Abstract
Основным ограничением ЯМР основе исследований является низкая чувствительность. Это побуждает течение долгого времени приобретения, тем самым предотвращая измерений методом ЯМР в режиме реального времени метаболических превращений. Гиперполяризация помощью растворения DNP обходит часть чувствительности выдает благодаря большому нестандартного равновесия ядерной намагниченности, вытекающих из передачи спиновой поляризации электрона и ядра. Высокого ЯМР сигнал, полученный могут быть использованы для мониторинга химических реакций в реальном времени. Недостатком гиперполяризованным ЯМР находится в ограниченном временном окне доступных для обнаружения сигнала, которая обычно составляет порядка ядерной спин продольной постоянной времени релаксации, T 1, или, в благоприятных случаях, порядка постоянной времени релаксации, связанной с синглетная сопряженных ядер, Т LLS. Сотовый поглощение эндогенных молекул и скоростей метаболических может оказать существенную информацию о развитии опухоли и ответ наркотиков. Nuполненных ранее многочисленных Гиперпол ризованные ЯМР исследования продемонстрировали релевантность пирувата как метаболический субстрат для мониторинга ферментативную активность в естественных условиях. Эта работа содержит подробное описание экспериментальной установки и методов, необходимых для изучения ферментативных реакций, в частности скорость пируват-к-лактата преобразования в присутствии лактатдегидрогеназы (ЛДГ), по гиперполяризованным ЯМР.
Introduction
Динамическая поляризация ядер (DNP), 1,2 методика предназначена для повышения спиновой поляризации ядерной, т.е. дисбаланс между «вверх» и «вниз» населенностей спиновых (P = [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), была впервые введена в 1950-х годах. Ядерные спины, такие как 13 C могут быть поляризованы до P = 10 -1 в благоприятных условиях, как правило, при температуре порядка 1 К и в магнитном поле 3,357 Т. 3,4 Прорыв для биологических применений пришел в начале 2000-х с развитием растворения DNP который состоит в растворении замороженных поляризованных образцов в перегретой воды при сохранении высокого уровня ядерной поляризации, полученной при низкой температуре. 5 жидкость состояния ЯМР сигнал усиливается с коэффициентом 10 3 -10 4, по сравнению с общийтермически поляризованных условия RT ЯМР. Поэтому Растворение DNP обеспечивает способ неинвазивного мерой биохимические скоростей реакций в месте в режиме реального времени, что позволяет динамику мониторинга от ЯМР с временным разрешением 1 сек или меньше 6 -. 10 Также стало возможным обнаружить аналиты в очень низких концентрациях 11.
Среди методов неинвазивной молекулярной визуализации, гиперполяризационная ЯМР является единственным методом, который позволяет одновременно измерения подложку и метаболические продукты в режиме реального времени. Растворение DNP был принят с энтузиазмом в различных научных областях, начиная от в пробирке ЯМР для клинической МРТ 12 и наиболее перспективных приложений связаны с на месте мониторинга метаболизма. 13,14 Основным ограничением для растворения DNP, что через некоторое время на порядок пять раз время продольной релаксации постоянной Т 1, улучшенная полярнаялизации теряется. Именно поэтому необходимо использовать молекулы, несущие ядерные спины, проявляющие относительно длительный T 1. Чтобы продлить время пролета повышения поляризации, медленно расслабляющий ядерных спиновых состояний, известных как долгоживущих состояний (LLS), могут быть использованы 15 -. 17 LLS нечувствительны к диполь-дипольного взаимодействия внутри пары, так что их характерной постоянная времени релаксации, Т РЛС, может быть гораздо больше, чем T 1. 18. намагниченность жизни десятков минут и, следовательно, до 1 часа можно было получить, 19,20 и РЛС были предложены как для магнитно-резонансной спектроскопии (MRS) и МРТ. 21
Основные моменты, которые должны быть тщательно оптимизирован для изучения ферментативных скорость реакции по гиперполяризованным ЯМР являются: (я) максимизировать твердотельный поляризацию и (II) свести к минимуму потери поляризации при передаче гиперполяризованным раствор изполяризатор на ЯМР-спектрометре. В данной статье описывается адаптации заказной растворения DNP аппарата и системы впрыска для изучения ферментативных реакций. Характеристики и производительность установки будет продемонстрирована с известной и широко используемой гиперполяризованным подложке [1- 13 C] пирувата. Основными причинами этого выбора являются, во-первых, его, естественно, долго 13С время продольной релаксации (T 1> 50 сек при высоких магнитных полей и температур выше 293 К), который позволяет реакции мониторинга в течение нескольких минут, а во-вторых, ее центральной роли в рак метаболизм. 13,14 Используя растворения DNP-ЯМР и систему впрыска пользовательский развитая, окисление пирувата, катализируемого лактатдегидрогеназы (ЛДГ) можно контролировать в присутствии начальной бассейне немеченого лактата 9,22 или без каких-либо немеченого лактата добавленной , как показано здесь. Было показано, что [1- 13 С] лактат сигнал измеряется в VIVO (в том числе в клетках) после инъекции гиперполяризованным [1- 13 C] пирувата в основном за счет быстрого обмена этикетки между пирувата и лактата, а не к лактата. 6
Мы здесь, представить продукцию в режиме реального времени [1- 13 C] лактат от гиперполяризованного [1- 13 С] пируват, вводили в ЯМР пробирку, содержащую ЛДГ но изначально не лактата.
Описание системы
Есть две основные части в установке растворения DNP (Рисунок 1): ДНП поляризатор и ЯМР спектрометр. Основным элементом поляризатор DNP является криостат для охлаждения образца до около 1 К в перекачиваемой гелиевой ванны. Криостат вставляется в сверхпроводящем магните 3,35 Тл и имеет геометрию, которая гарантирует, чтобы иметь поляризационный образца при изоцентром магнита (рис 1). Внутри криостата образец (а) окружен катушкой ЯМР (б), чтобы измерить поляризационную бuildup, содержащаяся в overmoded микроволнового резонатора (с). Весь образец выдерживают при низкой температуре в перекачиваемой гелиевой ванны (г) и облучают микроволнами через волновод. Вся система управляется заказ программного обеспечения (рис 2D).
Аппаратное и криогенное оборудование, необходимые для выполнения ДНП и последующее растворение по-прежнему технологической проблемой. Новый DNP криостат 23,24 была разработана и испытана для определения ее криогенных выступления, а затем оптимизирован для быстрого остывания, гелий удержания времени и общей минимальным потреблением гелия во время работы.
Криостат состоит из двух частей. Первая часть криостата, представляет собой изоляцию Дьюара (2А), что может быть грубо разделены на верхней части (а) хвост, или выборочное пространство (б), а наружный вакуумная камера (ВЗУ), выдерживалось при высоком вакууме и корпусом на радиационные экраны (с). Вторая часть криостата является основным вСерт (2В), помещают в сосуд Дьюара изоляции, где удалось все правила потока. Жидкий гелий камеры от внешнего дьюара через линию передачи (в), находится в первой стадии конденсируется в сепараторе (б), промежуточной камеры используется как для поддержания верхнюю часть криостат холодной и снять гелий испаряется во время передачи. Давление сепаратор опускают путем откачки через капилляр (с), обернутой вокруг верхней части криостата; поток холодного гелия в этом капилляре используется для охлаждения перегородки (D) и экраны излучения в изоляционном сосуда Дьюара (ВЗУ). Образец помещают и поляризовано в выборочном пространстве. Выборочное пространство подключен к сепаратору через другую капилляра (E), обернутой вокруг хвостовой части главного криостата вставкой. Это капиллярное может быть открыта или закрыта с помощью игольчатого клапана с ручным управлением снаружи.
Для достижения низкой температуры, используемый в ходе пр DNPocess, жидкий гелий, которые необходимо собирать в криостат выборочного пространства и его давление понижается до мбар диапазоне. Операции, необходимые для работы криостата выполняются через довольно сложной насосной системы с тремя наборами насосов, мониторинга и управления в разных точках с электронными и электромеханических приборов (рис 2С). Криостат ВЗУ должна насосом высокого вакуума на первом насосной системы. Эта система состоит из турбомолекулярным насоса резервной копии с помощью роторного насоса (A). Жидкий гелий передается от дьюара (б) путем передачи криостат впускную линию к криостата сепаратора. Сепаратор имеет выходное отверстие которого соединен со вторым набором накачки. Этот набор состоит из 35 м 3 / ч мембранного насоса (с). Эта линия позволяет удалять газообразный гелий вареной во время передачи от сосуда Дьюара и при охлаждении сепаратора. Жидкий гелий собирали в сепараторе может быть затем переведен в выборочном пространстве через колпачокIllary трубки описано выше. Для передачи жидкого гелия из сепаратора в выборочном пространстве, а затем в нижней выборочном пространстве давлении мбар диапазон, третий насосную систему, состоящую из 250 м 3 / ч насоса Рутса подкреплены 65 м 3 / ч роторного насоса (г) подключен к криостата посредством ручной дроссельный клапан (е).
Все вакуумной системы операции контролируются и регулируются электропневматического заказ устройства (F). Это устройство контролирует соединения вакуумной линии между криостата сепаратора (г) и выборочного пространства (ч) точек, вторые / систем третьих насосных (в, г), сжатым гелием бутылки (I) и за ее пределами. Связь между (F) и снаружи, проходит через односторонний клапан (J). Электро-пневматическое устройство (е), а также все параметры системы и аппаратные Растворение контролируются и управляются с помощью заказного электронного устройства сопряженной USB с общим ПК. Наконец вся система, через электронныйУстройство, управляется на заказ автономным программным обеспечением (рис 2D), где соответствующие операции запускаются через интерфейс с помощью программируемых кнопок.
Чтобы управлять образец и измерить сигнал ЯМР наращивание в твердом состоянии используются ряд вставок (рис 3А). Для приготовления криостат для поляризации, разместить основной вкладыш образца (а), в криостат. Основной вкладыш образец снабжен катушкой ЯМР (б), размещенные внутри overmoded позолоченной микроволнового резонатора. Предварительно заморозить основу, содержащую раствор поляризованным (поляризационный раствор) при температуре жидкого азота в подходящем контейнере образца и поместите его в конце нижней части держателя образца стекловолокна (с). Вставьте держатель образца в основную вставки образца, чтобы достичь магнита изоцентру. Вставьте позолоченный волновод (D) в держателе образца. Волновод позволяет микроволна, генерируемая из внешнего источника микроволнового путешествовать с минимальными потерями тO образца.
Заказ программное обеспечение для управления криостата обрабатывает автоматически, после нажатия соответствующей кнопки интерфейса, различные операции, как кд (температура криостат опускается близко к температуре жидкого гелия), заполняя (криостат с жидким гелием до заранее определенного уровня ), дополнительная стадия охлаждения до T ≈ 1 к (гелий ванны жидкость закачивается достичь самую низкую температуру можно), наддув (криостат слегка под давлением выше давления комнатной при Р = 10-30 мбар, чтобы позволить криостата отверстие без риска загрязнения криостата по воздуху) и растворения (автоматическая процедура для растворения образца DNP и передавать полученную гиперполяризованного раствора к месту измерения, т.е. ЯМР-спектрометра).
Поляризация выполняется облучения образца микроволн при 94 ГГц (в поляризационный поля B 0 T DNP, где Т ДПЯ время поляризации наращивание. Т DNP имеет тот же порядок, что и время продольной релаксации ядер мишени в твердом состоянии при заданной поля и температуры. Во всех наших экспериментах образец поляризован в течение более 5 Тл DNP.
В конце времени поляризации, образец должен быть растворен в растворе РТ в целях быть использован для измерения ферментативной активности. Во время процесса растворения, 5 мл перегретого D 2 O из котла для растворения вставки (фиг.3В) выталкиваются с помощью сжатого газообразного гелия (P = 6-8 бар), чтобы достичь DNP-расширенную выборку и растворить его. Полученный раствор гиперполяризационная выталкивается вставку растворения сжатым газообразным гелием, через выпускное отверстие растворение вставки (Фигура 3С-б 23 Время, необходимое для передачи образца от поляризатора DNP на спектрометр сайта ЯМР составляет около 3 сек.
Процесс растворения проводят с использованием растворения вставку (фигура 3В). Вставка растворения состоит из электронно-пневматическая сборки (а), углеродное волокно палочка (б), содержащий соединительные трубки между котлом в пневматическом собраний и шкафчик образец контейнера (С), что позволяет герметичное соединение с образцом контейнер, и обратно к выходу. Электропневматический сборки (фиг.3С) используется для производства и приводной перегретого D 2 O через углеродного волокна палки, чтобы контейнер для образца, а затем извлечь гиперполяризованного раствора из криостата. Электропневматический сборка состоит из пневматических клапанов (а), которые контролируют соединения между взаимодействующимиmpressed гелий (Р = 6-8 бар) линия (б), котел (с), где D 2 O вводят через клапан (D), а выпускное отверстие (е) через углеродного волокна палки (е). Система завершается G давления, термометром и нагревательной нагревательными проводами в котле (с), триггер (H) и соединительной коробке (I), используемого для взаимодействия системы с устройством электронного управления.
DNP криостат и ЯМР спектрометр соединен посредством линии передачи, т.е. ПТФЭ трубки 2 мм внутреннего диаметра, внутри которой гиперполяризационная раствор выталкивается гелия под давлением (Р = 6-8 бар) при растворение инициируется.
Последовательность растворения состоит из следующих операций: в первые 300 мс, перегретый D 2 O была помещена в контейнер для образца для того, чтобы расплавить и растворить гиперпол замороженного раствора. После этого гиперполяризационная раствор экстрагируют из криостата среднем врпродувается (Р = 6-8 бар) газообразный гелий и протолкнул внутренний диаметр ПТФЭ трубки 2 мм (Фигура 3С-е) к участку измерения, где впрыск осуществляется с любой из процедур, описанных в шаге 6.2.1 или Шаг 6.2 0,2.
Второй компонент растворения установки DNP ЯМР является ЯМР спектрометр. В установке, описанной в данном описании, ЯМР-спектрометр работает при поле В 0 = 11,7 Тесла. В 5 мм ЯМР зонд используется для измерения гиперполяризованного сигнал после растворения. ЯМР спектрометр работает через консоль ЯМР, используется как для твердотельных и жидкостных государственных ЯМР измерений, а фирма-прилагающееся программное обеспечение XWinNMR. Типичный измерение состоит из низким углом флип жесткий импульса (либо откалиброван, для liquidstate или снимите откалиброван, для твердотельных измерений) с последующим сигнальных поглощений.
Измерения твердотельного сигнала тепловой поляризации и DNP-производного сигнал наращивание выполняются с использованием заказных катушку 13 C в месте DNP поляризатор (рис 3AB), соединенного с ЯМР-спектрометра. В данном конкретном случае ЯМР спектрометр не выполняет блокировку сигнала. Когда твердотельные измерения проводятся, чтобы избежать значительных возмущений в поляризацию, задержка между поглощений должна быть достаточно длинной, примерно длиннее 0,5 Тл DNP.
Повышение твердотельный определяется как 
где 
является гиперполяризационная сигнала (полученного на стадии 3.3) и 
это твердотельный сигнала (получается при тепловом равновесии при накачке температуре жидкого гелия в шаге 3.2) (4А). Этот параметр defines максимальную поляризацию, доступной для экспериментов ЯМР, до неизбежных потерь при передаче гиперполяризованным раствора. Измерение производится с помощью простого последовательности импульсов приобретают использованием не-откалиброван с низким флип угол пульс. Калибровка импульсов обычно пропускаются для твердотельного измерений.
Аналогичную процедуру можно использовать для определения усиления гиперпол сигнала в жидкой государства. В этом случае образец помещают в спектрометре трубки перед инъекцией (Шаг 6.2) состоит из 500 мкл D 2 O. После растворения и инъекции, есть два важных параметра для мониторинга. Во-первых, гиперполяризационная повышение на участке ЯМР спектрометра, 
(4В), где 
это сигнал сразу после инъекции гипер поляризованный раствор (полученный на стадии 7.1) и 
тепловая сигнал поляризации (полученный на стадии 7.2). Во-вторых, время продольной релаксации, T 1 (Фиг.4В, вставка), связанный с подложкой и каждой продукта метаболизма (полученного экспоненциальной подгонки, сигналов, полученных на шаге 7.1). Эти два параметра определяют минимальную концентрацию субстрата, необходимого для получения достаточного отношения сигнал-шум (SNR) и доступного временного окна для измерения метаболических превращений. Соотношение между твердотельным поляризации 
и liquidstate поляризации 
дает оценку потерь поляризации за счет релаксации в процессе передачи гиперполяризованным раствора. Ценностьation12 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "ширина =" 80 "/> должен наблюдаться в отсутствие релаксационных потерь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все анализ данных проводили с использованием коммерческого программного обеспечения.
1. Подготовьте поляризационный решение
- Подготовьте 2 мл 1,12 М 13 С-меченого пирувата натрия (Na + [CH 3 -СО- 13 COO] -, субстрат) раствор легированный 33 мМ TEMPOL радикальной (4-гидрокси-2,2,6,6- тетраметилпиперидин-1-оксид, поляризационная агент) 4 в 2: 1 д 2 O / д 6 этанол в течение 13 C наблюдений. ВНИМАНИЕ: Меры предосторожности должны быть приняты в связи с горючей природы д 6 этанол.
- Убедитесь, что концентрация радикалов является оптимальным с точки зрения достигнутого поляризации.
- Изменение слегка радикальную концентрацию раствора в пункте 1.1 (например, до 30 мм или 35 мм).
- Определить итеративно повышение твердотельный (шаг 3) и найти концентрацию радикалов, что приводит к максимальному повышению.
2. Polarizatион
- Нижняя температура криостата DNP через расхолаживания процедуры. Нажмите кнопку "Кулдаун 'на интерфейсе криостат ПО (рис 2D).
- Сбор жидкого гелия в криостат DNP через процедуру заполнения. Нажмите кнопку "Заполнение" на интерфейсе криостат ПО (рис 2D).
- Поместите 300 мкл оптимизированной поляризационной раствора со стадии 1.1 в контейнер для образца, снабженного поляризатора DNP. Замораживание образцов контейнер с образцом внутри осторожно погружая его в ванну с жидким азотом.
- Устранить жидкий азот, который может присутствовать в контейнер для образца после процедуры замораживания (этап 2.3) путем извлечения контейнера для образца из ванны с жидким азотом и вращение ее вверх дном.
Примечание: Этот шаг является решающим для получения тщательного растворения образца (см шаг 5). - Вставьте образец в криостат.
Примечание: Эта СанктEP, состоящий из следующих подэтапа, должны быть быстро выполнена (т.е. менее чем 10-20 сек), чтобы предотвратить образца от плавки.- Вставьте контейнер с пробой в держателе образца. Вставьте держатель образца в главном криостата вставкой. Вставьте волновод микроволновые печи в держателе образца.
- Нижняя температура криостата началом процедуры 1 K охлаждения. Нажмите кнопку "1K охлаждения 'на интерфейсе криостат ПО (рис 2D).
- Включите источник микроволнового дальше и облучать образец. Нажмите кнопку "MW-ON 'на интерфейсе криостат ПО (рис 2D).
3. Твердотельные ЯМР Измерения
- Отключите коаксиальный кабель канала обнаружения ЯМР консоли от катушки спектрометра, вращая контакт против часовой стрелки на 90 ° и потянув ее. Вставьте коаксиальный кабель канала обнаружения на коаксиальный разъем криостатаЯМР катушки. Вставьте штекер разъема кабеля консоли ЯМР в женском разъем катушки ЯМР криостат, обращая внимание на ориентацию штифта; надавите и поверните разъем по часовой стрелке на 90 °.
- Измерить тепловой сигнал ЯМР в твердом состоянии в месте криостата используя простую последовательность импульсов сбора по с ООН-откалиброван импульсов низкой флип-угловых повторных с интервалом Т = 5 мин. После настройки измерения, написать в командной строке программного 'ZG' и нажмите «Enter» клавишу клавиатуры. Обратитесь к ЯМР-спектрометр работы руководства для более подробной информации о работе спектрометра и измерительной установки.
- Измерьте DNP-повышенную сигнал ЯМР. Повторные операции шага 3.2 после начала процесса DNP, как описано в разделе 2.
- Отключите ЯМР консоли канала обнаружения коаксиального кабеля от ЯМР катушки криостата, вращая контакт против часовой стрелки на 90 ° и потянув ее. Подключите коаксиальный кабель DETEие канал к коаксиальным соединителем катушки спектрометра. Вставьте штекер разъема кабеля консоли ЯМР в женском разъем катушки спектрометра, обращая внимание на ориентацию штифта; надавите и поверните разъем по часовой стрелке на 90 °.
4. Оптимизация однородности главным магнитом поле ( 'прокладок')
- Поместите в спектрометре пробирку, содержащую 500 мкл смеси, произведенные в предыдущих опытах (т.е. после шага 6.2).
- Выполните ЯМР-спектрометра прокладок путем изменения тока в прокладок градиентных катушек ищут максимально блокирования, сигнал дейтерия. Выберите соответствующую катушку прокладок, нажав на соответствующую кнопку на пульте ЯМР.
- Поверните ручку на консоли ЯМР для определения направления вращения, что увеличивает сигнал блокировки. Продолжайте вращать, пока сигнал не достигает максимума. Выбрать другой прокладок катушку и повторить максимизации ипсезам локального максимума для всех прокладок катушек находится. Обратитесь к ЯМР-спектрометр работы руководства для более подробной информации. В конце, удалить образец, используемый для блокировки.
5. Растворение
- Вставьте 5 мл D 2 O в роспуск вставки котла. Создайте давление и нагрев D 2 O посредством резистивного провода, пока T ≈ 180-200 ° С не будет достигнута. Нажмите кнопку "Prepare каменки на интерфейсе криостат ПО (рис 2D).
- После завершения процедуры образец поляризации (например, после 3 T DNP), слегка давление криостат выше давления комнатной. Нажмите кнопку "Шефа SS 'на интерфейсе криостат ПО (рис 2D). Удалить микроволновую руководство с вставкой растворения.
- Вставьте вкладыш растворения (рис 3B) вниз в держателе образца (3А-с). Вкладыш растворение должен достичь дна держателя образца и должна быть нажата твердо сделать герметичную связь с контейнера для образца, чтобы избежать D 2 O утечки в криостате.
- Нажмите аппаратную курок (3С-Н), чтобы начать последовательность растворения, заранее определенного приуроченный последовательность пневматических клапанов операций.
6. Инъекции
- Перед растворения месте в 5 мм ЯМР трубы, содержащей 500 пробы мкл (например, D 2 O для
Измерение в Шаг 7 или ЛДГ растворе из этапа 8 для измерений ферментативной активности в шаге 9), в изоцентром от 11,74 T ЯМР-спектрометра (шаг 4). - Сразу после роспуска (этап 5), смешать 500 мкл раствора гиперполяризованного с образцом, помещенным в спектрометре ЯМР на шаге 6.1.
- Руководство для инъекций: собрать гиперполяризованнымРаствор в конце длинной передачи трубки 2,5 м в стеклянном стакане, расположенного вблизи ЯМР-спектрометра магнита. Вручную вводить 500 мкл гиперполяризованным раствора в пробирку ЯМР через выполненный на заказ капиллярной системы.
- Автоматическое динамическое торможение: перед процессом растворения, подключить подводящий патрубок к автоматизированной выполненный на заказ инъекционного устройства, который отделяет гиперполяризованного раствора из газообразного гелия, используемого для передачи. Устройство автоматически подает 500 мкл гиперполяризованного раствора в пробирку.
7. жидкого состояния ЯМР Измерение
- После растворения, измеряют гиперпол сигнал ЯМР от образца в спектрометре с помощью серии из 10 ° флип углом импульсного приобретают последовательностей разнесенных на 1,5 с, чтобы следовать прогрессирование намагниченности подложки (а) и продукт (B). После настройки измерения, написать в командной строке программного 'ZG' и нажмите & #39; Enter 'клавиши клавиатуры. Обратитесь к ЯМР-спектрометр работы руководства для более подробной информации о работе спектрометра и измерительной установки.
- После намагниченность полностью расслаблен (то есть, после того, как Т = 10 T 1), измерить тепловую сигнал ЯМР серией угол 90 ° флип-импульсной приобретают последовательностей разнесенных на Т = 3 Т 1 ≈ 3 мин. После настройки измерения, написать в командной строке программного 'ZG' и нажмите «Enter» клавишу клавиатуры. Обратитесь к ЯМР-спектрометр работы руководства для более подробной информации о работе спектрометра и измерительной установки.
8. Подготовка, содержащего фермент образцов (специфический для трансформации Пируват-к-лактат)
- Подготовьте реакционного буфера со следующей рецептуре: 50 мМ восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH), 1 мМ этилен-diaminetetraacetic кислоты (ЭДТА), 0,1 мМ дитиотреитола (DTT) в 0,1 М фосфатном буфере, рН =7.0.
- Готовят раствор ЛДГ кролика мышечную 1 Ед / мл, приготовленные свеже в реакционном буфере с 20 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина, БСА.
- Смешайте 478 мкл реакционного буфера (Шаг 8.1), 20 мкл D 2 O, чтобы обеспечить стабилизацию спектрометр поля ( "блокирующего") и 2 мкл раствора LDH (Шаг 7.2).
- Поместите объем раствора в 500 мкл полученного на стадии 8.3 в ЯМР пробирку 5 мм и расположить трубку в 500 МГц ЯМР-спектрометре.
9. Полная ферментативной реакции Оценить Процедура измерения
- Подготовьте поляризационный образец (шаг 1) и поляризации его (шаг 2).
- Выполните прокладок на спектрометре (этап 4) и подготовить образец ферментативную (этап 8).
- Выполните растворение (шаг 5) и инъекции (шаг 6).
- Измерьте серию сигналов от гиперполяризованного образца с 10 ° флип угол импульсов поглощений расположенных на 1,5 сек (этап 7). Этот шаг позволяет измерять гиперполяризованнымСпад сигнала и накопление сигнала метаболитов.
10. Место
- Для каждого спектра, полученная на этапе 9.4, идентифицировать пики, соответствующие подложки (A) и продукт (B), соответственно, и интегрировать их (определить площадь пиков). Пики интегралы дают курс сигналы времени намагниченность (М (A, B) (т), см уравнение 2).
- Используя решение уравнения (2), определить значение F = (R A + K эфф ) От простого экспоненциального приступе сигнала подложки, встроенной в шаге 10.1.
- Используя значение F = (R A + K эфф ) Определяется на этапе 10.2, определить K эфф и R B из подгонки сигнала продукт М В (Т) с функцией полученного путем интегрирования уравнения (2). Обратитесь к репрезентативные результаты раздел (EnzymatАктивность IC и метаболические измерения) для дополнительной информации о реакции моделирование, фитинга и ВЧ коррекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
прирост сигнала ЯМР с использованием растворения ДНП
Эффект DNP состоит в передаче высокой поляризации непарных спинов электронов, обычно от стабильных радикалов молекул, к ЯМР-активных ядер, в условиях микроволнового облучения образца. Наиболее часто используемые свободные радикалы Там (OXO63) и TEMPOL. 4 процедуры Поляризационные использованием TEMPOL можно оптимизировать путем "кросс-поляризации '. 25
Оптимизация концентрации стабильного радикала, с тем чтобы получить максимальную ядерную поляризацию в твердом состоянии имеет решающее значение для успеха технике. Оптимальная концентрация TEMPOL оказалась 33 мМ в экспериментальных условиях данного исследования. Эта поляризация выбранного субстрата достаточно следовать своей ферментативное превращение в режиме реального времени.
Магнитное поле polariзер установлен в Париже Декарта B 0 = 3,35 Т и компоненты этой системы были описаны выше (фиг.1 - 3). Криостатострое- гарантирует, что окончательная позиция образца совпадает с магнитом изоцентру. Магнитное поле поляризатора поднимали и подкладками использовании сверхпроводящего регулировочные катушки только с криостата в месте. Окончательный протонного линейного ширина образца 1 х 0,5 х 0,5 см водного был 23 кГц. Мы оценивали 
а также 
для [1 13 C] пирувата. Чтобы сделать это, необходимо сначала определить 13С DNP сигнала с повышенной в твердом состоянии в месте поляризатора до роспуска (фиг.4А). После растворения, мы измерили [1-13 C] пируват гиперполяризационная сигнал и его распад на месте спектрометра. Жидкое состояние сигнала измеряли на испытательном растворения использованием 500 мкл D 2 O в качестве образца в ЯМР-спектрометра. Это позволило нам определить твердотельный Усиление ДПЯ (рис 4В, вставка), жидкость-государственном уровне ЯМР поляризации (рис 4б) и поляризационные потери во время передачи. Соотношение между сигналами измеряется в шаге 3.3 и Шаг 3.2 определить усиление твердотельный, , Соотношение между первым сигналом измеренного в шаге 7.1, и сигнал с шагом 7,2 определяет жидкого состояния гиперполяризованного усиление, ,
Данные из шага 3, Summarized на фиг.4А и фиг.4А (вставка), показывают, что методика позволяет поляризовать 13 С в [1- 13 C] пируват до = 22 ± 5, соответствующая поляризации 13 С = 1,5 ± 0,3%.
Этот уровень поляризации более тысячи раз углерода тепловая поляризация в обычных условиях MRS (например, 11,74 T до 300 К). Данные из стадии 7, суммированные в фиг.4В и фиг.4В (вставка), позволяют определить жидкого 13С гиперполяризацию [1- 13 C] пирувата, = 1 ± 0,2%. Повышение получены в твердом состоянии для пирувата былодостаточным для целей эксперимента, хотя более высокие усовершенствования были продемонстрированы с использованием различных радикалов. 5 Время данные курс подходит со стадии 7.1 дает меру постоянной времени релаксации. Пируват продольной релаксации в смеси состоят из 500 мкл DNP повышенной раствора и 500 мкл D 2 O, был Т 1 = 75 ± 5 сек после коррекции ВЧ (см уравнение (3)).
Ферментативная активность и метаболические измерения
Растворение DNP ЯМР обнаружение 13С-меченого субстрата (A) может быть использовано, чтобы следовать в динамике ферментативного превращения реального времени и наблюдать образование продукта (B):
Сразу после инъекции гиперполяризованного подложке (A),сигнал продукта (B) является нулевым. Затем ферментативного превращения (1) начинает производить (Б). Намагниченность ядер 13 С не зависит от различных химических сдвигов и химическому изменению молекул. Тем не менее, новая среда может привести к различным продольных скоростей релаксации для 13 C в B. Сигнал времени продукт Конечно можно качественно отделена в три этапа: в начале, ферментативное превращение преобразования А в В приводит к увеличению сигнала B; через некоторое время, в зависимости от условий эксперимента, потери намагниченности за счет релаксации, сбалансировать это увеличение и сигнал B достигает максимума; наконец, при более длительном времени, сигнал B ослабевает из-за продольной релаксации. В гипотезе ферментного насыщения, пренебрегая обратно преобразование и с учетом магнитной релаксации, намагниченность двух видов молекул (А и В) в течение ферментативного превращения может быть описано с помощью куПСД система дифференциальное уравнение: 22
где М (А, В) (Т) намагниченности молекулярные частицы А и В, соответственно, к эфф эффективная константа скорости конверсии для передачи сигнала по ферментативной реакции и R (A, B) являются очевидные продольные константы скорости релаксации наблюдаемых ядер в молекулярных частиц а и в, соответственно R (A, B) учитывать как чистого продольной релаксации намагниченности и эффекта ВЧ пульсации.:
где Т 1, (A, B) является продольная релаксацияПостоянная времени ядра в местном молекулярной среде молекулярных частиц А и В, соответственно. θ и τ являются угол ВЧ флип и задержка между двумя поглощений сигнала, соответственно.
В этом исследовании, субстрат А и продукт Б были [1- 13 С] пируват и [1- 13 С] лактат, соответственно, и цель была не измерить [1- 13 C] лактат производства по ЛДГ в условиях, когда нет (изотопно немеченного) лактат присутствует в растворе в начале эксперимента. Измерения состоит из серии 13 спектров C, записанный с помощью простого последовательности pulseacquire при Т = 21 ° С. Калиброванный 10 ° флип угол импульса был использован для последовательных возбуждений (шаг 9). Задержка между двумя последовательными импульсами τ = 1,5 сек. Последовательность приобретение ЯМР было начато несколько десятков секунд до гиперполяризованным Solutионная инъекции. Концентрация пирувата субстрат в пробирку после инъекции был 25-35 мМ. На шаге 10 лактата в скорости преобразования пирувата при концентрации ЛДГ 10 -3 ед / мл измеряли. Записанный сигнал от лактата и пирувата вписывается модель в уравнении (2) (пунктирная линия на рисунке 5) и получением K эфф = 0,9 ± 0,1 × 10 -3 с -1 (рисунок 5). Эта величина согласуется с начальной скоростью реакции определяется соотношением [Lac] / [Pyr] в момент времени 0 сек (рис.5, вставка).
Рисунок 1. Схемы экспериментальной установки. Поляризатор (слева) состоит из микроволнового резонатора (с), расположенной внутри криостата (г) помещают в широким отверстием 3,35 Тл сверхпроводящий магнит. Катушка ЯМР заказ (б), окружающий тон образец (а) используется для мониторинга спиновой поляризации ядерного на месте. Температура гелиевой ванны поддерживают при 1,12 ± 0,03 K то время как образец облучают СВЧ-N, Mw = 94 ГГц. Система позволяет измерение ЯМР должны быть выполнены на твердотельной образца во время поляризации. Поляризованный образец растворяют в перегретой воды и толкнул со сжатым гелием через линию передачи в пробирку ранее размещенных внутри соседней ЯМР-спектрометра (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Криостат и вакуумная система схемы. (А) криостат изоляции Дьюара; (B) вопль ostat основной вставки; (C) вакуумная система соединения; (D) Скриншот интерфейса программного обеспечения для управления с кнопками, используемыми для выполнения конкретных операций, описанных в шаге 2 и шаге 5 раздела протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. пробами и растворение. (A) вставки подготовки пробы; (Б) вкладыш растворения; (C) деталь электропневматических соединений вставки растворения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Твердотельный наращивание поляризация и гиперполяризационная сигнал распада. Растворение DNP сигналы. (А) твердотельный ЯМР поляризация наращивание сигналом 1,12 М натрий [1- 13 C] пирувата раствора во время DNP поляризации (кресты, оснащены экспоненциальной функции S (T) = А х ехр (-t / T б) + B из постоянной времени T B = 270 сек) и расслабления (кругов, S (T) = A · ехр (T / T B) + B, T SS 1 = 840 сек); (А, вставка) сравнение между DNPenhanced и термически поляризованных (масштабированных до 10 раз) сигналов намагниченности в твердом состоянии (ε сс = 22 ± 5, соответствующая твердотельного поляризации Р СС = 1,5 ± 0,3%); (Б) сравнение между первым спектром, зарегистрированного после растворения и AveraВГО спектр (расширены в 100 раз), полученного из термически поляризованного 13 C вращается при КТ с использованием 1,024 переходные (ε = 1000 ± 200). Процесс растворения принял 3,3 сек и автоматического впрыска около 2 сек с предполагаемой потери сигнала на 40%. Для экспериментов, выполненных передачи образца в ручном инъекции, дополнительные потери из-за длительной задержки впрыска, по оценкам, 30%; (В, вставка) гиперполяризационная спад сигнала пирувата после растворения в отсутствии ЛДГ (T 1 = 75 ± 5 сек). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Активность и раковая клетка метаболизм результаты ЛДГ. Наращивание [1- 13 C] лактат сигнала из-за enzymaкрестики преобразования в концентрации ЛДГ 10 -3 ед / мл с последующим распадом сигнала из-за продольной релаксации 13С намагниченности. Красная линия показывает подгонку с моделью, описанной в уравнении (2), включающий воздействие релаксации и ферментативной конверсии. (Вставка) соотношение между [1- 13 C] лактат и [1 -13 C] концентрации пирувата с экстраполяцией скорости реакции в момент времени Т = 0 (красная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические точки растворения DNP ЯМР эксперимента: (я) уровень поляризации достигается при подложки, которая определяет самую низкую концентрацию продукта, необходимого для экспериментов, а также ряд приобретений сигналов, которые могут быть выполнены и (II) времен жизни намагниченности, по сравнению с длительностью передачи между поляризацией и сайты обнаружения и к скорости трансформации субстрата. Система впрыска от установки DNP растворения, описанного здесь позволяет передавать пробы в качестве лишь 3-4 сек. Хотя передача не была столь быстрым, как в методике, предложенной С. Боуэн и C. Hilty, 26 поляризационные потери для пирувата были ограничены из-за умеренного продольной релаксации в слабом поле. [1- 13 C] пируват, с его длинной карбоновой ядерной T 1, позволяет измерять поток через ЛДГ в таких низких концентрациях, как 10 -3 ед / мл.
Высокий коэффициент сигнал-шум получены при использовании растворение ДНФ предполагает, что можно быть чувствительны даже к нижней [1- 13 С] пируват концентрациях и более низкие скорости ферментативного превращения. Достигнутый уровень поляризации дает более 200 экспериментов со значительным отношением сигнал-шум, чтобы быть приобретены в жидкого состояния ЯМР-спектрометра с использованием низкого угла флип а = 10 °. Это оставляет место для оптимизации как с точки зрения времени повторения и углов флип. Для наращивания поляризации в твердом состоянии некоторые молекулы также поляризовать с некоторыми поляризационных агентов (темп, OXO63) 4, а другие нет, по причинам, которые еще не до конца изучены. Экспериментальные испытания являются единственным способом определить стадию поляризация является ли успешным. Чтобы повысить уровень поляризации, можно изучить возможность использования различного радикального видов 4 и применения различных методов, опирающихся на «кросс-поляризации '. 25
ontent "> Дальнейшая оптимизация радикальных и подложки концентраций, а также от состава растворителя в образце DNP можно попытались улучшить поляризацию. Методика ограничено молекул, в которых ядро или группа ядер в состоянии поддерживать поляризацию после растворения может быть идентифицированы. Поляризация может быть устойчивым либо как дисбаланс между моно-ядерный собственных состояний в сильных магнитных полях или в виде LLS делокализованы на двух или более связанных ядер. для первого варианта, ядро зонд должен быть отдален от других ядер с высокой гиромагнитные отношения, такие как протоны. Если такая позиция не найдена, естественно, обогащение ЯМР-активных ядер при изолированных участков в молекуле или замены протонов в непосредственной близости от активных ядер дейтронов, чтобы понизить магнитную напряженность дипольного, необходимы . для получения LLS, теоретический анализ магнитных муфт внутри групп ядер может осуществляться 27,28 чтобы найти оптимальные средства для Suppорт поляризации. Эта стратегия оказалась успешной в небольших молекул, таких как аминокислоты 29 и может быть применен к другим молекулам, участвующих в метаболических циклах, представляющих интерес. Чтобы лучше сохранить намагниченность в ходе эксперимента, сочетание растворения DNP с возбуждением ДЛИ обещает расширить промежуток времени измерения для других ферментативных реакций. 20Эксперимент DNP-ЯМР описано здесь приспособлен для измерения пирувата в раковых клетках. 6 измерение в режиме реального времени ферментативной активности путем растворения DNP повышена ЯМР может помочь текущие усилия в диагностике рака путем DNP-МРТ, уже используются в клиника. 12 молекулярная специфичность DNP-усиленной ЯМР делает его методом выбора для различения молекулярных мишеней и продуктов их превращений. Дальнейшее совершенствование будет сосредоточена на оценке других молекулярных индикаторов для метаболических превращений 30
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не конкурируют финансовые интересы
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора JJ ван дер Klink за помощь в выборе и монтаже оборудования, а также д-ра Ф. Катеб и д-ра Г. Bertho за полезные обсуждения. AC была поддержана Национальным научным фондом Швейцарии (грант PPOOP2_157547). Мы признаем финансирование из Парижской Сорбонны Сите (ЯМР @ Com, DIM Analytics, мэрии Парижа, в Fondation де ла Recherche MEDICALE (FRM ING20130526708), и Parteneriat Hubert Кюрьен Бранкузи 32662QK. Наша команда является частью Equipex программ Париж-ан-резонансной и CACSICE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNP polarizer | Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) | /// | Cryostat and electronic equipment for sample polarization |
| Vacuum system components | Edwards vacuum (France) | Various | - turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components |
| DNP 3.35T Magnet | Bruker (France) | ||
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker (France) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (US) | Data analysis software | |
| Chemicals | |||
| SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C | Sigma Aldrich (France) | 490709 | |
| ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D | Sigma Aldrich (France) | 186414 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO 97% | Sigma Aldrich (France) | 176141 | |
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich (France) | 151882 | |
| reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) | Sigma Aldrich (France) | ||
| ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich (France) | ||
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich (France) | ||
| phosphate buffer, pH = 7.0 | Sigma Aldrich (France) | ||
| LDH enzyme in | Sigma Aldrich (France) | L-2500 | |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma Aldrich (France) |
References
- Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
- Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395 (1978).
- Wolber, J., Ellner, F., et al. Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization. Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).
- Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals. PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
- Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging. JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).
- Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction. An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).
- Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR. NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).
- Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy. Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).
- Lerche, M. H., Meier, S., et al. Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism. NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).
- Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108 (2013).
- Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
- Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function. Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).
- Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields. PRL. 92 (15), 153003 (2004).
- Carravetta, M., Levitt, M. H. Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field. J. Chem. Phys. 122 (21), 214505 (2005).
- Vasos, P. R., Comment, A., et al. Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization. PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).
- Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance. JMR. 239, 81-86 (2014).
- Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution. JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).
- Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution. Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).
- Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer. MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).
- Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).
- Comment, A., van den Brandt, B., et al. Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner. Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).
- Balzan, R. Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, EPFL - EDPY. Available from: http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf 1-140 (2013).
- Bornet, A., Melzi, R., et al. Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization. JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).
- Bowen, S., Hilty, C. Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy. PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).
- Cavadini, S., Vasos, P. R. Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy. Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).
- Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Long-lived States in Multiple-Spin Systems. Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).
- Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states. Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).
- Sarkar, R., Comment, A., et al. Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization. JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).
