Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Genom hedefleme moleküllerinin doğrudan hedefleri belirlenmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. DNA bağlama molekülleri genomu meşgul anlamak için, kromatin izole etmek için küçük moleküllerin çapraz bağlama dayanan bir yöntem (COSMIC) geliştirdi.

Abstract

Genom en etkili kemoterapötik bazı hedef, ancak bu ilaçların en doz sınırlayıcı toksisite ve çok sayıda olumsuz yan etkilere neden DNA sekansı özgüllük yoksundur. Diziye özgü küçük moleküller ile genom hedefleme artan terapötik indeksi ve daha az hedef dışı etkileri olan molekülleri sağlayabilir. N-metilpirol / N-metilimidazol poliamidler rasyonel mükemmel hassasiyetle spesifik DNA dizileri hedeflemek için tasarlanmış olabilir moleküllerdir. Ve en doğal transkripsiyon faktörleri farklı olarak, polyamidler afinite kaybı olmaksızın metil ve chromatinized DNA'ya bağlanabilir. Poliamidlerin dizisi özgüllüğü yoğun aynı kökenli yerinin tanımlanması (CSI) ile in vitro olarak, geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlarla ele alınmıştır, ancak hücrelerin genomik hedeflere bağlanabilen poliamidin çalışması zor olmaya devam etmektedir. Bir yöntemi rapor Burada, küçük moleküllerin çapraz bağlama için isolate kromatin (KOZMIK), genom çapında polyamid bağlanma yeri tanımlar. KOZMIK kromatin immunoprecipitation (chip) benzer olmakla birlikte, iki önemli noktada ayrılır: olarak bir foto çapraz seçici zamansal kontrollü polyamid bağlanma olgularının yakalama ve (2) biotin afinite kolu poliamid saflaştırmak için kullanılır sağlamak için kullanılır (1) Yarı denatüre edici koşullar altında a-DNA konjügatları kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan DNA azaltmak için kullanılır. KOZMIK poliamitler ve diğer genom hedefleme kemoterapötik ajanların genom bağlayıcı olayları ortaya çıkarmak için kullanılan bir genel bir stratejidir.

Introduction

Bilgi, insan vücudunda her hücre DNA'sında kodlanmış yapmak. Bu bilginin seçici olarak kullanımı, bir hücrenin kaderi yönetir. Transkripsiyon faktörleri (TF) genomunda genlerin özel bir alt ifade özel DNA dizilerine bağlanan proteinler, ve TFS arıza gelişimsel bozukluklar, kanser, ve diyabet gibi hastalıkların geniş bir dizinin başlangıcından bağlantılıdır . 1,2 Biz seçici genom bağlanan ve gen düzenleyici ağlar modüle moleküller geliştirmek isteyen olmuştur.

Poliamidler N-metilpirol oluşan ve N, rakip doğal transkripsiyon faktörleri. 3-6 Bu moleküller DNA minör oyuk içinde oluşan özel dizilerine bağlanan özgüllükleri ve afiniteleri olan hedef DNA molekülleri olabilir metilimidazol rasyonel tasarlanmıştır. 4,5,7 -11 Polyamidler hem bastırmak için kullanılan ve spesifik g ifadesini aktive edilmişenes. 4,12-19 Ayrıca ilginç 20-24 anti-viral ve anti-kanser 12,13,25-30 özelliklere sahiptir. Poliamidlerin bir çekici özelliği 31,32 metillenmiş ve histon proteinleri 9,10,33 sarılı DNA dizilerini ulaşmak için yetenekleridir.

