-PCD - Antwort wurde als eine negative Reaktion für eine einfachere visuelle Unterscheidung (die Detektorantwort erhalten wurde , war positiv) angezeigt wurde. Abbildung 10 zeigt einen Vergleich der Peakform von p - Cresol beide derivatisiert den RF-PCD Spalte und nichtderivatisiertes.

Abbildung 1
Abbildung 1. Chromatographische Überlagerung von Hexylbenzol auf einem HPLC - System mit unterschiedlichen Totvolumina hinzugefügt zwischen der Säule und dem Detektor injiziert. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Chromatographische Überlagerung von Toluol, Ethylbenzol und Propylbenzol auf einem HPLC - System mit verschiedenen Toträume zwischen der Säule und dem Detektor aufgenommen injiziert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Abbildung der Reaktion Flow - Säule Design. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Instrumental Einrichtung der RF-PCD. (A) einzelne Reagenz (dh DPPH oder Fluorescamin Derivatisierungsreagenzien) und (B) Dual - Reagenz (dh 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid Derivatisierungsreagenzien). Bitte klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5
Abbildung 5. Chromatogramme der Trennung von Ristretto Kaffee mit Detektion nach Nachsäulenderivatisierung mit der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil Rest (DPPH •). Die Derivatisierung wurde durchgeführt , die eine herkömmliche Säule mit einer 500 & mgr; l Reaktionsspule (A) und eine Reaktionsstromsäule (B rong>). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Chromatographische Überlagerung von vier Aminosäuren (Glycin (G), Leucin (L), Phenylalanin (P) und Tryptophan (T)) über den Bereich von 10 bis 1000 ppm detektiert durch Nachsäulenderivatisierung unter Verwendung von Fluorescamin als PCD Reagenz nach Trennung durch HPLC. Die Chromatogramme sind wie folgt: (A) konventionelle PCD, (B) RF-PCD, und (C) zentral ( nicht derivatisierten) Port von RF-PCD. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7. Vergleich der Signale für Glycin (erster Peak) und Leucin (zweiter Peak) von herkömmlichen PCD (rote Kurve) und RF-PCD (schwarze Kurve) erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8. Peakbreite Vergleich des Peaks aufgrund von Tryptophan , bezogen auf (A) Retentionszeit und (B) Spitzenvolumen. Die schwarze Kurve zeigt das herkömmliche Verfahren PCD, die rote Kurve zeigt die RF-PCD - Verfahren und die grüne Kurve zeigt die underivatisierten Strom aus dem zentralen Anschluss des RF-PCD - Methode. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 9. Die chromatographische Trennung eines künstlichen Probe. Die Komponenten umfassen Phenol (P), 4-Methoxyphenol (M), p - Kresol (C) und Tocopherol (T) sowie zahlreiche Alkylbenzole, mehrkernige aromatische Kohlenwasserstoffe, Anisol, phentanole, Koffein, Phenylalanin und benzamid. Die Spitzen der Bezeichnung i, ii und iii sind Alkylbenzole, die unerwartet auf die Derivatisierung Schema reagiert. Die schwarze Kurve stellt den nicht derivatisierten Antwort ein UV-Detektor bei 254 nm, während die rote Spur, die derivatisierte Reaktion bei 500 nm darstellt. Hinweis für die visuelle Klarheit der derivatisierten Antwort invertiert wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10 Abbildung 10. Chromatographische Reaktion von p - Kresol. Die schwarze Kurve stellt den nicht derivatisierten Antwort ein UV - Detektor bei 254 nm , während die rote Spur , die derivatisiert (RF-PCD) Reaktion bei 500 nm darstellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Reaktionstyp Glycine Leucine Phenylalanine Tryptophan
LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm)
RF-PCD 6 25 10 100 25 250 50 250
RF-PCD zentrale Schnittstelle (nichtderivatisiertes) Nicht erkannt Nicht erkannt Nicht erkannt 1 10
Herkömmliche PCD 10 100 50 500 50 500 100 500

Tabelle 1. Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung von vier verschiedenen Aminosäuren nachgewiesen durch verschiedene Nachsäulenderivatisierung Systeme mit Fluorescamin als Derivatisierungsreagenzes nach der Trennung durch HPLC.

