Introduction
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с пост колонку дериватизации (PCD) является мощным инструментом, который полезен при решении ряда вопросов, в аналитической лаборатории. Он может быть использован для обнаружения соединений, которые в противном случае невозможно обнаружить с набором детекторов , доступных 1,2, увеличивают сигнал целевого аналита, что позволяет более низкие пределы обнаружения и количественного 3-5 или селективно дериватизации мишень аналит, чтобы избежать матричные эффекты 6. Обычно используемые реакции PCD включают реакцию аминов, таких как аминокислоты, с орто-phthaladehyde 7-9, нингидрином 9,10 или флуорескамином 11,12, дериватизации активных форм кислорода (ROS) с 2,2-дифенил- 1-picrylhydrazil радикал (ДФПГ •) 13,14 или 2,2'-Азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (БЕСТ) 15,16, а также использование реагента йодо-азида до дериватизации серы грontaining соединения 17,18.
Есть, однако, многочисленные недостатки использования реакций PCD с помощью ВЭЖХ систем 6. Главным из них является использование катушек реакции между точкой добавления дериватизации реагента (ов) и детектора, которые позволяют время для смешивания и реакция протекала 8. Эти реакции петли часто имеют объем 500 мкл или более, что является значительным по сравнению с объемом остальной части системы ВЭЖХ 19. Использование этих реакций в больших объемах петли приводит к увеличению уширению пиков по сравнению с тем, что наблюдалось бы без присутствия реакционного контура. Это приводит к более короткие и более широких пиков , которые имеют более высокие пределы количественному и обнаружения и оказывает отрицательное воздействие на хроматографическое разрешение. На рисунках 1 и 2 подчеркивают ухудшение формы пика , которые являются результатом добавления различных объемов реакционного контура послеколоночной. Этот анализпроводили с помощью подвижной фазы состава 94% метанола и 6% Milli-Q воды. Скорость потока подвижной фазы была 1 мл / мин, объем впрыскивани 20 мкл, а длина волны анализ был 265 нм. Катушки различной мертвых объемов от 20 мкл до 1000 мкл были вставлены между колонной и детектором для имитации влияния реакционного контура мертвого объема в методах ПКА. Эти петли были изготовлены из трубки из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,5 мм. Эксперимент проводили на системе ВЭЖХ, состоящей из контроллера (SCL-10AVP), низкий градиент давления клапан (ГКЛ-10ALVP), насос (LC-20AD), инжектором (СИЛ-10ADVP), и детектор (PDA СПД-M10ADVP). Подвижная фаза прокачивали через дегазатор до введения в систему ВЭЖХ. Разделение проводили с использованием 250 мм х 4,6 мм внутренний диаметр 5 мкм колонку. Экспериментальные условия были выбраны характерные для реакций PCD, которые недавно были опубликованы в литературе.
простой, самый распространенный пост установки колонного реактора, называется несегментированных трубчатый реактор, который эффективно длинная, тонкая трубка, через которую жидкость может протекать и реакци может иметь место. В этой системе уширению пиков зависит от не только мертвого объема добавленной к системе, но и от внутреннего диаметра трубы , как подчеркнуто Иджимы и др. 8. Кроме того, геометрия катушки играет определенную роль в наблюдаемом расширении бренда. Стюарт 20 указано , что смотки реактора изменяет профили вторичный поток, что приводит к лучшему перемешиванию, а это означает , что мертвый объем может быть сведено к минимуму. Было заявлено , что пик расширение не имеет существенного значения при использовании открытого трубчатого трикотажного катушки 21. Когда пик уширения чрезмерно велика, и другие типы реакторов , могут быть также рассмотрены 20,22. Они могут включать реакторы или реакторы слоем сегментированных потока. Эти реакторы особенно полезны для медленных реакций, которые в противном случае были бы RequirE большая реакция петли. Как несегментированных трубчатые реакторы являются наиболее распространенными типами реакторов, используемых в приложениях, PCD, остальная часть этой статьи имеет дело с этим типом установки реактора.
Конструкция реакционной колонны потока (RF) включает в себя концевой заделки многопортовую, который позволяет подвижной фазы для выхода (или ввести) колонну через один порт, расположенный в радиальном центральной части колонны или три отверстия, расположенные на наружном стена область колонны (смотри рисунок 3). Эти два потока разделены с помощью концевой заделки, содержащий центральную пористую фритту, окруженного непроницаемым кольцом, которое, в свою очередь, окруженный наружной пористой фритты, которая простирается наружу к стенке колонны. Благодаря центральному непроницаемой поперечному кольцо потока не представляется возможным между двумя пористыми областей.
Во время потока хроматографии реакции, дериватизации реагент (ы) закачивают против направления подвижной фазы потока в одну или ТВтO внешних портов реакционной колонны потока. Колонку элюент смешивают с дериватизации реагента (ов) во внешнем фритты и передается к детектору через свободный наружный порт. Поток реакции может быть использован для либо дериватизации одиночный реагент (1 порт для реагента дериватизации, 1 порт для передачи столбца в качестве элюента до детектора и 1 порт заблокирован) или двойной системой реагента (2 порта для дериватизации реагентов и 1 порт для проходят колонны в качестве элюента до детектора). Поток из центрального потока может быть либо использованы для обнаружения непроизводного элюент колонку, фактически мультиплексирование обнаружения 23, или передается в отходы.
