Introduction
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is één van de belangrijkste oorzaken van blindheid bij mensen boven de leeftijd van 50 3/1. AMD kunnen worden ingedeeld in twee vormen: atrofische ("droog") AMD en neovasculaire ("natte") AMD. Het eerste wordt gekenmerkt door geografische atrofie van het retinale pigmentepitheel (RPE), choriocapillaris en fotoreceptoren, terwijl de laatste wordt gekenmerkt door invasie van abnormale vaartuigen uit de choroidea in de buitenste retina lagen zo lekkage, bloedingen en fibrose, en uiteindelijk leidt tot blindheid 1,2. Van de twee vormen, neovasculaire AMD verantwoordelijk voor de meerderheid van gezichtsverlies 1. Gelukkig is deze vorm heeft tal van effectieve farmacologische opties voor het beheer, terwijl zijn atrofische tegenhanger momenteel geen bewezen medische behandelingen 3. Omdat bovendien de neovasculaire vorm is gemakkelijk opnieuw overgegeven in een diermodel maar het is breder toegankelijk fundamentele A geweestMD onderzoek verkennen van de onderliggende pathologische mechanismen om nieuwe therapieën te ontwikkelen 4.
Het eerste diermodel voor experimentele choroïdale neovascularisatie (CNV) werd ontwikkeld door Ryan et al. bij niet-humane primaten 5. Dit model veroorzaakte breuk van Bruch's membraan via laserfotocoagulatie, die een lokale ontstekingsreactie resulteert in angiogenese vergelijkbaar met dat in neovasculaire AMD veroorzaakt. De histopathologische progressie van angiogenese post-laser inductie werd gevonden na te bootsen neovasculaire AMD, waarvan het model geldigheid 6 bevestigd. Niet-menselijke primaten de meest vergelijkbaar anatomie mens, maar helaas zijn duur om te onderhouden, kan niet gemakkelijk worden genetisch gemanipuleerd en een trage tijdsverloop van ziekteprogressie 7. Daartegenover, knaagdiermodellen veel rendabeler te onderhouden, kan genetisch worden gemanipuleerd met relatief gemak en een veel snellere course ziekteprogressie (experimenten kunnen worden uitgevoerd op een tijdschaal van weken versus maanden). Deze experimenten moeten alleen worden uitgevoerd gepigmenteerde knaagdieren het zeer moeilijk te visualiseren in albinodieren.
De muis laser-geïnduceerd CNV model eerst ontwikkeld door de Campochiaro groep in de late 90's 10, is uitgegroeid tot het dominante diermodel in de meeste recente studies 16/11 zijn. Vanwege de complexe en onduidelijk pathogenese van CNV, heeft de laser model toegepast in alle aspecten van natte AMD onderzoek gaande van het bestuderen van de moleculaire mechanismen die angiogenese te evalueren nieuwe behandelingsmogelijkheden voor toekomstig menselijk gebruik. Bijvoorbeeld, Sakurai et al. en Espinosa-Heidmann et al. de laser model gebruikt om het effect van macrofagen op de ontwikkeling van CNV in transgene muizen en farmacologische vermindering behandelingen 15, 16 onderzocht. Giani et al. en Hoerster c.s.. gebruikte optische coherentie tomografie (OCT) naar het beeld-laser geïnduceerde CNV in een poging om de progressie van CNV karakteriseren en vergelijken de histopathologische bevindingen aan de bevindingen zien op oktober imaging 12,17. Tenslotte hebben studies met intravitreale injectie van anti-angiogene middelen gebruikt als eerste vereisten voor menselijke proeven en waren essentieel bij het ontwikkelen van de eerste generatie anti-VEGF stoffen voor beheer van neovasculaire AMD vandaag 10,18,19.
