Identifisere de direkte målene for genom målretting molekyler er fortsatt en stor utfordring. For å forstå hvordan DNA-bindende molekyler engasjere genomet, har vi utviklet en metode som er avhengig av kryssbinding av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC).
Genomet er målet for noen av de mest effektive kjemoterapeutiske midler, men de fleste av disse stoffene mangler DNA-sekvens spesifisitet, noe som fører til dosebegrensende toksisitet, og mange uønskede bivirkninger. Målretting genomet med sekvensspesifikke små molekyler kan gjøre det mulig molekyler med økt terapeutisk indeks og færre off-target effekter. N -methylpyrrole / N metylimidazol polyamider er molekyler som kan rasjonelt utformet for å målrette spesifikke DNA-sekvenser med utsøkt presisjon. Og i motsetning til de fleste naturlige transkripsjonsfaktorer, kan polyamider binde til metylert og chromatinized DNA uten tap i affinitet. Sekvensen spesifisiteten av polyamider er blitt grundig undersøkt in vitro med beslektet område identifikasjon (CSI) og med tradisjonelle biokjemiske og biofysiske nærmer seg, men studiet av polyamid binding til genomiske mål i cellene fortsatt ukjent. Her kan vi rapportere en fremgangsmåte til tverrbinding av små molekyler isolate kromatin (COSMIC), som identifiserer polyamid bindingssteder over hele genomet. COSMIC er lik kromatin immunoutfelling (chip), men skiller seg i to viktige måter: (1) en photocrosslinker anvendes for å muliggjøre selektiv, midlertidig styrt innfanging av polyamid bindende hendelser, og (2) biotin affinitet håndtaket benyttes til å rense polyamid -DNA-konjugater i henhold til semi-denaturerende betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. COSMIC er en generell strategi som kan brukes for å avsløre genombindingsbegivenheter av polyamider og andre genom-målretting kjemoterapeutiske midler.
Den informasjon for å gjøre hver celle i kroppen er kodet i DNA. Den selektive bruk av denne informasjonen styrer skjebnen til en celle. Transkripsjonsfaktorer (TFS) er proteiner som binder seg til spesifikke DNA-sekvenser for å uttrykke en bestemt undergruppe av gener i genomet, og funksjonsfeil i TFS er knyttet til starten av en lang rekke sykdommer, inkludert utviklingsdefekter, kreft og diabetes . 1,2 Vi har vært interessert i å utvikle molekyler som selektivt kan binde til genomet og modulerer gen regulatoriske nettverk.
Polyamider består av N -methylpyrrole og N metylimidazol er rasjonelt utformet molekyler som kan målrette DNA med særegenheter og slektskap som rivaliserende naturtranskripsjonsfaktorer. 3-6 Disse molekylene binder seg til spesifikke sekvenser i mindre sporet av DNA. 4,5,7 -11 Polyamider har vært ansatt både undertrykke og aktivere uttrykk for spesifikke gEnes. 4,12-19 De har også interessante antivirale 20-24 og kreft 12,13,25-30 egenskaper. En attraktiv funksjon av polyamider er deres evne til å få tilgang til DNA-sekvenser som er metylert 31,32 og pakket rundt histonproteiner 9,10,33.
For å måle de omfattende bindingsspesifisiteter av DNA-bindende molekyler, vårt laboratorium opprettet beslektet område identifikator (CSI) -metoden. 34-39 Den antatte forekomsten av bindingsseter basert på in vitro-spesifisiteter (genomescapes) kan vises på genomet, fordi in vitro bindende intensiteter er direkte proporsjonal med foreningen konstanter (K a). 34,35,37 Disse genomescapes gi innsikt i polyamid belegg over genomet, men måle polyamid bindende i levende celler har vært en utfordring. DNA er tett pakket i kjernen, noe som kan påvirke tilgjengeligheten av bindingssteder. Accessibility av disse chromatinized DNA-sekvenser til polyamider forblir et mysterium.