Одной из основных метод настройки, который доступен при работе РЧ-PCD хроматографии является отношением центральных и периферийных потоков. Оптимальное соотношение для каждого дериватизации зависит от целого ряда факторов, таких как, будут ли обнаружены или переданы в отходы центральный поток. Поэтому, как только оптимальное соотношение было определено, Следует обеспечить, чтобы отношение правильно потока достигается перед каждый прогон выполняется.
Было обнаружено, что использование фритт для смешивания потока колонки элюента и дериватизации реагента в результатах РЧ-PCD в более эффективное перемешивание по сравнению с традиционными методами смешивания, которые обычно используют нулевой мертвый объем тройника или низкий мертвый объем W- кусок, чтобы смешать два потока. Это позволило за использование относительно небольших петель реакции, или даже устранение реакционного контура в целом. Снижение результатов размеров петли реакции в более резких пиков по сравнению с традиционными методами дериватизации пост столбцов. Это означает, что, несмотря на то, что не все из элюента колонки дериватизируется, больше сигнал-шум наблюдаются и поэтому нижние пределы детекции и количественного определения может быть достигнуто.
Поток реакции хроматографии была разработана для преодоления трудностей с адаптацией реакции PCDс современным колонн и систем ВЭЖХ, в частности, потери эффективности, вызванной полосы уширения из-за больших послеколоночной мертвых объемов, вызванных необходимостью использования большого объема реакция петли. Более эффективные процессы смешения в RF-PCD по сравнению с обычными PCD означает, что объемы цикла меньше реакции могут быть использованы что приводит к увеличению наблюдаемой эффективности разделения. Кроме того РЧ-ПКА хроматографии показывает, как увеличение сигнала и снижение шума по сравнению с обычными методами PCD что приводит к снижению предела обнаружения и количественного определения по сравнению с традиционными методами ПКА. Дополнительным преимуществом RF-PCD по сравнению с обычными методами PCD является способность контролировать непроизводного поток, который элюирует из центрального порта колонны РФ, а также дериватизированным поток, который элюируется из периферийной области колонны. RF-PCD является относительно новым, но перспективный метод, который отображает много преимуществ по сравнению с традиционными методами PCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Внимание: Пожалуйста , обратитесь к паспорте безопасности (MSDS) для всех материалов и реагентов перед использованием (т.е. паспорт безопасности для метанола). Обеспечивать использование всех соответствующих правил безопасности при работе с растворителями и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) элюент. Обеспечить надлежащее использование технических средств контроля ВЭЖХ, аналитического баланса и детектора измерительных приборов, а также обеспечить использование средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, и закрытую обувь).
Примечание: Этот протокол описывает 3 способа реакции потока дериватизации после колонки методы (RF-PCD), каждый с другим реагентом с учетом особого характера химического соединения, представляющего интерес. Для анализа ROS перейдите к разделу "1. Обнаружение АФК использованием ДФПГ •" для анализа первичных аминов смотри раздел "2. Обнаружение первичных аминов с использованием флуорескамином", так и для анализа фенольных соединений перейдите в раздел "3 . Обнаружение феноловс использованием 4-aminoantipyrene и феррицианида калия ". С помощью ультра-чистой воды (например, Milli-Q воды) во всем.
Примечание: Подключение колонки RF достигается практически так же, как в обычной ВЭЖХ колонке с основным отличием, число концевых соединительных элементов на колонке РФ. Фитинги, используемые для подключения стандартной колонки ВЭЖХ в ВЭЖХ-системы могут быть использованы для подключения ВЧ-колонки в систему ВЭЖХ.
1. Обнаружение ROS Использование ДФПГ •
- Настройка ВЭЖХ инструмента
- Подготовка ВЭЖХ-прибор со 100% воды на линии А и 100% метанола на линии В качестве подвижной фазы. Чистки насосов в соответствии с требованиями производителя.
- Настройка ВЭЖХ инструментальных компонентов и дополнительного дериватизации насоса , как показано на рисунке 4A.
- Установите UV-VIS детектор для анализа на длине волны 520 нм.
- Набор изколонка РФ
- Подключение входе колонки РФ к инструменту ВЭЖХ.
- Подключите длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора к выходному порту центрального столба РФ.
- Подключите выходной периферийный порт к UV-VIS детектора с использованием длиной 15 см трубки 0,13 мм идентификатора.
- Подключите ДФПГ • линии насоса к периферийному порту на выходе из колонки РФ.
- Неиспользованное периферийный порт на выходе из колонки ВЧ с использованием колонки стопора.
- Доведите скорость потока ВЭЖХ насоса до 1 мл мин - 1 при 100% линии В - 100% -ном растворе метанола.
- Равновесие колонку с 100% -ным раствором метанола подвижной фазы в течение 10 мин для 4,6 мм внутр х 100 колонке длиной мм. На этот раз должно быть соизмеримо в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
- Приготовление ДФПГ • реагента
- Приготовьте 0,1 мг / мл раствора ДФПГ • в метаноле. Разрушать ультразвуком колбу , содержащую ДФПГ • реагента в течение 10 мин.
- Накройте колбу в фольгу, чтобы не допустить воздействия света.
- Выпустите ДФПГ • насос с подготовленной ДФПГ • реагента в соответствии с требованиями завода - изготовителя.
- Тюнинг выход колонки RF
- Тщательно отвесить две чистые и сухие сосуды. Добавьте одно судно в качестве центрального, а другой, как периферийное устройство.
- Сбор выходящего потока, выходящего из центрального порта в сосуд с надписью центральный в течение 1,0 мин.
- Повторное взвешивание центрального порта судна и вычислить вес потока от центрального порта следующим образом:
Вес центрального порта (G) = Конечный вес Центральный Порт сосуда (г) - начальный вес Центральный Порт сосуда (г) - Повторите шаги 1.4.2 и 1.4.3 для выходящего потока, покидающего UV-VIS, который прикреплен к периферийному порту колонны РФ и вычислите вес для периферийного порта судна в качествеследующим образом:
Масса периферийного порта (G) = Конечный вес периферийного порта судна (г) - начальный вес периферийного порта сосуда (г) - Рассчитывают процент потока поступающей из центральных и периферийных портов следующим образом:
% Центральный порт = Вес центрального порта (г) / (Вес центрального порта (г) + Вес периферийного порта (г)) х 100
% Периферийный порт = Вес периферийного порта (г) / (Вес центрального порта (г) + Вес периферийного порта (г)) х 100 - Убедитесь, что соотношение сегментации между центральным потоком и периферийного потока 30:70 (центральная: периферические). Если центральный поток превышает 30%, уменьшить количество потока, выходящего путем добавления трубки определенной длины идентификатора 0,13 мм до выхода из центрального порта. Если центральный поток ниже 30% уменьшить длину 0,13 мм трубки из центрального порта.
- Повторите шаг 1.4.1 до 1.4.6, пока коэффициент сегментации 30:70 (центральный: периферическая) не будет достигнута.
- Установите скорость потока DПРК • Насос реагент 0,5 мл мин -1.
Примечание: В столбце РФ устанавливается с ДФПГ • реактив теперь готов к анализу. Образцы в настоящее время могут быть введены.
- Сообщение выполнения условия завершения работы
- После того, как все образцы были введены, указывая, что прогон закончится, остановить поток реагента дериватизации насоса.
- Удалите ДФПГ • реактив линии насоса от периферийного порта и закупорить порт.
- Уравновешивают колонку с подвижной фазой , в котором он должен быть сохранен, позволяя подвижной фазы через колонку со скоростью 1 мл мин -1 в течение 10 мин.
- Остановить поток подвижной фазы насоса на приборе ВЭЖХ.
- Заменить ДФПГ • реагента с метанолом и продуть дополнительный насос.
Примечание: Система ВЭЖХ теперь может быть выключена.
2. Обнаружение первичных аминов с использованием Fluorescамин
- Приготовление подвижной фазы
- Готовят 1 л 10 раствора ацетата аммония мМ, доводят рН раствора до 9,0 с помощью 5 М раствор гидроксида аммония до разбавления до объема.
- Добавить в 52,6 мл ацетонитрила (ACN) в буфер ацетата аммония, чтобы достичь предварительно смешанный качестве подвижной фазы (95:05 буфер: ACN).
- Настройка ВЭЖХ инструмента
- Подготовить ВЭЖХ прибор с предварительно перемешанной подготовленного буфера на линии А в качестве подвижной фазы. Промойте насос в соответствии с требованиями производителя.
- Настройка ВЭЖХ инструментальных компонентов и дополнительного дериватизации насоса , как показано на рисунке 4A.
- Приложить импульс демпфера катушку к дериватизации насоса.
- Настройка детектора флуоресценции (FLD) с длиной волны возбуждения 390 нм и эмиссионной длине волны 475 нм.
- Настройка столбца РФ
- Подключение-йе на входе ВЧ колонки в прибор для ВЭЖХ.
- Подключите длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора к выходному порту центрального столба РФ.
- Подключите выходной периферийный порт столба РФ к детектору ДПД, используя длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора.
- Подключение линии дериватизации насоса к периферийному порту на выходе из колонки РФ.
- Неиспользованное периферийный порт на выходе из колонки ВЧ с использованием колонки стопора.
- Доведите скорость потока ВЭЖХ насоса до 1 мл мин - 1 при 100% линии А - 10 мМ аммоний ацетатный буфер с рН 9, предварительно смешивают с 5% ACN.
- Равновесие столбец с 100% линии А подвижной фазы в течение 10 мин для 4,6 мм внутр х 100 колонке длиной мм. На этот раз, может быть расширена в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
- Приготовление флуорескамином реагента
- Сделать 100 мл мл -1 флуорескамин реагента 0,1 мг. <литий> Разрушать ультразвуком в течение 1 мин.
- Покрытие с фольгой для предотвращения воздействия света.
- Промойте насос реагента с подготовленной флуорескамином реагента в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
- Тщательно отвесить две чистые и сухие сосуды. Добавьте одно судно в качестве центрального, а другой, как периферийное устройство.
- Сбор выходящего потока, выходящего из центрального порта в сосуд с надписью центральный в течение 1,0 мин.