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Discussion

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RF-PCD ermöglicht die effiziente Durchmischung des Derivatisierungsreagens mit dem HPLC Abstrom säulennachgeordneten ohne die Verwendung von Reaktionsspulen, die Effekte der Bandverbreiterung zu minimieren und die Trennleistung verbessert. RF-PCD Methoden wurden auch Verbesserungen in der Signalantwort in Bezug auf Nachweisverfahren gezeigt. Camenzuli et al. 28 war die erste die Verwendung von Reaktionsströmungsspalten mit DPPH zum Nachweis von ROS in einer Espressokaffeeprobe zu melden. Ihre Studie umfasste die Analyse und Optimierung von HF - Bedingungen maximale Leistung zu erreichen, testet eine Reihe von DPPH Konzentrationen mit verschiedenen DPPH Reagenziendurchflussraten. Es wurde gefolgert , dass eine DPPH Konzentration von 0,1 mg ml -1 mit einer DPPH Reagenz Flussrate von 0,5 ml min -1 war optimal für eine verbesserte Trennleistung ( das heißt, der Effizienz und Empfindlichkeit) unter RF-PCDBedingungen im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren zur PCD DPPH Derivatisierung. Figur 5 zeigt zwei Chromatogramme , die die DPPH Assay von Antioxidantien in einer Espressokaffeeprobe verwendet. Besonders interessant sind die Hochintensitätspeaks mit Retentionszeiten von etwa 5 min. Es ist ersichtlich , dass , wenn eine 500 - ul - Reaktionsschleife, die aus traditionellen Derivatisierungsmethoden DPPH typisch ist, ein einzelner, breiter Peak zu beobachten. Wenn jedoch das RF-PCD-Verfahren ohne die Notwendigkeit einer Reaktionsschleife verwendet wird, wird deutlich, dass die einzelnen Peak a 500 & mgr; l-Schleife ist in der Tat zwei Spitzen unter Verwendung beobachtet. Darüber hinaus können zusätzliche Details nach 5,5 min zu sehen, wenn die RF-PCD-Setup. So ist für die Analyse von ROS in Proben DPPH unter Verwendung der Technik der RF-PCD bewies den konventionellen Methoden der ROS Analyse überlegen zu sein unter Verwendung von DPPH •.

RF-PCD mitFluorescamin - Reagenz wurde für die Analyse von primären Aminosäuren und im Vergleich zu den herkömmlichen Formen der PCD mit Fluorescamin 20 verwendet. Da die RF Säulenende sitz vorgesehen auch eine Plattform für gemultiplexte Erkennung, die nicht derivatisierte zentralen Strömungs wurde mittels UV-Vis überwacht, während die Derivatisierung zwischen Abstrom und Fluorescamin in dem äußeren Bereich des HF-End-Fitting und detektiert über UV- durchgeführt wurde Vis. Eine Reihe von Teststandards vier Aminosäuren enthielten , wurden unter gemultiplexte HF-PCD Bedingungen analysiert. Figur 6 die chromatographische Profil für das herkömmliche Verfahren des PCD (6A) und RF-PCD (Detektion von derivatisierten (6B) und nichtderivatisiertes vergleicht (Fig 6C)) aus der Reihe der Aminosäuren. 7 ist eine Überlagerung von zwei Aminosäuren Signale durch herkömmliche PCD und RF-PCD erhalten. Es ist zu erkennen, dass die effizienteren beobachtete Trennung aufgrund ter Entfernung der Reaktionsschleife hat eine größere Signalantwort geführt, trotz der Tatsache, dass nicht alle der Säulenausfluß derivatisiert wurde. Darüber hinaus führte die effizientere Derivatisierungsreagenz Mischschema in unteren Grundrauschen, das ferner das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Dieser Effekt wird in den unteren Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung für die RF-PCD - Methode berechnet bestätigt im Vergleich zu dem herkömmlichen PCD - Verfahren in Tabelle 1. Dieser Trend kann auch in 5 zu sehen, in dem das Antioxidationsmittel als Reaktion auf DPPH größer für die ist RF-PCD-Verfahren im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren PCD. Signifikante Spitze Verschlechterung in den Chromatogrammen beobachtet werden, wo ein herkömmliches PCD-Setup verwendet wurde, welche an der unteren Signalantwort dieses Verfahrens führt.

