Protocol
Todos los protocolos de investigación descritos han sido revisados por la Universidad de Chicago Junta de Revisión Institucional (IRB). El consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía y el estudio fue aprobado por la Universidad de Chicago IRB. Un gabinete de seguridad biológica de tipo 2 y los guantes se deben utilizar para la manipulación de tejidos humanos para su protección y para reducir el riesgo de contaminación de las células.
1. Aislamiento y cultivo de células estromales no transformadas primarias
- Recogida de tejido humano y preparación.
- Obtener muestras de epiplón humana, 2 cm 3, eliminado durante una cirugía abdominal, y sumergirse de inmediato el tejido en solución salina tamponada con fosfato de RT (PBS) (Figura 2). Un pedazo de epiplón 3 cm x 2 cm típicamente produce 1 millón de células mesoteliales primarios humanos (HPMC) y 200.000 fibroblastos humanos primarios o fibroblastos normales omental (NOF).
- Gira por la PBS el tejido se sumerge en 0,5 g durante 3min tan pronto como sea posible después de la recogida (<2 h en PBS) y transferir el tejido fresco a 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml. Cortar el tejido dentro de 5 mm 3 piezas mediante el picado con escalpelos en un diámetro de 15 cm, placa de cultivo estéril (Figura 2B).
- Mesotelial humana primaria aislamiento de células 8
- Para aislar HPMC, transferir el tejido picado en 50 ml tubos cónicos y esperar 1 min para los trozos sólidos floten a la parte superior (Figura 2 C + D). HPMC y los glóbulos rojos (RBC) estarán presentes en el líquido en la parte inferior. Usar una pipeta para eliminar el líquido de la parte inferior del tubo y en un nuevo tubo cónico. Girar el líquido hacia abajo a 0,5 xg durante 3 min y aspirar el sobrenadante del sedimento de HPMC / RBC.
- Repita el proceso tres veces: añadir 20 ml de PBS al tejido picada, deje el tejido se eleve, eliminar el líquido de la parte inferior con una pipeta y en el tubo de HPMC / RBC, girar hacia abajo, y extraiga laflotante. Después de todos los giros se han completado y se aspira el sobrenadante, el sedimento contiene HPMC y RBC.
- Plate todas las células del pellet en un matraz 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo (DMEM con 10% de suero bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de ácidos MEM aminoácidos no esenciales [81.4 mg / L], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]).
- Realizar un lavado PBS secundaria para aislar HPMCs adicionales.
- Para lavar el PBS secundaria, agitar el tejido sólido que queda a 200 rpm, 37 ° C durante 10 minutos en 20 ml de PBS, a continuación, espere 1 minuto para el tejido flote a la cima. Retirar el líquido de la parte inferior del tubo en un nuevo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, y aspirar el sobrenadante.
- Placa todo el HPMC / RBC desde el PBS secundaria de lavado en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
- Para aislar cualquier remaining HPMC, agitar el tejido picado a 200 rpm, 37 ° C grados durante 10 min en 20 ml de una mezcla 1: 1 0,25% de EDTA mM de tripsina 25: solución de PBS en volumen. Permitir que el tejido se eleve, recoger el líquido en la parte inferior del tubo en un nuevo tubo de 50 ml, y girar hacia abajo en 0,5 gx 3 min.
- Aspirar el sobrenadante y la placa todo el HPMC / RBC en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
- Cultivar las células en placas a 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado. Alimentación células sembradas por la adición de 15 ml de medio de cultivo completo en los días 3 y 5 sin necesidad de retirar los medios gastados. HPMC puede ser cultivadas durante 5-7 días antes de la división.
- Utilice HPMC de bajo paso (hasta el paso 2) en todos los experimentos para minimizar desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio de preferencia con un objetivo de 20x con capacidad de contraste de interferencia diferencial de plástico o objetivo 4-20x con contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste en el microscopio) para tomar todas las imágenes de las células, y un objetivo de 10x () en campo claro para analizar inmunohistoquímica 3,3'-diaminobencidina (DAB) tinción.
- Confirme que la HPMC son cúbicas y expresar citoqueratina 8 y vimentina realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3 A, C, E).
- Para aislar HPMC, transferir el tejido picado en 50 ml tubos cónicos y esperar 1 min para los trozos sólidos floten a la parte superior (Figura 2 C + D). HPMC y los glóbulos rojos (RBC) estarán presentes en el líquido en la parte inferior. Usar una pipeta para eliminar el líquido de la parte inferior del tubo y en un nuevo tubo cónico. Girar el líquido hacia abajo a 0,5 xg durante 3 min y aspirar el sobrenadante del sedimento de HPMC / RBC.
