Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Het identificeren van de directe doelstellingen van genoom-gerichte moleculen blijft een grote uitdaging. Om te begrijpen hoe DNA-bindende moleculen die aangrijpen op de genoom, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op de verknoping van kleine moleculen aan chromatine isoleren (COSMIC).

Abstract

Het genoom is het doelwit van een aantal van de meest effectieve chemotherapeutica, maar de meeste van deze geneesmiddelen missen DNA-sequentie specificiteit, wat leidt tot dosisbeperkende toxiciteit en vele bijwerkingen. Gericht op het genoom met sequentie-specifieke kleine moleculen kan moleculen met verhoogde therapeutische index en minder off-target effecten mogelijk. -methylpyrrole N / N -methylimidazole polyamiden moleculen die rationeel kunnen worden ontworpen om specifieke DNA-sequenties met uitstekende precisie richten. En in tegenstelling tot de meeste natuurlijke transcriptiefactoren, kunnen polyamiden binden aan gemethyleerd en chromatinized DNA zonder een verlies in affiniteit. De sequentie specificiteit van polyamiden is uitgebreid bestudeerd in vitro cognate locatie identificatie (CSI) en traditionele biochemische en biofysische benaderingen, maar de studie van polyamide binden aan genomisch doelen in cellen blijft ongrijpbaar. Hier beschrijven we een werkwijze het verknopen van kleine moleculen Isolate chromatine (COSMIC), dat identificeert polyamide bindende locaties in het genoom. COSMIC is vergelijkbaar met chromatine immunoprecipitatie (ChIP), maar verschilt op twee belangrijke manieren: (1) een fotocrosslinker wordt toegepast om selectief, temporeel-gestuurde opname van polyamide bindingsgebeurtenissen, en (2) het biotine affiniteit handvat wordt gebruikt om polyamide te zuiveren inschakelen -DNA conjugaten onder semi-denaturerende omstandigheden aan DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. COSMIC is een algemene strategie die kan worden gebruikt om genoom-brede bindingsgebeurtenissen polyamiden en andere genoom-gerichte chemotherapeutische middelen te onthullen.

Introduction

De informatie om elke cel in het lichaam wordt gecodeerd in DNA. Het selectief gebruik van deze informatie bepaalt het lot van een cel. Transcriptiefactoren (TFs) zijn eiwitten die binden aan specifieke DNA-sequenties van een bepaalde subset van de genen in het genoom expressie en de storing van TF is in verband met het ontstaan ​​van een breed scala aan ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, kanker en diabetes . 1,2 We hebben interesse in het ontwikkelen moleculen die selectief kan binden aan het genoom moduleren gen-regulerende netwerken zijn.

Polyamiden samengesteld uit N -methylpyrrole en N -methylimidazole zijn rationeel ontworpen moleculen die DNA met specificiteiten en affiniteiten die rivaliserende natuurlijke transcriptiefactoren. 3-6 Deze moleculen binden aan specifieke sequenties in de kleine groef van DNA kunnen richten. 4,5,7 -11 Polyamiden zijn gebruikt om zowel Repress en activeren van de expressie van specifieke genes. 4,12-19 Ze hebben ook interessante antivirale 20-24 en antikanker 12,13,25-30 eigenschappen. Een aantrekkelijke eigenschap van polyamiden is hun vermogen om DNA-sequenties die zijn gemethyleerd 31,32 en rond histoneiwitten 9,10,33.

Om de doorlopende bindingsspecificiteiten van DNA-bindende moleculen te meten, ons lab gemaakt de verwante plaats identifier (CSI) methode. 34-39 De voorspelde optreden van bindingsplaatsen op basis van in vitro specificiteiten (genomescapes) kan op het genoom worden weergegeven, omdat de in vitro binding intensiteiten zijn recht evenredig met associatie constanten (K a). 34,35,37 Deze genomescapes geven inzicht in polyamide bezettingsgraad over het genoom, maar het meten van polyamide verbindend in levende cellen is een uitdaging. DNA stevig verpakt in de kern, die de toegankelijkheid van bindingsplaatsen kunnen beïnvloeden. De eenccessibility van deze chromatinized DNA sequenties polyamiden blijft een mysterie.

Onlangs zijn veel methoden om wisselwerkingen tussen kleine moleculen en nucleïnezuren ontstaan ​​bestuderen. 40-48 De chemische affiniteitsinvangmiddel en massaal parallelle DNA-sequencing (chem-seq) is een dergelijke techniek. Chem-seq gebruikt formaldehyde tot kleine moleculen verknopen een genomische doelwit van belang en een gebiotinyleerd derivaat van een klein molecuul van belang zijn voor de ligand-target interactie vangen. 48,49

Formaldehyde verknoping leidt tot indirect interacties die valse positieven produceren. 50 We ontwikkelden een nieuwe methode, de verknoping van kleine moleculen aan chromatine (COSMIC), 51 isoleren met een fotocrosslinker aan deze zogenaamde "fantoom" pieken elimineren. 50 te beginnen, We ontworpen en gesynthetiseerd trifunctionele derivaten van polyamiden. Deze moleculen bevatten een DNA-bindend polyamide een fotocrosslinker (psoraleen) en affiniteit handvat (biotine, figuur 1). Met trifunctionele polyamiden, kunnen we covalent vastleggen polyamide-DNA interacties met 365 nm UV-straling een golflengte die geen DNA wordt beschadigd of induceert zonder psoraleen-gebaseerde verknoping. 51 Vervolgens fragmenteren we het genoom en zuivert de gevangen DNA onder stringente, semi -denaturing voorwaarden DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. Zo zien we COSMIC als een methode soortgelijk aan chem-seq, maar met een meer directe uitlezing van DNA richten. Belangrijk is dat de zwakke (Ka -10 10 3 4 M -1) affiniteit van psoraleen voor DNA niet detecteerbaar effect polyamide specificiteit. 51,52 de verrijkte DNA-fragmenten kan worden geanalyseerd met ofwel een kwantitatieve polymerasekettingreactie 51 (COSMIC-qPCR) of door het next-generation sequencing 53 (COSMIC-volgende). Deze gegevens maken een onpartijdige, genoom-geleide ontwerp van liganden die interhandelen met hun gewenste genomische loci en off-target effecten te minimaliseren.

Figuur 1
Figuur 1. Bioactieve polyamiden en kosmische plan. (A) Hairpin polyamiden 1-2 doelwit van de DNA-sequentie 5'-WACGTW-3 '. Lineaire polyamiden 3 - 4 doel 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringen van N-methylimidazool worden vet weergegeven voor de duidelijkheid. Open en gevulde cirkels vertegenwoordigen -methylpyrrole N en N -methylimidazole resp. Rechthoek stelt 3-chloorthiofeen en ruiten staan ​​β-alanine. Psoralen en biotine worden aangeduid met P en B, respectievelijk. (B) kosmische plan. Cellen worden behandeld met trifunctionele afgeleiden van polyamiden. Na verknoping met 365 nm UV- bestraling cellen lysed en genomische DNA wordt geschoren. Met streptavidine beklede magnetische parels worden toegevoegd aan polyamide-DNA adducten vangen. Het DNA wordt vrijgegeven en kan worden geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR) of next-generation sequencing (NGS). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Crosslinking in levende cellen

  1. Te beginnen met ~ 2,5x10 7 H1 cellen, of andere gekweekte cellen.
    OPMERKING: Dit nummer van H1 cellen komt overeen met vijf 10-cm schalen (ongeveer 40% confluentie).
  2. Groeien cellen in E8 media op schotels op een oppervlak dat pluripotente stamcellen ondersteunt bekleed (zie Materials List) en incubeer ze op 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Oogst cellen enzymatisch (zie Materials List). Opmerking: Sta niet toe dat H1 cellen tot 90% confluentie overschrijden; confluentie induceert spontane differentiatie van H1 cellen. Om cellen te tellen, groeien een extra 10 cm schotel van cellen, til de cellen enzymatisch, zoals beschreven in paragraaf 1,8-1,10, en tel ze met een hemocytometer.
    1. Bereid E8 kweekmedia zoals beschreven in Chen et al. 54
  3. Voorafgaand aan het toevoegen polyamide, verwijder het gebruikte kweekmedium met een Pasteur pipet bevestigd aan een vacuüm te houden. Voeg verse media met alserological pipet en pipet dispenser (8 ml per 10 cm schaal).
    OPMERKING: Voeg de media aan de zijkant van de schaal om te voorkomen dat verstoring van de cellen. Vanaf dit punt de cellen te beschermen tegen het licht om voortijdige foto-verknoping te voorkomen.
  4. Polyamide Voeg met een pipet (8 ul van 400 uM polyamide in DMSO, 400 nM eindconcentratie) direct aan het kweekmedium van elk gerecht. Zwenk de schotel naar het polyamide gelijkmatig te verspreiden in de media.
    OPMERKING: concentratie kan worden gevarieerd, maar voorkomen dat cellulaire toxiciteit wordt waargenomen voor de geselecteerde behandeling.
  5. Incubeer de cellen 24 uur 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en zorgen ze beschermd tegen licht.
    Opmerking: De incubatietijd kan worden gevarieerd om polyamide te meten binding in de tijd.
  6. Was elke 10 cm schaal met 4 ml PBS (1,05 mM monobasisch kaliumfosfaat, 155,17 mM natriumchloride, 2,97 mM natriumfosfaat dibasisch) met behulp van een serologische pipet en pipet disPenser. Zuig PBS en voeg 3 ml E8 cultuur media.
  7. Met de lichten gedimd, verwijder het deksel van 5 cultuur gerechten en plaats de cellen op een vlakke ondergrond buiten de kap. Plaats een glas filter over de 5 cultuur gerechten uit te filteren licht met λ <300 nm. Plaats de UV bron boven filter. Crosslink monsters 30 min met 365 nm UV- bestraling (2,4 mW / cm 2).
    OPMERKING: Verknopende tijd moet empirisch worden bepaald.
  8. Transfer cultuur gerechten terug naar de kap. Zuig het medium met een Pasteur pipet bevestigd aan een vacuüm te houden. Was elke 10-cm schaal met 4 ml PBS. Zuig het PBS. Voeg 3 ml enzym voor mobiele dissociatie (zie Materials List) per 10 cm schotel om de cellen te scheiden. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
    OPMERKING: pre-warm het enzym.
  9. Quench het enzym met 3 ml E8 media per gerecht. Transfer gescheiden cellen in een 15 ml conische buis.
    OPMERKING: Plaats cellen op ijs vanaf dit punt verder.
  10. Centrifuge gescheiden cellen 5 min, 500 x g bij 4 ° C. Zuig supernatant enzym en media te verwijderen.
    OPMERKING: Pauze punt. Cellen kunnen snel bevroren in vloeibare stikstof, bewaard bij -80 ° C voor verdere verwerking op een later tijdstip.

2. Isolatie van chromatine

  1. Voeg 1,2 ml COSMIC buffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) en de pipet op en neer meerdere malen de celpellet voor elk monster in hersuspenderen 1,2 ml COSMIC buffer.
    1. Voeg 133 ul van elk 100 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 100 mM benzamidine en 150 uM pepstatine proteaseremmers vers tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM van PMSF en benzamidine en 1,5 pM van pepstatine. Split oplossing van cellysaat in twee amber 1,7 ml microcentrifugebuisjes.
  2. Ultrasone trillingen met sonicator 35 min (10 sec op 10 sec af, 60% vermogen) om het genoom te fragmenteren om tussen de 100 and 500 bp.
    1. Houd het niveau van chromatine oplossing in de microcentrifugebuis evenwijdig aan het waterniveau in het reservoir. Bevestig dit niveau door visuele inspectie.
      . OPMERKING: Controleer of DNA werd geknipt met een 1,5% agarosegel 55
    2. Optimaliseer de ultrasoonapparaat tijd empirisch. Met een minimale hoeveelheid ijs in het reservoir aan de monsters koelen en zorgen het ijs niet storende tussen de monsters en de cup horn.
  3. Centrifuge het monster 12.000 xg 10 min. Bewaar de oplossing in water oplosbare chromatine bevat door deze naar een nieuwe microcentrifugebuis amber met een pipet. Gooi de pellet.
  4. Breng 110 pi (10%) van het monster op een nieuwe microcentrifugebuis en label het input-DNA. Bewaren bij -80 ° C. Sla de rest van het chromatine monster op ijs voor gebruik in stap 3.3.

3. Vangst van Ligand-DNA Crosslinks

  1. Gebruik een pipet tot 60 pi streptavi afziendin-beklede magnetische kralen in een microcentrifugebuis. Voeg 1 ml COSMIC buffer en meng op een nutator 5 min bij RT. Plaats magnetische kralen aan magnetische scheiding rack 2 min tot kralen te vangen. Verwijder COSMIC buffer met een pipet.
    OPMERKING: Laat de kralen te drogen. Direct doorgaan naar de volgende stap.
  2. Voeg chromatine monster (~ 1 ml) aan korrels (60 ui) en resuspendeer de kralen. Incubeer chromatine met met streptavidine beklede magnetische korrels tenminste 4 uur op een roterende, schommelen menger bij 4 ° C. Incubeer desgewenst de monsters O / N.

4. Isolatie van affiniteit-gezuiverde DNA

  1. Was kralen met 7 min interval bij kamertemperatuur met de volgende wasbuffers om niet-specifieke interacties te verwijderen. Gebruik een magnetische scheiding rek kralen vangen na elke wasbeurt. Resuspendeer de kralen na elke wijziging in wasbuffer.
  2. Bereid wasbuffers in gedestilleerd gedemineraliseerd water en filter (0,2 micrometer) voor gebruik. WINKEL wasbuffers 1 en 2 bij 4 ° C gedurende several maanden. Bereid Wash Buffer 3 fris elke dag. Toevoegen en verwijderen wassen buffers uit het monster met een pipet. Voor 2 en 4, voeg 1 en 3 (5 mM), respectievelijk in de wassingen. Monsters kunnen bovendien tweemaal gewassen met COSMIC buffer (na 12 uur, na 4 uur) voor de onderstaande wasbeurten.
    1. Eenmaal met Wash Buffer 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Eenmaal met wasbuffer 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% natriumdeoxycholaat). Tweemaal wassen met wasbuffer 3 (4 M ureum, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Tweemaal wassen met Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Resuspendeer de kralen in 200 gl TE-buffer met een pipet. Dit monster van gevangen DNA wordt aangeduid met affiniteit gezuiverd (AP) DNA.
  4. Een aanvulling op de Input en AP DNA met 10x Crosslink Reversal buffer (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) tot een eindconcentratie 1x. 56,57 Incubeer 30 min bij 90 ° C.
    OPMERKING: 254 nm UV-bestraling kan ook worden gebruikt voor het verknopen psoraleen, 58 maar cyclobutyl pyrimidine dimeren kunnen worden gevormd door bestraling bij deze golflengte te keren en interfereren met verdere verwerking van DNA.
  5. AP DNA, plaatst de microcentrifugebuis met het monster op magnetische scheiding rek 2 min bij RT en het isoleren van vloeistof (DNA) met een pipet. Breng de AP DNA (dat is afgegeven uit de korrels) in nieuw amber microcentrifugebuis.
    Opmerking: De gewenste AP DNA wordt in de vloeistof niet meer gekoppeld aan de korrels.
  6. Neutraliseer Input en AP DNA met geconcentreerd HCl tot pH 7 door toevoeging van ongeveer 1 ui 6 N HCl per 100 pl monster met een pipet. Bevestig de monsters worden geneutraliseerd door het toevoegen van ~ 0,5 ul op pH-papier met een pipet. WAARSCHUWING: Geconcentreerd HCl is een sterk bijtend zuur. Verwerken volgens uw instelling217; s richtlijnen voor de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
  7. Voeg RNase A (100 mg / ml) met 0,2 ug / ul eindconcentratie zowel input en AP DNA. Incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voeg Proteinase K (20 mg / ml) met 0,2 ug / ul eindconcentratie zowel Input en AP DNA toe. Incubeer 1 uur bij 55 ° C.
  8. Zuiveren het DNA met een DNA-kolom opruimen kit (zie Materials List). 55 Elueer DNA in 58 pl DNA-klasse H 2 O. Store Input en AP monsters bij -20 of -80 ° C
  9. Analyseer AP DNA door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) met een locus-specifieke primers en / of next-generation sequencing. Voor qPCR gebruikt 2 pl AP DNA per locus met de volgende parameters: 1 cyclus van 95 ° C 10 minuten en 40 cycli van 95 ° C 20 sec, 54 ° C of 56 ° C 20 sec, 72 ° C 40 sec.
    OPMERKING: De annealing temperatuur moet worden aangepast aan de smelttemperatuur van de primerparen gebruikt. Selecteer een gloeien temperatuopnieuw dat minimaliseert de kwantificering cyclus zonder specifieke amplificatie.
    LET OP: Voor de analyse van next-generation sequencing, streven naar minstens 10 miljoen toegewezen leest. Het aantal toegewezen leest kan worden verhoogd door de hoeveelheid van AP DNA en door het combineren van minder monsters in een run voor sequentiebepaling. Meer leest betere gevoeligheid. Standaard pakketten voor ChIP-seq analyse (bv, Homerus, MACS 59, 60 en 61 SPP) werken met kosmische-seq data. Net als bij andere methoden die vertrouwen op next-generation sequencing, waaronder genoom sequencing en ChIP-seq, repetitieve gebieden creëren onduidelijkheden in uitlijning en assemblage en blijven dus een technische uitdaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ter compensatie van niet-uniforme genoom fragmentatie en andere variabelen, moet het gezuiverde DNA altijd genormaliseerd tegen een referentie van input-DNA. Primers specifiek voor een locus van belang kunnen worden gebruikt. Het is nuttig om ook te analyseren een locus waarbij het molecuul niet verwacht binden, als negatieve controle. We zien een> 100-voudige toename van polyamide bezettingsgraad bij bestraling met 365-nm licht (Figuur 2).

Verrijkte DNA kan ook worden geanalyseerd met de volgende generatie sequencing. DNA sequentiebepaling voorbereid op dezelfde wijze als ChIP DNA wordt bereid (bijvoorbeeld met een commercieel monster prep kit, zie Materialen List). Zelfs met next-generation sequencing, we nog steeds gebruiken qPCR om verrijking van het DNA te bevestigen bij loci, waar we verwachten dat de polyamide gebonden te zijn. Eenmaal gesequenced, ruw DNA leest zijn afgestemd op het genoom en dichtheid sporen worden bereid met dezelfde software ontworpen voor ChIP-seq data (figuur 3) te analyseren. Based van onze analyse van polyamide verdelingen in cellen, vonden we dat bindingsplaatsen gegroepeerd, verspreid over een breed affiniteiten, best voorspellen bezetting in cellen. We ontwikkelden een algoritme om het gehele genoom scoren voor binding met onze in vitro CSI data (Figuur 4A). Dit scoringsmethode bleek dat verschillende genomische loci met soortgelijke voorspelde binding scores vertonen diverse clustering van meerdere sites van verschillende affiniteiten (Figuur 4B).

Figuur 2
Figuur 2. De resultaten van de kosmische-qPCR. Effect van 365 nm UV-bestraling op de fractie van AP / input van HEK293 cellen. AP, affiniteitsgezuiverde. De resultaten worden uitgezet op log schaal en representeren gemiddelde ± sem

Figuur 3
Figuur 3. Resultaten van de kosmische-seq in H1 cellen. kosmische volgende tag dichtheid spoor voor lineaire polyamide 4 ontworpen om AAG herhalingen richten. Tag dichtheid werd genormaliseerd tot 10 7-tags en ​​weergegeven met de geïntegreerde Genome Viewer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Model van polyamide binden. (A) Violin percelen van de voorspelde scores voor 2 en 4 binding over het gehele genoom. Representatieve genomescapes voor 4 zijn eveneens weergegeven. Met de dienst van de bioinformatica scoringsmethode, kunnen genomische loci som aan hetzelfde voorspelde score op verschillende manieren. (B) Loci met meerdere lage en middelgrote affiniteit sequenties show vergelijkbaar polyamide bezetting tot loci met weinig hoge affiniteit sequenties. Overgenomen met toestemming. 51 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

Molecular Biology kosmisch CSI moleculaire herkenning cheminformatica chemische genomics polyamide genoom targeting precisie geneeskunde DNA chromatine immunoprecipitatie next-generation sequencing
Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter