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Medicine

Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

doi: 10.3791/53541 Published: December 31, 2015

Protocol

Todos os protocolos de pesquisa descritas foram revistos pela Universidade de Revisão Institucional Chicago Board (IRB). O consentimento informado foi obtido de cada paciente antes da cirurgia e do estudo foi aprovado pela Universidade de Chicago IRB. Um gabinete de segurança biológica do tipo 2 e as luvas devem ser usados ​​ao manusear tecido humano para proteção e para reduzir o risco de contaminação de células.

1. Isolamento e Cultura de células estromais não transformadas primárias

  1. Coleta de tecido humano e preparação.
    1. Obter amostras de omento humano, 2 cm 3, removida durante uma cirurgia abdominal, e mergulhar imediatamente no tecido RT solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Figura 2A). Um pedaço de omento 3 cm x 2 cm normalmente produz 1 milhão de células primárias humanas mesoteliais (HPMC) e 200.000 fibroblastos humanos primários ou fibroblastos omentais normais (NOF).
    2. Girar o PBS o tecido foi mergulhado em a 0,5 g durante 3min o mais rapidamente possível após a colheita (<2 h em PBS) e transferir para o tecido fresco 20 mL de PBS num tubo de 50 ml. Corta-se o tecido em 5mm 3 peças por picagem com bisturis em um 15 cm de diâmetro, estéril prato de cultura (Figura 2B).
  2. Isolamento de células mesoteliais humanas primárias 8
    1. Para isolar HPMC, transferir o tecido moído em 50 ml de tubos cónicos e esperar 1 min para os pedaços sólidos a flutuar para o topo (Figura 2C e D). HPMC e glóbulos vermelhos (RBC) estará presente no líquido na parte inferior. Usar uma pipeta para retirar o líquido a partir do fundo do tubo e para um novo tubo cónico. Girar o líquido para baixo, para 0,5 xg durante 3 min e aspirar o sobrenadante do pellet de HPMC / RBC.
      1. Repita o processo três vezes: adicionar 20 ml de PBS ao tecido picada, permitir que o tecido a subir, remover o líquido do fundo com uma pipeta e no tubo de HPMC / RBC, girar para baixo, e retire asobrenadante. Depois de todas as rotações são concluídos e o sobrenadante é aspirado, o sedimento conterá HPMC e RBC.
    2. Placa de todas as células a partir do sedimento num frasco de 75 cm 2 em 15 ml de meio de crescimento completo (DMEM com soro a 10% de bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de MEM aminoácidos não essenciais ácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]).
    3. Realize uma lavagem PBS secundário para isolar HPMCs adicionais.
      1. Para lavar o secundário PBS, agitar o tecido sólido restante a 200 rpm, 37 ° C durante 10 min em 20 ml de PBS, em seguida, esperar um minuto para o tecido a flutuar para o topo. Remover o líquido a partir do fundo do tubo para um novo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, e o sobrenadante aspirado.
      2. Placa toda a HPMC / RBC do PBS secundário lavar em um frasco separado 75 cm 2 em 15 ml de meio de crescimento completo.
    4. Para isolar qualquer remaining HPMC, agitar o tecido moído a 200 rpm, 37 ° C graus durante 10 min em 20 ml de uma mistura 1: 1 0,25% de tripsina 25 mM de EDTA: solução de PBS em volume. Permitir que o tecido a subir, recolher o líquido na parte inferior do tubo em um novo tubo de 50 ml, e a rotação para baixo de 0,5 gx 3 min.
      1. Aspirar o sobrenadante e placa toda a HPMC / RBC em um frasco separado 75 cm 2 em 15 ml de meio de crescimento completo.
    5. Cultura das células plaqueadas a 37 ° C e 5% de CO2 num ambiente humidif içado. Alimentar as células banhado, adicionando 15 ml de meio de crescimento completo nos dias 3 e 5 sem a remoção dos meios gastos. HPMC podem ser cultivadas por 5-7 dias antes de se separarem.
      1. Use baixa passagem HPMC (até passagem 2) em todos os experimentos para minimizar desdiferenciação e modificação do fenótipo inicial. Use um microscópio de campo amplo de preferência com uma objetiva de 20x com capacidades de contraste de interferência diferencial plástico ou objetivo 4-20x com contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste no microscópio) para tomar todas as imagens das células, e uma objetiva de 10x () no campo claro para analisar imunohistoquímica 3,3'-diaminobenzidina (DAB) coloração.
    6. Confirme que a HPMC são cubóide e expressar citoqueratina 8 e vimentina através da realização de imunohistoquímica 8 (Figura 3A, C, E).
  3. NOF isolamento 8
    1. Preparar 10 ml de uma solução de estoque de colagenase de tipo III (10x) por combinação de uma mistura 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividade / ml de colagenase de tipo III: Actividade de 714 unidades / ml de hialuronidase em PBS.
    2. Agitar o tecido omento picada que permanece após HPMC isolamento a 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas em 10 ml da solução 10x colagenase tipo III diluída em meio isento de soro (DMEM com 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], MEM a 1% aminoácidos não essenciais [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]). Tecido digerido vai olhar opaco e pode ter alguns detritos fibroso (Figura 2E).
    3. Centrifugar a solução contendo as células NOF em suspensão em 0,5 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e o sedimento em placa num frasco de 75 cm 2 em 13 ml de meio de crescimento completo.
    4. Remover a velha mídia e substituir com 15 ml de meio de crescimento completo fresco depois de 24 horas. NOF podem ser cultivadas durante 1-3 dias antes de se separarem. Proliferação nota da NOF cessará quando as células atingem a confluência.
    5. Confirmar que os fibroblastos humanos primários, as células são alongadas planas e expressar vimentina mas não citoqueratina 8 8 através da realização de imuno-histoquímica (Figura 3B, D, F). Use NOF de baixa passagem para experiências (idealmente antes da passagem 3) para minimizar desdiferenciação e modificação do fenótipo inicial. Use um microscópio de campo amplo com uma objetiva de 20x com capacidades DIC de plástico para tomar todas as imagens de fase de células,e uma objectiva de 10x em campo brilhante para analisar a coloração imuno-histoquímica DAB.

2. chapeamento o Organotípicas Cultura 8

  1. NOF lançamento do balão de cultura de 75 cm por lavagem com 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de tripsina a 0,25% / EDTA 25 mM, durante não mais do que 5 minutos. Neutralizar a tripsina com pelo menos 3 vezes o volume de meio de crescimento completo.
  2. Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml e girar para baixo em 0,5 gx 3 min. Remover o sobrenadante e trazer as células de volta em 5 ml de meio de crescimento completo. Utilizar um contador de células para contagem das células recuperadas a partir do balão de cultura.
  3. Dilui-se as células no volume apropriado de meio de crescimento completo ao prato 2.000-4.000 NOF por 100 ul numa placa preta, clara de fundo, de 96 cavidades. Adicionar 0,5 ug / 100 ul de colagénio de cauda de rato-I da mistura de células antes do plaqueamento. Let células sentar a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante pelo menos 4 horas, ou até que as célulaspara aderir à superfície da chapa.
  4. HPMC liberar a partir do frasco de cultura utilizando os mesmos métodos descritos nos passos 2.1 e 2.2. Dilui-se as células na quantidade apropriada de meio de crescimento completo ao prato 10.000-20.000 HPMC por 50 ul no topo da NOF já revestida com colagénio I, em placas de 96 poços. Permitir que as células se sentar a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado durante pelo menos 18 horas antes de iniciar as experiências.
  5. Cultura proteína fluorescente verde (GFP) -expressing HeyA8 células cancerígenas de ovário em meio de crescimento completo. HeyA8 células cancerosas do ovário está marcado de forma fluorescente por expressão de um vector lentiviral expressando copépodo cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 células cancerosas do ovário deve ser 80-90% confluentes no dia da utilização (fase de crescimento logarítmica). Libertar as células a partir da placa de cultura e contagem usando os mesmos métodos descritos nos passos 2.1-2.2 para células primárias.
  6. Permitir que as células de cancro do ovário para recuperar num meio de crescimento completo durante 15-20 min a 37 ° C numatubo cónico com a tampa solta selado.

3. Ensaio de Adesão 8

  1. Após a recuperação, sedimentar as células do cancro do ovário por centrifugação durante 3 minutos a 0,5 xg e, em seguida, remover o sobrenadante e dilui-se as células no volume apropriado de meio isento de soro para alcançar uma concentração de 50.000 células / 100 pi.
  2. Inverter as placas de 96 poços com as culturas organotípicas / NOF HPMC para remover meios gastos, e adicionar 100 uL da suspensão de células de câncer em meio isento de soro a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 30 min a 4 h.
  3. Inverta a placa de 96 poços e meios para remover as células não aderentes. Use uma pipeta multicanal com baixo poder de cuidado e gentilmente pipeta 100 ul de PBS em cada poço e inverter placa novamente. Repita o PBS lavar mais uma vez.
  4. Inverta a remover PBS e adiciona-se 100 ul de paraformaldeido a 4% a cada poço. Permitir que a placa de sentar-se por 20 min para corrigir as células. Após 20 min, inverter a placa e adiciona-se 100 ul de PBS.
  5. Note-se que a fluorescência total dos poços pode ser reportada ou o número de células pode ser quantificada. Para a quantificação, a primeira placa de uma curva padrão em duplicado utilizando células HeyA8 a uma concentração de 1 milhão de células / ml.
    1. Fazer a curva padrão por fiação para baixo 1 milhão de células, removendo mídia, e permitindo-lhes para se sentar em 1 ml de paraformaldeído a 4% durante 20 minutos.
    2. Células girar novamente e trazer em 1 ml de PBS (células recontagem para confirmar 1 milhão / ml de concentração). Placa de 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000 e 0 células em cada cavidade, em duplicado, e adicionar PBS para um volume total final de 50 uL em cada poço.
  6. Inferior ler a placa de cultura em um leitor fluorescente placa (excitação = 488 nm, emissão = 528 nm), dimensionamento altos poços (50.000 na curva padrão). Use a curva padrão para calcular quantas células de cancro do ovário aderiram ao organotypIC cultura em cada poço (Figura 4A-C).

4. Ensaio de Proliferação de 10

  1. Após as células de cancro do ovário recuperar (ver passos 2.5 e 2.6, supra), sedimentar as células por centrifugação durante 3 minutos a 0,5 xg e depois dilui-se as células no volume apropriado de 1% de meio de FBS (DMEM com FBS a 1%, 1% MEM vitaminas [93 mg / L], MEM a 1% de aminoácidos não essenciais [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina]) para obter uma concentração de 4000 células / 150 ul.
  2. Inverta a placa de 96 poços com as culturas organotípicas de HPMC / NOF para remover o meio gasto e adicionar 150 uL da suspensão de células do cancro em 1% de meio FBS a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 72 h.
  3. Parte inferior da placa de cultura de ler num leitor de placas fluorescente, uma vez por dia (excitação = 488 nm, emissão = 528 nm) para avaliar a proliferação relativade células. Continue o ensaio durante 96 horas, mudando a mídia em 48 horas (Figura 5A-C). Tenha cuidado para não perturbar a cultura quando se muda de mídia (invertendo a placa é preferível).

5. Invasão Ensaio 8

  1. Antes de chapeamento a cultura 3D, adicionar 7,5 g rato-cauda colágeno I em 200 � de PBS a um 24 bem inserção placa de cultura (8 mm de tamanho de poro). Deixe a placa incubado O / N, em seguida, retire cuidadosamente a PBS com uma pipeta imediatamente antes do plaqueamento a cultura organotípico HPMC / NOF para as inserções revestidos com colagénio (etapa 2, acima).
  2. Preparar as células de cancro do ovário como no passo 3.1. Ao prato as células de cancro do ovário para as culturas organotípicas sobre as inserções, utilize cuidadosamente uma pipeta para remover o excesso de mídia a partir do topo das inserções. Adicionar 100 ul da suspensão de células do cancro do ovário em meio isento de soro a cada poço.
  3. Adicionar 750 ul de meio de crescimento completo na cavidade abaixo da inserção para induzir células no cancrovasion em culturas organotípicas. Incubar a placa a 37 ° C em 5% de CO2 num ambiente humidif içado, durante 24 horas.
    Nota: As células do cancro do ovário que invadem a cultura organotípica vai atravessar a inserção e permanecem no lado inferior da peça inserta.
  4. Após 24 horas, segure a inserção com pinças e brevemente enxágüe-la num copo de PBS, em seguida, passar a inserção em um poço vazio. Esfregar a parte superior de cada inserto com dois lados de uma mecha de algodão para um total de 1 min. Rapidamente colocar o inserto para uma placa contendo 750 ul de paraformaldeido a 4% em cada poço. Permitir que cada inserção para sentar-se em paraformaldeído durante 10 minutos antes de transferir as inserções em poços cheios com 750 � de PBS.
  5. Ver as células invadidas (aderidas e fixas à parte inferior das inserções) com um microscópio com uma ampliação de 2,5 vezes. Quando todo o poço está dentro do campo de visão, para ajustar a ampliação de 10x e levar 5 imagens, um perto do centro e um em cada quadrante do poço, evitandoa tomada de imagens que são demasiado perto das bordas. Siga o mesmo padrão para cada poço.
  6. Usar o programa do fabricante para contar o número de células em cada imagem para obter um número médio de células invadidas por campo em cada poço (Figura 6A-C) de acordo com o seu protocolo.

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Representative Results

A cultura organotípica foi montada misturando primeiro fibroblastos humanos primários com colagénio do tipo I e, em seguida, sobrepondo esta cultura com 5 vezes o número de células de mesotélio. A cultura foi incubada durante, pelo menos, 18 horas antes das células de cancro do ovário foram adicionados a estudar a adesão, invasão ou proliferação. Cada ensaio foi repetido com múltiplos (n = 3-5) culturas em 3D obtidas de diferentes pacientes e numerosos poços foram testados em cada condição para a adesão (n = 5), ensaios de proliferação (n = 5) e invasão (n = 3) . Células cancerosas do ovário aderidas à cultura organotípica 3D depois de 4 h (Figura 4), ​​proliferaram na cultura depois de 72 horas (6 vezes o tempo de duplicação da célula HeyA8) (Figura 5), e após 24 h invadido (Figura 6). A adesão, proliferação e invasão das células de câncer de ovário HeyA8 era dependente de integrina (Figura 4-6). Especificamente, o péptido RGD, impedindo ANTIBodies para ácido a 5 integrina, β 1 e integrina α v β 3 integrina inibiu a adesão de células de cancro do ovário para a cultura organotípica, enquanto que o péptido, anticorpo e RAD de controlo p 4 integrina anticorpo não (Figura 4) 10. No ensaio de proliferação, o péptido RGD e anticorpos bloqueadores de ácido a 5 - e p 1 integrina proliferação de células de cancro do ovário inibida na cultura organotípica, enquanto que o péptido RAD, anticorpo de controlo, α v integrina p3 anticorpo e p 4 integrina anticorpo não (Figura 5). No ensaio de invasão, o péptido RGD e anticorpos bloqueadores de ácido a 5 - e p 1 inibiu a integrina, enquanto a α v β 3 integrina de anticorpo melhorada a invasão de células do cancro do ovário por meio da cultura organotípica 3D. A RAD peptídeo, anticorpo controle, e β4 integrina anticorpo não afectou a invasão (Figura 6). Raramente, estes ensaios se tornará não interpretáveis ​​(isto é, 5 α integrina anticorpo bloqueador não irá inibir a adesão, invasão ou proliferação quando comparado com o anticorpo de controlo). Anteriormente, nós descobrimos que certas culturas organotípicas vai lavar em cima de mudança dos meios de comunicação ou de lavagem PBS durante os ensaios. Além disso, se as células de cancro do ovário são mortas ou não ter recuperado o suficiente de tripsina a digerir as integrinas a re-express, os ensaios não funcionará. Portanto, é sempre importante ter um controlo positivo e negativo em cada ensaio para que a qualidade da cultura organotípica e ensaio de células do cancro do ovário pode ser avaliada. Como mostrado aqui, o péptido RGD, a- 5 integrina p 1 e integrina anticorpos de bloqueio de adesão celular do cancro do ovário todo inibida, invasão e proliferação da cultura organotípica para e pode ser usado como con positivacontroles em ensaios futuros. Da mesma forma, β 4 integrina anticorpo bloqueador não afectaram a adesão celular do cancro do ovário, invasão e proliferação da cultura organotípica para e pode ser usado como um controlo negativo em ensaios futuros.

figura 1
Figura 1. A histologia de metástases omento humano. Hematoxilina e eosina de (A) omento humano normal (MC, células mesoteliais, Fib, fibroblastos, Adi, adipócitos) e (B) a metástase do cancro do ovário omental (Met, metástases do cancro do ovário). Bar em painéis = 100 um de comprimento. (C) Esquema do modelo organotípico 3D de metástase do câncer de ovário imitando cedo metástase de células de cancro do ovário para a superfície do omento humano. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.

Figura 2
Figura 2. Isolamento de células primárias humanas omental. (A) uma porção de omento é recolhido no momento da cirurgia em PBS e transportadas para o laboratório. O tecido é sedimentado a 0,5 xgx 3 min e transferidos para PBS fresco. (B) O pedaço de omento é transferido para uma placa de Petri de 10 cm, lavou-se com PBS, e bisturis são usados ​​para cortar o omento em pedaços pequenos (0,5 cm 3 ). (CD) Os pedaços de tecido são recolhidos utilizando uma pipeta de 25 ml serológica e transferida para um tubo de 50 ml para o isolamento de HPMC. PBS é removido do tubo e HPMC foram sedimentadas a partir de uma 0,5 xg de PBS a 37 ° C. (MC, células mesoteliais, RBC, células vermelhas do sangue, Fib, fibroblastos) (E) NOF são isolados a partir do remaini tecido omental ng após incubação com hialuronidase e colagenase tipo III. A imagem mostra o tecido após uma digestão de 6 a 12 horas. NOF são sedimentados por centrifugação a 0,5 xg à temperatura ambiente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Caracterização de HPMC e NOF isolado a partir de tecido omento humano. Imagens de contraste de fase de (A) células mesoteliais (HPMC) e (B) fibroblastos (NOF) após isolamento a partir de tecido omento. HPMC humano coradas para (C) citoqueratina 8 e (E) vimentina. NOF humano coradas para (F) vimentina, mas não coraram para (D) citoqueratina 8. Barra = 100 fim, aplica-se a todos os painéis.ftp_upload / 53541 / "target =" _ blank 53541fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. a adesão de células de cancro do ovário para a cultura organotípica é dependente de integrina. Ensaio (A) A adesão foi realizada com 50.000 células marcadas fluorescentemente de cancro do ovário, células HeyA8, como descrito na secção de Protocolo. A fluorescência total em cada poço é relatado. O anticorpo controle é IgG. Cada barra representa a média +/- erro padrão médio. Representante (B) de contraste de fase e (c) as imagens fluorescentes de adesão de células do cancro do ovário para a cultura organotípica. Bar = 100 mm, aplica-se a ambos os painéis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. proliferação de células de cancro do ovário em cultura organotípica é dependente de integrina. Ensaio (A) A proliferação foi realizada com 4.000 fluorescentemente marcados com células de cancro do ovário, células HeyA8, como descrito na secção de Protocolo. O número total de células é relatado. O anticorpo controle é IgG. Cada barra representa a média +/- erro padrão médio. Incorporada de contraste de fase e imagens fluorescentes de proliferação de células do cancro do ovário em cultura organotípica em (B) e 24 (C) 96 horas. Bar = 100 mm, aplica-se a ambos os painéis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. invasão do cancro do ovário por meio da cultura organotípica é dependente de integrina. Ensaio (A) A invasão foi realizada com 40.000 células marcadas fluorescentemente de cancro do ovário, células HeyA8, como descrito na secção de Protocolo. O número de células invasoras (deslocado através da cultura 3D para a parte inferior do inserto) é relatado. O anticorpo controle é IgG. Cada barra representa a média +/- erro padrão médio. (B) e de contraste de fase (C) imagens fluorescentes das células de cancro do ovário que invadiram através da cultura organotípica. Bar = 100 mm, aplica-se a todos os painéis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um modelo organotípico do microambiente peritoneal foi criada para avaliar a função (s) individual e coletiva de ambos os componentes celulares e inatas do microambiente na disseminação do cancro do ovário. Os protocolos específicos para o plaqueamento e personalizar a cultura organotípico 3D para investigar ovário adesão célula cancerosa, proliferação e invasão são fornecidos. Células humanas primárias omentais mesoteliais e fibroblastos foram isoladas de pacientes e usado em uma passagem antecipada para preservar a morfologia normal e variação paciente. Neste modelo, os fibroblastos normais e omental ECM (tipicamente colagénio tipo I) foram revestidas com uma monocamada de células de mesotélio humano primário. Este modelo histologicamente imita o revestimento peritoneal, e nos permite recriar e examinar eventos-chave na metástase do câncer de ovário, incluindo a adesão de células de cancro do ovário, proliferação e invasão 8,27.

Anteriormente, modelos 3D limitados têmfoi estabelecido para investigar interacções cancro do ovário com o microambiente 13,14,21-25, enquanto este modelo organotípico 3D é o primeiro a recriar a construção do revestimento mesotelial-da cavidade peritoneal. O omento humano é coletado de pacientes variando em idade e saúde. A saúde do tecido afeta diretamente as técnicas de isolamento de células de fibroblastos e mesoteliais. O tecido saudável aparece de cor mais clara com muito pequenos lóbulos (1-3 mm) em comparação com o tecido que é mais cor de laranja com lóbulos grandes presentes (> 5 mm). A maioria de HPMC desprendem no PBS inicial como o tecido é transportado de uma cirurgia para o laboratório. Quanto mais saudável do tecido, no entanto, mais resistente a HPMC é a remoção, e lavagens adicionais com PBS e de 1: 1 de PBS: digestão de tripsina podem resultar em uma cultura mista de células de HPMC e NOF. Nos tecidos saudáveis, alguns HPMC pode sobreviver a colagenase-6 hr digerir, e um resumo S / N em solução de colagenase 1x integralmentemeios de crescimento é recomendada para se obter uma cultura pura NOF. Nota o omento deve ser colocado imediatamente em PBS após a remoção ou há HPMC será recuperada a partir de tecido. Além disso, se o tecido é armazenado em PBS durante um período de tempo prolongado (> 2 horas) à temperatura ambiente ou no frigorífico, o número de HPMC isolados viáveis ​​é significativamente reduzida.

Uma proporção de 1: 5 de fibroblastos de células mesoteliais é revestida para imitar a proporção de fibroblastos de células mesoteliais in vivo 8. É importante notar que o tamanho das células mesoteliais isoladas varia de paciente para paciente e pode necessitar de ajuste com a relação de chapeamento. As células mesoteliais de alguns pacientes são muito menores; Nestes casos, estamos placa dupla do número de células mesoteliais (20000). Além disso, as células primárias são sempre utilizado numa (1-2) passagem precoce para preservar a morfologia. Mesothelial células podem ser células mesoteliais cubóides ou finas, e tornar-se mais espigado cúbicascomo eles são passadas, ou com maior exposição ao meio condicionado a partir de células de cancro do ovário ou o tratamento com TGF 10.

Células cancerosas do ovário pode aderir e invadir através das células mesoteliais mesenquimais mais eficientemente do que as células mesoteliais epiteliais da mesma ou de diferentes pacientes. Normalmente, montamos a cultura organotípico durante 18 horas antes de iniciar os ensaios funcionais com células de cancro do ovário. Quanto mais tempo as células mesoteliais e fibroblastos são cultivadas em conjunto, mais tempo eles têm para segregar diferentes proteínas, incluindo proteínas da MEC, que podem afetar o comportamento das células de câncer de ovário. Outro factor importante a ter em conta quando da realização destes ensaios é o nível de proteínas associadas com o aumento da adesão, invasão, e / ou a proliferação, incluindo integrinas, proteases e factores de crescimento taxa de proliferação diferencial e de expressão, em cada linha celular de cancro ou humano primário tipos de células de cancro.O tempo e o número de células cancerosas usado em cada um dos ensaios funcionais com a cultura organotípica necessita de ser optimizada para cada linha celular de cancro ou tipo de célula do cancro primário. Por exemplo, no ensaio de ades descrito, as células de cancro do ovário pode ser invadindo a cultura durante este tempo.

Claramente, este modelo organotípico não contém todos os componentes do microambiente peritoneal normal, tal como imunitário, células endoteliais, adipócitos e. Além disso, o modelo depende da acessibilidade e disponibilidade de tecido humano primário, como as células primárias são usadas apenas nos primeiros três passagens. No entanto, o modelo tem muitas vantagens na sua utilização de células humanas primárias e incorporação de vários tipos de células que foram demonstradas para desempenhar papéis importantes na metástase. Este modelo tem sido utilizado para investigar a regulação de genes e proteínas nos tipos de células individuais (ie, células cancerosas, mesotelial normal ou células de fibroblastos) depoisco-cultura. Em particular, o papel de c-Met 28, MMP-2, 9,29, 30 E-caderina, uma integrina β 10, p 16 3 integrina, a- 5 integrina 10,31, fibronectina e 10 tem início na metástase sido explorado. Além disso, o modelo tem o potencial para se expandir para incluir mais tipos de células, tais como a incorporação de adipócitos 6. O modelo foi modificado e miniaturizado para utilização em rastreio de alto rendimento para identificar pequenas moléculas inibidoras de adesão de células de cancro / invasão do ovário para o microambiente peritoneal 27. As aplicações futuras deste modelo incluem a incorporação de células imunes para o ensaio, incluindo macrófagos para estudos mecanicistas e rastreio de alto rendimento. Em resumo, a cultura de células organotípicas fornece um modelo útil para avaliar as interacções entre o microambiente peritoneal humano e células de cancro do ovário, com o Goal de elucidar os mecanismos moleculares importantes de disseminação e progressão da doença, e identificar potenciais alvos terapêuticos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS Fisher Scientific SH3001304
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640
15 cm culture dishes BD Biosciences 353025
Glass flask ? ?
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine Corning 10-013-CV
MEM Vitamins Corning 25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids Corning 25-025-CI
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Shaker  Thermo-Fisher MaxQ 4450
Centrifuge Eppendorf 5702
Incubator Thermo-Fisher Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%) Corning 25-053-CI
Hyaluronidase Worthington Biochemical LS002592
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
T-175 Flasks BD Biosciences 353112
Pipet tips Rainin P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips Corning Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter Invitrogen Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10313
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Collagen Type I (Rat Tail) BD Biosciences 354236
96 well plate, clear bottom, black BD Biosciences 353219
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet Eppendorf Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Plate reader Molecular Devices Minimax
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well) BD Biosciences 353097
Cotton swabs Q-tips cotton swabs
Microscope Zeiss Axiovert 200m
Cell Profiler public domain
24 well plate BD Biosciences 353047
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 EMD Millipore MAB1976
Beta 1  Oncosynergy OS2966
Alpha 5 [CD49e] ID Pharmingen 555615
Beta 4 [CD104] EMD Millipore MAB 2058

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References

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Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano
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Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).More

Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).

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