Alternatieve modellen voor experimentele CNV gebruik chirurgische methoden CNV induceren. Deze werkwijze omvat het injecteren van pro-angiogene substanties (bijv recombinante virale vectoren overexpressie VEGF, subretinale injectie van RPE cellen en / of polystyreen korrels) de toegenomen VEGF-expressie waargenomen bij neovasculaire AMD nabootsen, met als doel het veroorzaken angiogenese 8,20. Echter, levert deze werkwijze een aanzienlijk lagere incidentie van neovascularisatie; Deze studies toonden aan dat CNV inC57 / BL6 muizen voorkomt in 31% van injecties versus ~ 70% slagingspercentage gezien in de laser fotocoagulatie werkwijze van dezelfde stam van muizen 8,14. Om deze redenen, en gezien de voordelen van knaagdieren versus niet-humane primaten, is het muizenmodel van door laser geïnduceerde CNV worden standaard diermodel van CNV meeste neovasculaire AMD studie experimenten 8.
De muis oog is een minuscuul, delicate weefsel te werken. Manoeuvreren van het oog naar de retina te visualiseren is moeilijk en vereist veel oefening tot beheersing wordt bereikt. Deze taak wordt bemoeilijkt door het feit dat het moet worden geleerd de dominante en niet-dominante hand. Bovendien, na de fijne bewegingen die nodig zijn om het netvlies te visualiseren zijn geleerd, de coördinatie tussen beide handen en het voetpedaal bedienen van de laser zijn belangrijk. In dit artikel hebben we geprobeerd om de uitdagingen van het leren van alle fysieke manipulaties die betrokken zijn bij de laser-geïnduceerde CNV proc destillerenedure in een gids die zou helpen exploitanten bereiken snelle succes met dit model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren worden behandeld in overeenstemming met de gids van de Zorg en gebruik van proefdieren 2013 Edition, de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en zoals goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en gebruik Comite voor de Northwestern University.
Opmerking: De volgende procedure kan volledig worden uitgevoerd met één operator; het is echter veel efficiënter uitgevoerd met twee operators de taken afzonderlijke hoofdstukken.
1. Bereid Station Laser en Pre-laser
- Plaats de laser en spleetlamp waar het gemakkelijk toegankelijk kan zijn. Zet laser en ingesteld op vooraf bepaalde parameters (bv 75 pm vlekgrootte, 100 mW vermogen, 100 msec duur).
LET OP: Zorg ervoor dat exploitant draagt alle dierlijke en laserveiligheid persoonlijke beschermingsmiddelen en relevante laserveiligheid tekens buiten de procedure kamer getoond.- Voordat u een proefdieren, vind ideale parameters met behulp van een kalibratie, niet-experimentele muis. Laser parameters hangt af van de gebruikte laser. Ideaal parameters worden bepaald door het laagste laservermogen instelling die consequent veroorzaakt "bubble" formatie als goed scherp. Bekijk de video van bijvoorbeeld letsel met de juiste "bubble" formatie.
- Bereid de pre-laser-station, zodat verdoving, dier warmer, weefsel doekjes, en al oogdruppels (Tropicamide, Tetracaine en kunsttranen) zijn binnen handbereik te operator.
- Zorg dat dier warmer voorverwarmd temperatuur (37 ° C) alvorens te injecteren verdoving in eerste muis om anesthesie-geïnduceerde hypothermie te voorkomen corrigeren.
- Plaats de muis op het podium warmer zodat het kan behouden warmte en blijven warm eenmaal laser procedure begint.
2. Muis Anesthesie en Pre-laser Voorbereiding
- Voordat injecterening verdoving, te inspecteren het oog macroscopisch om ervoor te zorgen dat geen misvormingen of afwijkingen die het hoornvlies duidelijkheid (zoals cataract) verminderen.
- Weeg muis.
- Record gewicht, geslacht en dier ID-nummer.
- Met behulp van gewicht, bereken geschikte hoeveelheid anestheticum te gebruiken op basis richtlijnen van de instelling (bv 100 mg / kg ketamine hydrochloride, 10 mg / kg xylazine of tribroomethanol 250 mg / kg, voor een 20 g muis injecteer 0,20 ml xylazine / ketamine cocktail OR 0,25 ml tribroomethanol). Heb een lijst van vooraf berekende doseringen per gewicht in stappen van 1 g om wiskundige fouten te verminderen.
- Scruff muis en injecteer verdoving intraperitoneaal op basis van berekeningen in stap 2.4.
- Plaats de muis op dierlijke warmer en wacht tot de muis is volledig verdoofd door het controleren van het pedaal reflex via teen knijpen (ongeveer 3-5 minuten).
- Oprollen een tissue af te vegen en de bescherming van de muis neus-gebied te voorkomen aspiration van vloeibare roll-off. Roll muis op zijn kant en plaats een druppel (ongeveer 30 pl) van tetracaine hydrochloride in elk oog voor plaatselijke verdoving. Wacht 2 min voor oplossing door te voeren.
- Herhaal stap 2.7 met een druppel actuele Tropicamide voor pupil dilatatie. U kunt ook gebruik maken van fenylefrine-hydrochloride (2,5%) voor de uitzetting.
- Wacht 2 min naar oplossingen door te voeren; houden dier op warmer in deze tijd.
- Na juiste tijd is verstreken, snel plaatst u de muis op de muis podium en plaats het podium op de kin rest van spleetlamp.
- Zet spleetlamp tot het laagste licht helderheid en controleer de mate van pupil dilatatie. Als leerling niet voldoende verwijd (ongeveer 2,5-3 mm), terug muis om dierlijke warmer en wachten. Als alternatief, beheren andere druppel Tropicamide. Eenmaal oog is voldoende verwijd, overgaan tot laser procedure.
3. Laser Procedure
Opmerking: Zorg ervoor dat andere personen in de kamer dragen beschermbril bij weg van laser-beschermde spleetlamp oculair
- Pas de plaatsing van muis in de muis-fase zodat deze ideaal gepositioneerd voor het zichtbaar maken van de oogzenuw (zie 3.1.2).
- Richt de muis op de houder, zodat het horizontaal ligt, loodrecht op de lamp beam spleet, met het hoofd aan de ene kant en de staart aan de andere. Ideaal muis plaatsing zal oogzenuw visualisatie veel gemakkelijker als dekglas wordt toegepast maken.
- Iets zet de muis, zodat het zich in een ~ 170 ° hoek met de kop dichter bij laser operator.
- Controleer of muis zo dicht mogelijk lamp spleet, maar toch op een plaats waar hij stabiel is en waarbij de hand van de bediener genoeg ruimte voor fijne manipulatie hebben.
- Na de muis ideaal is geplaatst, plaats één druppel kunstmatige traan oplossing op een 25 mm x 25 mm glazen dekglaasje.
- Plaats één druppel kunstmatige traan oplossing opp muisosite eye - dit zal zorgen voor de ogen wordt gehydrateerd en helpen vertraging cataract.
- Houd hoek van dekglaasje tussen duim en aanwijzer vingers; positie, zodat het glas wordt ingeklemd tussen tips van beide vingers.
- Voorzichtig wikkel de overige drie vingers rond het lichaam van het dier om steun en hand stabilisatie. Positie hand, zodat kan het glas dekglaasje eenvoudig worden geplaatst op het oog van de muis.
- Zorg ervoor dat de pols is gestabiliseerd op een stevige ondergrond om de hand tremor verminderen.
- Zodra een stabiele positie wordt verkregen, zorgvuldig op glas dekglaasje (met daling van kunstmatige scheur nog steeds gehandeld) op het oog van de muis.
- Zorg ervoor dat het dekglaasje geplaatst is zo loodrecht mogelijk op de laserstraal teneinde laserbundel verstrooien of reflectie te voorkomen. Het dekglaasje fungeert als een contactlens op de cornea te vlakken.
- Kijk door spleetlamp en met de vrije hand toggle richten until retina kan worden gevisualiseerd. Het netvlies is een licht geel / rode kleur afhankelijk van de locatie zichtbaar zijn, zullen verschillen, rood vaten zichtbaar.
- Langzaam en voorzichtig te manipuleren muis hoofd en / of dekglaasje tot het visualiseren van de oogzenuw. De oogzenuw wordt geel van kleur met meerdere schepen die uitlopen van het zijn.
- Zodra exploitant visualisatie van oogzenuw heeft bevestigd, zet laser beam focussen.
- Zodra laserbundel is ingeschakeld, manoeuvreren laser beam focussen gewenste positie (ongeveer 1 disc diameter van de optische zenuw).
- Focus laserstraal op de RPE van de oogfundus. Juiste scherpstelling wordt bereikt door het hebben van de scherpste en helderste laserstraal. Als richtstraal kijkt ovale of onscherp, toggle spleetlamp scherpstelling of re-positie glas dekglaasje.
- Zodra het doel bundel is gericht op het RPE, initiëren laser administratie met behulp van de laser voet trekker.
- Zorg ervoor dat retinale vaten tot intra-oculaire voorkomen voorkomen dat hijmorrhage.
- Let op het uiterlijk van een bel direct na laser toediening. De omtrek van de laser schot moet duidelijk en niet wazig op geen enkele manier.
- Als de laser schot niet leidt tot belvorming of gebied van effecten lijkt wazig (vertroebeling en slecht omschreven cirkelgrens vs. helder, scherp gedefinieerde rand van het succes ervan) of bloeding wordt gezien na toediening laser, do NOT omvatten deze laesies voor toekomstige analyse.
- Herhaal stap 3,10-3,12 alle gewenste posities CNV (meestal 3, 6, 9 en 12 uur posities rond oogzenuw). Als laser inducties worden aangebracht op ongeveer dezelfde afstand van de optische zenuw, toeleggen niet nodig. Vanwege de sterke kromming van de muis oog en kleine variaties die kunnen bestaan in de retina, heroriëntatie bundel nodig tussen opeenvolgende toedieningen laser zijn.
- Record in een notebook van de locatie en het resultaat van each laser schot administratie en het resultaat (succesvol, wazig, bloedingen, enz.) van elk toegediend schot voor het oog. Zorg ervoor dat de laser plaatsen in stand-by modus wanneer niet in gebruik.
- Herhaal 3,1-3,14 voor andere oog van de muis, indien nodig, met de andere hand te stabiliseren en een nieuw dekglaasje.
- Nadat alle gewenste laser shots worden toegediend, zet laser en spleet-lamp.
- Gooi dekglaasje en plaats de muis op warmere voor het herstel van de anesthesie. Macroscopisch inspecteren oog voor enig letsel en plaats een daling van kunstmatige traan oplossing voor de ogen gehydrateerd en potentieel voorkomen van toekomstige cataract ontwikkeling. Zodra muis herstelt van anesthesie, terug naar de kooi.
| AVERTIN | AVERTIN | AVERTIN | XYL / KET | XYL / KET | |
| Muis Gewicht (g) | Dosis (mg / kg) | Verdoving Dosis (ml) | Dosis (mg / kg) | Verdoving Dosis (ml) | |
| 15 | 250 | 20 | 0,1875 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.15 |
| 16 | 250 | 20 | 0.2 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.16 |
| 17 | 250 | 20 | 0,2125 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.17 |
| 18 | 250 | 20 | 0,225 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.18 |
| 19 | 250 | 20 | 0,2375 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0.25 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.2 |
| 21 | 250 | 20 | 0,2625 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.21 |
| 22 | 250 | 20 | 0,275 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.22 |
| 23 | 250 | 20 | 0,2875 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.23 |
| 24 | 250 | 20 | 0.3 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.24 |
| 25 | 250 | 20 | 0,3125 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.25 |
| 26 | 250 | 20 | 0,325 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.26 |
| 27 | 250 | 0,3375 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0.35 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.28 |
| 29 | 250 | 20 | 0,3625 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.29 |
| 30 | 250 | 20 | 0,375 | 100 mg / kg ketamine; 10 mg / kg xylazine | 0.3 |
Tabel 1: XyIKet Dosering Chart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kwantificering van CNV laesies kunnen worden uitgevoerd door middel van analyse van de flat-gemonteerde choroidea met immunofluorescentiekleuring aan de CNV schepen labelen. De twee meest gebruikte methoden van weefsel voorbereiding zijn FITC-dextran labeling, gedaan via perfusie onmiddellijk voor het offeren van dieren, of post-mortem immuno-kleuring met een endotheelcellen marker. Beide werkwijzen zijn eerder in detail beschreven 13,14,21; Figuren 1 en 2 tonen voorbeelden van elk resp. Na confocale microscopie afbeelding overname, hetzij gebied (2-Dimensions) of volume (3-Dimensions) kan worden berekend en gevisualiseerd met ImageJ software of Volocity. Naast kwantificering kan oktober beeldvorming worden gebruikt om de CNV laesie in vivo visualiseren. Een voorbeeld van een dwarsdoorsnede afbeelding van het netvlies resulterende CNV is weergegeven in figuur 3.
lt = "Figuur 1" src = "/ files / ftp_upload / 53.502 / 53502fig1.jpg" />
Figuur 1:. CNV perfusie kleuring & Ruimte (2D) Rekenvoorbeeld (25X) (A) FITC dextran geperfuseerd CNV laesie. (B) ImageJ gebied kwantificering methode via drempelen. Muizenstam. C57BL / 6J Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: CNV Immunokleuring & Volume (3D) Rekenvoorbeeld (25X) (A) isolectin GS-IB4 gekleurd CNV laesie.. (B) 3D-reconstructie van CNV laesie en gezicht bekijken. (C) 3D reconstructie zijaanzicht (B en C één tegel width = 35 pm). Muis Strain: C57BL / 6J.g2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Oktober dwarsdoorsnede CNV Visualisatie (A) oktober en face uitzicht op CNV laesie. (B) oktober dwarsdoorsnede B-scan van het netvlies met CNV omcirkeld in geel. Muizenstam. C57BL / 6J Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn meerdere factoren die van invloed kan zijn laser levering en de daaruit voortvloeiende CNV laesie ontwikkeling na een succesvolle laser-inductie. Deze factoren moeten worden gecontroleerd en gestandaardiseerd teneinde de meest betrouwbare resultaten. De meeste relevante factoren muis selectie (genotype, leeftijd en geslacht), verdoving selectie en laserinstellingen.
De specifieke muismodel gebruikt kan een significant effect op het verloop van de CNV ontwikkeling. De meest gebruikte genotype is de C57BL / 6 muis. De leverancier van waaruit de dieren worden verkregen kunnen beïnvloeden de resulterende CNV. Slechte et al. toonde significante verschillen in finale CNV laesiegrootte in C57BL / 6 muizen uit Jackson, Charles Rivers en Taconic laboratoria met muizen uit Taconic ontwikkelen CNV beduidend groter dan de andere twee leveranciers 4. Daarom is de aanschaf van het ene bedrijf en het gebruik van alle muizen van dezelfde leverancier zal helpen om uiterlijke verschillen te minimaliserenin CNV laesie grootte. Leeftijd en geslacht van de muis is ook aangetoond dat een belangrijke factor om te overwegen bij het ontwerpen van het experiment. Vrouwelijke muizen ontwikkelen meer CNV dan mannelijke muizen van dezelfde leeftijd en ouder muizen van beide seksen te ontwikkelen meer CNV dan jongere muizen 22,23. Afhankelijk van de experimentele parameters, moeten exploitanten van deze factoren in het achterhoofd te houden. Als bijvoorbeeld operators behulp van de laser-CNV procedure mechanistische en drugs-ontwikkelingsdoeleinden verhelderen, beide geslachten op verschillende leeftijden worden gebruikt om mechanismen die specifiek zijn voor de seksen en die niet zijn gedefinieerd.
Juiste verdoving is een cruciale stap voor deze procedure, vooral tijdens het leerproces. De meeste IACUC goedgekeurd regimes kunnen anesthesie gedurende tenminste 15-30 minuten, wat meer dan voldoende 4-5 laserpulsen leveren aan elk oog nadat de procedure is beheerst. Echter, als er te veel tijd is verstreken, kan de anesthesie leiden tot omkeerbare lens opacificatie, rendering het oog optisch ongevoelig voor experimentele CNV 24. De twee belangrijkste protocollen die worden gebruikt voor anesthesie zijn een xylazine / ketamine cocktail of tribroomethanol (TBE) intraperitoneaal afgeleverd. Hoewel sommige rapporten poneren voordelen van TBE tot xylazine / ketamine qua cataract vorming, zowel uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van een troebele lens als de bediener niet snel 14 werken. Een manier om de tijd te verlengen voordat cataract ontwikkeling hydratatie van het oog te handhaven, zoals in de gedetailleerde protocol, door toepassing van kunsttranen 25. Deze werkwijze, ongeacht verdoving gebruikte stof dient te vertragen cataractvorming en geeft de gebruiker meer tijd om de procedure te voltooien.
Laserinstellingen kan een belangrijke factor in de betrouwbare inductie van CNV zijn. Kalibreren van het laservermogen en duur zijn een belangrijke eerste stap voor het uitvoeren van de procedure op proefdieren. Laser shotsdie oorzaak bloeding of onscherp zonder belvorming dienen van de berekening worden uitgesloten, aangezien dit verstoort de CNV ontwikkelingsproces. Wanneer meerdere vaten gescheurd veroorzaken diffuse bloeding, dient de gehele oog uitgesloten. Idealiter zou de laagste kracht en de kortst mogelijke laser die consequent breekt Bruch's membraan waardoor belvorming en een laesie met duidelijke afbakening gebruiken 4. Protocollen experimenteren met verschillende energie-instellingen zijn die meer kracht en de duur leiden tot overmatige weefselschade en vervolgens lagere tarieven van CNV vorming 4, 14,17 aangetoond. Bovendien kan plaats van de laser schade ook invloed CNV ontwikkeling. Effecten geleverd ongeveer 1 disc diameter (DD) van de optische schijf aanzienlijk groter gebied CNV volumes dan die geleverd <DD 1 of 2 of meer DD weg 23 opgeleverd. Afhankelijk van de post-laser analyse laesies al dan niet cruciaal. Bijvoorbeeld,Als een afbeelding oktober moet worden verkregen van alle letsels, centraal gelegen rond de oogzenuw is van vitaal belang. Contrastingly, als laesies zijn via plat mount te analyseren, laesie locatie is niet zo belangrijk. Tot slot, zorg ervoor dat de laatste shots zijn niet te dicht bij elkaar of anders twee laesies kunnen "groeien" elkaar geplaatst.
De CNV-test is een robuuste methode om experimenteel te bestuderen neovasculaire AMD. De angiogenese gevolg van laser inductie is qua locatie en de algehele verschijning op de angiogenese waargenomen bij menselijke patiënten AMD. Het is echter verre van perfect model. In tegenstelling tot het menselijk oog, muizen hebben geen gedefinieerde macula hebben en de acute verwonding verwante angiogenese gezien in de laser geïnduceerde CNV model verschilt fundamenteel van de genetisch bepaalde chronische pathologie van AMD 7,8,14. De muis retinale milieu gezond en de resulterende angiogenese optreedt als reactie op het trauma veroorzaakt door de laser effect, in plaats van genetische / environmental factoren en leeftijd, zoals in menselijke AMD. Daartegenover, de menselijke retina milieu AMD is in een toestand van chronische ontsteking, waarbij afwijkingen in VEGF expressie en andere cytokinen veroorzaken CNV 3. Het is duidelijk dat de neovasculaire ontwikkeling van deze twee omgevingen is duidelijk verschillend.
Kortom, de lasergeïnduceerde CNV-protocol is er een die in eerste instantie moeilijk uit te voeren, maar uiteindelijk de moeite waard om meester. De fijne handigheid nodig muis dekglaasje houden, evenals het manipuleren dekglaasje en muis kop aan de oogzenuw zichtbaar zijn oefeningen die geduld en oefening vereist, vooral omdat ze moeten ook worden uitgevoerd met behulp van de handen van de operator. Echter, zodra de techniek geleerd kan efficiënt te voeren experimentele CNV en kan worden toegepast op de meeste aspecten van neovasculaire AMD onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
