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Medicine

Modélisation des étapes précoces de cancer de l'ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

doi: 10.3791/53541 Published: December 31, 2015

Protocol

Tous les protocoles de recherche décrits ont été examinés par l'Université de Chicago Institutional Review Board (IRB). Le consentement éclairé a été obtenu à partir de chaque patient avant la chirurgie et l'étude a été approuvé par l'Université de Chicago CISR. Une sécurité biologique type armoire 2 et des gants devraient être utilisés lors de la manipulation des tissus humains pour la protection et de réduire le risque de contamination des cellules.

1. Isolement et culture de cellules stromales primaires non transformés

  1. Collection de tissus humains et de préparation.
    1. Obtenir des échantillons de omentum humain, 2 cm 3, enlevé au cours d'une intervention chirurgicale abdominale, et immerger le tissu immédiatement en RT-solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (figure 2A). Un morceau de épiploon 3 cm x 2 cm donne généralement 1 million de cellules primaires humaines mésothéliales (HPMC) et 200.000 fibroblastes humains primaires ou des fibroblastes normaux omentales (NOF).
    2. Isoler la PBS le tissu a été immergé dans de 0,5 g pendant 3min dès que possible après la collecte (<2 h dans du PBS) et transférer le tissu à frais 20 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml. Coupez le tissu en 5mm 3 pièces en hachant avec scalpels dans un diamètre de 15 cm, boîte de culture stérile (figure 2B).
  2. Isolement de cellules mésothéliales humaines primaires 8
    1. Pour isoler HPMC, transférer le tissu haché dans 50 ml tubes coniques et attendre 1 min pour les morceaux solides de flotter vers le haut (figure 2C & D). HPMC et les globules rouges (RBC) sont présents dans le liquide sur le fond. Utiliser une pipette pour éliminer le liquide de la partie inférieure du tube et dans un nouveau tube conique. Spin le liquide vers le bas à 0,5 g pendant 3 min et aspirer le surnageant du culot HPMC / RBC.
      1. Répétez le processus à trois reprises: ajouter 20 ml de PBS au tissu hachée, laisser le tissu se lever, enlever le liquide du fond avec une pipette et dans le tube HPMC / RBC, spin-down, et retirer lesurnageant. Après que tous les tours sont terminés et le surnageant est aspiré, le culot contiendra HPMC et RBC.
    2. Plaque de toutes les cellules de la pastille dans un 2 flacon de 75 cm dans 15 ml de milieu de croissance complet (DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal [FBS], 1% de vitamines MEM [93 mg / L], 1% MEM acides aminés non essentiels [81,4 mg / L], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine]).
    3. Effectuer un lavage PBS secondaire pour isoler HPMC supplémentaires.
      1. Pour le secondaire PBS laver, secouez le tissu solide restant à 200 rpm, 37 ° C pendant 10 min dans 20 ml de PBS, puis attendre 1 min pour que le tissu flottent à la surface. Retirer le liquide depuis le fond du tube dans un nouveau tube, centrifuger à 0,5 g pendant 3 min, et aspirer le surnageant.
      2. Plate toute la HPMC / RBC de la PBS secondaire laver dans un 75 cm 2 ballon séparé dans 15 ml de milieu de croissance.
    4. Pour isoler toute remaining HPMC, secouez le tissu haché à 200 rpm, 37 ° degrés C pendant 10 min dans 20 ml d'un 1: 1 0,25% mM EDTA trypsine 25: solution de PBS en volume. Laisser le tissu à la hausse, de recueillir le liquide au fond du tube dans un nouveau tube de 50 ml, tourner vers le bas et à 0,5 gx 3 min.
      1. Aspirer le surnageant et de la plaque toute la HPMC / RBC dans un 75 cm 2 ballon séparé dans 15 ml de milieu de croissance.
    5. Culture des cellules étalées à 37 ° C et 5% de CO2 dans un environnement humidifié. Flux cellules étalées en ajoutant 15 ml de milieu de croissance complète les jours 3 et 5 sans enlever les médias dépensé. HPMC peut être cultivé pendant 5-7 jours avant de se séparer.
      1. Utilisez faible passage HPMC (jusqu'à passage 2) dans toutes les expériences de minimiser dédifférenciation et la modification du phénotype d'origine. Utiliser un microscope à champ large de préférence avec un objectif 20x avec différentiel plastique capacités de contraste d'interférence ou objectif 4-20x avec contraste de phase capabilities (filtres de phase de contraste sur microscope) pour prendre toutes les images de cellules, et un objectif 10x () dans le champ lumineux d'analyser immunohistochimique 3,3'-diaminobenzidine (DAB) coloration.
    6. Vérifiez que le HPMC sont cubiques et expriment la cytokératine 8 et vimentine en effectuant immunohistochimie 8 (figure 3A, C, E).
  3. NOF isolement 8
    1. Préparer 10 ml d'un stock de III solution de type collagénase (10x) en combinant un mélange 1: 1 de 100x Pen-Strep: 1 1.500 unités activité / ml de collagénase de type III: activité 714 unités / ml de hyaluronidase dans du PBS.
    2. Agiter le tissu haché épiploon qui reste après HPMC isolement à 200 rpm, 37 ° C pendant 6 heures dans 10 ml de la III solution de type 10x collagénase dilué dans un milieu sans sérum (DMEM avec 1% MEM vitamines [93 mg / l], 1% MEM acides aminés non essentiels [81,4 mg / L], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine]). Tissu digéré examinera opaque et peut avoir quelques débris fibreux (figure 2E).
    3. Centrifuger les cellules NOF de solution contenant en suspension à 0,5 x g pendant 3 minutes à température ambiante, aspirer le surnageant et le culot de plaque dans une fiole 75 de 2 cm dans 13 ml de milieu de croissance complet.
    4. Retirer les anciens médias et les remplacer par 15 ml de milieu de croissance complet frais après 24 h. NOF peut être cultivé pendant 1-3 jours avant de se séparer. Remarque prolifération de la NOF cessera lorsque les cellules atteignent la confluence.
    5. Vérifiez que les fibroblastes humains primaires sont des cellules plates, allongées et expriment la vimentine mais ne cytokératine 8 en effectuant immunohistochimie 8 (figure 3B, D, F). Utilisez faible passage NOF pour les expériences (idéalement avant le passage 3) pour minimiser dédifférenciation et la modification du phénotype d'origine. Utiliser un microscope à champ large avec un objectif 20x avec des capacités DIC en plastique de prendre toutes les images de phase de cellules,et un objectif 10x dans le champ lumineux d'analyser coloration immunohistochimique de DAB.

2. Placage la Culture organotypique 8

  1. NOF de sortie du flacon de culture de 75 cm par rinçage avec 10 ml de PBS suivis par 3 ml de trypsine à 0,25% / EDTA 25 mM à pas plus de 5 min. Neutraliser la trypsine avec au moins 3 fois le volume de milieu de croissance complet.
  2. Transfert cellules trypsinisées dans un tube conique de 50 ml et centrifuger à 0,5 gx 3 min. Retirer le surnageant et amener les cellules de retour dans 5 ml de milieu de croissance. Utiliser un compteur de cellules pour compter les cellules récupérées à partir du flacon de culture.
  3. Diluer cellules dans le volume approprié de milieu de croissance complet à l'assiette 2,000-4,000 NOF par 100 pi sur une plaque noire, fond transparent, 96 puits. Ajouter 0,5 ug / 100 ul de collagène de queue de rat I du mélange de cellules avant l'étalement. Cellules laisser reposer à 37 ° C dans 5% de CO 2 dans un environnement humide pendant au moins 4 heures, ou jusqu'à ce que les cellulesà adhérer à la surface de la plaque.
  4. HPMC de sortie du flacon de culture en utilisant les mêmes procédés décrits dans les étapes 2.1 et 2.2. Diluer les cellules de la quantité appropriée de milieu de croissance complet à l'assiette 10.000-20.000 HPMC par 50 pi au-dessus du NOF déjà plaqué avec du collagène I dans des plaques à 96 puits. Laissez les cellules sont assis à 37 ° C dans 5% de CO 2 dans un environnement humide pendant au moins 18 heures avant le début des expériences.
  5. Culture protéine verte fluorescente (GFP) exprimant les cellules cancéreuses de l'ovaire HeyA8 dans les médias de croissance. Les cellules cancéreuses de l'ovaire HeyA8 sont marquées par fluorescence par l'expression d'un vecteur lentiviral exprimant copépode CGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Les cellules cancéreuses de l'ovaire HeyA8 devrait être de 80 à 90% de confluence le jour de l'utilisation (en phase de croissance logarithmique). Libérer les cellules de la plaque de la culture et de compter en utilisant les mêmes méthodes décrites dans les étapes 2.1-2.2 pour des cellules primaires.
  6. Laisser les cellules cancéreuses d'ovaire de récupérer dans un milieu de croissance complet pendant 15-20 min à 37 ° C dans untube conique avec le couvercle lâche scellé.

3. Essai d'adhésion 8

  1. Après la récupération, sédimenter les cellules de cancer de l'ovaire en faisant tourner pendant 3 min à 0,5 XG, puis éliminer le surnageant et diluer les cellules dans le volume approprié de milieu sans sérum pour obtenir une concentration de 50.000 cellules / 100 pi.
  2. Inverser les plaques à 96 puits avec les cultures organotypiques / NOF HPMC pour enlever milieu usé, et ajouter 100 pi de la suspension de cellules de cancer en milieu sans sérum à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans 5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 30 min pour 4 heures.
  3. Inversez la plaque de 96 puits pour enlever les médias et les cellules non-adhérentes. Utilisez une pipette multicanaux à faible puissance à pipette soigneusement et doucement 100 pi de PBS dans chaque puits, et inverser à nouveau la plaque. Répétez la PBS laver une fois de plus.
  4. Inversez pour enlever PBS et ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% à chaque puits. Laisser la plaque reposer pendant 20 min pour fixer les cellules. Après 20 minutes, retourner la plaque et ajouter 100 ul de PBS.
  5. Notez que la fluorescence totale de puits peut être rapporté ou le nombre de cellules peut être quantifiée. Pour la quantification, première plaque une courbe standard en double exemplaire, en utilisant des cellules HeyA8 à une concentration de 1 millions de cellules / ml.
    1. Faire de la courbe standard par filage soit 1 million de cellules, de retirer le média, et en leur permettant de siéger dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min.
    2. Cellules Spin ramènerai et dans 1 ml de PBS (cellules de recomptage confirment 1 million / ml de concentration). Plate 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, et 0 cellules dans chaque puits en double, et d'ajouter PBS pour un volume total final de 50 ul dans chaque puits.
  6. Bottom lire la plaque de culture sur un lecteur de plaque fluorescente (excitation = 488 nm, émission = 528 nm), mise à l'échelle haute puits (50.000 sur la courbe standard). Utilisez la courbe standard pour calculer le nombre de cellules de cancer de l'ovaire ont adhéré à la organotypic culture dans chaque puits (figure 4A-C).

4. Essai de prolifération 10

  1. Après que les cellules de cancer de l'ovaire récupérer (voir les étapes 2.5 et 2.6 ci-dessus), d'une pastille les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 0,5 x g et ensuite dilué les cellules dans le volume approprié de 1% de FBS médias (DMEM avec 1% de FBS, 1% de MEM vitamines [93 mg / L], 1% MEM non essentiels acides aminés [81,4 mg / l], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine]) pour obtenir une concentration de 4000 cellules / 150 ul.
  2. Inversez la plaque de 96 puits avec les HPMC / cultures organotypiques NOF pour enlever milieu usé, et ajouter 150 pi de la suspension de cellules de cancer de 1% de FBS à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans 5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 72 heures.
  3. Bottom lire la plaque de culture sur un lecteur de plaque fluorescente une fois par jour (excitation = 488 nm, émission = 528 nm) pour évaluer la prolifération rapportdes cellules. Continuer l'essai pendant 96 heures, en changeant les médias à 48 h (figure 5A-C). Soyez prudent de ne pas perturber la culture lors du changement de média (inversant la plaque est préférable).

5. Invasion Assay 8

  1. Avant la culture 3D de placage, ajouter 7,5 ug de collagène de queue de rat I dans 200 ul de PBS dans une plaque de culture de 24 insert de puits (8 um de taille de pore). Laissez la plaque d'incubation O / N, puis retirez soigneusement la PBS avec une pipette immédiatement avant l'ensemencement de la culture organotypique HPMC / NOF sur les inserts revêtus de collagène (étape 2, ci-dessus).
  2. Préparer les cellules de cancer ovarien comme à l'étape 3.1. Pour plaquer les cellules cancéreuses de l'ovaire sur les cultures organotypiques sur les inserts, utiliser avec précaution une pipette pour enlever l'excès des médias à partir du haut des inserts. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules de cancer ovarien dans du milieu sans sérum à chaque puits.
  3. Ajouter 750 ul de milieu de pleine croissance dans le bien en dessous de l'insert pour induire des cellules cancéreuses dansinvasion dans les cultures organotypiques. Incuber la plaque à 37 ° C dans 5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 24 heures.
    Nota: Les cellules de cancer ovarien qui envahissent la culture organotypique traversera l'insert et rester sur le côté inférieur de l'insert.
  4. Après 24 h, saisir l'insert avec des pinces et brièvement rincer dans un bécher de PBS, puis déplacer l'insert dans un puits vide. Frotter la partie supérieure de chaque insert avec deux côtés d'un coton-tige pour un total de 1 min. Placer rapidement l'insert dans une plaque contenant 750 pi 4% de paraformaldehyde dans chaque puits. Permettre à chaque insert de siéger dans paraformaldéhyde pendant 10 minutes avant de transférer les inserts dans les puits remplis de 750 pi de PBS.
  5. Afficher les cellules envahies (collées et fixées sur le fond du inserts) avec un microscope à grossissement 2,5x. Lorsque l'ensemble du bien est dans le champ de vision, ajuster l'agrandissement de 10x et de prendre 5 photos, l'un près du centre et 1 dans chaque quadrant du puits, en évitantprendre des images qui sont trop près des bords. Suivez la même pour chaque puits.
  6. Utilisez le programme du fabricant à compter le nombre de cellules dans chaque image pour obtenir un nombre moyen de cellules envahies par champ dans chaque puits (figure 6A-C) en fonction de leur protocole.

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Representative Results

La culture organotypique a été assemblé en mélangeant d'abord des fibroblastes humains primaires avec collagène de type I et recouvrant cette culture avec 5 fois le nombre de cellules mésothéliales. La culture a été incubée pendant au moins 18 heures avant que les cellules cancéreuses de l'ovaire ont été ajoutés pour étudier l'adhérence, l'invasion ou la prolifération. Chaque essai a été répété avec de multiples (n = 3-5) cultures 3D obtenues à partir de différents patients et de nombreux puits ont été testées dans chaque état de l'adhérence (n = 5), la prolifération des essais (n = 5) et d'invasion (n = 3) . Des cellules de cancer de l'ovaire ont adhéré à la culture organotypique 3D après 4 h (figure 4), ont proliféré sur la culture après 72 heures (6 fois le doublement temps-cellule HeyA8) (figure 5), et envahi après 24 h (figure 6). L'adhérence, la prolifération et l'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire a été HeyA8 intégrine-dépendante (Figure 4-6). En particulier, le peptide RGD et le blocage ANTIBOdies à a 5 intégrine, β 1 intégrine et α v β 3 intégrine a inhibé l'ovaire adhésion cellulaire de cancer de la culture organotypique, tandis que le peptide, un anticorps et de contrôle RAD ß 4 intégrine anticorps n'a pas (figure 4) 10. Dans l'essai de prolifération, le peptide RGD et des anticorps bloquants à a 5 - et ß une intégrine a inhibé la prolifération de cellules de cancer de l'ovaire de la culture organotypique, tandis que le peptide RAD, Anticorps de contrôle, α v ß 3 intégrine anticorps et ß 4 intégrine anticorps n'a pas (figure 5). Dans l'essai d'invasion, le peptide RGD et anticorps bloquants alpha à ​​5 - et une intégrine ß inhibé, tandis que l'α v β 3 intégrine anticorps améliorée de l'ovaire invasion des cellules cancéreuses à travers la culture organotypique 3D. Le RAD peptide, anticorps de contrôle, et β4 intégrine anticorps n'a pas affecté invasion (figure 6). Rarement, ces essais seront non interprétable (c.-α 5 intégrine anticorps bloquant ne sera pas inhiber l'adhérence, la prolifération ou l'invasion par rapport à l'anticorps de contrôle). Auparavant, nous avons constaté que certaines cultures organotypiques seront emportés lors d'un changement des médias ou du PBS laver pendant les essais. En outre, si les cellules cancéreuses de l'ovaire sont morts ou ont pas récupéré assez longtemps de la trypsine digérer intégrines de re-express, les dosages ne fonctionneront pas. Par conséquent, il est toujours important de disposer d'un contrôle positif et négatif dans chaque essai de sorte que la qualité de la culture organotypique et le dosage de cellules de cancer de l'ovaire peut être évaluée. Comme représenté ici, le peptide RGD, a et ß 5 intégrine une intégrine anticorps bloquants tous inhibé l'adhésion des cellules de l'ovaire du cancer, l'invasion et la prolifération de la culture organotypique et pourrait être utilisé comme positif concontrôles dans des analyses futures. De même, quatre intégrine β blocage anticorps n'a pas affecté l'adhérence des cellules de l'ovaire du cancer, l'invasion et la prolifération de la culture organotypique et pourrait être utilisé comme témoin négatif dans les essais futurs.

Figure 1
Figure 1. L'histologie des métastases omental humaine. Hématoxyline-éosine de (A) omentum humain normal (MC, cellules mésothéliales, Fib, fibroblastes, Adi, adipocytes) et (B) Cancer de l'ovaire métastatique omental (Met, les métastases de cancer de l'ovaire). Bar à panneaux = 100 mm de longueur. (C) Schéma du modèle organotypique 3D des métastases du cancer de l'ovaire imitant début de l'ovaire métastatique des cellules cancéreuses à la surface de l'épiploon humaine. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher un plus grand version de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Isolement des cellules humaines primaires épiploïques. (A) Un morceau de épiploon est recueilli à la chirurgie dans du PBS et transportés au laboratoire. Le tissu est sédimenté à 0,5 xgx 3 min et transféré dans du PBS frais. (B) Le morceau de épiploon est transféré dans une boîte de Pétri de 10 cm, on l'a lavé avec du PBS, et des scalpels sont utilisés pour couper l'épiploon en petits morceaux (0,5 cm 3 ). (DR) Les morceaux de tissu sont recueillies au moyen d'une pipette sérologique de 25 ml et on les transfère dans un tube conique de 50 ml pour l'isolement de HPMC. PBS est éliminé et le tube de HPMC sont en culot à partir du PBS une xg 0,5 à 37 ° C. (MC, cellules mésothéliales, RBC, les globules rouges, Fib, fibroblastes) (E) NOF sont isolés du remaini tissus omental ng après incubation avec de la hyaluronidase et de la collagénase de type III. L'image montre le tissu après une digestion de 6 à 12 heures. NOF sont culottées par centrifugation à 0,5 g à RT. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Caractérisation de HPMC et NOF isolé à partir de tissu humain épiploon. Images à contraste de phase (A) de cellules mésothéliales (HPMC) et (B) (NOF) fibroblastes après isolement à partir de tissu épiploon. HPMC humain coloré pour (C) et la cytokératine 8 (E) vimentine. NOF humaine colorée pour (F) vimentine, mais n'a pas pour tache (D) cytokératine 8. bar = 100 um, applique à tous les panneaux.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. cellule de cancer de l'ovaire adhérence à la culture organotypique est intégrine-dépendante. Dosage (A) L'adhérence a été effectuée avec 50000 cellules de cancer ovarien marqués par fluorescence, des cellules HeyA8, comme décrit dans la section de protocole. La fluorescence totale dans chaque puits est rapporté. L'anticorps de contrôle est IgG de souris. Chaque barre représente la moyenne +/- erreur standard moyenne. Représentant (B) à contraste de phase (C) et des images de fluorescence de l'ovaire adhérence des cellules cancéreuses de la culture organotypique. Bar = 100 um, applique à deux panneaux. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. cellule de cancer de l'ovaire prolifération de la culture organotypique est intégrine-dépendante. Dosage (A) La prolifération a été réalisée avec 4.000 cellules de cancer ovarien marqués par fluorescence, des cellules HeyA8, comme décrit dans la section de protocole. Le nombre total de cellules est rapportée. L'anticorps de contrôle est IgG de souris. Chaque barre représente la moyenne +/- erreur standard moyenne. Fusionnée à contraste de phase et les images fluorescentes de l'ovaire prolifération de cellules de cancer de la culture organotypique dans (B) 24 et (C) de 96 h. Bar = 100 um, applique à deux panneaux. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6. invasion de cancer de l'ovaire à travers la culture organotypique est intégrine-dépendante. Dosage (A) L'invasion a été effectuée avec 40000 cellules de cancer ovarien marqués par fluorescence, des cellules HeyA8, comme décrit dans la section de protocole. Le nombre de cellules qui envahissent (déplacé à travers la culture 3D de la partie inférieure de l'insert) est signalée. L'anticorps de contrôle est IgG de souris. Chaque barre représente la moyenne +/- erreur standard moyenne. (B) à contraste de phase et (C) des images fluorescentes de cellules de cancer ovarien qui ont envahi par la culture organotypique. Bar = 100 um, applique à tous les panneaux. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Un modèle organotypique du microenvironnement péritonéale a été créé pour évaluer la fonction (s) individuelle et collective à la fois des composants cellulaires et innées du microenvironnement dans la diffusion de cancer de l'ovaire. Les protocoles spécifiques pour le placage et la personnalisation de la culture organotypique 3D pour étudier l'ovaire adhérence des cellules cancéreuses, la prolifération et l'invasion sont fournis. Cellules humaines omentales mésothéliales et des fibroblastes primaires ont été isolées chez des malades et utilisés à un passage au début de préserver la morphologie normale et la variation patient. Dans ce modèle, les fibroblastes normaux et épiploïques ECM (typiquement collagène de type I) ont été posés avec une monocouche de cellules mésothéliales primaire humain. Ce modèle histologiquement imite le péritoine, et nous permet de recréer et examiner les événements clés dans les métastases du cancer de l'ovaire, y compris l'adhésion cellulaire de cancer de l'ovaire, de la prolifération et l'invasion 8,27.

Auparavant, des modèles 3D limitées ontété établi pour étudier les interactions de cancer ovarien avec le microenvironnement 13,14,21-25, tandis que ce modèle organotypique 3D est le premier à recréer la construction de la doublure mésothéliales-de la cavité péritonéale. L'épiploon humaine est recueilli à partir de patients variant en âge et la santé. La santé du tissu affecte directement les techniques de cellulaires et d'isolement des fibroblastes mésothéliales. Le tissu sain apparaît de couleur plus claire avec de très petits lobules (1-3 mm) par rapport à un tissu qui est plus de couleur orange avec de grands présents lobules (> 5 mm). La majorité des HPMC dépouiller dans la première PBS que le tissu est réalisée à partir de la chirurgie au laboratoire. Le plus saine du tissu, cependant, le plus élastique de HPMC sont à l'enlèvement, et d'autres lavages au PBS et 1: 1 PBS: produit de digestion de la trypsine peut se traduire par une culture mixte de cellules de HPMC et NOF. Dans les tissus sains, certains HPMC peut survivre à la collagénase de 6 h à digérer, et un condensé O / N dans une solution de collagénase 1x en pleinedes milieux de croissance est recommandé pour obtenir une culture de NOF pur. Notez l'épiploon doit être placé immédiatement dans PBS lors du retrait ou pas de HPMC sera récupéré à partir de tissu. En outre, si le tissu est stocké dans du PBS pendant une période de temps prolongée (> 2 heures) à la température ambiante ou au réfrigérateur, le nombre de HPMC viables isolées est considérablement réduite.

Un rapport de 1: 5 de fibroblastes de cellules mésothéliales est plaqué pour imiter le rapport des fibroblastes de cellules mésothéliales in vivo 8. Il est important de noter que la taille des cellules mésothéliales isolées varie d'un patient à l'autre, ce qui peut nécessiter un ajustement de la proportion de placage. Les cellules mésothéliales de certains patients sont beaucoup plus petits; dans ces cas, nous plaque double du nombre de cellules mésothéliales (20.000). En outre, les cellules primaires sont toujours utilisées à un stade précoce (1-2) pour conserver la morphologie passage. Les cellules mésothéliales peuvent être des cellules mésothéliales cubiques ou grêles, et cubiques deviennent plus grêlescomme elles sont soumises à des passages, ou avec une plus grande exposition au milieu conditionné à partir de cellules du cancer des ovaires ou le traitement avec 10 TGFß.

Cellules de cancer ovarien peuvent adhérer à et envahir par les cellules mésothéliales mésenchymateuses plus efficacement que les cellules mésothéliales épithéliales provenant des mêmes ou différents patients. Typiquement, nous mettons en place la culture organotypique pendant 18 heures avant de commencer les tests fonctionnels avec des cellules de cancer de l'ovaire. Les plus longues et les cellules fibroblastes mésothéliales sont cultivées ensemble, plus le temps qu'ils ont à sécréter des protéines différentes, y compris des protéines ECM, ce qui peut affecter le comportement des cellules de cancer de l'ovaire. Un autre facteur important à prendre en compte lors de l'exécution de ces tests est le taux de prolifération différentielle et l'expression niveau de protéines associées à l'adhérence accrue, l'invasion et / ou la prolifération, y compris les intégrines, les protéases, et les facteurs de croissance, dans chaque lignée cellulaire de cancer ou humain primaire types de cellules cancéreuses.La durée et le nombre de cellules cancéreuses utilisées dans chacun des essais fonctionnels avec la culture organotypique doit être optimisée pour chaque lignée de cellules de cancer ou un type de cellule cancéreuse primaire. Par exemple, dans l'essai d'adhérence décrit, cellules de cancer ovarien pourraient être envahissant la culture pendant ce temps.

De toute évidence, ce modèle organotypique ne contient pas tous les composants de la micro-péritonéale normale immunitaire telles que, endotheliales et des cellules adipocytaires. En outre, le modèle dépend de la disponibilité et de l'accessibilité du tissu humain primaire, comme les cellules primaires ne sont utilisés que dans les trois premiers passages. Cependant, le modèle présente de nombreux avantages dans son utilisation de cellules humaines primaires et l'intégration de plusieurs types de cellules qui ont été démontrées à jouer un rôle important dans les métastases. Ce modèle a été utilisé pour étudier la régulation des gènes et des protéines dans des types cellulaires particuliers (par exemple, les cellules cancéreuses, mésothéliale normal ou des cellules de fibroblastes) aprèsco-culture. En particulier, les rôles de c-Met 28, MMP-2 9,29, la E-cadhérine 30, β 1 intégrine 10, ß 3 intégrine 16, a 5 intégrine 10,31, et la fibronectine 10 dans les métastases ont tôt été explorées. En outre, le modèle a le potentiel de développer pour inclure plus de types de cellules, telles que l'incorporation de 6 adipocytes. Le modèle a été modifié et miniaturisé destiné à être utilisé dans un criblage à haut débit pour identifier les petites molécules inhibitrices de l'ovaire cellule cancéreuse adhérence / invasion de micro-péritonéale 27 le. Les applications futures de ce modèle comprennent l'incorporation de cellules immunitaires dans l'essai, y compris les macrophages pour des études mécanistiques et criblage à haut débit. En résumé, la culture cellulaire organotypique est un modèle utile pour évaluer les interactions entre le micro-péritonéale humaine et de cellules de cancer ovarien, de la goal d'élucider les mécanismes moléculaires importants de diffusion et de progression de la maladie, et l'identification de cibles thérapeutiques potentielles.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS Fisher Scientific SH3001304
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640
15 cm culture dishes BD Biosciences 353025
Glass flask ? ?
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine Corning 10-013-CV
MEM Vitamins Corning 25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids Corning 25-025-CI
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Shaker  Thermo-Fisher MaxQ 4450
Centrifuge Eppendorf 5702
Incubator Thermo-Fisher Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%) Corning 25-053-CI
Hyaluronidase Worthington Biochemical LS002592
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
T-175 Flasks BD Biosciences 353112
Pipet tips Rainin P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips Corning Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter Invitrogen Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10313
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Collagen Type I (Rat Tail) BD Biosciences 354236
96 well plate, clear bottom, black BD Biosciences 353219
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet Eppendorf Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Plate reader Molecular Devices Minimax
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well) BD Biosciences 353097
Cotton swabs Q-tips cotton swabs
Microscope Zeiss Axiovert 200m
Cell Profiler public domain
24 well plate BD Biosciences 353047
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 EMD Millipore MAB1976
Beta 1  Oncosynergy OS2966
Alpha 5 [CD49e] ID Pharmingen 555615
Beta 4 [CD104] EMD Millipore MAB 2058

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References

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Modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain
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Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).More

Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).

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