Het identificeren van de directe doelstellingen van genoom-gerichte moleculen blijft een grote uitdaging. Om te begrijpen hoe DNA-bindende moleculen die aangrijpen op de genoom, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op de verknoping van kleine moleculen aan chromatine isoleren (COSMIC).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het genoom is het doelwit van een aantal van de meest effectieve chemotherapeutica, maar de meeste van deze geneesmiddelen missen DNA-sequentie specificiteit, wat leidt tot dosisbeperkende toxiciteit en vele bijwerkingen. Gericht op het genoom met sequentie-specifieke kleine moleculen kan moleculen met verhoogde therapeutische index en minder off-target effecten mogelijk. -methylpyrrole N / N -methylimidazole polyamiden moleculen die rationeel kunnen worden ontworpen om specifieke DNA-sequenties met uitstekende precisie richten. En in tegenstelling tot de meeste natuurlijke transcriptiefactoren, kunnen polyamiden binden aan gemethyleerd en chromatinized DNA zonder een verlies in affiniteit. De sequentie specificiteit van polyamiden is uitgebreid bestudeerd in vitro cognate locatie identificatie (CSI) en traditionele biochemische en biofysische benaderingen, maar de studie van polyamide binden aan genomisch doelen in cellen blijft ongrijpbaar. Hier beschrijven we een werkwijze het verknopen van kleine moleculen Isolate chromatine (COSMIC), dat identificeert polyamide bindende locaties in het genoom. COSMIC is vergelijkbaar met chromatine immunoprecipitatie (ChIP), maar verschilt op twee belangrijke manieren: (1) een fotocrosslinker wordt toegepast om selectief, temporeel-gestuurde opname van polyamide bindingsgebeurtenissen, en (2) het biotine affiniteit handvat wordt gebruikt om polyamide te zuiveren inschakelen -DNA conjugaten onder semi-denaturerende omstandigheden aan DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. COSMIC is een algemene strategie die kan worden gebruikt om genoom-brede bindingsgebeurtenissen polyamiden en andere genoom-gerichte chemotherapeutische middelen te onthullen.
Inleiding
De informatie om elke cel in het lichaam wordt gecodeerd in DNA. Het selectief gebruik van deze informatie bepaalt het lot van een cel. Transcriptiefactoren (TFs) zijn eiwitten die binden aan specifieke DNA-sequenties van een bepaalde subset van de genen in het genoom expressie en de storing van TF is in verband met het ontstaan van een breed scala aan ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, kanker en diabetes . 1,2 We hebben interesse in het ontwikkelen moleculen die selectief kan binden aan het genoom moduleren gen-regulerende netwerken zijn.
Polyamiden samengesteld uit N -methylpyrrole en N -methylim....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Crosslinking in levende cellen
- Te beginnen met ~ 2,5x10 7 H1 cellen, of andere gekweekte cellen.
OPMERKING: Dit nummer van H1 cellen komt overeen met vijf 10-cm schalen (ongeveer 40% confluentie). - Groeien cellen in E8 media op schotels op een oppervlak dat pluripotente stamcellen ondersteunt bekleed (zie Materials List) en incubeer ze op 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Oogst cellen enzymatisch (zie Materials List). Opmerking: Sta niet toe dat H1 cellen tot 90% confluentie overschrijden; confluentie induceert spontane differentiatie van H1 cellen. Om cellen te tellen, groeien een extra 10 cm schotel van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ter compensatie van niet-uniforme genoom fragmentatie en andere variabelen, moet het gezuiverde DNA altijd genormaliseerd tegen een referentie van input-DNA. Primers specifiek voor een locus van belang kunnen worden gebruikt. Het is nuttig om ook te analyseren een locus waarbij het molecuul niet verwacht binden, als negatieve controle. We zien een> 100-voudige toename van polyamide bezettingsgraad bij bestraling met 365-nm licht (Figuur 2).
Verrijkte DNA kan ook worden ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een van de grootste uitdagingen met conventionele ChIP is de identificatie van geschikte antilichamen. ChIP is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het antilichaam, en de meeste commerciële antilichamen zijn onaanvaardbaar voor ChIP. In feite ontdekte het Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium dat slechts 20% van de commerciële antilichamen geschikt is voor ChIP-assays.50 Met COSMIC worden antilichamen vervangen door streptavidin. Omdat polyamiden zijn gefunctionaliseerd met biotin, wordt streptavi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
A.Z.A. is de enige eigenaar van Vista Motif, LLC en WINStep Forward.
Dankbetuigingen
We danken de leden van het Ansari-lab en Prof. Parameswaran Ramanathan voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies CA133508 en HL099773, de H. I. Romnes-faculteitsbeurs, en de W. M. Keck Medical Research Award aan A.Z.A. G.S.E. werd ondersteund door een Peterson Fellowship van het Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. werd ondersteund door de Morgridge Graduate Fellowship en de Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, en D.B. werd ondersteund door de NSEC-subsidie van NSF.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | elke bron | ||
| Benzamidine | elke bron | ||
| Pepstatin | elke bron | ||
| Proteinase K | elke bron | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | Andere bronnen kunnen worden gebruikt |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | We hebben andere fabrikanten van DNA-kolommen met succes geprobeerd. |
| TruSeq ChIP Sample Prep Kit | Illumina | IP-202-1012 | Deze Kit kan worden gebruikt om COSMIC DNA voor next-generation sequencing voor te bereiden |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356231 | Wordt gebruikt om platen te coaten om H1 ESCs te laten groeien |
| pH papier | elke bron | ||
| beren microcentrifugebuisjes | elke bron | ||
| microcentrifugebuisjes | elke bron | ||
| pyrex filter | elke bron | Pyrex bakvormen zijn geschikt | |
| qPCR master mix | elke bron | ||
| RNase | elke bron | ||
| HCl (6 N) | elke bron | ||
| 10-cm weefselkweekschalen | elke bron | ||
| Serologische pipetten | elke bron | ||
| Pasteur pipetten | elke bron | ||
| Pipettips | elke bron | ||
| 15-ml conische buisjes | elke bron | ||
| centrifuge | elke bron | ||
| microcentrifuge | elke bron | ||
| nutator | elke bron | ||
| Magnetische scheidingsstandaard | elke bron | ||
| UV-bron | CalSun | B001BH0A1A | Andere UV-bronnen kunnen worden gebruikt, maar de crosslinkingtijd moet empirisch worden geoptimaliseerd |
| Misonix Sonicator | Qsonica | S4000 met 431C1 cup horn | Andere sonicators kunnen worden gebruikt, maar de sonicatiecondities moeten empirisch worden geoptimaliseerd |
| Bevochtigde CO2 incubator | elke bron | ||
| Biologische veiligheidskast met vacuümuitlaat | elke bron |
Referenties
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