DNA bağlama moleküllerinin kapsamlı bir birleşme spesifisitelerine ölçmek için, laboratuar, 34-39, in vitro özgüllükleri (genomescapes) dayalı bağlanma yerlerinin tahmini oluşum genomu üzerinde görüntülenebilir. Kognat Alanı tanımlayıcısı (CSI) yöntemini yarattığı için in vitro bağlanma şiddetleri dernek sabitleri ile doğru orantılıdır (K a). 34,35,37 Bu genomescapes genom boyunca poliamid doluluk içgörü sağlar, ancak canlı hücrelerde bağlanmasını ölçme poliamid bir meydan okuma olmuştur. DNA, sıkı bir şekilde bağlanma sitelerinin erişilebilirliğini etkileyebilir çekirdek içinde paketlenir. Birpoliamidlere bu chromatinized DNA dizilerinin ccessibility bir gizem kalıyor.

Son zamanlarda, birçok yöntem ortaya çıkmıştır küçük moleküller ve nükleik asitler arasındaki etkileşimleri incelemek için. 40-48 kimyasal afinite yakalama ve kitlesel paralel DNA dizileme (kimya-seq) böyle bir tekniktir. Chem seq ligand-hedef etkileşimi yakalamak için ilgi konusu bir genomik hedef ve ilgi konusu bir küçük molekülün, bir biyotinile türevine küçük moleküller çapraz bağlanması için formaldehit kullanır. 48,49

Formaldehit çapraz bağlama hata üretebilirken dolaylı etkileşimleri yol açar. 50 Yeni bir yöntem, küçük moleküllerin çapraz bağlama olarak adlandırılan bu "hayalet" tepe ortadan kaldırmak için bir foto çapraz bağlayıcının ile kromatin (KOZMIK), 51 izole etmek için. 50 başlamak için geliştirilen biz tasarladık ve poliamitlerin üç işlevli türevleri sentezlendi. Bu moleküller, bir DNA-bağlama pol ihtivayamide bir Foto çapraz bağlayıcı (psoralen) ve bir afinite kolu (biotin, Şekil 1). Üç işlevli poliamidler ile, kovalent. 365 nm UV ışıması, DNA hasarı ya da olmayan psoralen-esaslı çapraz bağlanmasını yol açan bir dalga boyuna sahip poliamid-DNA etkileşimlerini yakalayabilir 51 Sonra, katı, yarı altında çekilen DNA genom fragman ve saflaştırmak -denaturing koşulları kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan DNA azaltmak için kullanılır. Böylece, kimya-SEQ ilişkin bir yöntem olarak KOZMIK görebilir, ancak DNA 'nın daha doğrudan bir okuma ile hedeflenmesi. Önemli bir şekilde, zayıf (K 10 3 -10 4 M-1) DNA için psoralen afinitesi yapar saptanabilir etki poliamid spesifikliği. 51,52 zenginleştirilmiş DNA fragmanları kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ya da 51 ile analiz edilebilir (kozmik qPCR) ya da yeni nesil dizileme 53 (COSMIC-seq) tarafından. Bu veriler ligandların tarafsız bir genom güdümlü tasarım etkinleştirmek arasıOnların arzu genomik loci ile hareket ve hedef dışı etkilerini en aza indirmek.

figür 1
Şekil 1. Biyoaktif poliamidler ve KOZMİK düzeni. (A) Firkete poliamitler 1-2 hedef DNA sekansı 5'-WACGTW-3 '. Lineer poliamidler 3-4 hedef 5'-AAGAAGAAG-3 '. N-metilimidazol Rings netlik için kalın edilmektedir. Açık ve dolu daireler sırasıyla N-metilpirol ve N-metilimidazol temsil etmektedir. Kare 3-klorotiofen temsil eder ve elmas β-alanin temsil etmektedir. Psoralen biotin, sırasıyla, P ve B ile temsil edilir. (B) KOZMİK düzeni. Hücreler Poliamidlerin üç işlevli türevleri ile muamele edilmektedir. 365 nm UV ışınlama ile çapraz sonra, hücreler l vardırysed ve genomik DNA 'kırılır. Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar, poliamid-DNA adüktleri yakalamak için ilave edilir. DNA serbest bırakılır ve kantitatif PCR (qPCR) veya yeni nesil dizileme (NGS) tarafından analiz edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Canlı hücreler 1. Çapraz bağlanma,