- Повторное взвешивание центрального сосуда и вычислить вес потока от центрального порта следующим образом на этапе 1.4.3.
- Повторите шаги 2.5.2 на 2.5.3 для выходящего потока, выходящего из ДПД, который прикреплен к периферийному порту колонны РФ и вычислите вес для периферического следующим образом на этапе 1.4.4.
- Рассчитывают процент потока поступающей из центральных и периферийных портов следующим образом на этапе 1.4.5.
- Убедитесь, что соотношение сегментации между центральным потоком и периферийнаяпоток 43:57 (центральный: периферические). Если центральный поток превышает 43%, уменьшить количество потока, выходящего путем добавления трубки определенной длины идентификатора 0,13 мм до выхода из центрального порта. Если центральный поток ниже 43%, уменьшить длину 0,13 мм трубки из центрального порта.
- Повторите шаг 2.5.1 для 2.5.6 до тех пор, соотношение сегментация 43:57 (центральный: периферическая) не будет достигнута.
- Установите скорость потока подвижной фазы насоса до 0,7 мл мин -1.
- Установите дериватизации насос течь в количестве 0,1 мл мин -1.
Примечание: В столбце РФ устанавливается с флуорескамином реагента теперь готов к анализу. Образцы в настоящее время могут быть введены.
- После того, как все образцы были введены, указывая, что прогон закончится, остановить насос дериватизации.
- Удалите строку дериватизации насоса из периферийного порта и пробки.
- Равновесие колонку с подвижной фазой вкоторой она должна быть сохранена, позволяя подвижной фазы через колонку со скоростью 1 мл мин -1 в течение 10 мин.
- Остановить поток подвижной фазы насоса.
- Заменить флуорескамином реагента с ацетонитрилом и продуть дериватизации насос.
Примечание: Система ВЭЖХ теперь может быть выключена.
3. Обнаружение фенолов с использованием 4-Aminoantipyrene и калия феррицианида
- Приготовление подвижной фазы
- Готовят 1 л 100 раствора ацетата аммония мМ, доводят рН раствора до 9,0 с помощью 5 М раствор гидроксида аммония до разбавления до объема.
- Добавить в 52,6 мл метанола в буфер ацетата аммония, чтобы достичь предварительно смешанный качестве подвижной фазы 95: 5 (буфер: метанол).
- Настройка ВЭЖХ инструмента
- Подготовить ВЭЖХ прибор с предварительно перемешанной подготовленного буфера на линии А в качестве подвижной фазы. Промойте насос в соответствии с производителем "; Ы требования.
- Настройка ВЭЖХ инструментальных компонентов и двух дополнительных насосов для реагентов , как показано на рисунке 4B.
- Приложить импульс Демпфер катушку для каждого из насосов для реагентов.
- Установите UV-VIS детектор для анализа на длине волны 500 нм.
- Настройка столбца РФ
- Подключение входе колонки РФ к инструменту ВЭЖХ.
- Подключите длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора к выходному порту центрального столба РФ.
- Подключите выходной периферийный порт колонки РФ к UV-VIS детектора с использованием длиной 15 см трубки 0,13 мм идентификатора.
- Подключение каждого реагента (т.е. 4-aminoantipyrene и феррицианида калия) линии насоса к периферийному порту на выходе из колонки РФ.
- Доведите скорость потока ВЭЖХ насоса до 1 мл мин - 1 при 100% линии А - 100 мМ аммоний ацетатный буфер с рН 9, предварительно смешивают с 5% -ным метанолом.
- Равновесие столбец шIth 100% линии А подвижной фазы в течение 10 мин для 4,6 мм внутр х 100 колонке длиной мм. На этот раз, может быть расширена в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
- Приготовление реагента 4-aminoantipyrene
- Готовят ацетатный буфер аммония с рН 9, выполнив пункт 3.1.1.
- Взвешивают 150 мг 4-aminoantipyrene и растворяют в 100 мл приготовленного буфера ацетата аммония (рН 9).
- Разрушать ультразвуком в течение 1 мин.
- Покрытие с фольгой для предотвращения воздействия света.
- Чистки первый насос реагента с подготовленным 4-aminoantipyrene реагента в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
- Приготовление реагента феррицианида калия
- Взвешивают 150 мг калия и феррицианида растворяют в 100 мл буферного раствора ацетата аммония (рН 9), подготовленной в соответствии с шагом 3.1.1.
- Разрушать ультразвуком в течение 1 мин.
- Накройте фольгой для предотвращения воздействия света.
- Пурге второй реагент насос с подготовленным феррицианида калия реагентом в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
- Настройка колонки РФ
- Тщательно отвесить две чистые и сухие сосуды. Добавьте одно судно в качестве центрального, а другой, как периферийное устройство.
- Сбор выходящего потока, выходящего из центрального порта в сосуд с надписью центральный в течение 1,0 мин.
- Повторное взвешивание центрального сосуда и вычислить вес потока от центрального порта следующим образом на этапе 1.4.3.
- Повторите шаги 3.6.2 3.6.3 для выходящего потока, покидающего UV-VIS, который прикреплен к периферийному порту колонны РФ и вычислите вес для периферического следующим образом на этапе 1.4.4.
- Рассчитывают процент потока поступающей из центральных и периферийных портов следующим образом на этапе 1.4.5.
- Убедитесь, что соотношение сегментации между центральным потоком и периферийного потока составляет 50:50 (центральный: периферические). Если центральный поток выше 50%, снижениеколичество потока, выходящего путем добавления трубки определенной длины идентификатора 0,13 мм к выпускному центрального порта. Если центральный поток ниже 50%, уменьшить длину 0,13 мм трубки из центрального порта.
- Повторите шаг 3.6.1 для 3.6.6 до тех пор, соотношение сегментация 50:50 (центральный: периферическая) не будет достигнута.
- Установите скорость потока 4-aminoantipyrene насоса до 0,5 мл мин -1.
- Установите скорость потока кровяной соли насоса до 0,25 мл мин -1.
Примечание: В столбце РФ устанавливается с двухкомпонентных реагентов теперь готов для анализа. Образцы в настоящее время могут быть введены.
- Сообщение выполнения условия завершения работы
- После того, как все образцы были введены прогон закончил, указывая, что бег закончил, остановить обоих насосов для реагентов.
- Удалите линии реагента насоса из периферийных портов и заменить их на 15 см кусок 0,13 мм трубки.
- Равновесие колонку с подвижной фазой в WHIч она должна быть сохранена, позволяя подвижной фазы через колонку со скоростью 1 мл мин -1 в течение 10 мин.
- Остановить поток подвижной фазы насоса на приборе ВЭЖХ.
- Заменить и реагенты на реактива насосы с метанолом и продуть дополнительные насосы согласно требованию производителя.
Примечание: Система ВЭЖХ теперь может быть выключена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первый метод ПКА , который был адаптирован для использования RF-PCD был дериватизации антиоксидантов с использованием 2,2-дифенил-1-picrylhydrazil радикал (ДФПГ •) 24. Эта реакция была введена Koleva и др. 25 и широко используется с тех пор. Обнаружение опирается на обесцвечивания ДФПГ • радикала в присутствии активных форм кислорода, следовательно, наличие антиоксидантов приводит к уменьшению наблюдаемой поглощательной способности . ДФПГ • реакции часто используют большие петли реакции 500 мкл или более 13-15, однако было установлено , что при использовании колонки ВЧ-PCD не требовалось никакой реакции контура. На рисунке 5 показаны две хроматограммы образца Ристретто кофе , дериватизированных с использованием ДФПГ • радикал , используя как обычный PCD и RF-PCD приборов.
Второй метод ПКА, который был адаптирован для использования RF-ПКА дерivatization из четырех аминокислот (глицин, лейцин, фенилаланин и триптофан) с использованием в качестве флуорескамином дериватизации реагента 23. Этот метод был адаптирован из работы по Udenfriend и др. , 11 с подвижной фазой композиции, флуорескамином концентрации и скорости потока флуорескамином , оптимизированной для использования с колоннами РФ. Традиционный метод использовали два реагента систему дериватизации, где рН 9,0 буфер был добавлен в отходящем потоке перед добавлением реагента флуорескамином, в то время как метод РЧ-PCD используемой мобильной фазы, который уже был буферизированный, таким образом, только один реагент системы дериватизации было необходимо. Для этого приложения производное поток анализируют при 390 нм с использованием УФ-видимой детектор, который соответствует длине волны возбуждения, используемый для обнаружения с помощью флуоресценции. Дериватизации поток может быть обнаружен с помощью детектора флуоресценции, что дает больший сигнал к шуму и, следовательно, более низкие пределы обнаружения и кванттации, согласно работе Udenfriend и др. 11. Кроме того, в качестве элюента, поступающие от центрального порта установки ВЧ-PCD контролировали с помощью второго УФ-видимой детектор.
Производительность метода ВЧ-PCD для получения производных аминокислот по сравнению с обычными таблице ПКА методом. 1 приведены расчетные пределы количественному и детектирования для каждой из аминокислот , анализируемых в обычных режимах PCD как RF-PCD и. Предел обнаружения был определен как концентрацию , где был получен сигнал-шум 2 в то время как предел количественного определения был определен как концентрацию , где было достигнуто соотношение сигнал - шум 10. На рисунке 6 показана хроматограмма четырех аминокислоты анализировались с помощью обычного метода PCD, метод ВЧ-ПРД и непроизводного потока из метода ВЧ-PCD. фиг.7 представляет собой сравнение сигналов , полученных для горошкаК.С. в связи с глицином и лейцина с использованием как традиционного метода ПРД и метод ВЧ-PCD. На рисунке 8 сравнивает ширину пика триптофана пика при анализе с использованием традиционного метода PCD, метод ВЧ-ПРД и непроизводного поток из RF- метод PCD.
Последний метод ПКА , который был адаптирован для использования RF-PCD 26 является получение производных четырех фенолы (фенол, 4-метоксифенола, п - крезола и токоферол). Метод был адаптирован с работы по Бигли и Grob 27 с незначительными изменениями , чтобы оптимизировать метод для использования с колоннами РФ. Эта работа используется двухкомпонентный реакции дериватизации и добавляют растворы как 4-amionantiprine и калия феррицианида в качестве элюента колонки в концевой заделки колонны РФ. Было установлено , что при использовании колонки RF для реакции без дополнительных реакционных циклов послеколоночной , необходимые , которые будут использоваться. На рисунке 9 показан пример хроматограммы где21-компонента пробы тест, который содержал некоторые компоненты, которые показывают реакцию на схеме дериватизации и некоторые, которые не были разделены, и дериватизированных обнаружен (черный след). Та же смесь также разделены и обнаружены непроизводного для сравнения (красная линия). На рисунке 9 RF-ПКА ответ был отображаться в виде отрицательного ответа для более легкого визуального отличия (отклик детектора получен был положительным). На рисунке 10 показано сравнение пика формы р - крезола и дериватизированные с использованием колонки ВЧ-PCD и непроизводного.
Рисунок 1. Хроматографическое наложение hexylbenzene вводимой в систему ВЭЖХ с различными нечувствительности добавленными между колонной и детектором. Пожалуйста , Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Хроматографическое наложение толуола, этилбензола и пропилбензола закачиваемой в системе ВЭЖХ с различными мертвыми объемами добавленных между колонной и детектором. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Иллюстрация конструкции колонны потока реакции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Инструментальный комплект из RF-PCD. (А) одного реагента (т.е. ДФПГ • или флуорескамином дериватизации реагентов) и (В) двойной реагент (т.е. 4-aminoantipyrene и феррицианида калия дериватизации реагентов). Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 5. хроматограммы разделения Ристретто кофе с обнаружением после послеколоночной дериватизации с использованием 2,2-дифенил-1-picrylhydrazil радикал (ДФПГ •). Дериватизацию проводили с использованием обычного колонку с мкл реакционной катушки 500 (А) и колонна реакции потока (В Rong>). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Хроматографический наложение четырех аминокислот (глицин (G), лейцин (L), фенилаланин (Р) и триптофан (Т)) в диапазоне от 10 до 1000 частей на миллион , обнаруженного послеколоночной дериватизации с использованием флуорескамином в качестве реагента PCD после разделение с помощью ВЭЖХ. Хроматограммы заключаются в следующем: (A) обычный PCD, (B) RF-PCD, и (С) центральный (непроизводного) порт от RF-PCD. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
_upload / 53462 / 53462fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Сравнение сигналов , полученных для глицина (первый пик) и лейцина (второй пик) от обычного PCD (красная линия) и RF-PCD (черный след). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. ширина пика сравнение пика из - за триптофана на основе (А) время удерживания и (B) , пик объема. Черная линия показывает обычный способ PCD, красная линия показывает метод ВЧ-ПРД и зеленый след показывает непроизводного поток из центрального порта РФ-PCD метода. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9. Хроматографическое разделение искусственного образца. Компоненты включают фенол (Р), 4-метоксифенола (М), р - крезола (С) и токоферол (Т), а также многочисленные алкилбензолы, полициклические ароматические углеводороды, анизол, phentanole, кофеин, фенилаланин и бензамид. Пики помечены I, II и III являются алкилбензолы, которые неожиданно откликнулись на схеме дериватизации. Черный след представляет собой непроизводного ответ с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм в то время как красный след представляет дериватизированная ответ на длине волны 500 нм. Примечание для визуальной ясности дериватизации ответ был перевернутой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
![Рисунок 10]("/files/ftp_upload/53462/53462fig10.jpg")
Рисунок 10. Хроматографический реакция р - крезола. Черный след представляет собой непроизводного ответ с помощью УФ - детектора при длине волны 254 нм в то время как красный след представляет дериватизированная ответ (RF-PCD) при 500 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
| Тип реакции | Глицин | лейцин | Фенилаланин | Триптофан | ||||
| УД (частей на миллион) | ПКО (частей на миллион) | УД (частей на миллион) | ПКО (частей на миллион) | УД (частей на миллион) | ПКО (частей на миллион) | УД (частей на миллион) | ПКО (частей на миллион) | |
| RF-PCD | 6 | 25 | 10 | 100 | 25 | 250 | 50 | 250 |
| RF-PCD центральный порт (непроизводного) | Не обнаружен | Не обнаружен | Не обнаружен | 1 | 10 | |||
| Обычные PCD | 10 | 100 | 50 | 500 | 50 | 500 | 100 | 500 |
Таблица 1. Пределы обнаружения и количественного определения четырех различных аминокислот , обнаруженных различными системами послеколоночной дериватизации с использованием флуорескамином в качестве дериватизации реагента после разделения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
РЧ-ПКА позволяет эффективное перемешивание дериватизации реагента со сточными водами после ВЭЖХ колонки без использования катушки реакции, сводя к минимуму эффекты уширения полос и повышение эффективности сепарации. методы РЧ-PCD также показали улучшение в ответ сигнала относительно способа обнаружения. Camenzuli и др. 28 был первым , чтобы сообщить использование колонн потока с реакцией ДФПГ • для обнаружения ROS в образце кофе эспрессо. Их исследование включало анализ и оптимизацию условий РФ для достижения максимальной производительности, тестирование диапазона ДФПГ • концентрации с различными ДФПГ • расхода реагента. Был сделан вывод о том , что концентрация ДФПГ • 0,1 мг мл -1 с ДФПГ • расход реагента 0,5 мл мин -1 был оптимальным для улучшения производительности разделения (т.е. эффективность и чувствительность) при RF-PCDусловия по сравнению с обычным способом ПКА ДФПГ • дериватизации. На рисунке 5 показаны две хроматограммы , использующих ДФПГ • количественный анализ антиоксидантов в образце кофе эспрессо. Особенно интересны пики высокой интенсивности с временами удерживания приблизительно 5 мин. Можно видеть , что при использовании циклической реакции 500 мкл, что характерно для традиционных ДФПГ • методов дериватизации, можно наблюдать один, широкий пик. Тем не менее, когда РЧ-ПКА метод используется без необходимости в цикле реакции, то становится понятно, что единственный пик, наблюдаемый с использованием цикла 500 мкл, на самом деле два пика. Кроме того, дополнительные подробности можно увидеть через 5,5 мин при использовании установки РЧ-PCD. Таким образом, для анализа РОС в образцах с использованием ДФПГ •, технику RF-PCD оказались выше обычных методов анализа РОС с использованием ДФПГ •.
RF-PCD сфлуорескамин реагент был использован для анализа первичных аминокислот и по сравнению с обычными формами PCD с флуорескамином 20. Так как РЧ колонке конечного облегающие также служит платформой для мультиплексированного обнаружения, то непроизводного центральный поток контролировали с помощью UV-VIS, в то время как дериватизации между элюат и флуорескамином проводилось во внешней области РФ конечного облегать и обнаружен с помощью УФ- видимый Серия стандартов испытаний , содержащие четыре аминокислоты , были проанализированы в соответствии с мультиплексированием РЧ-ПКА условиях. На рисунке 6 приведено сравнение хроматографический профиль для обычного метода PCD (фиг.6а) и RF-PCD (обнаружение дериватизации (Фиг.6В) и непроизводного (рис 6C)) ряда аминокислот. фиг.7 представляет собой наложение двух аминокислот сигналов , полученных с помощью традиционных PCD и RF-PCD. Можно видеть, что более эффективно, наблюдаемое разделение из-за тон удаление реакционного контура привело к усилению реакции сигнала, несмотря на тот факт, что не все из вытекающего потока колонного дериватизированной. Кроме того, более эффективная схема смешивания дериватизации реагентов привело к снижению базового уровня шума, дальнейшее увеличение отношения сигнала к шуму. Этот эффект подтверждается на нижних пределов обнаружения и количественного , вычисленной для метода ВЧ-PCD по сравнению с обычным способом ПКА в таблице 1. Эта тенденция также можно видеть на рисунке 5 , где антиоксидант представляет ответ на ДФПГ • больше , для метод ВЧ-ПКА по сравнению с обычным способом ПКА. Значительное ухудшение пик можно наблюдать в хроматограммах, где обычный установка ПКА использовалась, что приводит к более низкой ответный сигнал этого метода.
Рисунок 8 сравнивает пик профиля триптофана при анализе с помощью RF-PCD (оба Модифицированные и непроизводного потоков) и обычного PCD, Когда пик профиля в зависимости от времени ширины пиков все , как представляется, в целом аналогичны (8А). Улучшения найдены в RF-PCD по сравнению с обычными PCD очевидны , когда пик профиля представлен в зависимости от пикового объема (8В). Если же построить график от пикового объема, то ясно, что в то время как РЧ-ПКА пик показывает небольшое количество деградации по сравнению с пиком непроизводного, деградация, тем не менее, является минимальным по сравнению с наблюдаемым с помощью обычного метода PCD. Улучшения в эффективности разделения RF-PCD по сравнению с обычными PCD также показано на рисунке 7 , который сравнивает формы пиков глицина и лейцина после дериватизации как обычных , PCD и RF-PCD. Можно видеть, что в обычном режиме PCD глицин и лейцин пики едва базисный отделенную в то время как в режиме ВЧ-PCD сигнал на исходном уровне в течение более длительного периода между двумя пиками.
Дополнительное преимущество RF-PCD по сравнению с обычными методами PCD является возможность контролировать непроизводного сточные воды из центрального порта РФ колонны, позволяющей мультиплексированного обнаружения. Это возможно, так как конструкция фритты внутри концевой заделки РФ не допускает поток в радиальном центральной области смешивать с потоком в периферийной области концевой заделки, что позволяет мониторинг дериватизированного потока из внешней области фитинга, а также мониторинг непроизводного потока из центрального порта. Эта способность подсвечивается результатами , полученными для триптофана в таблице 1, которая , как известно, имеют слабую реакцию сигнала после дериватизации флуорескамином 20, тем не менее, в отличие от других аминокислот , она показывает реакцию на УФ - детектора при непроизводного (при 280 нм) , Для обеих систем дериватизации пределы обнаружения и количественной оценки были относительно высокими, однако пределы обнаружения и количественной оценки были значительно ниже тон непроизводного поток. Используя возможность контролировать как дериваты и непроизводного вытекающие потоки параметры обнаружения могут быть оптимизированы, чтобы дать наибольший уровень производительности для каждой аминокислоты.
Конструкция мультипортовый РФ конечного фитинга позволяет анализировать двойной дериватизации реагентов. Селим и др. 23 исследовали эффективность двух реагентов (4-aminoantipyrene и феррицианида калия) с использованием условий РЧ-PCD для анализа фенольных соединений , по сравнению с традиционным методом ПКА с использованием 4-aminoantipyrene и кровяной соли. Этот тип техники PCD требует двух насосов и реакция петли для каждого дериватизации реагента , в отличие от одного насоса и реакции петли для ДФПГ •. Различные фенольные и алкилбензол соединения были проанализированы в соответствии с обычными и РФ PCD условиях. Интересно, не фенольные соединения, которые не были обнаружены при обычном способе фактически были обнаружены ипдер условия RF-PCD. Рисунок 9 показывает UV-VIS хроматографического отклик и РЧ-PCD колориметрического ответ на стандартной тестовой смеси. RF-PCD представила упрощенную методику PCD с точки зрения инструментария, без компромисса эффективности разделения , как отмечено на рисунке 10. Рисунок 10 сравнивает пик профиля р - крезола при анализе с помощью RF-PCD , а также без дериватизации. Можно видеть, что ширина пика на хроматограмме ВЧ-PCD очень похож на что из непроизводного хроматограмме. Основное различие между этими двумя хроматограммах является то, что хроматограмма РЧ-ПКА немного шире в основании. Это показывает, что практически нет пика дисперсии из-за ВЧ-PCD техники. Аналогичный ответ наблюдался на рисунке 9 , которая показывает , что не только р - крезола пик , который имеет аналогичную ширину пика при дериватизируют RF-PCD по сравнению с его непроизводного пика, но все фенолы и щелочностьlbenzenes, ответившие на схеме дериватизации показали такую же тенденцию. Несмотря на то, РЧ-ПКА с использованием двух дериватизации реагентов получили аналогичные показатели сепарации с обычным способом без дериватизации, RF-ПКА позволило для селективного детектирования фенольных соединений, одно из которых, что не был обнаружен при недериватизированного условиях ,
В качестве ВЧ-ПКА является разработка традиционный метод ВЭЖХ-ПКА методов, все настройки инструментов, доступных в общих методов, таких как ВЭЖХ фазового состава подвижной и скорости потока, вводимый объем и длина волны анализа применимы к методам РЧ-PCD. Кроме того, инструменты настройки, доступные в обычных ВЭЖХ-ПКА методами, такими как подвижной фазы Отношение скоростей потока реагента PCD к, а также от состава реагента PCD применимы к методам РЧ-PCD. Дополнительный инструмент настройки доступны при использовании RF-PCD, который не доступен в традиционных методах PCD представляет собой отношение потоков, поступающих из центральной и периферическойпорты колонны. Потоки управляются путем изменения относительного противодавление на каждой из линий, контролируя длины и / или внутренний диаметр детектора почтового (или послеколоночной, если поток, идущий от центрального порта не обнаруживается) трубки. Оптимальное соотношение центрального периферийных потоков зависит от рассматриваемой реакции, а также других факторов, таких как, является ли обнаружения центральный порт или нет. Отношение потока 60% периферической и центральной 40% часто является хорошей отправной точкой.
Как и с параметрами настройки, многие из вопросов, которые могут возникнуть при использовании колонки RF-PCD также распространены с традиционными методами PCD. Один конкретный параметр, что хроматограф должен знать при выполнении РЧ-ПКА анализов является стабильность потока и давления в системе, в частности, что из насоса (ов) реагентов. Если поток в системе не стабильна, она может привести к нестабильности базовой линии, следовательно, уменьшаяотношение сигнала к шуму и впоследствии пределы количественному и обнаружения.
RF-PCD хроматография была разработана для преодоления трудностей в процессе адаптации PCD реакции на современных колонок и систем ВЭЖХ. Основным преимуществом RF-PCD по сравнению с традиционными методами ПКА более эффективное перемешивание воздуха из-за его происходит внутри фритты внутри концевой заделки колонны РФ, и это смешивание при немного более противодавлением. Это дает возможность минимизации или даже устранение больших циклов реакции объема, которые используются во многих традиционных методов ПКА. С помощью этой минимизации послеколоночной мертвого объема, более эффективные разлуки с большей хроматографического разрешения могут быть выполнены.
Режим RF-PCD привело к повышению эффективности разделения, пик формы и сигнала к шуму по сравнению с обычными методами PCD. Тем не менее, важно отметить, что улучшения сигнала зависят детектора. Например детекторовчто количество образца зависит не может демонстрировать увеличение отклика сигнала при ВЧ-PCD условиях по сравнению с традиционными методами. Это так, потому что в соответствии с обычными методами 100% от на колонке образца обнаружен, где при определенных условиях RF-PCD лишь определенный процент на колонке образца определяется в зависимости от коэффициента сегментации. Это, однако, ожидается, что РЧ-PCD реакции будут иметь возможность адаптировать к любому одному или два реагента (до тех пор, пока обе реагенты добавляются в то же время) ПКА реакция с минимальной повторной оптимизации и что выгоды наблюдается для всех трех реакции до сих пор испытания переведут ко всем другим реакциям PCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatization system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method. | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
References
- Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
- Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
- Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
- Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
- Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
- Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
- Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
- Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
- Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
- Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
- Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
- Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
- Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
- Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
- Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
- Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
- Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
- Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
- Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
- Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
- Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
- Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
- Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