Abbildung 8 vergleicht das Spitzenprofil von Tryptophan bei der Analyse von RF-PCD (beide derivatisierten und nicht derivatisierten Streams) und konventionelle PCD. Wenn das Spitzenprofil über die Zeit alle peak aufgetragen Breiten erscheinen weitgehend ähnlich (8A) zu sein. Die Verbesserungen gefunden in RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD sind offensichtlich , wenn das Spitzenprofil gegen Spitzenvolumen (8B) aufgetragen ist. Bei der Anwendung gegen Spitzenvolumen aufgetragen, ist es klar, dass, während die RF-PCD peak eine geringe Menge an Degradation zeigt im Vergleich zum underivatisierten peak, der Abbau jedoch minimal ist im Vergleich zu derjenigen von herkömmlichen PCD Verfahren beobachtet. Die Verbesserungen in Abscheideleistung von RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD werden auch in Abbildung 7 gezeigt , die die Peakformen von Glycin und Leucin nach Derivatisierung sowohl durch konventionelle PCD und RF-PCD vergleicht. Man erkennt, daß das Glycin und Leucin in herkömmlichen PCD Modenpeaks sind kaum Basislinie, während in RF-PCD-Modus wird das Signal an der Basislinie für eine viel längere Zeit zwischen den beiden Spitzen getrennt werden, zu sehen ist.

EinZusatznutzen von RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PKD-Methoden ist die Fähigkeit, nicht derivatisierten Abflusses aus dem zentralen Anschluss der HF-Säule ermöglicht Multiplexdetektion zu überwachen. Dies ist möglich, da die Gestaltung der Fritte innerhalb des RF Endarmatur ist die Strömung in der radialen Mittelbereich nicht zulassen, mit dem Strom in dem Randbereich des Endstückes, wodurch die Überwachung von dem äußeren Bereich des derivatisierten Stroms ermöglicht mischen von die Armatur sowie die Überwachung des nicht derivatisierten Strom vom zentralen Hafen. Diese Fähigkeit , von den für Tryptophan in Tabelle erhaltenen Ergebnisse hervorgehoben 1, die durch Fluorescamin 20 schlechte Signalantwort nach Derivatisierung zu haben ist jedoch bekannt, im Gegensatz zu den anderen Aminosäuren zeigt es eine Antwort auf einen UV - Detektor bei nichtderivatisiertes (bei ​​280 nm) . Für beide Systeme Derivatisierung die Grenzen der Detektion und Quantifizierung relativ hoch waren jedoch die Grenzen der Detektion und Quantifizierung waren viel geringer für ter nichtderivatisiertes Strom. die Fähigkeit, mit beiden derivatisierten und nicht derivatisierten Abwasserströme die Erfassungsparameter zu überwachen optimiert werden kann, das größte Maß an Leistung für jede Aminosäure zu geben.

Die Multiport-Design des HF-End-Fitting ermöglicht Dual Derivatisierungsreagenzes Analyse. RF-PCD Bedingungen für die Analyse von phenolischen Verbindungen im Vergleich zu der herkömmlichen Technik der PCD Selim et al. 23 untersucht die Leistung von zwei Reagenzien (4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid) unter Verwendung unter Verwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid. Diese Art der PCD - Technik erfordert zwei Pumpen und Reaktionsschleifen für jede Derivatisierungsreagenzes wie für DPPH auf eine Pumpe und Reaktionsschleife entgegengesetzt. Verschiedene Phenol- und Alkylbenzol Verbindungen wurden unter konventionellen und RF PCD Bedingungen analysiert. Interessanterweise nicht-phenolischen Verbindungen, die nicht unter der herkömmlichen Verfahren nachgewiesen wurden, waren in der Tat festgestellt under RF-PCD Bedingungen. 9 zeigt das UV-Vis chromatographische Antwort und die RF-PCD kolorimetrische Reaktion auf eine Standardtestmischung. RF-PCD bereitgestellt ein vereinfachtes PCD - Technik in Bezug auf die Instrumentierung, ohne Kompromisse Leistungstrennung wie in 10 beobachtet. Abbildung 10 das Spitzenprofil von p - Cresol vergleicht , wenn sie von RF-PCD analysiert und auch ohne Derivatisierung. Es ist ersichtlich, dass die Peak-Breite des RF-PCD-Chromatogramm zu der des underivatisierten Chromatogramm sehr ähnlich ist. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Chromatogramme ist, dass die RF-PCD-Chromatogramm an der Basis etwas breiter ist. Dies zeigt, dass es aufgrund der RF-PCD-Technik kein Peak Dispersion gering ist. Eine ähnliche Reaktion wurde in 9 beobachtet , was zeigt , dass es nicht nur die p - Cresol peak ist , die ähnliche Peakbreite aufweist , wenn sie durch RF-PCD derivatisiert Vergleich zu seiner nichtderivatisierten peak, aber alle Phenolen und alkylbenzenes, die auf die Derivatisierung Schema reagiert zeigte, dass diese gleichen Trend. Obwohl RF-PCD mit der Verwendung von zwei Derivatisierungsreagenzien eine ähnliche Trennleistung der herkömmlichen nicht-Derivatisierung Verfahren erhalten, erlaubt die RF-PCD zum selektiven Nachweis von phenolischen Verbindungen, von denen die nicht unter nicht-derivatisierten Bedingungen erkannt .

