Abstract
القيد الرئيسي للتحقيقات استنادا NMR هو حساسية منخفضة. وهذا يدفعنا لمدة التحصيل طويلة، وبالتالي منع قياسات الرنين المغناطيسي في الوقت الحقيقي من التحولات الأيضية. فرط الاستقطاب عبر حل إدارة التخطيط الوطني تلتف جزء من حساسية القضايا بفضل مغنطة النووية خارج نطاق التوازن الكبيرة الناجمة عن نقل تدور الاستقطاب الإلكترون إلى النواة. إشارة الرنين المغناطيسي النووي العالية التي تم الحصول عليها يمكن استخدامها لمراقبة التفاعلات الكيميائية في الوقت الحقيقي. الجانب السلبي من hyperpolarized NMR يقيم في إطار ضيق الوقت المتاح لاكتساب إشارة، التي عادة ما تكون بناء على أمر من زيادة ونقصان النووي الطولي ثابت وقت الاسترخاء، تي 1، أو، في الحالات الملائمة، بناء على أمر من ثابت وقت الاسترخاء المرتبطة والقميص للدولة من نوى جانب، T LLS. امتصاص الخلوي من جزيئات الذاتية ومعدلات التمثيل الغذائي يمكن أن توفر معلومات أساسية عن نمو الورم والاستجابة للدواء. نووقد أظهرت دراسات الرنين المغناطيسي النووي hyperpolarized السابقة merous ملاءمة البيروفات باعتبارها الركيزة التمثيل الغذائي لرصد النشاط الأنزيمي في الجسم الحي. ويوفر هذا العمل وصفا مفصلا لإعداد التجريبية والأساليب اللازمة لدراسة التفاعلات الإنزيمية، ولا سيما معدل التحويل البيروفات إلى لاكتات في وجود نازعة اللاكتات (LDH)، التي كتبها NMR hyperpolarized.
Introduction
الاستقطاب النووي الحيوي (إدارة التخطيط الوطني)، 1،2 تقنية تهدف إلى تعزيز الاستقطاب تدور النووي، أي عدم التوازن بين 'حتى' و 'أسفل' السكان تدور (P = [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓])، لأول مرة في عام 1950. يدور النووية مثل 13 C يمكن استقطاب ما يصل إلى 10 P = -1 في ظروف مواتية، وعادة عند درجة حرارة في حدود 1 K وفي مجال مغناطيسي من 3،357 T. 3،4 جاء اختراق للتطبيقات البيولوجية في أوائل عام 2000 مع تطوير حل إدارة التخطيط الوطني الذي يتكون في حل عينات الاستقطاب المجمدة في السخونة المياه مع الحفاظ على مستوى الاستقطاب النووي ارتفاع حصلت على درجة حرارة منخفضة. 5 ومما يعزز NMR إشارة السائل للدولة بمعامل 10 3 -10 4 مقارنة مشتركحراريا الاستقطاب الظروف RT NMR. بالتالي يوفر حل إدارة التخطيط الوطني وسيلة لقياس البيوكيميائية معدلات التفاعل غير جراحية في الموقع في الوقت الحقيقي، مما يسمح للديناميات الرصد التي كتبها NMR مع القرار الزماني من 1 ثانية أو أقل 6 - 10 كما أصبح من الممكن الكشف عن التحاليل في تركيزات منخفضة جدا (11).
بين طرائق التصوير الجزيئي غير الغازية، hyperpolarized NMR هي التقنية الوحيدة التي تتيح قياس في وقت واحد الركيزة ومنتجات الأيض في الوقت الحقيقي. وكان في استقبال إدارة التخطيط الوطني حل بحماس في مختلف المجالات العلمية بدءا من في المختبر NMR إلى التصوير بالرنين المغناطيسي السريري 12 و التطبيقات الواعدة ترتبط في الموقع رصد عملية التمثيل الغذائي. 13،14 القيد الرئيسي من حل إدارة التخطيط الوطني هو أنه، بعد مرور فترة زمنية على ترتيب خمس مرات في وقت الاسترخاء الطولي المستمر تي 1، وتعزيز القطبيةيتم فقدان سعودة. ولذلك فمن الضروري استخدام جزيئات تحمل يدور النووية واظهار تي طويلة نسبيا 1. تمديد فترة زمنية من تعزيز الاستقطاب، ببطء الاسترخاء الدول تدور النووية، والمعروفة باسم دول طويلة الأجل (LLS)، ويمكن استخدام 15 - 17 LLS لا تعير اهتماما للداخل الزوج تفاعل ثنائي القطب-ثنائي القطب، وذلك من مميزة وقت الاسترخاء ثابت، T LLS، يمكن أن تكون أطول بكثير من تي 1. 18 متوسط عمر مغنطة عشرات من دقيقة وتصل إلى 1 ساعة وبالتالي من الممكن الحصول عليها، 19،20، وقد اقترح LLS لكلا التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي (MRS) والتصوير بالرنين المغناطيسي. 21
النقاط الرئيسية التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل بعناية لدراسة معدلات التفاعل الأنزيمية التي كتبها hyperpolarized NMR هي: (أ) تحقيق أقصى قدر من الاستقطاب الحالة الصلبة و (ب) تقليل فقدان الاستقطاب أثناء نقل الحل hyperpolarized منالمستقطب للمطياف الرنين المغناطيسي النووي. توضح هذه المقالة التكيف من حل إدارة التخطيط الوطني أجهزة وحقن النظام حسب الطلب لدراسة التفاعلات الأنزيمية. وسوف تظهر خصائص وأداء الإعداد مع الركيزة hyperpolarized المعروفة والمستخدمة على نطاق واسع [1- 13 C] البيروفات. الأسباب الرئيسية لهذا الاختيار هي، أولا، طويلة بشكل طبيعي 13 C وقت الاسترخاء الطولي لها (T 1> 50 ثانية في حقول مغناطيسية عالية ودرجات حرارة فوق 293 ك) الذي يسمح ردود الفعل رصد خلال عدة دقائق، وثانيا، دورها المحوري في سرطان الأيض. 13،14 طريق حل إدارة التخطيط الوطني NMR ونظام حقن وضعت العرف، وأكسدة البيروفات يحفزه نازعة اللاكتات (LDH) يمكن رصدها في وجود مجموعة أولية من لاكتات لا تحمل علامات 9،22 أو مع أي اللاكتات لا تحمل علامات وأضاف كما هو موضح هنا. وقد تبين أن [1- 13 C] إشارة اللاكتات يقاس في السادسفو (بما في ذلك خلايا) بعد حقن hyperpolarized [1- 13 C] البيروفات يرجع أساسا إلى تبادل التسمية سريع بين البيروفات واكتات بدلا من إنتاج اللاكتات. 6
نقدم هنا الإنتاج في الوقت الحقيقي من [1- 13 C] اللاكتات من hyperpolarized البيروفات [1- 13 C] حقن في أنبوب الرنين المغناطيسي التي تحتوي LDH ولكن في البداية لا اكتات.
وصف النظام
هناك نوعان من الأجزاء الرئيسية في الإعداد حل إدارة التخطيط الوطني (الشكل 1): المستقطب إدارة التخطيط الوطني ومطياف الرنين المغناطيسي النووي. العنصر الرئيسي للالمستقطب إدارة التخطيط الوطني هو ناظم البرد لتبريد العينة إلى حوالي 1 K في حمام الهليوم ضخ. يتم إدراج ناظم البرد في 3.35 تي فائقة التوصيل المغناطيس ولديه هندسة يضمن الحصول على عينة الاستقطاب في مركز التساوي من المغناطيس (الشكل 1). داخل ناظم البرد، العينة (أ) تحيط به لفائف NMR (ب)، لقياس الاستقطاب بuildup، الواردة في تجويف الميكروويف overmoded (ج). يتم الاحتفاظ العينة كلها في درجة حرارة منخفضة في حمام الهليوم ضخ (د) والمشع مع أفران ميكروويف من خلال الدليل الموجي. تتم إدارة النظام برمته من قبل البرامج حسب الطلب (الشكل 2D).
الأجهزة والمعدات المبردة اللازمة لأداء إدارة التخطيط الوطني وحل لاحق لا يزال التحدي التكنولوجي. ووضعت إدارة التخطيط الوطني ناظم البرد الجديد 23،24 واختبار لتحديد عروضه المبردة ثم الأمثل لسرعة للتهدئة، الهيليوم عقد لمرة وعموما الحد الأدنى من استهلاك الهيليوم خلال العملية.
يتكون ناظم البرد من جزأين. الجزء الأول من ناظم البرد هو ديوار العزل (الشكل 2A) التي يمكن فصلها تقريبا في الجزء العلوي (أ) الاحتفاظ الذيل، أو فضاء العينة (ب)، وفراغ الغرفة الخارجي (أفك) في ظل فراغ عالية والإسكان شاشات الأشعة (ج). الجزء الثاني من ناظم البرد هو الميناء الرئيسي فيسرت (الشكل 2B)، وضعت في ديوار العزل، حيث تدار جميع الأنظمة التدفق. الهيليوم السائل قادمة من ديوار التخزين الخارجي من خلال خط نقل (أ)، في المرحلة الأولى مكثف في فاصل (ب)، وغرفة وسيطة تستخدم على حد سواء للحفاظ على الجزء العلوي من البرد ناظم البرد وإزالة الهليوم تبخرت أثناء عملية النقل. يخفض ضغط الفاصل عن طريق ضخ من خلال الشعيرات الدموية (ج) ملفوفة حول الجزء العلوي من ناظم البرد. يستخدم تدفق الهليوم البارد في هذه الشعرية لتهدئة يحير (د) وشاشات الإشعاع في ديوار العزل (أفك). يتم وضع عينة والاستقطاب في فضاء العينة. توصيل فضاء العينة إلى فاصل من خلال شعري آخر (ه)، ملفوفة حول ذيل إدراج ناظم البرد الرئيسي. هذا شعري يمكن فتحه أو إغلاقه من خلال صمام إبرة تشغيلها يدويا من الخارج.
لتحقيق درجات الحرارة المنخفضة التي استخدمت خلال العلاقات العامة إدارة التخطيط الوطنيocess، يحتاج الهليوم السائل التي سيتم جمعها في فضاء العينة ناظم البرد ويخفض ضغط على المجموعة ميللي بار. يتم إجراء العمليات اللازمة لتشغيل ناظم البرد من خلال نظام ضخ معقدة نوعا ما مع ثلاث مجموعات من مضخات ومراقبتها وتشغيلها في أماكن مختلفة مع الأدوات الإلكترونية والكهربائية الميكانيكية (الشكل 2C). يحتاج الأيتام والأطفال الضعفاء ناظم البرد أن تضخ إلى فراغ عالية من قبل نظام الضخ الأولى. ويتكون هذا النظام من مضخة توربو الجزيئي مدعومة مضخة دوارة (أ). يتم نقل الهليوم السائل من ديوار التخزين (ب) من خلال خط مدخل نقل ناظم البرد إلى فاصل ناظم البرد. فاصل لديه منفذ توصيل مجموعة ضخ الثاني. وتتألف هذه المجموعة من 35 م 3 / ساعة مضخة الغشاء (ج). هذا الخط يسمح بإزالة غاز الهيليوم المغلي أثناء نقل من ديوار وأثناء فاصل التبريد. الهليوم السائل التي تم جمعها في فاصل ثم يمكن نقلها إلى فضاء العينة من خلال غطاءأنابيب illary المذكورة أعلاه. لنقل الهليوم السائل من فاصل لفضاء العينة وبعد ذلك إلى خفض ضغط فضاء العينة لميللي بار مجموعة، نظام ضخ الثالث يتكون من 250 م 3 / ساعة جذور مضخة مدعومة 65 م 3 / مضخة دوارة ساعة (د) متصلة ناظم البرد من خلال صمام فراشة اليدوي (ه).
يتم التحكم في جميع عمليات نظام فراغ وينظم عبوة مصنوعة خصيصا الكهربائية و(و). يتحكم هذا الجهاز اتصالات خط فراغ بين فاصل ناظم البرد (ز) وفضاء العينة (ح) وسائل وأنظمة الضخ الثالثة / ثانية (ج، د)، وزجاجة الهيليوم المضغوط (ط) و الخارج. التواصل بين (و) و الخارج يمر عبر صمام باتجاه واحد (ي). يتم التحكم في جهاز الكهربائية الهوائية (و) وكذلك جميع معلمات النظام والأجهزة حل وتشغيلها من قبل جهاز الكتروني لUSB ربطه حسب الطلب مع جهاز كمبيوتر مشترك. وأخيرا كل نظام، من خلال الإلكترونيةالجهاز، يديره حسب الطلب برنامج مستقل (الشكل 2D) حيث بدأت العمليات ذات الصلة من خلال واجهة استخدام أزرار البرامج.
لإدارة العينات وقياس NMR إشارة تراكم في الحالة الصلبة وتستخدم سلسلة من إدراج (الشكل 3A). لإعداد ناظم البرد لالاستقطاب، ضع العينة (أ) إدراج الرئيسي، في ناظم البرد. يتم توفير إدراج عينة الرئيسي مع لفائف NMR (ب) وضعت داخل تجويف الميكروويف مطلية بالذهب overmoded. قبل تجميد الركيزة التي تحتوي على حل لأن يكون مستقطبا (حل الاستقطاب) في درجة حرارة النيتروجين السائل في وعاء العينة المناسبة ووضعها في أسفل نهاية صاحب العينة الألياف الزجاجية (ج). حرك صاحب العينة في العينة إدراج الرئيسي للوصول إلى مركز التساوي المغناطيس. إدراج الدليل الموجي مطلية بالذهب (د) في صاحب العينة. الدليل الموجي يسمح الميكروويف ولدت من مصدر الميكروويف الخارجي للسفر بأقل الخسائر رس العينة.
البرنامج حسب الطلب للإدارة ناظم البرد يعالج تلقائيا، عند النقر على زر واجهة المقابلة، عمليات مختلفة مثل تباطوء (يتم خفض درجة حرارة ناظم البرد قريبة من درجة حرارة الهيليوم السائل)، وملء (شغل ناظم البرد مع الهيليوم السائل إلى مستوى محدد مسبقا )، خطوة إضافية من التبريد إلى T ≈ 1 ك (يتم ضخ حمام الهيليوم السائل إلى تحقيق أدنى درجة حرارة ممكنة)، الضغط (هو الضغط على ناظم البرد قليلا أعلى من الضغط غرفة في P = 10-30 مليبار للسماح افتتاح ناظم البرد تخلو من المخاطر من تلوث ناظم البرد جوا) والحل (الإجراء التلقائي لإذابة العينة إدارة التخطيط الوطني ونقل الحل hyperpolarized مما أدى إلى موقع القياس، أي مطياف الرنين المغناطيسي).
يتم تنفيذ الاستقطاب تشعيع عينة مع أفران ميكروويف في 94 غيغاهرتز (في مجال استقطاب ب 0 T إدارة التخطيط الوطني، حيث T إدارة التخطيط الوطني هي المرة الاستقطاب تراكم. تي إدارة التخطيط الوطني هو من نفس الترتيب من حيث حجمها ووقت الاسترخاء الطولي للنواة الهدف في الحالة الصلبة في مجال معين ودرجة الحرارة. في كل تجاربنا والاستقطاب العينة لأكثر من 5 ر إدارة التخطيط الوطني.
في نهاية الوقت الاستقطاب، وعينة لابد من حله في حل RT من أجل استخدامها لقياس النشاط الأنزيمي. أثناء عملية حل، يتم دفع 5 مل من السخونة D 2 O من المرجل من إدراج حل (الشكل 3B) بواسطة غاز الهيليوم المضغوط (P = 6-8 بار) للوصول إلى عينة تعزيز إدارة التخطيط الوطني وحله. يتم الضغط على حل hyperpolarized الناتجة من إدراج حل من غاز الهيليوم المضغوط، من خلال منفذ إدراج حل (الشكل 3C-ب 23 الوقت اللازم لنقل عينة من المستقطب إدارة التخطيط الوطني إلى الموقع مطياف الرنين المغناطيسي النووي حوالي 3 ثانية.
تتم عملية حل باستخدام إدراج حل (الشكل 3B). يتكون إدراج حل لتجميع الالكترونيات هوائية (أ)، عصا من ألياف الكربون (ب) التي تحتوي على أنابيب اتصال بين المرجل في الجمعية الهوائية وخزانة حاوية العينة (ج)، والذي يسمح اقتران تسرب محكم مع عينة حاوية، والعودة بها إلى مخرج. يتم استخدام التجميع الكهربائية الهوائية (الشكل 3C) لإنتاج وحملة ساخنة D 2 O عن طريق عصا من ألياف الكربون إلى الحاوية عينة ثم لاستخراج الحل hyperpolarized من ناظم البرد. تتكون الجمعية الكهربائية الهوائية صمامات تعمل بالهواء المضغوط (أ) التي تتحكم في الاتصالات بين المشاركينالهيليوم mpressed (P = 6-8 بار) خط (ب)، والمرجل (ج) حيث يتم حقن D 2 O من خلال صمام (د)، ومنفذ (ه) من خلال العصا من ألياف الكربون (و). اكتمال النظام بواسطة G الضغط، والحرارة وسلك مقاوم التدفئة في المرجل (ج)، مشغل (ح) ومربع الاتصال (ط) تستخدم ليكون واجهة النظام مع جهاز الإدارة الإلكترونية.
يتم توصيل ناظم البرد إدارة التخطيط الوطني ومطياف الرنين المغناطيسي التي كتبها خط نقل، أي أنبوب PTFE 2 مم القطر الداخلي داخل الذي يتم الضغط على حل hyperpolarized من الهيليوم المضغوط (P = 6-8 بار) عندما يتم تشغيل الحل.
يتكون تسلسل حل العمليات التالية: في ميللي ثانية 300 الأولى، يتم الضغط الفائق D 2 O إلى الحاوية عينة من أجل إذابة وحل حل المجمدة hyperpolarized. بعد ذلك، يتم استخراج الحل hyperpolarized من ناظم البرد التي كتبها متوسط بريهsurized (P = 6-8 بار) غاز الهيليوم ودفعت من خلال 2 مم أنبوب PTFE القطر الداخلي (الشكل 3C-ه) إلى موقع القياس حيث يتم تنفيذ حقن مع أي من الإجراءات الموضحة في الخطوة 6.2.1 أو خطوة 6.2 0.2.
المكون الثاني من حل الإعداد إدارة التخطيط الوطني NMR هو مطياف الرنين المغناطيسي النووي. في الإعداد الموصوفة هنا، يعمل مطياف الرنين المغناطيسي النووي في حقل B 0 = 11.7 تسلا. ويستخدم الرنين المغناطيسي التحقيق 5 مم لقياس إشارة hyperpolarized بعد حل. ويتم تشغيل مطياف الرنين المغناطيسي النووي من خلال وحدة الرنين المغناطيسي، وتستخدم لقياس الرنين المغناطيسي النووي على حد سواء الحالة الصلبة والسائلة للدولة، وXWinNMR البرامج التي توفرها الشركة. ويتألف قياس نموذجي لنبض الصعب زاوية منخفضة الوجه (إما محسوبة، لliquidstate أو غير محسوبة، لقياس الحالة الصلبة)، يليه الاستحواذ إشارة.
قياسات الحالة الصلبة إشارة الاستقطاب الحراري والاشتراكية المستمدة إدارة التخطيط الوطني،يتم تنفيذ gnal تراكم باستخدام 13 C لفائف مصنوعة خصيصا في موقع المستقطب إدارة التخطيط الوطني (الشكل 3AB) بالإضافة إلى مطياف الرنين المغناطيسي النووي. في هذه الحالة بالذات مطياف الرنين المغناطيسي النووي لا تؤدي إشارة قفل. عندما يتم إجراء قياسات الحالة الصلبة للخروج، لتجنب حدوث اضطرابات كبيرة في الاستقطاب، وينبغي أن يكون التأخير الزمني بين عمليات الاستحواذ طويلة بما فيه الكفاية، تقريبا أطول من 0.5 T إدارة التخطيط الوطني.
يتم تعريف تعزيز الحالة الصلبة كما 
أين 
هو إشارة hyperpolarized (تم الحصول عليها في الخطوة 3.3) و 
هي إشارة الحالة الصلبة (التي تم الحصول عليها في التوازن الحراري في ضخ الحرارة الهيليوم السائل في الخطوة 3.2) (الشكل 4A). هذه المعلمة دefines الاستقطاب القصوى المتاحة للتجارب الرنين المغناطيسي النووي، وذلك قبل الخسائر لا يمكن تجنبها أثناء نقل الحل hyperpolarized. يتم تنفيذ قياس مع بسيطة تسلسل نبض اكتساب باستخدام منخفضة الوجه زاوية نبض برنامج الأمم المتحدة للمعايرة. يتم تخطي معايرة نبض عادة لقياس solidstate.
ويمكن استخدام إجراء مماثل لتحديد تعزيز إشارة hyperpolarized في السائل للدولة. في هذه الحالة، وتتكون عينة وضعت في أنبوب مطياف قبل الحقن (الخطوة 6.2) 500 ميكرولتر من D 2 O. بعد حل والحقن، وهناك نوعان من المعالم الهامة لمراقبة. الأول هو تعزيز hyperpolarized في موقع NMR مطياف، 
(الشكل 4B)، حيث 
هي إشارة فقط بعد الحقن من فرط حل الاستقطاب (تم الحصول عليها في الخطوة 7.1) و 
هي إشارة الاستقطاب الحرارية (التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.2). والثاني هو وقت الاسترخاء الطولي، تي 1 (الشكل 4B، أقحم)، ويرتبط مع الركيزة وكل منتج الأيض (تم الحصول عليها عن طريق إشارات المناسب الأسي التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.1). هذه المعلمتين تحدد الحد الأدنى لتركيز الركيزة اللازمة للحصول على ما يكفي من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) ونافذة الوقت المتاح لقياس التحولات الأيضية. النسبة بين الاستقطاب الحالة الصلبة 
والاستقطاب liquidstate 
يعطي تقديرا للخسائر الاستقطاب بسبب الاسترخاء أثناء نقل حل hyperpolarized. قيمةation12 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "العرض =" 80 "/> ينبغي مراعاتها في غياب خسائر الاسترخاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ كافة تحليل البيانات باستخدام البرمجيات التجارية.
1. إعداد الحل الإستقطاب
- إعداد 2 مل من 1.12 M 13 المسمى C البيروفات الصوديوم (نا + [CH 3 -CO- 13 COO] - الركيزة) حل مخدر مع 33 ملم من TEMPOL الراديكالية (4-هيدروكسي-2،2،6،6- tetramethylpiperidin-1-oxyl، الاستقطاب وكيل) 4 في 1: 2 D 2 O / د 6 -ethanol لمدة 13 الملاحظات مئوية. يجب اتخاذ الاحتياطات المناولة نظرا لطبيعة قابلة للاشتعال من د 6 -ethanol: تنبيه.
- تحقق من أن تركيز جذري هو الأمثل من حيث الاستقطاب التي تحققت.
- تغيير طفيف في تركيز جذري في حل عند نقطة 1.1 (على سبيل المثال، إلى 30 ملم أو 35 ملم).
- تحديد تكرارا تعزيز الحالة الصلبة (راجع الخطوة 3) والعثور على تركيز المتطرف الذي يقود إلى أقصى تعزيز.
2. Polarizatأيون
- خفض درجة الحرارة ناظم البرد إدارة التخطيط الوطني من خلال إجراء التباطؤ. انقر على زر "تباطوء" على واجهة البرنامج ناظم البرد (الشكل 2D).
- جمع الهيليوم السائل في ناظم البرد إدارة التخطيط الوطني من خلال إجراءات التعبئة. انقر على زر "ملء" على واجهة البرنامج ناظم البرد (الشكل 2D).
- وضع 300 ميكرولتر من الحل الأمثل الاستقطاب من الخطوة 1.1 في حاوية عينة المتوفرة مع المستقطب إدارة التخطيط الوطني. تجميد الحاوية عينة مع عينة داخل بغمر برفق في حمام النيتروجين السائل.
- القضاء على النيتروجين السائل التي قد تكون موجودة في حاوية العينة بعد إجراء التجميد (الخطوة 2.3) عن طريق استخراج الحاوية عينة من الحمام النيتروجين السائل وتناوب رأسا على عقب.
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة للحصول على حل شامل للعينة (انظر الخطوة 5). - إدراج العينة إلى ناظم البرد.
ملاحظة: هذا القديسالجيش الشعبي، ويتألف من خطوة الفرعية التالية، يجب أن يؤديها بسرعة (أي في أقل من 10-20 ثانية) لمنع عينة من الذوبان.- إدراج الحاوية عينة في صاحب العينة. إدراج صاحب العينة في إدراج ناظم البرد الرئيسي. إدراج الدليل الموجي أفران ميكروويف في صاحب العينة.
- خفض درجة الحرارة ناظم البرد قبل بدء تشغيل الإجراء 1 K التبريد. انقر على "1K التبريد 'زر على واجهة البرنامج ناظم البرد (الشكل 2D).
- تحويل مصدر الميكروويف على وأشرق العينة. انقر على زر "MW-ON" على واجهة البرنامج ناظم البرد (الشكل 2D).
3. قياسات الرنين المغناطيسي النووي الحالة الصلبة
- افصل الكبل المحوري للقناة الكشف عن وحدة الرنين المغناطيسي من لفائف مطياف عن طريق تدوير عكس اتجاه عقارب الساعة الموصل بنسبة 90 درجة وسحبه. قم بتوصيل الكابلات المحورية للقناة الكشف لموصل محوري من ناظم البردNMR لفائف. إدراج موصل الذكور من كابل وحدة الرنين المغناطيسي في الموصل الإناث لفائف ناظم البرد NMR، مع إيلاء الاهتمام لدبوس التوجه. اضغط بقوة وتدوير في اتجاه عقارب الساعة الموصل بنسبة 90 درجة.
- قياس إشارة الحرارية NMR في الحالة الصلبة في موقع ناظم البرد باستخدام تسلسل نبض اكتساب بسيط مع انخفاض نبضات الوجه زاوية معايرة الامم المتحدة المتكررة في الفترة الفاصلة من T = 5 دقائق. بعد إعداد القياس، الكتابة في سطر الأوامر من البرنامج 'زج' واضغط على مفتاح "Enter" لوحة المفاتيح. الرجوع إلى NMR دليل التشغيل مطياف لمزيد من التفاصيل حول عملية طيف والإعداد القياس.
- قياس إشارة NMR تعزيز إدارة التخطيط الوطني. عمليات كرر الخطوة 3.2 بعد الشروع في عملية إدارة التخطيط الوطني كما هو موضح في القسم 2.
- افصل وحدة الرنين المغناطيسي كابل قناة الكشف محوري من لفائف NMR ناظم البرد عن طريق تدوير عكس اتجاه عقارب الساعة الموصل بنسبة 90 درجة وسحبه. قم بتوصيل الكابلات المحورية للDETEقناة تصنيع الى موصل محوري لفائف مطياف. إدراج موصل الذكور من كابل وحدة الرنين المغناطيسي في الموصل الإناث لفائف مطياف، مع إيلاء الاهتمام لدبوس التوجه. اضغط بقوة وتدوير في اتجاه عقارب الساعة الموصل بنسبة 90 درجة.
4. تحسين تجانس مجال مغناطيس الرئيسية ( 'الملئ')
- ضع في مطياف أنبوب يحتوي على 500 ميكرولتر من خليط المنتجة في التجارب السابقة (أي بعد الخطوة 6.2).
- أداء NMR مطياف الملئ من خلال تغيير التيار في الملفات الملئ التدرج في البحث عن الأقصى 'قفل' إشارة من الديوتريوم. حدد الملف الملئ ذات الصلة عن طريق الضغط على زر المقابلة على وحدة الرنين المغناطيسي.
- تناوب على مقبض الباب على وحدة الرنين المغناطيسي لتحديد اتجاه دوران أن يزيد من إشارة القفل. الاستمرار في تدوير حتى تصل إشارة كحد أقصى. حدد الملف الملئ آخر وكرر الامم المتحدة تعظيمسمسم كحد أقصى المحلي لجميع ملفات الملئ يتم العثور عليها. الرجوع إلى NMR دليل التشغيل مطياف لمزيد من التفاصيل. في النهاية، إزالة العينة المستخدمة للتأمين.
5. حل
- إدراج 5 مل من D 2 O في المرجل إدراج حل. ضغط وحرارة D 2 O عن طريق سلك مقاوم حتى يتم التوصل إلى T ≈ 180-200 درجة مئوية. انقر على "إعداد سخان 'زر على واجهة البرنامج ناظم البرد (الشكل 2D).
- بعد الانتهاء من إجراء عينة الاستقطاب (على سبيل المثال، بعد 3 T إدارة التخطيط الوطني)، الضغط على ناظم البرد قليلا أعلى من الضغط غرفة. انقر على زر 'عمليات SS "على واجهة البرنامج ناظم البرد (الشكل 2D). إزالة دليل الميكروويف من إدراج حل.
- حرك إدراج حل (الشكل 3B) أسفل إلى صاحب العينة (الشكل 3A-ج). إدراج حل له للوصول إلى الجزء السفلي من صاحب العينة، ويجب أن تكون دفعت بقوة لإجراء اتصال معزولة مع الحاوية عينة من أجل تجنب D 2 O تسريب في ناظم البرد.
- اضغط على الزناد الأجهزة (الشكل 3C-ح) لبدء تسلسل حل، سلسلة توقيت محدد مسبقا من عمليات صمامات تعمل بالهواء المضغوط.
6. حقن
- قبل وضع حل أنبوب NMR 5 مم، تحتوي على 500 عينة ميكرولتر (على سبيل المثال، D 2 O ل
القياس في الخطوة 7 أو LDH حل من الخطوة 8 لقياس النشاط الأنزيمية في الخطوة 9)، في مركز التساوي من 11.74 تي NMR مطياف (راجع الخطوة 4). - فقط بعد حل (الخطوة 5)، مزيج 500 ميكرولتر من حل hyperpolarized مع العينة وضعها في مطياف الرنين المغناطيسي النووي في الخطوة 6.1.
- دليل حقن: جمع hyperpolarizedالحل في نهاية 2.5 متر أنبوب نقل طويلة في كوب زجاجي وضعت على مقربة من المغناطيس الرنين المغناطيسي النووي مطياف. حقن يدويا 500 ميكرولتر من حل hyperpolarized في أنبوب عينة NMR من خلال نظام الشعرية حسب الطلب.
- حقن التلقائي: قبل عملية انحلال، وربط أنبوب نقل إلى جهاز حقن العرف الآلي الذي يفصل الحل hyperpolarized من غاز الهيليوم يستخدم لنقل. ويقدم هذا الجهاز تلقائيا 500 ميكرولتر من حل hyperpolarized في أنبوب العينة.
7. السائل للدولة قياس الرنين المغناطيسي النووي
- بعد حل، وقياس إشارة NMR hyperpolarized من العينة في مطياف سلسلة من 10 درجة الوجه زاوية تسلسل نبض اكتساب متباعدة بمقدار 1.5 ثانية لمتابعة تطور مغنطة الركيزة (A) والمنتج (B). بعد إعداد القياس، الكتابة في سطر الأوامر من البرنامج 'زج' واضغط على & #39؛ أدخل 'مفتاح لوحة المفاتيح. الرجوع إلى NMR دليل التشغيل مطياف لمزيد من التفاصيل حول عملية طيف والإعداد القياس.
- وبمجرد أن مغنطة خففت بالكامل (أي بعد T = 10 T 1)، وقياس إشارة الحرارية NMR من خلال سلسلة من 90 درجة الوجه زاوية اكتساب نبض تسلسل متباعدة من قبل T = 3 T 1 ≈ 3 دقائق. بعد إعداد القياس، الكتابة في سطر الأوامر من البرنامج 'زج' واضغط على مفتاح "Enter" لوحة المفاتيح. الرجوع إلى NMR دليل التشغيل مطياف لمزيد من التفاصيل حول عملية طيف والإعداد القياس.
8. إعداد أنزيم التي تحتوي على عينات (محددة لتحويل البيروفات إلى لاكتات)
- إعداد رد فعل العازلة مع الوصفة التالية: 50 مم انخفاض نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH)، 1 ملم الاثيلين diaminetetraacetic حمض (EDTA)، 0.1 ملي dithiothreitol (DTT) في 0.1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة =7.0.
- إعداد أرنب العضلات LDH حل 1 يو / مل الطازجة في رد فعل العازلة مع 20 ميكروغرام / مل ألبومين المصل البقري، BSA.
- مزيج 478 عازلة رد فعل ميكرولتر (الخطوة 8.1)، 20 ميكرولتر D 2 O للسماح لتحقيق الاستقرار الحقل مطياف ( 'تأمين') وحل LDH 2 ميكرولتر (الخطوة 7.2).
- ضع حجم حل 500 ميكرولتر أعدت في الخطوة 8.3 في أنبوب NMR 5 مم ووضع أنبوب في NMR مطياف 500 ميغاهيرتز.
9. كاملة الأنزيمية معدل التفاعل إجراء القياس
- إعداد نموذج الاستقطاب (الخطوة 1) واستقطاب أنه (الخطوة 2).
- أداء الملئ على مطياف (الخطوة 4) وإعداد عينة الأنزيمية (الخطوة 8).
- أداء حل (الخطوة 5) والحقن (الخطوة 6).
- قياس سلسلة من الإشارات من العينة hyperpolarized مع 10 درجة الوجه الاستحواذ البقول زاوية متباعدة بمقدار 1.5 ثانية (الخطوة 7). هذه الخطوة تتيح قياس hyperpolarizedتسوس إشارة وتراكم إشارة الأيض.
10. تركيب
- لكل الطيف المكتسبة في الخطوة 9.4، وتحديد قمم المقابلة لالركيزة (A) والمنتج (ب) على التوالي ودمجها (تحديد منطقة من قمم). تكاملات قمم تعطي الوقت مغنطة بالطبع إشارات (M (A، B) (ر)، انظر المعادلة 2).
- عن طريق حل معادلة (2)، وتحديد قيمة F = (R A + ك ممثل المؤسسة ) من نوبة أسي بسيط للإشارة الركيزة متكاملة في خطوة 10.1.
- استخدام قيمة F = (R A + ك ممثل المؤسسة ) تحدد في الخطوة 10.2، تحديد ممثل المؤسسة ك وR B من نوبة من الإشارة المنتج M ب (ر) مع وظيفة التي تم الحصول عليها عن طريق دمج المعادلة (2). الرجوع إلى قسم النتائج الممثل (Enzymatالنشاط جيم والقياسات التمثيل الغذائي) لمزيد من التفاصيل على تصحيح النمذجة رد فعل، وتركيب والترددات اللاسلكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مكاسب إشارة الرنين المغناطيسي باستخدام حل إدارة التخطيط الوطني
يتكون تأثير إدارة التخطيط الوطني في نقل الاستقطاب عال من الإلكترون يدور المفردة، وعادة من جزيئات جذرية مستقرة، إلى نوى NMR النشطة، تحت أشعة الميكروويف من العينة. الجذور الحرة الأكثر استخداما، هي TAM (OXO63) وTEMPOL. قد يكون الأمثل 4 إجراءات الاستقطاب باستخدام TEMPOL التي كتبها 'الاستقطاب المتقاطع ". 25
تحسين تركيز مستقرة جذرية من أجل الحصول على الاستقطاب النووي الأقصى في الحالة الصلبة أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه التقنية. تم العثور على تركيز TEMPOL الأمثل لتكون 33 مم في ظروف تجريبية من هذه الدراسة. هذا الاستقطاب الركيزة المختار هو كاف لمتابعة تحويل الأنزيمي في الوقت الحقيقي.
المجال المغناطيسي للpolariذر تركيبها في باريس ديكارت هو ب 0 = 3.35 T و وصفت مكونات هذا النظام فوق (أرقام 1-3). تصميم ناظم البرد يضمن أن موقف عينة النهائي يتزامن مع مركز التساوي المغناطيس. وكان المجال المغناطيسي للالمستقطب رفعت وshimmed باستخدام لفائف فائقة التوصيل الرقائق فقط، مع ناظم البرد في المكان. كان البروتون خط العرض النهائي من عينة المياه 1 × 0.5 X 0.5 سم 23 كيلو هيرتز. قمنا بتقييم 
و 
ل[1 13 C] البيروفات. للقيام بذلك، فمن الضروري أولا لتحديد إشارة تعزيز إدارة التخطيط الوطني-13 C في الحالة الصلبة في موقع المستقطب قبل فسخ الشكل (4A). بعد انحلال، قمنا بقياس [1-13 C] إشارة hyperpolarized البيروفات واضمحلاله في موقع مطياف. وقد تم قياس إشارة الحالة السائلة على حل الاختبار باستخدام 500 ميكرولتر من D 2 O كما عينة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي. وهذا ما سمح لنا لتحديد الحالة الصلبة إدارة التخطيط الوطني وتعزيز (الشكل 4B، أقحم)، ومستوى NMR الاستقطاب السائل للدولة (الشكل 4B) والخسائر الاستقطاب أثناء عملية النقل. النسبة بين إشارات قياس في الخطوة 3.3 و 3.2 الخطوة تحديد تعزيز الحالة الصلبة، . النسبة بين الإشارة الأولى يقاس في الخطوة 7.1 والإشارة من الخطوة 7.2 تحدد تعزيز hyperpolarized السائل للدولة، .
البيانات من الخطوة 3، قummarized في الشكل 4A) والشكل (4A (الشكل)، وتبين أن هذه التقنية تسمح لاستقطاب 13 مئوية في [1- 13 C] البيروفات تصل إلى = 22 ± 5، المقابلة لاستقطاب 13 C = 1.5 ± 0.3٪.
هذا المستوى الاستقطاب أكثر من ألف مرة الاستقطاب الحراري الكربون في ظروف MRS المشتركة (على سبيل المثال، 11.74 T و 300 K). البيانات من الخطوة 7، ملخصة في الشكل 4B و الشكل 4B (الشكل)، تسمح تحديد السائل للدولة 13 C فرط من [1- 13 C] البيروفات، = 1 ± 0.2٪. وكان تعزيز حصلت في الحالة الصلبة لالبيروفاتكافية لغرض التجربة، على الرغم أثبتت التحسينات أعلى باستخدام الجذور مختلفة. 5 الساعة بيانات بالطبع تناسب من الخطوة 7.1 يعطي مقياس ثابت وقت الاسترخاء. والبيروفات وقت الاسترخاء الطولي في خليط يتكون من 500 ميكرولتر إدارة التخطيط الوطني حل المعززة و 500 ميكرولتر D 2 O، وتي 1 = 75 ± 5 ثانية بعد تصحيح الترددات اللاسلكية (انظر المعادلة (3)).
النشاط الأنزيمي والقياسات التمثيل الغذائي
حل إدارة التخطيط الوطني NMR الكشف عن 13 الركيزة المسمى C (A) يمكن استخدامها لتتبع في الوقت الحقيقي ديناميات تحويل الأنزيمية ومراقبة تشكيل المنتج (ب):
مباشرة بعد حقن الركيزة hyperpolarized (A)،إشارة من المنتج (ب) فارغة. ثم، وتحويل الأنزيمية (1) يبدأ في إنتاج (B). لا يتأثر مغنطة من 13 نواة C من التحولات الكيميائية المختلفة والتغير الكيميائي للجزيئات. ومع ذلك، فإن البيئة الجديدة قد تؤدي إلى اختلاف معدلات الاسترخاء الطولي للC 13 في B. الدورة منتج الوقت إشارة يمكن فصلها نوعيا في ثلاث خطوات: في البداية، وتحويل الأنزيمية تحويل وإلى B تنتج زيادة في إشارة باء؛ بعد فترة معينة من الزمن، تعتمد على الظروف التجريبية، فإن الخسائر مغنطة بسبب الاسترخاء، وتوازن هذه الزيادة وإشارة من B يصل كحد أقصى. أخيرا، في بعض الأحيان أطول، يضمحل إشارة من B بسبب الاسترخاء الطولي. في فرضية تشبع الانزيم، إهمال الظهر تحويل ومراعاة الاسترخاء المغناطيسي، ومغنطة اثنين من الأنواع الجزيئية (A و B) خلال تحويل الأنزيمية يمكن وصفها من قبل فصول التوجيه الجامعيأقر نظام المعادلة التفاضلية: 22
حيث M (A، B) (ر) وmagnetizations الأنواع الجزيئية ألف وباء، على التوالي، ك ممثل المؤسسة هو ثابت معدل التحويل الفعال لنقل الإشارات من رد الفعل الأنزيمية وR (A، B) هي ثوابت معدل الاسترخاء الطولي واضحة من نوى الملحوظة في والأنواع الجزيئية وباء، على التوالي R (A، B) حساب لكل من محض الطولي الاسترخاء مغنطة وتأثير ينبض الترددات اللاسلكية:
حيث T 1، (A، B) هو الاسترخاء الطوليوقت ثابت للنواة في البيئة الجزيئية المحلية من الأنواع الجزيئية ألف وباء، على التوالي. θ وτ هي زاوية الترددات اللاسلكية الوجه وتأخير بين عمليتي استحواذ إشارة، على التوالي.
في هذه الدراسة، الركيزة ألف والمنتج B كان [1- 13 C] البيروفات و[1- 13 C] اللاكتات، على التوالي، وكان الهدف هو قياس [1- 13 C] إنتاج اللاكتات من قبل رابطة حقوق الإنسان في ظل الظروف التي لا يوجد فيها (نظائريا وكانت لا تحمل علامات) اللاكتات في الحل في بداية التجربة. يتكون القياس في سلسلة من 13 C الأطياف المسجلة مع تسلسل pulseacquire بسيط في T = 21 درجة مئوية. تم استخدام معايرة 10 درجة الوجه نبض زاوية لالإثارات متتابعة (الخطوة 9). وكان التأخير بين النبضات المتتالية τ = 1.5 ثانية. وقد بدأ تسلسل اكتساب NMR بضع عشرات من الثواني قبل solut hyperpolarizedحقن أيون. وكان تركيز البيروفات الركيزة في أنبوب عينة بعد الحقن 25-35 ملم. في الخطوة 10 اللاكتات إلى سرعة تحويل البيروفات بتركيز LDH من 10 -3 U / مل وقد تم قياس. الإشارات المسجلة من اللاكتات والبيروفات يتناسب تماما نموذج في المعادلة (2) (الخط المنقط في الشكل 5) والعائد ك ممثل المؤسسة = 0.9 ± 0.1 × 10 -3 ثانية -1 (الشكل 5). توافق هذه القيمة مع معدل رد الفعل الأولي التي تحددها النسبة [لاك] / [فندق Pyr] في الوقت 0 ثانية (الشكل 5، أقحم).
الشكل 1. مخططات لجهاز تجريبي. المستقطب (يسار) ويتكون من تجويف الميكروويف (ج) الواقعة داخل ناظم البرد (د) وضعت في مجموعة واسعة الجوف 3.35 تي فائقة التوصيل المغناطيس. لفائف NMR حسب الطلب (ب) المحيطة رانه أخذ عينات (أ) يستخدم لرصد الاستقطاب تدور النووي في الموقع. يتم الحفاظ على درجة حرارة الحمام الهيليوم عند 1.12 ± 0.03 K بينما المشع في العينة عند تردد الموجات الدقيقة ν ميغاواط = 94 غيغاهيرتز. ويسمح هذا النظام لقياس الرنين المغناطيسي التي يتعين القيام بها على عينة الحالة الصلبة خلال الاستقطاب. يذوب العينة الاستقطاب في السخونة المياه ودفعت بغاز الهيليوم المضغوط من خلال خط نقل في أنبوب عينة وضعت سابقا داخل مطياف الرنين المغناطيسي النووي المجاور (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ناظم البرد ونظام فراغ الخطط. (A) ناظم البرد ديوار العزل. (ب) صرخة ostat إدراج الرئيسي. (C) وصلات نظام فراغ، (D) قطة من إدارة واجهة البرنامج مع الأزرار المستخدمة لتنفيذ عمليات محددة هو موضح في الخطوة 2 والخطوة 5 من قسم البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. معالجة العينة وانحلال. (أ) إدراج معالجة العينة. (ب) إدراج الحل، (C) التفاصيل اتصالات الكهربائية الهوائية من إدراج حل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الحالة الصلبة تراكم الاستقطاب وhyperpolarized إشارة الاضمحلال. إشارات حل إدارة التخطيط الوطني. (أ) الحالة الصلبة NMR الاستقطاب تراكم إشارة من حل البيروفات 1.12 M الصوديوم [1- 13 C] خلال الاستقطاب إدارة التخطيط الوطني (الصلبان، ومزودة الدالة الأسية S (ر) = أ س إكسب (-t / T ب) + B من الزمن ثابتة T ب = 270 ثانية) والاسترخاء (الدوائر، S (ر) = A · إكسب (ر / ر ب) + B، T SS 1 = 840 ثانية). (A، أقحم) مقارنة بين DNPenhanced والاستقطاب حراريا (الارتقاء بها 10 مرات) إشارات مغنطة في الحالة الصلبة (ε SS = 22 ± 5، المقابلة لاستقطاب الحالة الصلبة ف SS = 1.5 ± 0.3٪)؛ (ب) المقارنة بين الطيف الأول سجلت بعد حل وaveraالطيف GED (الارتقاء 100 مرة) تم الحصول عليها من الاستقطاب حراريا 13 C يدور في RT باستخدام 1024 العابرين (ε = 1000 ± 200). استغرقت العملية حل 3.3 ثانية وحقن التلقائي حوالي 2 ثانية مع فقدان إشارة تقدر ب 40٪. لأداء التجارب نقل العينة عن طريق الحقن اليدوي، وقدرت خسائر إضافية بسبب تأخر حقن الطويل إلى 30٪. (B، أقحم) hyperpolarized إشارة تسوس البيروفات بعد حل في غياب LDH (تي 1 = 75 ± 5 ثانية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. LDH النشاط والتمثيل الغذائي الخلايا السرطانية النتائج. تراكم [1- 13 C] إشارة اللاكتات بسبب enzymaتحويل عرة بتركيز LDH من 10 -3 U / مل تليها تسوس إشارة بسبب الاسترخاء الطولي لل13 C مغنطة. يظهر خط أحمر لتتناسب مع نموذج موضح في المعادلة (2) تتألف من آثار الاسترخاء وتحويل الأنزيمية. (أقحم) النسبة بين [1- 13 C] اللاكتات و[1 -13 C] تركيز البيروفات مع استقراء سرعة رد الفعل في الزمن t = 0 (خط أحمر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النقاط الحرجة من حل إدارة التخطيط الوطني NMR التجربة هي: (أ) مستوى الاستقطاب بلغ عن الركيزة، والذي يحدد أقل تركيز المنتج الضروري لإجراء التجارب، فضلا عن عدد من عمليات الاستحواذ إشارة التي يمكن القيام بها و (ب) وعمر من مغنطة، مقارنة مع مدة النقل بين الاستقطاب ومواقع الكشف عن ومعدل التحول الركيزة. نظام حقن من إعداد إدارة التخطيط الوطني حل الموصوفة هنا يسمح لنقل عينة في اقل من 3-4 ثانية. على الرغم من أن نقل لم يكن سريعا كما هو الحال في الطريقة المقترحة من قبل س بوين وجيم Hilty، 26 خسائر الاستقطاب لالبيروفات كانت محدودة بسبب الاسترخاء الطولي المعتدل في مجال منخفضة. [1- 13 C] البيروفات، مع تي في الكربوكسيلية طويلة النووي 1، يسمح قياس التدفق من خلال رابطة حقوق الإنسان في تركيزات منخفضة تصل إلى 10 -3 U / مل.
ال ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء التي تم الحصول عليها باستخدام حل تقترح إدارة التخطيط الوطني التي يمكن للمرء أن يكون حساس لأقل من [1- 13 C] تركيزات البيروفات، وانخفاض معدلات التحويل الأنزيمية. يتيح مستوى الاستقطاب حققت أكثر من 200 التجارب مع نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء التي سيتم اكتسابها في NMR مطياف السائل للدولة باستخدام منخفضة الوجه زاوية α = 10 °. وهذا يترك مجالا للتحسين من حيث مرات التكرار وزوايا الوجه. لتراكم الاستقطاب في الحالة الصلبة بعض الجزيئات استقطاب جيدا مع بعض وكلاء الاستقطاب (TEMPO، OXO63) (4) والبعض الآخر لا، وذلك لأسباب لا تزال غير مفهومة تماما. التجارب التجريبية هي الطريقة الوحيدة لتحديد ما إذا كانت خطوة الاستقطاب ناجحة. لتحسين مستوى الاستقطاب، يمكن للمرء أن يستكشف استخدام الأنواع جذري مختلف 4 وتطبيق تقنيات مختلفة تعتمد على 'الاستقطاب المتقاطع ". 25
ontent "> مزيد من التحسين من تركيزات المتطرفة والركيزة فضلا عن تكوين المذيبات في العينة إدارة التخطيط الوطني يمكن أن يحاكم لتحسين الاستقطاب. ويقتصر تقنية الجزيئات التي نواة أو مجموعة من نواة قادرة على الحفاظ على الاستقطاب بعد حل يمكن أن يكون التي تم تحديدها. الاستقطاب يمكن أن يستمر إما عدم التوازن بين eigenstates أحادية النووي في المجالات المغناطيسية العالية أو في شكل LLS ضلت موضعها الصحيح على اثنين أو نوى أكثر إلى جانب. وبالنسبة للخيار الأول، ونواة التحقيق يجب أن تكون بعيدة عن النوى الأخرى مع ارتفاع نسبة مغناطيسية دورانية، مثل البروتونات، وإذا لم يتم العثور على مثل هذا الموقف بشكل طبيعي، والإثراء في نوى NMR النشطة في مواقع معزولة في جزيء أو استبدال البروتونات في محيط الأنوية النشطة دوتيرونس، لخفض قوة ثنائي القطب المغناطيسي، هي ضرورية . للحصول على LLS، التحليل النظري من وصلات المغناطيسية ضمن مجموعة من الأنوية يمكن القيام بها 27،28 من أجل إيجاد وسائل أفضل لتحاميلالاستقطاب أورط. وقد أثبتت هذه الاستراتيجية ناجحة في جزيئات صغيرة مثل الأحماض الأمينية 29 ويمكن تطبيقها على الجزيئات الأخرى المشاركة في دورات التمثيل الغذائي من الفائدة. أفضل للحفاظ على مغنطة خلال التجربة، فإن الجمع بين حل إدارة التخطيط الوطني مع إثارة LLS وعود لتمديد الفترة الزمنية لقياس التفاعلات الأنزيمية الأخرى. 20ويتم تكييف التجربة إدارة التخطيط الوطني-NMR الموصوفة هنا لقياس التمثيل الغذائي البيروفات في الخلايا السرطانية. 6 في الوقت الحقيقي لقياس النشاط الأنزيمي حل إدارة التخطيط الوطني تعزيز NMR يمكن أن تساعد الجهود الحالية في تشخيص السرطان عن طريق تعزيز إدارة التخطيط الوطني، التصوير بالرنين المغناطيسي، وتستخدم بالفعل في عيادة 12 خصوصية الجزيئية لتعزيز إدارة التخطيط الوطني-NMR يجعلها الأسلوب المفضل للتمييز بين الأهداف الجزيئية ومنتجات تحولاتها. وسوف تركز التحسينات المستقبلية على تقييم استشفاف الجزيئية الأخرى لالأيضية التحولات 30
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنها لا المصالح المالية المتنافسة
Acknowledgments
الكتاب أشكر الدكتور يانوش فان دير كلينك للمساعدة في اختيار وتجميع المعدات، وكذلك الدكتور F. الكاتب والدكتور ج Bertho لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد AC من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسري (منح PPOOP2_157547). ونحن نعترف التمويل من باريس السوربون سيتي (NMR @ كوم، DIM تحليلات، فيل دي باريس، ومؤسسة للبحوث ميديكال (FRM ING20130526708)، وParteneriat هوبير كيريان برانكوزي 32662QK فريقنا هو جزء من برامج Equipex باريس-أون-الرنين وCACSICE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNP polarizer | Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) | /// | Cryostat and electronic equipment for sample polarization |
| Vacuum system components | Edwards vacuum (France) | Various | - turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components |
| DNP 3.35T Magnet | Bruker (France) | ||
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker (France) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (US) | Data analysis software | |
| Chemicals | |||
| SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C | Sigma Aldrich (France) | 490709 | |
| ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D | Sigma Aldrich (France) | 186414 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO 97% | Sigma Aldrich (France) | 176141 | |
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich (France) | 151882 | |
| reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) | Sigma Aldrich (France) | ||
| ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich (France) | ||
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich (France) | ||
| phosphate buffer, pH = 7.0 | Sigma Aldrich (France) | ||
| LDH enzyme in | Sigma Aldrich (France) | L-2500 | |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma Aldrich (France) |
References
- Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
- Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395 (1978).
- Wolber, J., Ellner, F., et al. Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization. Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).
- Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals. PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
- Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging. JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).
- Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction. An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).
- Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR. NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).
- Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy. Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).
- Lerche, M. H., Meier, S., et al. Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism. NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).
- Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108 (2013).
- Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
- Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function. Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).
- Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields. PRL. 92 (15), 153003 (2004).
- Carravetta, M., Levitt, M. H. Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field. J. Chem. Phys. 122 (21), 214505 (2005).
- Vasos, P. R., Comment, A., et al. Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization. PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).
- Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance. JMR. 239, 81-86 (2014).
- Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution. JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).
- Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution. Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).
- Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer. MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).
- Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).
- Comment, A., van den Brandt, B., et al. Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner. Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).
- Balzan, R. Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, EPFL - EDPY. Available from: http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf 1-140 (2013).
- Bornet, A., Melzi, R., et al. Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization. JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).
- Bowen, S., Hilty, C. Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy. PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).
- Cavadini, S., Vasos, P. R. Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy. Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).
- Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Long-lived States in Multiple-Spin Systems. Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).
- Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states. Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).
- Sarkar, R., Comment, A., et al. Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization. JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).