  1. ~ 2.5x10 7 H1 hücreleri veya diğer kültür hücreleri ile başlayın.
    Not: H1 Bu hücre sayısı beş ila 10 cm'lik kaplar (yaklaşık% 40 konflüans) karşılık gelir.
  2. Pluripotent kök hücrelerin destekleyen bir yüzey üzerinde kaplı kaplar üzerinde E8 ortam hücreleri büyümek (Malzeme listesi bakınız) ve 5% CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de inkübe. Hasat hücreleri enzimatik (Malzeme Listesi'ne bakın). Not: H1 hücreleri% 90 confluency aşmasına izin vermeyin; Birleşme sağlandığı H1 hücrelerin spontan farklılaşmasını indükler. Hücreleri saymak için, hücrelerin fazladan bir 10 cm'lik çanak büyümek enzimatik olarak bölümlerde 1,8-1,10 açıklanan hücreleri kaldırın ve bir hemasitometre ile saymak.
    1. Chen ve diğerleri içinde tarif edilen E8 kültür ortamı hazırlayın. 54
  3. Polyamid eklemeden önce bir vakum tuzak bağlı bir Pasteur pipeti ile geçirilerek kültür ortamını çıkarın. Olarak taze medya ekleerological pipet ve pipet verici (10 cm'lik tabağı başına 8 mi) hazırlandı.
    NOT: Hücreler parçalanmadan kaçınmak için çanak tarafındaki ortam ekleyin. Bu noktadan itibaren prematüre fotoğraf çapraz bağlanmasını önlemek için ışıktan hücreleri korumak.
  4. Doğrudan her çanak kültür ortamına bir pipet (DMSO içinde 400 uM poliamidin 8 ul, 400 nM nihai konsantrasyon) ile poliamid ekleyin. Ortama eşit poliamid dağıtmak için çanak girdap.
    Not: Konsantrasyon, çeşitli olabilir, ancak herhangi bir hücresel toksisite, seçilen işlem için gözlenen emin olabilir.
  5. % 5 CO2 'nin nemlendirilmiş bir atmosferinde hücreler 24 saat 37 ° C inkübe ve ışıktan korunmasını sağlamak.
    Not: Kuluçka süresi zaman içinde bağlanma poliamid ölçmek için değiştirilebilir.
  6. 4 ml PBS (1.05 mM potasyum fosfat monobazik, 155,17 mM sodyum klorid, 2.97 mM sodyum fosfat dibazik) serolojik bir pipet ve pipet dis kullanılarak her 10 cm tabak yıkayınpenser. PBS aspire ve 3 ml E8 kültür ortamı ekleyin.
  7. Işıkları sönük ile 5 kültür kaplarına kapağını kaldırın ve kaput dışında düz bir yüzeye yerleştirin hücreleri. L <300 nm ile ışık filtrelemek için 5 kültür yemekleri üzerine bir cam filtre yerleştirin. Filtrenin üstünde UV kaynağını yerleştirin. Çapraz bağ örnekleri 365 nm UV ışımasına (2,4 mW / cm2) ile 30 dk.
    NOT: Zaman Crosslinking ampirik olarak tespit edilmelidir.
  8. Geri kaput kültür kaplarına aktarın. Bir vakum tuzak bağlı bir Pasteur pipeti ile medya aspire. 4 ml PBS ile her biri 10 cm tabak yıkayın. PBS aspire. Hücreleri ayırmak için 10 cm'lik tabak başına hücre ayrışma için 3 ml enzim (Malzeme Listesine bakın) ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Do not enzimi önceden ısıtmak.
  9. Çanak başına 3 ml E8 ortamı ile enzim söndürün. Transferi bir adet 15 ml konik tüp içine hücreleri ayrışmış.
    NOT: Bu noktadan itibaren buz üzerine yerleştirin hücreleri.
  10. Centrifuge hücreler 5 dakika, 4 ° C 'de 500 xg ayrışmış. Süpernatant aspire enzim ve medyayı çıkarın.
    NOT: noktasını Pause. Hücreler, daha sonraki bir zamanda, takip eden işlemler için -80 ° C'de saklandı, anında donduruldu sıvı azot içinde olabilir.

Kromatin 2. izolasyonu

  1. 1,2 mi KOZMIK tampon ekleme (20 mM Tris-HCI [pH 8.1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 1 Triton-X100,% 0.1 SDS) ve yukarı ve aşağı pipet birkaç kez, her bir numunede, hücre pelletini için 1,2 mi KOZMIK tamponu.
    1. PMSF ve benzamidin ve pepstatin 1.5 uM 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar, taze 133 ul 100 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF) her biri, 100 mM benzamidin ve protez engelleyici pepstatin 150 uM ekleyin. İki amber 1.7 ml mikrosantrifüj tüpler içine hücre lizatının Bölünmüş çözüm.
  2. Sonikatör 35 dakika (10 sn, 10 sn kapalı,% 60 güç) ile sonikasyon 100 a arasına genomu parçalara içinnd 500 bp.
    1. Rezervuar su seviyesine Mikrosantrifüj tüpü paralel kromatin çözelti seviyesini muhafaza edin. Görsel muayene ile bu seviyeyi onaylayın.
      Not:., DNA% 1.5 agaroz jel ile kesilmiş olduğu teyit 55
    2. Ampirik sonication süresini optimize edin. Örnekleri chill rezervuar içinde buz az miktarda kullanın ve buz örnekleri ve fincan boynuz arasına engel olmadığından emin olun.
  3. Santrifüj Numune 12.000 xg 10 dk. Bir pipet yardımıyla yeni bir kehribar mikrosantrifüj tüp aktararak çözünür kromatin içeren sulu çözeltinin kaydedin. Pelet atın.
  4. Yeni mikrosantrifüj tüp numune 110 ul (% 10) aktarın ve ona Girdi DNA etiket. -80 ° C saklayın. Adım 3.3 kullanılmak üzere buz üzerinde kromatin örnek kalanını kaydedin.

Ligand-DNA çapraz bağların 3. Yakalama

  1. 60 ul streptavi dağıtmak için bir pipet kullanınBir mikrosantrifüj tüp manyetik boncuk din kaplı. 1 ml KOZMİK tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir nutator 5 dk karıştırın. Manyetik ayırma üzerindeki manyetik boncuk boncuk yakalamak için 2 dk raf yerleştirin. Bir pipet yardımıyla KOZMİK tamponu çıkarın.
    NOT: boncuk kurumasına izin vermeyin. Bir sonraki aşamada hemen geçin.
  2. Kromatin örneği ekleyin (~ 1 ml) boncuk (60 ul) ve boncuklar tekrar süspansiyon. 4 ° C'de dönen bir sallanan mikserde streptavidin kaplı manyetik boncuklar, en az 4 saat ile kromatin inkübe edin. Arzu edildiği takdirde örnekleri O / N inkübe edin.

Afinite ile saflaştırılmış DNA izolasyonu 4.