Als RF-PCD eine Entwicklung von konventionellen HPLC-PCD Methoden ist, sind alle der Tuning-Tools zur Verfügung, in der Regel HPLC-Verfahren wie Zusammensetzung der mobilen Phase und der Strömungsgeschwindigkeit, Einspritzmenge und Analyse Wellenlänge auf RF-PCD Methoden anwendbar. Darüber hinaus Tuning-Tools in herkömmlichen HPLC-PCD Methoden, wie die mobile Phase zu PCD-Reagenz Flussrate-Verhältnis sowie die PCD Reagenszusammensetzung sind anwendbar auf RF-PCD-Methoden. Ein zusätzliches Tuning-Tool zur Verfügung, wenn RF-PCD verwenden, die nicht in herkömmlichen PCD Verfahren ist das Verhältnis der Ströme von der zentralen und peripheren kommendenPorts der Säule. Die Ströme werden gesteuert, indem die relative Gegendruck auf jede der Leitungen zu verändern, indem die Länge und / oder Innendurchmesser des Pfostens Detektor Steuerung (oder Spalte hinterlassen, wenn die Strömung von dem zentralen Port kommt nicht erkannt wird) Schläuche. Das optimale Verhältnis des zentralen peripherer Ströme ist auf die Reaktion in Frage abhängig, wie auch andere Faktoren, wie beispielsweise, ob die zentrale Öffnung detektiert wird oder nicht. Ein Flussquote von 60% peripheren und 40% von zentraler Bedeutung ist oft ein guter Ausgangspunkt.

Wie bei den Anpassungsparametern, viele der Probleme, die mit der Verwendung der RF-PCD Spalte sind ebenfalls häufig mit herkömmlichen PCD Verfahren entstehen können. Ein besonderer Parameter, die chromatographer muss sich bewusst sein, bei der Durchführung von RF-PCD-Analysen ist die Stabilität der Strömung und des Drucks in dem System, insbesondere das des Reagenzpumpe (s). Wenn der Fluss in dem System nicht stabil ist, kann sie verursachen daher Basis Instabilität der abnehmSignal-Rausch-Verhältnis und anschließend Grenzen der Quantifizierung und Detektion.

RF-PCD-Chromatographie wurde Schwierigkeiten bei der Anpassung der PCD Reaktionen auf modernen HPLC-Säulen und Systeme zu überwinden. Der große Vorteil der RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen Methoden PCD ist effizienter Vermischung aufgrund seiner Innenseite eine Fritte innerhalb des Endstückes des RF-Säule stattfindet, und das Mischen bei einem etwas höheren Druck zurück. Dies ermöglicht die Minimierung oder sogar Eliminierung der großvolumige Reaktionsschleifen, die in vielen herkömmlichen PKD-Methoden verwendet werden. Mit dieser Minimierung post Säule Totvolumen, effizientere Trennungen mit höherer chromatographische Auflösung durchgeführt werden.

RF-PCD-Modus wurde in die Verbesserung der Trennleistung, Peakform und Signal-Rausch im Vergleich zu herkömmlichen PCD Methoden geführt. Allerdings ist es wichtig, dass Signal Verbesserungen sind Detektor abhängig zu beachten. Beispielsweise Detektorendaß Probenmenge abhängig kann keine Erhöhung der Signalantwort unter RF-PCD Bedingungen im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zeigen. Dies ist so, weil bei herkömmlichen Verfahren 100% der auf der Säule Probe nachgewiesen wird, wobei unter RF-PCD Bedingungen nur ein bestimmter Prozentsatz der Probe auf der Säule wird in Abhängigkeit von der Segmentierungsverhältnis detektiert. Es wird jedoch erwartet, dass RF-PCD Reaktionen der Lage zu einem oder zwei Reagenzien angepasst werden (solange beide Reagenzien gleichzeitig zugegeben werden) PCD Reaktion mit minimaler Nachoptimierung und dass die Vorteile für alle drei beobachteten Reaktionen bisher zu allen anderen PCD Reaktionen übersetzen getestet.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

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References

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Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns
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Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

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