- NOF aislamiento 8
- Preparar 10 ml de un stock de solución de colagenasa de tipo III (10x) mediante la combinación de una mezcla 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividad / ml de colagenasa de tipo III: actividad 714 unidades / ml de hialuronidasa en PBS.
- Agitar el tejido epiplón picada que permanece después del aislamiento HPMC en 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas en 10 ml de el tipo de solución 10x colagenasa III diluido en medio libre de suero (DMEM con 1% de MEM vitaminas [93 mg / l], 1% aminoácidos no esenciales MEM [81.4 mg / L], 1% penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]). Tejido digerido se verá opaca y puede tener algunos escombros fibrosa (Figura 2E).
- Centrifugar las células NOF solución que contiene en suspensión a 0,5 × g durante 3 min a RT, aspirar el sobrenadante y el sedimento de la placa en un matraz de 75 cm 2 en 13 ml de medio de crecimiento completo.
- Retire los viejos medios y reemplazar con 15 ml de medio de cultivo completo fresco después de 24 horas. NOF puede cultivarse durante 1-3 días antes de la división. Nota proliferación de la NOF cesará cuando las células alcanzan la confluencia.
- Confirme que los fibroblastos humanos primarios son células planas, alargadas y expresan vimentina pero no citoqueratina 8 realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3B, D, F). Utilice NOF bajo paso para experimentos (idealmente antes paso 3) para reducir al mínimo desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio con un objetivo de 20x con plástico capacidades DIC para la toma de todas las imágenes de fase de las células,y un objetivo de 10x en campo claro para analizar tinción inmunohistoquímica DAB.
2. Revestimiento del organotípicos Cultura 8
- NOF de lanzamiento del matraz de cultivo 75 cm de un enjuague con 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 25 mM durante no más de 5 min. Neutralizar la tripsina con al menos 3 veces el volumen de medio de crecimiento completo.
- Transferencia de las células tratadas con tripsina en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 0,5 gx 3 min. Eliminar el sobrenadante y llevar a las células una copia de seguridad en 5 ml de medio de cultivo completo. Utilice un contador de células para contar las células recuperadas del matraz de cultivo.
- Diluir las células en el volumen apropiado de medio de crecimiento completo a la placa 2.000-4.000 NOF por 100 l en una placa de negro, de fondo transparente, de 96 pocillos. Añadir 0,5 g / 100 l de colágeno de cola de rata I de la mezcla de células antes de la siembra. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 4 horas, o hasta que las célulasa adherirse a la superficie de la placa.
- Soltar HPMC del matraz de cultivo usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1 y 2.2. Diluir las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento completo a la placa de 10.000-20.000 HPMC por cada 50 l en la parte superior de la NOF ya chapada con colágeno I en placas de 96 pocillos. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 18 horas antes de comenzar los experimentos.
- Cultura proteína fluorescente verde (GFP) expresando las células del cáncer de ovario HeyA8 en medio de crecimiento completo. Células de cáncer ovárico HeyA8 están etiquetados con fluorescencia mediante la expresión de un vector lentiviral que expresa copépodos CGFP (Pcdh-CMV-MCS-EF1). Células de cáncer ovárico HeyA8 deben ser 80-90% de confluencia en el día de uso (fase de crecimiento logarítmica). Liberar células de la placa de cultivo y contar usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1-2.2 para las células primarias.
- Permitir que las células de cáncer de ovario se recuperen en medio de crecimiento completo para 15-20 minutos a 37 ° C en untubo cónico con la tapa sellada débilmente.
3. Ensayo de adhesión 8
- Después de la recuperación, sedimentar las células de cáncer de ovario haciendo girar durante 3 min a 0,5 × g y luego eliminar el sobrenadante y diluir las células en el volumen apropiado de medio libre de suero para lograr una concentración de 50.000 células / 100 l.
- Invertir las placas de 96 pocillos con los cultivos organotípicos / NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 100 l de la suspensión de células de cáncer en medio libre de suero a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 30 min a 4 h.
- Invierta la placa de 96 pocillos para eliminar los medios de comunicación y las células no adherentes. Utilice una pipeta multicanal a baja potencia para pipetear con cuidado y suavidad 100 l de PBS en cada pocillo, e invertir la placa de nuevo. Repita el PBS lavar una vez más.
- Invertir para eliminar PBS y añadir 100 l de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Permita que la plancha reposar por 20 millasn para fijar las células. Después de 20 minutos, invierta la placa y añadir 100 l de PBS.
- Tenga en cuenta que la fluorescencia total de pozos puede ser reportada o el número de células puede ser cuantificado. Para la cuantificación, primera placa de una curva estándar por duplicado utilizando células HeyA8 a una concentración de 1 millón de células / ml.
- Hacer la curva estándar desacelerándose 1 millón de células, la eliminación de los medios de comunicación, y que les permite sentarse en 1 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 min.
- Células girar de nuevo y traer en 1 ml de PBS (células de recuento para confirmar 1.000.000 / ml de concentración). Plate 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, y 0 células en cada pocillo en duplicado, y añadir PBS para un volumen total final de 50 l en cada pocillo.
- Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm), escalando altos pozos (50.000 en la curva estándar). Utilice la curva estándar para calcular el número de células de cáncer de ovario se adhirieron a la organotypcultura ic en cada pocillo (Figura 4A-C).
4. Ensayo de proliferación de 10
- Después de que las células de cáncer de ovario se recuperan (consulte los pasos 2.5 y 2.6 arriba), sedimentar las células por centrifugación durante 3 min a 0,5 xg y luego diluir las células en el volumen apropiado de 1% de FBS medios (DMEM con 1% de FBS, 1% MEM vitaminas [93 mg / l], 1% MEM no esenciales aminoácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]) para lograr una concentración de 4.000 células / 150 l.
- Invierta la placa de 96 pocillos con los / cultivos organotípicos NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 150 l de la suspensión de células de cáncer en el 1% de medios FBS a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 72 hr.
- Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente una vez al día (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm) para evaluar la proliferación relativade las células. Continuar el ensayo durante 96 horas, cambiando los medios de comunicación a las 48 h (Figura 5A-C). Tenga cuidado de no molestar a la cultura al cambiar los medios de comunicación (invirtiendo la placa es preferible).
5. Invasión Ensayo 8
- Antes plateando la cultura 3D, agregue el colágeno de cola de rata 7,5 g I en 200 l de PBS a un 24 pocillos de inserción placa de cultivo (8 micras de tamaño de poro). Deje que la placa incubado O / N, a continuación, retire con cuidado la PBS con una pipeta inmediatamente antes plateando la cultura organotípico HPMC / NOF en los insertos recubiertos con colágeno (paso 2 anterior).
- Preparar las células de cáncer de ovario que en el paso 3.1. Para la placa de las células de cáncer de ovario en los cultivos organotípicos en los insertos, utilice cuidadosamente una pipeta para eliminar el exceso de medios de comunicación de la parte superior de los insertos. Añadir 100 l de la suspensión de células cáncer de ovario en medio libre de suero a cada pocillo.
- Añadir 750 l de medio de cultivo completo en el pozo por debajo de la inserción para inducir las células de cáncer eninvasión en los cultivos organotípicos. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 24 hr.
Nota: células de cáncer ovárico que invaden el cultivo organotípico cruzará el inserto y permanecer en el lado inferior del inserto. - Después de 24 horas, sujete el inserto con pinzas y brevemente enjuague en un vaso de precipitados de PBS, a continuación, mueva el inserto en un pozo vacío. Frote la parte superior de cada inserto con ambos lados de un hisopo de algodón para un total de 1 min. Colocar rápidamente el inserto en una placa que contiene 750 l de paraformaldehído al 4% en cada pocillo. Permitir que cada inserto para sentarse en paraformaldehído durante 10 min antes de transferir los insertos en los pozos llenos con 750 l de PBS.
- Ver las células invadidas (adheridas y se fija a la parte inferior de inserciones) con un microscopio con un aumento de 2,5 veces. Cuando todo el bien está dentro del campo de visión, ajustar la ampliación de 10x y tomar 5 fotos, uno cerca del centro y 1 en cada cuadrante del pozo, evitandotomando imágenes que están demasiado cerca de los bordes. Siga el mismo patrón para cada pozo.
- Utilice el programa del fabricante para contar el número de células en cada imagen para obtener un número medio de células invadidas por campo en cada pocillo (Figura 6A-C) de acuerdo con su protocolo.
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Representative Results
El cultivo organotípico se ensambló mezclando primero los fibroblastos humanos primarios con colágeno de tipo I y luego superponiendo esta cultura con 5 veces el número de células mesoteliales. El cultivo se incubó durante al menos 18 horas antes de que se añadieron células de cáncer de ovario para estudiar la adhesión, invasión o proliferación. Cada ensayo se repitió con múltiples (n = 3-5) culturas 3D obtenidos de diferentes pacientes y numerosos pozos fueron probados en cada condición para la adhesión (n = 5), la proliferación de ensayos (n = 5) y la invasión (n = 3) . Células de cáncer ovárico se adhirieron a la cultura organotípicos 3D después de 4 h (Figura 4), proliferaron en el cultivo después de 72 hr (6 veces el tiempo de duplicación celular HeyA8) (Figura 5), e invadieron después de 24 hr (Figura 6). La adhesión, la proliferación y la invasión de células de cáncer de ovario HeyA8 era dependiente de integrina (Figura 4-6). Específicamente, el péptido RGD y el bloqueo de antibodies a alpha 5-integrina, β 1-integrina α y β 3 v integrina inhibió la adhesión celular de cáncer de ovario a la cultura organotípicos, mientras que el péptido, anticuerpo y control RAD ß 4-integrina anticuerpo no lo hizo (Figura 4) 10. En el ensayo de proliferación, el péptido RGD y el bloqueo de anticuerpos a alfa 5 - 1 y ß-integrina la proliferación de células de cáncer de ovario inhibido en el cultivo organotípico, mientras que el péptido RAD, el control de anticuerpo, α v ß 3-integrina anticuerpo y ß 4-integrina anticuerpo no lo hizo (Figura 5). En el ensayo de invasión, el péptido RGD y anticuerpos bloqueantes de alfa 5 - y beta 1 integrina inhibido, mientras que la α v β 3 integrina anticuerpos mejora la invasión de células de cáncer de ovario a través de la cultura organotípico 3D. El péptido RAD, anticuerpo de control, y β4-integrina anticuerpo no afectó la invasión (Figura 6). En raras ocasiones, estos ensayos serán-un interpretable (es decir, α-integrina 5 anticuerpo bloqueante no inhibir la adhesión, la proliferación o la invasión en comparación con el anticuerpo de control). Anteriormente, hemos encontrado que ciertos cultivos organotípicos se lava después de cambiar los medios de comunicación o de lavado PBS durante los ensayos. Además, si las células de cáncer de ovario están muertos o no se han recuperado lo suficiente de la tripsina digerir integrinas re-express, los ensayos no funcionarán. Por lo tanto, siempre es importante tener un control positivo y negativo en cada ensayo lo que la calidad del cultivo organotípico y ensayo de células de cáncer de ovario se puede evaluar. Como se muestra aquí, el péptido RGD, alfa 5-integrina y ß 1-integrina anticuerpos bloqueantes todo inhibe la adhesión de células de cáncer de ovario, la invasión y la proliferación a la cultura organotípicos y podría ser utilizado como con positivocontroles en ensayos futuros. Del mismo modo, β 4 integrina anticuerpo bloqueante no afectó la adhesión de células de cáncer de ovario, la invasión y la proliferación a la cultura organotípicos y podría ser utilizado como un control negativo en ensayos futuros.
Figura 1. Histología de metástasis omental humana. Hematoxilina y eosina de (A) epiplón humano normal (MC, células mesoteliales, Fib, fibroblastos, Adi, adipocitos) y (B) la metástasis del cáncer de ovario omental (Met, metástasis de cáncer de ovario). Bar en paneles = 100 micras de longitud. (C) Esquema del modelo organotípico 3D de la metástasis del cáncer de ovario imitando temprana metástasis de las células de cáncer de ovario a la superficie del omento humano. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 2. Aislamiento de células humanas primarias omental. (A) Un pedazo de epiplón se recoge en la cirugía en PBS y se transporta al laboratorio. El tejido se sedimentaron a 0,5 xgx 3 min y se transfirió a PBS fresco. (B) La pieza de epiplón se transfiere a una placa de Petri de 10 cm, se lava con PBS, y escalpelos se utilizan para cortar el epiplón en trozos pequeños (0,5 cm 3 ). (CD) Las piezas de tejido se recogen usando una pipeta serológica de 25 ml y se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml para el aislamiento de HPMC. PBS se retira del tubo y HPMC se sedimentan desde el PBS un xg 0,5 a 37 ° C. (MC, células mesoteliales, RBC, las células rojas de la sangre, Fib, fibroblastos) (E) NOF están aislados de la remaini tejido omental ng después de la incubación con hialuronidasa y colagenasa de tipo III. La imagen muestra el tejido después de una digestión de 6 a 12 hr. NOF se sedimentó por centrifugación a 0,5 xg a temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Caracterización de HPMC y NOF aislado a partir de tejido humano epiplón. Imágenes de contraste de fase de células mesoteliales (A) (HPMC) y fibroblastos (NOF) (B) después del aislamiento a partir de tejido epiplón. HPMC humano manchado para (C) citoqueratina 8 y (E) vimentina. NOF humano manchado de (F) vimentina, pero no mancha para (D) citoqueratina 8. Bar = 100 m, se aplica a todos los paneles.ftp_upload / 53.541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. adhesión celular El cáncer de ovario a la cultura organotípicos es dependiente de integrina. De ensayo (A) La adhesión se realizó con 50.000 células de cáncer de ovario marcados con fluorescencia, las células-HeyA8, como se describe en la sección de Protocolo. Se reporta el total de fluorescencia en cada pocillo. El anticuerpo de control IgG de ratón es. Cada barra representa la media +/- error estándar media. Representante (B) de contraste de fase y (c) imágenes fluorescentes de la adhesión de células de cáncer de ovario a la cultura organotípicos. Bar = 100 m, se aplica a los dos paneles. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. proliferación celular El cáncer de ovario en el cultivo organotípico es dependiente de integrina. De ensayo (A) La proliferación se realizó con 4.000 células de cáncer de ovario marcados con fluorescencia, las células-HeyA8, como se describe en la sección de Protocolo. Se informa el número total de células. El anticuerpo de control IgG de ratón es. Cada barra representa la media +/- error estándar media. Fusionado de contraste de fases y las imágenes fluorescentes de la proliferación de células de cáncer de ovario en el cultivo organotípico en (B) y 24 (C) 96 hr. Bar = 100 m, se aplica a los dos paneles. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6. invasión El cáncer de ovario a través del cultivo organotípico es dependiente de integrina. De ensayo (A) La invasión se realizó con 40.000 células de cáncer de ovario marcados con fluorescencia, las células-HeyA8, como se describe en la sección de Protocolo. Se informa el número de células invasoras (movido a través de la cultura 3D para la parte inferior de la pieza de inserción). El anticuerpo de control IgG de ratón es. Cada barra representa la media +/- error estándar media. (B) de contraste de fases y (C) imágenes fluorescentes de las células de cáncer de ovario que invadieron a través de la cultura organotípicos. Bar = 100 m, se aplica a todos los paneles. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se estableció un modelo organotípico del microambiente peritoneal para evaluar la función individual y colectiva (s) de ambos los componentes celulares y innatas del microambiente en la diseminación del cáncer de ovario. Se proporcionan los protocolos específicos para el chapado y personalizar el cultivo organotípico 3D para investigar la adhesión de células de ovario cáncer, la proliferación y la invasión. Células epiplón humanos primarios mesoteliales y fibroblastos fueron aisladas de los pacientes y se usan en una pronta aprobación de preservar la morfología normal y variación paciente. En este modelo, los fibroblastos normales y omental ECM (tipo típicamente colágeno I) se dispusieron en capas con una monocapa de células mesoteliales humano primario. Este modelo histológicamente imita el revestimiento peritoneal, y nos permite recrear y examinamos eventos clave en la metástasis del cáncer de ovario, incluyendo la adhesión de células de cáncer de ovario, la proliferación y la invasión 8,27.
Anteriormente, limitados modelos 3D tienenha establecido para investigar las interacciones de ovario cáncer con el microambiente 13,14,21-25, mientras que este modelo organotípico 3D es la primera para recrear la construcción de la mesotelial-revestimiento de la cavidad peritoneal. El omento humano se obtiene de los pacientes varían en edad y salud. La salud del tejido afecta directamente a las técnicas celulares y aislamiento de fibroblastos mesoteliales. El tejido sano aparece de color más claro, con muy pequeños lobulillos (1.3 mm) en comparación con el tejido que es más de color naranja con grandes lóbulos presentes (> 5 mm). La mayoría de HPMC se desprenden en el PBS inicial ya que el tejido se realiza a partir de la cirugía para el laboratorio. Cuanto más sano el tejido, sin embargo, el más resistente HPMC son a la eliminación, y lavados con PBS adicionales y las posiciones 1: 1 PBS: tripsina digestión puede resultar en un cultivo mixto de células de HPMC y NOF. En los tejidos sanos, algunos HPMC puede sobrevivir a la colagenasa 6-hr digerir, y un compendio O / N en solución de colagenasa 1x en su totalidadSe recomienda medios de cultivo para obtener un cultivo puro NOF. Tenga en cuenta el epiplón debe ser colocado inmediatamente en PBS después de la retirada o no HPMCs será recuperado a partir de tejido. Además, si el tejido se almacena en PBS durante un período prolongado de tiempo (> 2 hr) a temperatura ambiente o en el refrigerador, el número de HPMCs viables aisladas se reduce significativamente.
Una proporción de 1: 5 de los fibroblastos para células mesoteliales se platea para imitar la relación de los fibroblastos para células mesoteliales in vivo 8. Es importante tener en cuenta que el tamaño de las células mesoteliales aisladas varía de paciente a paciente y esto puede requerir el ajuste de la relación de chapado. Las células mesoteliales de algunos pacientes son mucho más pequeñas; en estos casos, placa doble del número de células mesoteliales (20.000). Además, las células primarias se usan siempre en un (1-2) pasaje temprano para preservar la morfología. Las células mesoteliales pueden ser células mesoteliales cúbicas o delgadas, y cúbicas se vuelven más delgadasa medida que se pasan, o con una mayor exposición a los medios acondicionados de las células de cáncer de ovario o el tratamiento con TGF 10.
Células de cáncer ovárico pueden adherirse e invadir a través de las células mesoteliales mesenquimales más eficientemente que las células mesoteliales epiteliales de los mismos o diferentes pacientes. Por lo general, hemos creado la cultura organotípico durante 18 horas antes de comenzar los ensayos funcionales con células de cáncer de ovario. Las más largas las células mesoteliales y fibroblastos se cultivan juntos, más tiempo que tienen que secretar diferentes proteínas, incluyendo las proteínas ECM, que pueden afectar el comportamiento de las células de cáncer de ovario. Otro factor importante a tener en cuenta a la hora de realizar estos ensayos es el nivel de la tasa de proliferación diferencial y expresión de proteínas asociadas con el aumento de la adhesión, invasión y / o proliferación, incluyendo integrinas, proteasas, y factores de crecimiento, en cada línea celular de cáncer o humano primaria tipos de células cancerosas.El tiempo y el número de células cancerosas utilizado en cada uno de los ensayos funcionales con la cultura organotípicos necesita ser optimizado para cada línea celular de cáncer o tipo de célula de cáncer primario. Por ejemplo, en el ensayo de adhesión descrito, las células de cáncer de ovario podrían ser invadir la cultura durante este tiempo.
Es evidente que este modelo organotípico no contiene todos los componentes del microambiente peritoneal normales como inmune, endoteliales y células adipocitos. Además, el modelo depende de la accesibilidad y disponibilidad de tejido humano primordial, ya que las células primarias sólo se utilizan dentro de los tres primeros pasos. Sin embargo, el modelo tiene muchas ventajas en el uso de células humanas primarias y la incorporación de múltiples tipos de células que se han demostrado jugar un papel importante en la metástasis. Este modelo se ha utilizado para investigar la regulación de genes y proteínas en los tipos de células individuales (es decir, las células cancerosas, mesotelial normal o células de fibroblastos) después deco-cultivo. En particular, las funciones de c-Met 28, MMP-2 9,29, E-cadherina 30, β 1-integrina 10, ß 3-integrina 16, alfa 5-integrina 10,31, 10 y fibronectina en la metástasis temprana tienen ha explorado. Además, el modelo tiene el potencial de expandirse para incluir más tipos de células, tales como la incorporación de los adipocitos 6. El modelo ha sido modificado y miniaturizado para su uso en el cribado de alto rendimiento para identificar inhibidores de molécula pequeña de células de cáncer de adhesión / invasión de ovario a la microambiente peritoneal 27. Las aplicaciones futuras de este modelo incluyen la incorporación de células inmunes en el ensayo, incluyendo los macrófagos para estudios mecanísticos y cribado de alto rendimiento. En resumen, el cultivo celular organotípicos ofrece un modelo útil para evaluar las interacciones entre el microambiente peritoneal humana y células de cáncer de ovario, con el goal de dilucidar importantes mecanismos moleculares de la difusión y la progresión de la enfermedad, y la identificación de posibles dianas terapéuticas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
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