Nylig, til mange metoder studere samspillet mellom små molekyler og nukleinsyrer har dukket opp. 40-48 Den affinitet fangst og massivt-parallell DNA-sekvensering (chem-seq) er en slik teknikk. Chem-seq bruker formaldehyd for å kryssbinde små molekyler til et genomisk mål av interesse og et biotinylert derivat av et lite molekyl av interesse å fange ligand-target-interaksjon. 48,49
Formaldehyd kryssbinding fører til indirekte vekselvirkninger som kan produsere falske positiver. 50 Vi har utviklet en ny metode, kryssbindingen av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC), 51 med en photocrosslinker å eliminere disse såkalte "fantom" topper. 50 til å begynne, vi designet og syntetisert trifunksjonelle derivater av polyamider. Disse molekylene inneholdt et DNA-bindende polyamide, en photocrosslinker (psoralen), og en tilhørighet håndtaket (biotin, figur 1). Med trifunksjonelle polyamider, kan vi kovalent fange polyamid-DNA-interaksjoner med 365 nm UV-bestråling, en bølgelengde som ikke skader DNA eller indusere ikke-psoralen-baserte tverrbinding. 51 Deretter vi fragmentere genomet og rense det oppfangede DNA under strenge, semi -denaturing betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. Således ser vi på kosmiske som en metode relatert til chem-seq, men med en mer direkte avlesning av DNA målretting. Viktigere, svak (K 10 3 -10 4 M -1) psoralen affinitet for DNA ikke påviselig effekt polyamid spesifisitet. 51,52 anriket DNA-fragmenter kan analyseres enten ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon 51 (kosmiske-qPCR) eller ved neste generasjons sekvense 53 (COSMIC-seq). Disse data aktivere en objektiv, genom styrt design av ligander som interopptre med sine ønskede genomisk loci og minimere off-target effekter.
Figur 1. Bioaktive polyamider og COSMIC ordningen. (A) hårnål polyamider 1 – 2 målet DNA-sekvensen 5'-WACGTW-3 '. Lineære polyamider med 3 – 4 mål 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringer av N-methylimidazole er uthevet for klarhet. Åpne og fylte sirklene representerer N -methylpyrrole og N metylimidazol hhv. Square representerer tre-klortiofen og diamanter representerer β-alanin. Psoralen og biotin er betegnet med P og B, respektivt. (B) COSMIC ordningen. Celler behandles med trifunksjonelle derivater av polyamider. Etter kryssbinding med 365 nm UV-bestråling, cellene er lysed og genomisk DNA er skåret. Streptavidin-belagte magnetiske kuler blir tilsatt for å fange opp polyamid-DNA-addukter. DNA frigjøres og kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR) eller ved neste generasjons sekvensering (NGS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | any source | ||
Benzamidine | any source | ||
Pepstatin | any source | ||
Proteinase K | any source | ||
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 | |
PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | Other sources can be used |
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | We have tried other manufacturers of DNA columns with success. |
TruSeq ChIP Sample Prep Kit | Illumina | IP-202-1012 | This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing |
Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356231 | Used to coat plates in order to grow H1 ESCs |
pH paper | any source | ||
amber microcentrifuge tubes | any source | ||
microcentrifuge tubes | any source | ||
pyrex filter | any source | Pyrex baking dishes are suitable | |
qPCR master mix | any source | ||
RNase | any source | ||
HCl (6 N) | any source | ||
10-cm tissue culture dishes | any source | ||
Serological pipettes | any source | ||
Pasteur pipettes | any source | ||
Pipette tips | any source | ||
15-mL conical tubes | any source | ||
centrifuge | any source | ||
microcentrifuge | any source | ||
nutator | any source | ||
Magnetic separation rack | any source | ||
UV source | CalSun | B001BH0A1A | Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically |
Misonix Sonicator | Qsonica | S4000 with 431C1 cup horn | Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically |
Humidified CO2 incubator | any source | ||
Biological safety cabinet with vacuum outlet | any source |