  1. Spesifik olmayan etkileşimleri kaldırmak için aşağıdaki yıkama tamponları ile oda sıcaklığında 7 dakika ara ile boncuk yıkayın. Her yıkamadan sonra boncuk yakalamak için manyetik ayırma raf kullanın. Yıkama tamponunda her değişiklikten sonra boncuk süspanse.
  2. Kullanımdan önce damıtılmış iyonu giderilmiş su ve filtre (0,2 um) yıkama tamponları hazırlayın. S için 4 ° C'de saklayın, yıkama tamponları 1 ve 2everal aydır. Her gün Yıkama Tamponu 3 taze hazırlayın. Ekleme ve bir pipet ile numuneden yıkama tamponları kaldırın. 2 ve 4 için, yıkama sırasıyla, 1 ve 3 (5 mM) ilave edin. Örnekler ek olarak (bir kez 12 saat, 4 saat sonra) öncesinde aşağıda belirtilen yıkamalar COSMIC tampon ile iki kez yıkanabilir.
    1. Yıkama Tamponu 1 (10 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 1 mM EDTA,% 3 SDS) ile bir kez yıkanır. Yıkama Tamponu 2 (10 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 250 mM LiCI, 1 mM EDTA,% 0.5 NP40,% 1 sodyum deoksikolat) ile bir kez yıkanır. Yıkama Tamponu ile 3 kez yıkanır (4 M üre, 10 mM Tris-CI [pH 7.5], 1 mM EDTA,% 0.1 NP-40). Tris EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 1 mM EDTA) ile iki kere yıkayın.
  3. Bir pipet ile 200 ul TE tamponu boncuk tekrar. Yakalanan DNA Bu örnek afiniteyle saflaştırılmış (AP) DNA olarak adlandırılır.
  4. 10x çapraz bağ Ters Tamponu (100 mM Tris-Cl, [pH 8.0], 1 M KOH, 4 mM Giriş ve AP DNA EkEDTA) nihai konsantrasyon 1x. 56,57 inkübe 30 dakika 90 ° C'de.
    Not: 254 nm UV ışınlaması da psoralen çapraz bağ, 58 ancak siklobutil pirimidin dimerleri bu dalga boyunda ışınlama oluşturulabilir ters ve DNA sonraki işlem müdahale etmek için kullanılabilir.
  5. AP DNA, manyetik ayırma üzerine numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü bir pipet ile 2 oda sıcaklığında dk ve izolasyon sıvısı (DNA) raf yerleştirin. Yeni kehribar mikrosantrifüj tüp AP DNA (boncuk serbest olan) aktarın.
    Not: İstenilen AP DNA sıvısı içinde artık boncuklara bağlanır.
  6. Bir pipet ile 100 ul numune başına yaklaşık 1 | il 6 N HCI eklenerek pH 7 konsantre HCI ile Giriş ve AP DNA nötralize. . Numuneler, bir pipet UYARI pH kağıdı üzerine ~ 0.5 ul eklenerek nötralize edilir onaylayın: Konsantre HCI güçlü bir aşındırıcı asittir. Kurumunuza göre Kolu217, uygun kişisel koruyucu ekipmanlar için s kurallar.
  7. 0,2 ug RNaz A (100 mg / ml) ilave / Giriş ve AP DNA hem de nihai konsantrasyon ul. 37 ° C 'de 1 saat inkübe edin. 0,2 ug Proteinaz K (20 mg / ml) ilave / Giriş ve AP DNA hem de nihai konsantrasyon ul ilave edin. 55 ° C 'de 1 saat inkübe edin.
  8. DNA sütun temizleme kiti ile DNA (Malzeme Listesi'ne bakınız) arındırın. 55 Zehir DNA 58 ul DNA dereceli H 2 O. -20 Veya -80 ° C'de saklayın Giriş ve AP örnekleri
  9. Lokus spesifik primerler ve / veya yeni nesil dizileme ile birlikte kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından AP DNA analiz edin. 95 ° C, 10 dakika 1 döngü, 95 ° C 20 saniye 40 döngü, 54 ° C veya 56 ° C 20 sn, 72 ° C ile 40 saniye: qPCR için, aşağıdaki parametreler ile lokus için 2 ul AP DNA kullanılır.
    NOT: tavlama sıcaklığı kullanılan primer çiftleri erime sıcaklığına göre modifiye edilmelidir. Bir tavlama temperatu seçinBu yeniden hiçbir spesifik olmayan amplifikasyon ile kantitasyon döngüsünü en aza indirir.
    NOT: Yeni nesil dizileme ile analiz için okur eşlenen en az 10 milyon hedefliyoruz. Eşlenen sayısı AP DNA miktarını artırarak ve sekanslama için bir çalışma halinde daha az numune birleştirerek arttırılabilir okunur. Daha duyarlılığı artırmak okur. ChIP-seq analizi için standart paketler (örneğin, HOMER, 59 MACS, 60 ve SPP 61) KOZMİK seq verilerle çalışmak. Genom dizileme ve ChIP-seq dahil yeni nesil dizileme güvenmek diğer yöntemlerle, olduğu gibi, tekrarlayan bölgeler uyum ve montaj belirsizlikler yaratmak ve böylece bir teknik zorluk olmaya devam etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Düzgün olmayan genom parçalanma ve diğer değişkenler hesaba katılması için, saflaştırılmış DNA daima Girdi DNA referans karşı normalize edilmelidir. Ilgi odağı özgü primerler kullanılabilir. Aynı zamanda, negatif bir kontrol olarak, bir molekül bağlamak beklenmemektedir bir bölgeyi analiz etmek için yararlıdır. Bu 365 nm ışık (Şekil 2) ile radyasyona tabi tutulduktan sonra poliamid doluluk bir> 100-misli bir artış görülür.

Zenginleştirilmiş DNA, aynı zamanda, yeni nesil dizileme ile analiz edilebilir. Yonga DNA hazırlanır gibi DNA (örneğin, ticari bir örneği hazırlık kiti ile, Malzeme Listesi bakınız) aynı şekilde, sıralama için hazırlanır. Hatta yeni nesil dizileme ile, biz hala poliamid bağlı olmayı bekliyoruz nereye lokusların DNA zenginleştirme onaylamak için qPCR kullanın. Bir kez sıralı, ham DNA genom ve yoğunluk izleri ChIP-seq verileri (Şekil 3) analiz etmek için tasarlanmış aynı yazılımı ile hazırlanmıştır hizalanır okur. Bahücrelerde poliamid dağılımlarının bizim analiz sed, biz en iyi hücrelerde doluluk tahmin afiniteler geniş bir yelpazede kapsayan, bağlayıcı siteler kümelenmiş bulundu. Bizim in vitro CSI verileri (Şekil 4A) ile bağlanması için tüm genomu puan için bir algoritma geliştirdi. Bu puanlama yöntemi içindeki tahmin edilen bağlanma skorları ile farklı bir genomik lokus farklı afiniteleri (Şekil 4B) birden fazla farklı kümeleme gösterdiğini ortaya çıkarmıştır.

Şekil 2,
Şekil HEK293 hücrelerinden AP / giriş kısmıyla 365 nm UV ışınlama KOZMİK-qPCR. Etkisi 2. Sonuçlar. AP, afinite ile saflaştırılmış. Sonuçlar günlük ölçeğinde çizilen ve ± sem ortalama temsil etmektedir

Şekil 3,
Fişekil H1 hücrelerinde KOZMİK-seq 3. Sonuçları. AAG tekrarlar hedef için tasarlanmış doğrusal poliamid 4 KOZMİK seq etiket yoğunluğu parça. Etiket yoğunluğu 10 7 etiketleri normalize ve Entegre Genome Viewer ile gösteriliyordu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
2 ve 4, tüm genom boyunca bağlanması için tahmin edilen puanların. (A) Keman araziler bağlama poliamidin Şekil 4. modeli. 4 için Temsilcisi genomescapes de gösterilmiştir. Biyoinformatik puanlama yöntemi istihdam ile genomik lokusların farklı şekillerde aynı tahmin puanlara özetleyebilirim. Birden fazla düşük ve orta afinite dizileri sho ile (B) Lociw benzer poliamid doluluk birkaç yüksek afiniteli dizileri ile loci için. Izni ile yayımlanmaktadır. 51, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 107 KOZMİK CSI moleküler tanıma cheminformatics kimyasal genomik poliamid genom hedefleme hassas tıp DNA kromatin immünopresipitasyon yeni nesil dizileme
COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter