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Chemistry

Dissolution Polarisation Dynamique Nucléaire Instrumentation pour en temps réel la vitesse de réaction enzymatique mesures par RMN

Published: February 23, 2016 doi: 10.3791/53548
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1LCBPT - UMR8601, Institut de Chimie, Université Paris Descartes, 2Institute of Physics of Biological Systems, EPFL, 3PARCC - INSERM U970, Université Paris Descartes

Abstract

La principale limitation des enquêtes à base de RMN est faible sensibilité. Cette demande pour des temps d'acquisition longues, empêchant ainsi les mesures de RMN en temps réel des transformations métaboliques. Hyperpolarisation par dissolution DNP contourne une partie de la sensibilité émet grâce à la grande magnétisation nucléaire hors d'équilibre résultant de la cession polarisation de spin électronique à noyau. Le signal de RMN haute obtenu peut être utilisé pour contrôler des réactions chimiques en temps réel. L'inconvénient de hyperpolarisé RMN réside dans la fenêtre de temps disponible pour l'acquisition du signal, qui est généralement de l'ordre de la direction longitudinale constante de temps de relaxation de spin nucléaire, T 1, ou, dans les cas favorables, de l'ordre de la constante de temps de relaxation associé à la-singulet de noyaux couplés, T LLS. absorption cellulaire de molécules endogènes et les taux métaboliques peut fournir des informations essentielles sur le développement de la tumeur et la réponse aux médicaments. Nuétudes RMN hyperpolarisés précédentes nom- ont démontré la pertinence de pyruvate comme substrat métabolique pour surveiller l'activité enzymatique in vivo. Ce travail fournit une description détaillée du dispositif expérimental et les méthodes nécessaires à l'étude des réactions enzymatiques, en particulier le taux de pyruvate à lactate conversion en présence de lactate déshydrogénase (LDH), par RMN hyperpolarisé.

Introduction

Polarisation nucléaire dynamique (DNP), 1,2 une technique visant à renforcer la polarisation de spin nucléaire, à savoir, le déséquilibre entre le «haut» et les populations «bas» de spin (P = [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), a été introduit dans les années 1950. Spins nucléaires tels que 13 C peuvent être polarisés jusqu'à P = 10 -1 dans des conditions favorables, typiquement à une température de l'ordre de 1 K et dans un champ magnétique de 3.357 T. 3,4 Une percée pour les applications biologiques est venu dans la début des années 2000 avec le développement de dissolution DNP qui consiste à dissoudre les échantillons polarisés gelés dans de l'eau surchauffée, tout en conservant le niveau de polarisation nucléaire à haute obtenue à basse température. 5 le signal RMN à l'état liquide est améliorée d'un facteur 10 3 -10 4 par rapport à communthermiquement polarisée conditions RT RMN. Dissolution DNP fournit donc un moyen de non-invasive mesure biochimique des vitesses de réaction in situ en temps réel, ce qui permet une dynamique de contrôle par RMN avec une résolution temporelle de 1 s ou moins. 6 - 10 Il est également devenu possible de détecter des analytes à des concentrations très faibles 11.

Parmi les modalités moléculaires imagerie non invasives, RMN hyperpolarisé est la seule technique qui permet de mesurer à la fois un substrat et ses produits métaboliques, en temps réel. Dissolution DNP a été accueillie avec enthousiasme dans divers domaines scientifiques allant de in vitro RMN à l'IRM clinique 12 et les applications les plus prometteuses sont liées à la surveillance in situ du métabolisme. 13,14 La principale limitation de dissolution DNP est que, après un certain temps sur l'ordre de cinq fois le temps de relaxation longitudinale T 1 constant, la améliorée polairesation est perdue. Il est donc nécessaire d'utiliser des molécules portant des spins nucléaires présentant relativement longue T 1. Pour prolonger le laps de temps de la mise en valeur de polarisation, lentement-détente états de spin nucléaires, dites d'état à long terme (LLS), peuvent être utilisés 15 -. 17 LLS sont insensibles à l'intra-paire dipôle-dipôle interaction, de sorte que leur temps de relaxation caractéristique constante, T LLS, peut être beaucoup plus longue que T 1. 18 Une durée de vie de l'aimantation de dizaines de minutes et jusqu'à 1 heure pourrait donc être obtenu, 19,20 et LLS ont été proposés à la fois pour la spectroscopie par résonance magnétique (SRM) et l'IRM. 21

Les principaux points qui doivent être soigneusement optimisée pour l'étude des taux de réaction enzymatique par hyperpolarisé RMN sont les suivants: (i) maximiser la polarisation à l'état solide et (ii) de minimiser la perte de polarisation pendant le transfert de la solution de la hyperpolarisépolariseur vers le spectromètre de RMN. Cet article décrit l'adaptation d'un système d'appareils et injection DNP dissolution sur mesure pour étudier les réactions enzymatiques. Les caractéristiques et les performances de l'installation seront démontrés avec le substrat hyperpolarisé bien connu et largement utilisé [1- 13 C] pyruvate. Les principales raisons de ce choix sont, en premier lieu, son naturellement longs 13 C temps de relaxation longitudinale (T 1> 50 secondes à des champs magnétiques élevés et des températures supérieures à 293 K) qui permet des réactions de surveillance pendant plusieurs minutes, et, d'autre part, son rôle central dans cancer métabolisme. 13,14 Utilisation dissolution DNP RMN et un système d'injection développé sur mesure, l'oxydation du pyruvate catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH) peuvent être surveillés en présence d'un groupe initial de lactate non marqué 9,22 ou sans lactate ajoutée non marqué , comme montré ici. Il a été montré que le [1- 13 C] lactate de signal mesuré en vivo (y compris dans les cellules) après l'injection de hyperpolarisé [1- 13 C] pyruvate est principalement due à un échange d'étiquettes rapide entre pyruvate et lactate plutôt que de la production de lactate. 6

Nous présentons ici la production en temps réel de [1- 13 C] lactate à partir de pyruvate hyperpolarisé [1- 13C] injecté dans un tube de RMN LDH contenant initialement mais pas le lactate.

Description du système
Il y a deux parties principales dans une configuration dissolution de DNP (Figure 1): le polariseur de DNP et le spectromètre RMN. L'élément principal du polariseur DNP est un cryostat de refroidissement de l'échantillon à environ 1 K dans un bain d'hélium pompé. Le cryostat est inséré dans un aimant supraconducteur 3,35 T et a une géométrie qui garantit avoir l'échantillon de polarisation à l'isocentre de l'aimant (figure 1). À l'intérieur du cryostat, l'échantillon (a) est entouré par une bobine RMN (b), pour mesurer la polarisation buildup, contenu dans une cavité à micro-ondes overmoded (c). L'échantillon entier est maintenu à basse température dans un bain d'hélium pompé (d) et irradié avec des micro-ondes à travers le guide d'ondes. L'ensemble du système est géré par un logiciel sur mesure (figure 2D).

Le matériel et l'équipement cryogénique nécessaire pour effectuer DNP et la dissolution subséquente sont toujours un défi technologique. Un nouveau cryostat DNP 23,24 a été développé et testé pour déterminer ses performances cryogéniques et optimisée pour le refroidissement rapide, l'hélium hold-temps et la consommation globale d'hélium minimale pendant le fonctionnement.

Le cryostat est constitué de deux parties. La première partie du cryostat est le dewar d'isolation (figure 2A) qui peuvent être plus ou moins séparé dans la partie supérieure (a) la queue, ou de l'espace de l'échantillon (b), et de la chambre à vide externe (OVC) conservés sous vide poussé et le logement du écrans à rayonnement (c). La deuxième partie du cryostat est le principalSERT (figure 2B), placé dans le vase de Dewar d'isolation, où tous les règlements de flux sont gérés. L'hélium liquide provenant du Dewar de stockage externe à travers la ligne de transfert (a), est dans la première étape condensé dans le séparateur (b), une chambre intermédiaire utilisé à la fois pour maintenir la partie supérieure du froid cryostat et d'éliminer l'hélium évaporé pendant le transfert. La pression du séparateur est abaissée par pompage à travers un capillaire (c) enroulé autour de la partie supérieure du cryostat; le flux d'hélium froid dans ce capillaire est utilisée pour refroidir les déflecteurs (d) et les écrans de rayonnement dans le dewar d'isolation (OVC). L'échantillon est placé et polarisé dans l'espace d'échantillon. L'espace d'échantillon est connectée au séparateur via un autre tube capillaire (e), enroulé autour de la queue de l'insert principal cryostat. Ce capillaire peut être ouvert ou fermé par une soupape à pointeau actionnée manuellement de l'extérieur.

Pour atteindre la basse température utilisée au cours de la pr DNPocessus, hélium liquide doit être recueillie dans l'espace de l'échantillon de cryostat et sa pression abaissée à la gamme mbar. Les opérations nécessaires pour le fonctionnement du cryostat sont exécutées par un système de pompage assez complexes avec trois ensembles de pompes, contrôlées et gérées en différents points avec des instruments électroniques et électro-mécaniques (figure 2C). Le cryostat OVC doit être pompé à un vide poussé par le premier système de pompage. Ce système se compose d'une pompe turbomoléculaire soutenue par une pompe rotative (A). L'hélium liquide est transféré à partir du vase de Dewar de stockage (b) à travers l'entrée de transfert de cryostat de la ligne vers le séparateur de cryostat. Le séparateur comporte une sortie connectée au second groupe de pompage. Cet ensemble est composé d'un / h pompe 35 m 3 de membrane (c). Cette ligne permet l'évacuation du gaz d'hélium bouillie pendant le transfert à partir du vase de Dewar et au cours du refroidissement du séparateur. L'hélium liquide collecté dans le séparateur peut alors être transféré vers l'espace d'échantillon à travers le bouchonIllary tubes décrits ci-dessus. Pour transférer l'hélium liquide du séparateur à l'espace de l'échantillon et par la suite à la pression de l'espace de l'échantillon inférieure en mbar gamme, un troisième système de pompage composé d'un 250 m 3 / h Roots pompe soutenu par une / h pompe rotative 65 m 3 (d) est reliée à travers le cryostat une vanne papillon manuelle (e).

Toutes les opérations du système de vide sont contrôlés et régulés par un dispositif sur mesure électropneumatique (f). Cet appareil contrôle les connexions de la ligne de vide entre le séparateur de cryostat (g) et de l'espace d'échantillon (h) des points de vente, les deuxième, troisième systèmes / de pompage (C, D), une bouteille d'hélium comprimé (i) et l'extérieur. La communication entre (f) et l'extérieur passe à travers un clapet anti-retour (j). Le dispositif électro-pneumatique (f) ainsi que tous les paramètres du système et le matériel de dissolution sont contrôlés et exploités par un dispositif électronique USB interface avec un PC commun sur-mesure. Enfin tout le système, par l'électroniquedispositif, est géré par-mesure logiciel autonome (figure 2D) où les opérations concernées sont lancés à travers une interface en utilisant les boutons de logiciels.

Pour gérer l'échantillon et mesurer le signal RMN accumulation à l'état solide une série d'inserts sont utilisés (figure 3A). Pour préparer le cryostat pour une polarisation, placer l'échantillon principal insert (a), dans le cryostat. L'échantillon principal insert est muni d'une bobine RMN (b) placé à l'intérieur d'une cavité à micro-ondes doré overmoded. Pré-gel du substrat contenant la solution devant être polarisé (solution polarisation) à la température de l'azote liquide dans un récipient d'échantillon approprié et le placer à la partie inférieure du porte-échantillon de fibre de verre (c) d'extrémité. Faites glisser le porte-échantillon dans l'échantillon principal insert pour atteindre l'isocentre de l'aimant. Insérer le guide d'ondes plaqué or (d) dans le porte-échantillon. Le guide d'ondes micro-onde permet la généré à partir d'une source micro-onde externe de voyager avec des pertes minimes to l'échantillon.

Le logiciel sur mesure pour la gestion du cryostat gère automatiquement, lorsque vous cliquez sur le bouton de l'interface correspondante, différentes opérations comme temps de recharge (la température du cryostat est abaissée proche de la température de l'hélium liquide), de remplissage (le cryostat est rempli d'hélium liquide à un niveau prédéterminé ), une étape supplémentaire de refroidissement de 1 K T (le bain d'hélium liquide est pompé pour atteindre la température la plus basse possible), mise sous pression (le cryostat est mis sous pression légèrement supérieure à la pression ambiante à P = 10 à 30 mbar pour permettre cryostat ouverture sans risques de contamination du cryostat par l'air) et de la dissolution (procédure automatique pour dissoudre l'échantillon de DNP et transférer la solution résultante hyperpolarisé au site de mesure, à savoir le spectromètre RMN).

La polarisation est effectuée irradier l'échantillon avec un micro-ondes à 94 GHz (dans un champ de polarisation B 0 T DNP, où T DNP est le temps de polarisation de l'accumulation. T DNP est du même ordre de grandeur que le temps de relaxation longitudinale des noyaux cibles à l'état solide sur le terrain et température donnée. Dans toutes nos expériences, l'échantillon a été polarisée pendant plus de 5 T DNP.

A la fin du temps de polarisation, l'échantillon doit être dissous dans une solution à température ambiante afin d'être utilisé pour la mesure de l'activité enzymatique. Au cours du processus de dissolution, 5 ml d'surchauffée D 2 O à partir de la chaudière de la plaquette de dissolution (figure 3B) sont poussés par comprimé de l'hélium gazeux (P = 8.6 bar) pour accéder à l'échantillon DNP améliorée et le dissoudre. La solution résultante hyperpolarisé est poussé hors de l'insert de dissolution par le gaz d'hélium comprimé, à travers la sortie d'insertion de la dissolution (figure 3C-b 23 Le temps nécessaire pour le transfert de l'échantillon à partir du polariseur DNP sur le site du spectromètre RMN est d'environ 3 sec.

Le processus de dissolution est effectué en utilisant un insert de dissolution (figure 3B). L'insert de dissolution est composé d'un ensemble électronique-pneumatique (a), un bâton en fibres de carbone (b) contenant des tubes de raccordement entre la chaudière dans l'ensemble pneumatique et le casier de conteneurs d'échantillons (c), ce qui permet un couplage étanche avec l'échantillon récipient, et à l'arrière vers la sortie. L'ensemble électro-pneumatique (figure 3C) est utilisée pour produire et conduire surchauffée D 2 O à travers le bâtonnet de fibres de carbone pour le récipient d'échantillon, puis à extraire la solution hyperpolarisé à partir du cryostat. L'ensemble électro-pneumatique est composé de valves pneumatiques (a) et qui éliminent les liaisons entre le cohélium mpressed (P = 6-8 bar) ligne (b), la chaudière (c) où le D 2 O est injecté par la soupape (d), et la sortie (e) par le bâton de fibre de carbone (f). Le système est complété par un G à la pression, d'un thermomètre et d'un fil résistif de chauffage dans la chaudière (c), une gâchette (h) et une zone de raccordement (i) utilisé pour interfacer le système avec le dispositif de gestion électronique.

Le cryostat DNP et le spectromètre RMN sont reliés par une ligne de transfert, à savoir un tube en PTFE de 2 mm de diamètre interne à l'intérieur duquel la solution hyperpolarisé est poussé par de l'hélium sous pression (P = 8.6 bar) lorsque la dissolution est déclenchée.

La séquence de dissolution se compose des opérations suivantes: dans les 300 premières millisecondes, surchauffée D 2 O est poussé vers le récipient d'échantillon afin de faire fondre et dissoudre la solution congelée hyperpolarisé. Ensuite, la solution hyperpolarisé est extraite du cryostat par moyen de pressionsurized (P = 8.6 bar) de l'hélium gazeux et poussée à travers le tube en PTFE de diamètre intérieur de 2 mm (figure 3C-E) à l'endroit où la mesure où l'injection est réalisée avec l'un des modes opératoires décrits à l'étape 6.2.1 ou l'étape 6.2 .2.

Le deuxième volet de la dissolution configuration DNP RMN est le spectromètre RMN. Dans l'installation décrite ici, le spectromètre de RMN fonctionnant à un champ B 0 = 11,7 Tesla. Une sonde de RMN de 5 mm est utilisé pour mesurer le signal hyperpolarisé après la dissolution. Le spectromètre de RMN est exploité par la console RMN, utilisé à la fois à l'état solide et l'état liquide mesures de RMN et le XWINNMR logiciel cabinet fourni. Une mesure typique se compose d'une impulsion forte à faible angle de basculement (soit calibré, pour liquidstate ou non-étalonné, pour les mesures à l'état solide), suivie par les acquisitions de signal.

Mesures du signal de polarisation thermique à l'état solide et si DNP dérivésgnal accumulation sont effectuées à l'aide de la bobine sur mesure 13 C au niveau du site du polariseur DNP (figure 3AB) couplé au spectromètre RMN. Dans ce cas particulier, le spectromètre RMN ne réalise pas de verrouillage de signal. Lorsque les mesures à l'état solide sont réalisées, afin d'éviter des perturbations importantes à la polarisation, le temps de retard entre les acquisitions doit être suffisamment long, à peu près plus de 0,5 T DNP.

La mise en valeur à l'état solide est définie comme Equation4 où Equation5 est le signal hyperpolarisé (obtenu à l'étape 3.3) et Equation6 le signal est à l'état solide (obtenu à l'équilibre thermique à la température de l'hélium liquide pompé à l'étape 3.2) (figure 4A). Ce paramètre defines la polarisation maximale disponible pour les expériences de RMN, avant pertes inévitables lors du transfert de la solution hyperpolarisé. La mesure est effectuée avec une séquence d'impulsions acquérir simple en utilisant une impulsion d'angle faible bascule non-étalonné. calibration d'impulsion est généralement ignorée pour les mesures SolidState.

Une procédure analogue peut être utilisé pour déterminer l'amplification du signal hyperpolarisé à l'état liquide. Dans ce cas, l'échantillon placé dans le tube de spectromètre avant l'injection (étape 6.2) est composé de 500 ul de D 2 O. Après dissolution et d'injection, il existe deux paramètres importants à surveiller. La première est le renforcement hyperpolarisé au site de spectromètre RMN, Equation7 (Figure 4B), où Equation8 est le signal juste après l'injection de l'hyper solution polarisée (obtenu à l'étape 7.1) et Equation9 est le signal de polarisation thermique (obtenu à l'étape 7.2). Le second est le temps de relaxation longitudinale T 1 (Figure 4B, encadré), associée avec le substrat et chaque produit métabolique (obtenus par des signaux d'ajustement exponentielle obtenue à l'étape 7.1). Ces deux paramètres définissent la concentration minimale de substrat nécessaire pour obtenir un rapport suffisant signal sur bruit (SNR) et la fenêtre de temps disponible pour la mesure des transformations métaboliques. Le rapport entre la polarisation à l'état solide Equation10 et la polarisation liquidstate Equation11 donne une estimation des pertes de polarisation dues à la relaxation pendant le transfert de solution hyperpolarisé. Une valeuration12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> devrait être observée en l'absence de pertes de relaxation.

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Protocol

NOTE: Toutes les analyses des données a été réalisée en utilisant un logiciel commercial.

1. Préparer la solution polarisant

  1. Préparer 2 ml de pyruvate de sodium 1,12 M 13 C-marqué (Na + [CH 3 -CO- 13 COO] -, substrat) dopée avec une solution 33 mM de TEMPOL radical (4-hydroxy-2,2,6,6- tétraméthylpipéridine-1-oxyle, un agent polarisant) 4 à 2: 1 D 2 O / D 6 -éthanol C pendant 13 observations. ATTENTION: Précautions de manipulation doivent être prises en raison de la nature inflammable des d6 éthanol.
  2. Vérifiez que la concentration de radicaux est optimale en termes de polarisation atteint.
    1. Changer légèrement la concentration radicale de la solution au point 1.1 (par exemple, à 30 mm ou 35 mm).
    2. Déterminer de manière itérative l'amélioration à l'état solide (voir l'étape 3) et de trouver la concentration de radicaux qui conduit à la mise en valeur maximale.

2. Polarization

  1. Baissez la température du cryostat DNP par la procédure de recharge. Cliquez sur le bouton «Recharge» sur l'interface du logiciel de cryostat (figure 2D).
  2. Recueillir l'hélium liquide dans le cryostat DNP par la procédure de remplissage. Cliquez sur le bouton «de remplissage» sur l'interface du logiciel de cryostat (figure 2D).
  3. Placer 300 ul de la solution de polarisation optimisé obtenu à l'étape 1.1 dans le récipient d'échantillon fourni avec le polariseur DNP. Congeler le conteneur d'échantillon avec l'échantillon à l'intérieur en immergeant doucement dans un bain d'azote liquide.
  4. Éliminer l'azote liquide qui peut être présent dans le conteneur d'échantillon après la procédure de congélation (étape 2.3) en extrayant le conteneur d'échantillon du bain d'azote liquide et à faire tourner à l'envers.
    NOTE: Cette étape est cruciale pour obtenir une dissolution complète de l'échantillon (voir l'étape 5).
  5. Insérer l'échantillon dans le cryostat.
    NOTE: Ce Step, composé de la sous-étape suivante doit être réalisée rapidement (par exemple, en moins de 10 à 20 secondes) afin d'empêcher l'échantillon de la fonte.
    1. Insérer le conteneur d'échantillon dans le porte-échantillon. Insérez le porte-échantillon dans le cryostat principale insert. Insérer le guide d'onde de micro-ondes dans le porte-échantillon.
  6. Baissez la température du cryostat en démarrant la procédure 1 K de refroidissement. Cliquez sur le bouton "1K refroidissement» sur l'interface du logiciel de cryostat (figure 2D).
  7. Mettez la source de micro-ondes sur et irradier l'échantillon. Cliquez sur le 'MW-ON "bouton sur l'interface du logiciel de cryostat (figure 2D).

3. RMN des solides mesures

  1. Déconnecter le câble coaxial du canal de détection de la console de RMN provenant de la bobine en faisant tourner le spectromètre de connecteur dans le sens antihoraire de 90 ° et en le tirant. Brancher le câble coaxial de la voie de détection sur le connecteur coaxial du cryostatbobine RMN. Insérez le connecteur mâle du câble de la console RMN dans le connecteur femelle de la bobine de RMN du cryostat, en accordant une attention à la broche d'orientation; appuyez fermement et tourner le connecteur dans le sens horaire de 90 °.
  2. Mesurer le signal thermique RMN à l'état solide sur le site de cryostat utilisant une simple séquence d'impulsions acquérir avec de faibles impulsions flip-angle de non-étalonné répétées à un intervalle de T = 5 min. Après la mise en place de la mesure, écrire dans la ligne de commande du logiciel "ZG" et appuyez sur la touche «Entrée» du clavier. Reportez-vous au manuel d'utilisation RMN du spectromètre pour de plus amples détails sur le fonctionnement du spectromètre et de la configuration de mesure.
  3. Mesurer le signal RMN DNP-renforcée. Répéter les opérations de l'étape 3.2 après le lancement du processus DNP comme décrit à la section 2.
  4. Déconnecter le câble de détection de canal coaxial de la console de RMN à partir de la bobine de RMN du cryostat par une rotation dans le sens antihoraire de raccordement de 90 ° et en le tirant. Branchez le câble coaxial de la detection canal au connecteur coaxial de l'enroulement du spectromètre. Insérez le connecteur mâle du câble de la console RMN dans le connecteur femelle de la bobine du spectromètre, en accordant une attention à la broche d'orientation; appuyez fermement et tourner le connecteur dans le sens horaire de 90 °.

4. Optimiser l'homogénéité de l'aimant principal champ ( 'Calage')

  1. Placez dans le spectromètre un tube contenant 500 pi de mélange produit dans les expériences précédentes (par exemple, après l'étape 6.2).
  2. Effectuer spectromètre RMN calage en faisant varier le courant dans les bobines de gradient de calage à la recherche d'un maximum de 'verrouiller' signal du deutérium. Sélectionnez la bobine de calage pertinente en appuyant sur le bouton correspondant sur la console RMN.
    1. Tourner le bouton sur la console de RMN pour déterminer le sens de rotation qui augmente le signal de verrouillage. Continuer à tourner jusqu'à ce que le signal atteint un maximum. Choisir une autre bobine de calage et de répéter l'ONU de maximisationtil un maximum local pour toutes les bobines de calage se trouve. Reportez-vous au manuel d'utilisation RMN du spectromètre pour plus de détails. A la fin, retirer l'échantillon utilisé pour le blocage.

5. Dissolution

  1. Introduire 5 ml de D 2 O dans la chaudière d'insertion de dissolution. Pressuriser et chauffer le D 2 O au moyen du fil résistif jusqu'à 180 à 200 ° C de T soit atteinte. Cliquez sur le bouton «Préparer Heater 'sur l'interface du logiciel de cryostat (figure 2D).
  2. Après l'achèvement de la procédure de polarisation de l'échantillon (par exemple, après 3 T DNP), pressuriser le cryostat légèrement supérieure à la pression ambiante. Cliquez sur le bouton 'SS' opérations sur l'interface du logiciel de cryostat (figure 2D). Retirez le guide de micro-ondes de l'insert de dissolution.
  3. Faire glisser la plaquette de dissolution (figure 3B) vers le bas dans le porte-échantillon (figure 3A-c). L'insert de dissolution doit atteindre le fond du porte-échantillon et doit être poussé fermement pour établir une connexion étanche avec le récipient d'échantillon afin d'éviter une fuite D 2 O dans le cryostat.
  4. Appuyer sur la gâchette du matériel (figure 3C-h) pour commencer la séquence de dissolution, une séquence cadencée prédéterminée d'opérations de vannes pneumatiques.

6. injection

  1. Avant la dissolution place un tube de RMN de 5 mm, contenant 500 pi d'échantillon (par exemple, D 2 O pour Equation13 la mesure à l'étape 7 ou LDH solution provenant de l'étape 8 pour la mesure de l'activité enzymatique dans l'étape 9), dans l'isocentre du T spectromètre RMN 11,74 (voir l'étape 4).
  2. Juste après la dissolution (étape 5), mélanger 500 pi de solution hyperpolarisé avec l'échantillon placé dans le spectromètre de RMN à l'étape 6.1.
    1. Injection manuelle: recueillir le hyperpolarisésolution à la fin d'un long tube de transfert de 2,5 m dans un bêcher en verre placée à proximité de l'aimant du spectromètre de RMN. injecter manuellement 500 ul de solution hyperpolarisé dans le tube à échantillon RMN à travers un système capillaire sur mesure.
    2. injection automatique: avant que le processus de dissolution, connecter le tube de transfert d'un dispositif automatisé d'injection sur mesure qui sépare la solution hyperpolarisé du gaz d'hélium utilisé pour le transfert. Le dispositif délivre automatiquement 500 ul de solution hyperpolarisé dans le tube de l'échantillon.

7. Liquide L'état-RMN mesure

  1. Après la dissolution, mesurer le signal hyperpolarisé RMN de l'échantillon dans le spectromètre par une série de 10 ° bascules angle séquences d'impulsions acquièrent espacées de 1,5 sec pour suivre la progression de l'aimantation du substrat (A) et le produit (B). Après la mise en place de la mesure, écrire dans la ligne de commande du logiciel "ZG" et appuyez sur le & #39; Enter »du clavier. Reportez-vous au manuel d'utilisation RMN du spectromètre pour de plus amples détails sur le fonctionnement du spectromètre et de la configuration de mesure.
  2. Une fois que l'aimantation est complètement détendu (par exemple, après 10 T = T 1), mesurer le signal RMN thermique par une série de 90 ° d'angle de bascule d'impulsion acquérir des séquences espacées de T = 3 T 1 ≈ 3 min. Après la mise en place de la mesure, écrire dans la ligne de commande du logiciel "ZG" et appuyez sur la touche «Entrée» du clavier. Reportez-vous au manuel d'utilisation RMN du spectromètre pour de plus amples détails sur le fonctionnement du spectromètre et de la configuration de mesure.

8. Préparation de l'enzyme contenant des échantillons (spécifique pour la transformation du pyruvate à lactate)

  1. Préparer le tampon de réaction avec la recette suivante: 50 mM de nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH), 1 mM d'acide éthylène-diaminetétraacétique (EDTA), 0,1 mM de dithiothréitol (DTT) dans un tampon phosphate 0,1 M, pH =7.0.
  2. Préparer une solution de LDH de muscle de lapin 1 U / ml fraîchement préparés dans du tampon de réaction avec 20 ug / ml d'albumine de sérum bovin, BSA.
  3. Mélanger 478 ul de tampon de réaction (étape 8.1), 20 ul de D 2 O pour permettre la stabilisation de champ du spectromètre ( «verrouillage») et une solution de LDH 2 pi (étape 7.2).
  4. Placer le volume de la solution 500 ul préparé à l'étape 8.3 dans un tube RMN de 5 mm et positionner le tube dans le spectromètre de RMN à 500 MHz.

9. complète réaction enzymatique Taux Procédure de mesure

  1. Préparer l'échantillon de polarisation (étape 1) et de la polariser (étape 2).
  2. Effectuer le calage sur le spectromètre (étape 4) et préparer l'échantillon enzymatique (étape 8).
  3. Effectuer la dissolution (étape 5) et l'injection (étape 6).
  4. Mesurer une série de signaux provenant de l'échantillon hyperpolarisé à 10 ° bascules impulsions d'angle acquisitions espacés de 1.5 sec (étape 7). Cette étape permet de mesurer l'hyperpolarisédécroissance du signal et l'accumulation de signaux de métabolites.

10. Fitting

  1. Pour chaque spectre acquis dans l'étape 9.4, identifier les pics correspondant au substrat (A) et le produit (B), respectivement, et de les intégrer (déterminer la surface des pics). Les pics intégrales donnent les cours des signaux de temps de magnétisation (M (A, B) (t), voir l'équation 2).
  2. Grâce à la solution de l'équation (2), de déterminer la valeur de F = (R A + k eff ) À partir d'un ajustement exponentiel simple du signal de substrat intégré à l'étape 10.1.
  3. Utilisation de la valeur F = (R A + k eff ) Déterminée à l'étape 10.2, déterminer k eff et R B à partir d'un ajustement du signal de produit M B (t) par la fonction obtenue en intégrant l'équation (2). Se reporter à la section des résultats Représentant (Enzymatactivité ic et des mesures métaboliques) pour plus de détails sur la correction de modélisation de la réaction, le montage et RF.

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Representative Results

Les gains de signaux de RMN en utilisant dissolution DNP
L'effet DNP consiste dans le transfert de la forte polarisation des spins d'électrons non appariés, typiquement de molécules des radicaux stables, à des noyaux de RMN-actifs, micro-ondes sous l'irradiation de l'échantillon. Les radicaux libres le plus souvent utilisés sont TAM (OXO63) et TEMPOL. 4 procédures de polarisation utilisant TEMPOL peuvent être optimisées par "polarisation croisée. 25

L'optimisation de la concentration du radical stable en vue d'obtenir le maximum de polarisation nucléaire à l'état solide est cruciale pour le succès de la technique. La concentration optimale de TEMPOL a été constaté que 33 mm dans les conditions expérimentales de cette étude. Cette polarisation du substrat choisi est suffisante pour suivre sa conversion enzymatique en temps réel.

Le champ magnétique de la Polarizer installé à Paris Descartes est B 0 = 3.35 T et les composants de ce système ont été décrites ci-dessus (figures 1 - 3). La conception du cryostat garantit que la position finale de l'échantillon coïncide avec l'isocentre de l'aimant. Le champ magnétique du polariseur était rampe et calé à l'aide des bobines supraconductrices de calage seulement, avec le cryostat en place. Le proton ligne largeur finale d'un échantillon d'eau 1 x 0,5 x 0,5 cm était de 23 KHz. Nous avons évalué Equation14 et Equation13 de [1 13 C] pyruvate. Pour ce faire, il faut d'abord déterminer le signal 13 C DNP améliorée Equation5 à l'état solide au niveau du site de polariseur avant la dissolution (figure 4A). Après dissolution, nous avons mesuré la [1-13 C] de signal hyperpolarisé pyruvate Equation8 et son déclin sur le site du spectromètre. Le signal à l'état liquide a été mesurée sur une dissolution d'essai en utilisant 500 pi de D 2 O comme échantillon dans le spectromètre RMN. Cela nous a permis de déterminer l'état solide DNP amélioration (figure 4B, en médaillon), le niveau RMN polarisation à l'état liquide (figure 4B) et les pertes de polarisation pendant le transfert. Le rapport entre les signaux mesurés à l'étape 3.3 et l'étape 3.2 définissent la mise en valeur à l'état solide, Equation14 . Le rapport entre le premier signal mesuré à l'étape 7.1 et du signal obtenu à l'étape 7.2 définit l'amélioration hyperpolarisé état liquide, Equation13 .

Les données de l'étape 3, summarized sur la figure 4A et la figure 4A (encart), montrent que cette technique permet de polariser en C 13 [1- 13C] pyruvate jusqu'à Equation14 = 22 ± 5, correspondant à une polarisation de 13 C Equation10 = 1,5 ± 0,3%.

Ce niveau de polarisation est plus de mille fois la polarisation thermique du carbone dans les conditions de MRS communs (par exemple, 11,74 T et 300 K). Les données de l'étape 7, résumés dans la figure 4B et la figure 4B (en médaillon), permettent de déterminer l'état liquide 13 C hyperpolarisation de [1- 13 C] pyruvate, Equation11 = 1 ± 0,2%. L'amélioration obtenue à l'état solide pour la pyruvate étaitsuffisante pour que le but de l'expérience, bien que des améliorations supérieures ont été mises en évidence à l'aide des radicaux différents. 5 Les données de temps de parcours correspondent à l'étape 7.1 donne une mesure de la constante de temps de relaxation. Le temps de relaxation longitudinale du pyruvate dans le mélange composé d'une solution améliorée 500 ul de DNP et 500 pi de D 2 O, a une T = 75 ± 5 secondes après la correction de haute fréquence (voir l'équation (3)).

L'activité enzymatique et les mesures métaboliques
Dissolution détection DNP RMN du 13 substrat de C marqué (A) peut être utilisé pour suivre en temps réel la dynamique de conversion enzymatique et d'observer la formation du produit (B):

équation1

Immédiatement après l'injection du substrat hyperpolarisé (A),le signal de produit (B) est nulle. Ensuite, la conversion enzymatique (1) commence à se produire (B). L'aimantation des noyaux de 13 C ne soit pas affectée par les divers déplacements chimiques et la modification chimique des molécules. Néanmoins, le nouvel environnement peut conduire à des taux de relaxation longitudinales pour le 13 C en B. Le cours produit de temps de signal peut être qualitativement séparé en trois étapes: au début, la conversion enzymatique transformant A en B produit une augmentation du signal de B; après un certain temps, en fonction des conditions expérimentales, les pertes d'aimantation due à la détente, cette augmentation de l'équilibre et le signal de B atteint un maximum; Enfin, à des temps plus longs, le signal de B se désintègre à cause de relaxation longitudinale. Dans l'hypothèse de saturation enzyme, négligeant retour conversion et en tenant compte de la relaxation magnétique, l'aimantation des deux espèces moléculaires (A et B) au cours de la conversion enzymatique peut être décrite par un couPLED système d'équation différentielle: 22

équation2

où M (A, B) (t) sont des aimantations des espèces moléculaires A et B, respectivement, k eff est la constante de vitesse de conversion efficaces pour le transfert du signal par la réaction enzymatique et R (A, B) sont les constantes de vitesse de relaxation longitudinaux apparents des noyaux observés dans l'espèce moléculaire A et B, respectivement R (A, B) représentent à la fois le pur détente de magnétisation longitudinale et l'effet de rf pulsation.:

Equation3

où T 1, (A, B) est la relaxation longitudinalela constante de temps du noyau dans l'environnement moléculaire locale d'espèces moléculaires A et B, respectivement. θ et τ sont l'angle de bascule rf et le délai entre deux acquisitions de signal, respectivement.

Dans cette étude, le substrat A et le produit B étaient [1- 13 C] pyruvate et [1- 13 C] lactate, respectivement, et le but était de mesurer [1- 13 C] la production de lactate par la LDH dans des conditions où aucune (isotope non marqué) lactate est présent dans la solution au début de l'expérience. La mesure consiste en une série de 13 spectres C enregistrée avec une séquence de pulseacquire simples à T = 21 ° C. Une impulsion d'angle de 10 ° de bascule étalonné a été utilisée pour les excitations successives (étape 9). Le délai entre deux impulsions successives est τ = 1,5 sec. La séquence d'acquisition RMN a été lancé quelques dizaines de secondes avant la solut hyperpolariséinjection d'ions. La concentration en substrat de pyruvate dans le tube d'échantillon après l'injection est de 25 à 35 mM. À l'étape 10, le lactate de la vitesse de conversion du pyruvate à une concentration de LDH de 10 -3 U / ml a été mesurée. Le signal enregistré à partir du lactate et du pyruvate cadrent bien le modèle de l'équation (2) (en pointillés sur la figure 5) et donné k eff = 0,9 ± 0,1 x 10 -3 s -1 (figure 5). Cette valeur est en accord avec la vitesse de réaction initiale déterminée par le rapport [Lac] / [Pyr] au temps 0 sec (Figure 5, en médaillon).

Figure 1
Figure 1. Schéma de l'appareil expérimental. Le polariseur (à gauche) est constitué par une cavité micro-ondes (c) situé à l'intérieur d'un cryostat (d) placée dans un alésage de l'échelle 3,35 T aimant supraconducteur. Une bobine de RMN sur-mesure (b) entourant til d'échantillon (a) est utilisé pour contrôler la polarisation de spin nucléaire in situ. La température du bain d'hélium est maintenu à 1,12 ± 0,03 K tandis que l'échantillon est irradié à mw = 94 GHz de la fréquence de micro-ondes. Le système permet la mesure de RMN à effectuer sur l'échantillon à l'état solide pendant la polarisation. L'échantillon polarisé est dissous dans l'eau surchauffée et poussé avec de l'hélium gazeux comprimé à travers la ligne de transfert dans le tube d'échantillon préalablement placé à l'intérieur d'un spectromètre de RMN à côté (à droite). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. cryostat et système de vide schémas. (A) cryostat isolation dewar; (B) cri ostat insert principal; (C) des connexions du système de vide; (D) capture d'écran de l'interface du logiciel de gestion avec des boutons utilisés pour effectuer des opérations spécifiques décrites dans les étapes 2 et 5 de la section de protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Manipulation des échantillons et de la dissolution. (A) inserts de manipulation des échantillons; (B) insert de dissolution; (C) le détail des connexions électro-pneumatique de garniture de dissolution. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"> Figure 4
Figure 4. Solid-state accumulation de polarisation et signaux Dissolution DNP hyperpolarisé décroissance du signal.. (A) de signal d'accumulation RMN polarisation à l'état solide d'un 1,12 M sodium [1- 13 C] solution de pyruvate lors d'une polarisation de DNP (croix, équipé d'une fonction exponentielle S (t) = A x exp (-t / T b) + b de la constante de temps T b = 270 sec) et de détente (cercles, S (t) = A · exp (t / T b) + b, T ss = 1 840 s); (A, encadré) comparaison entre DNPenhanced et thermiquement polarisés (échelle jusqu'à 10 fois) des signaux d'aimantation à l'état solide (ε ss = 22 ± 5, correspondant à une polarisation à l'état solide P SS = 1,5 ± 0,3%); (B) la comparaison entre le premier spectre enregistré après la dissolution et la Averaspectre ged (mise à l'échelle jusqu'à 100 fois) obtenu à partir de la chaleur polarisée 13 C tourne à RT en utilisant 1.024 transitoires (ε = 1,000 ± 200). Le processus de dissolution a pris 3.3 sec et l'injection automatique environ 2 secondes avec une perte de signal d'environ 40%. Pour les expériences effectuées transfert de l'échantillon par injection d'emploi, des pertes supplémentaires dues à la temporisation d'injection ont été estimées à plus de 30%; (B, encadré) hyperpolarisé décroissance du signal de pyruvate après dissolution dans l'absence de la LDH (T 1 = 75 ± 5 sec). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. activité et le métabolisme des cellules cancéreuses résultats de la LDH. L'accumulation de [1- 13 C] Signal lactate due à enzymaconversion tic à une concentration de la LDH de 10 -3 U / ml suivie par décroissance du signal due à la relaxation longitudinale de 13 C aimantation. La ligne rouge montre l'ajustement avec le modèle décrit dans l'équation (2), comprenant les effets de la relaxation et de la conversion enzymatique. (Encadré) rapport entre [1- 13 C] lactate et [1 -13 C] concentration en pyruvate avec une extrapolation de la vitesse de réaction à l'instant t = 0 (ligne rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Les points critiques de la dissolution expérience DNP RMN sont les suivants: (i) le niveau de polarisation atteint pour le substrat, qui détermine la concentration du produit la plus faible nécessaire pour des expériences ainsi que le nombre d'acquisitions de signaux qui peuvent être effectuées et (ii) la durée de vie d'aimantation, par rapport à la durée du transfert de la polarisation et les sites de détection et de la vitesse de transformation du substrat. Le système d'injection de l'installation de DNP de dissolution décrit ici permet le transfert de l'échantillon en aussi peu que 3 à 4 sec. Bien que le transfert n'a pas été aussi rapide que dans la méthode proposée par S. Bowen et C. Hilty, 26 pertes de polarisation pour pyruvate ont été limités en raison de la relaxation longitudinale modérée dans le domaine bas. [1- 13C] pyruvate, avec sa longue T carboxylique nucléaire 1, permet de mesurer le flux à travers la LDH à des concentrations aussi faibles que 10 -3 U / ml.

le rapport signal sur bruit obtenu en utilisant la dissolution DNP suggère que l'on pourrait être sensible à même inférieure [1- 13 C] concentrations de pyruvate, et la baisse des taux de conversion enzymatique. Le niveau de polarisation atteint offre plus de 200 expériences avec un rapport important signal-bruit à acquérir dans le spectromètre de RMN de l'état liquide à l'aide d'un faible angle de basculement a = 10 °. Cela laisse place à l'optimisation à la fois en termes de temps de répétition et des angles de bascule. Pour l'accumulation de polarisation dans l'état solide certaines molécules polarisent bien avec certains agents de polarisation (TEMPO, OXO63) 4 et d'autres pas, pour des raisons qui ne sont pas encore bien compris. Des essais expérimentaux sont le seul moyen de déterminer si l'étape de polarisation est réussie. Pour améliorer le niveau de polarisation, on peut explorer l'utilisation de différentes espèces radical 4 et l'application de différentes techniques dépendant «de polarisation croisée» 25.

ontenu "> Une nouvelle optimisation des concentrations en radicaux et du substrat ainsi que la composition de solvant dans l'échantillon DNP peut être jugé pour améliorer la polarisation. La technique est limitée à des molécules dans lesquelles un noyau ou un groupe de noyaux en mesure de maintenir la polarisation après la dissolution peut être identifié. la polarisation peut être maintenue soit comme un déséquilibre entre les états propres de mono-nucléaire à des champs magnétiques élevés ou sous la forme de LLS délocalisée sur deux ou plusieurs noyaux couplés. pour la première option, le noyau de la sonde doit être éloigné d'autres noyaux de haute rapport gyromagnétique, tel que des protons. Si une telle situation ne se trouve pas naturellement, l'enrichissement dans les noyaux actifs en RMN sur des sites isolés dans la molécule ou le remplacement des protons dans le voisinage de noyaux actifs par des deutérons, pour abaisser l'intensité du dipôle magnétique, sont nécessaires . pour obtenir LLS, une analyse théorique des accouplements magnétiques au sein des groupes de noyaux peut être réalisée 27,28 afin de trouver des moyens optimaux pour Supppolarisation ort. Cette stratégie a donné de bons résultats dans les petites molécules telles que des acides aminés 29 et peut être appliquée à d'autres molécules impliquées dans les cycles métaboliques d'intérêt. Pour mieux préserver aimantation cours de l'expérience, la combinaison de dissolution DNP avec excitation de LLS promet de prolonger le temps de mesure étendue à d'autres réactions enzymatiques. 20

L'expérience DNP-RMN décrite ici est conçue pour la mesure du métabolisme du pyruvate dans les cellules cancéreuses. 6 la mesure en temps réel de l'activité enzymatique par dissolution DNP renforcée RMN peut aider les efforts actuels en matière de diagnostic du cancer par DNP-IRM, déjà utilisé dans l' clinique. 12 La spécificité moléculaire de DNP-RMN améliorée en fait un procédé de choix pour faire la distinction entre cibles moléculaires et les produits de leur transformation. Les améliorations futures se concentreront sur ​​l'évaluation d'autres traceurs moléculaires pour métabolique transformations 30

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont pas de concurrence intérêts financiers

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr JJ van der Klink pour l'assistance dans le choix et l'assemblage de l'équipement, ainsi que le Dr F. Kateb et le Dr G. Bertho pour des discussions utiles. AC a été soutenu par le Fonds national suisse (accorder PPOOP2_157547). Nous reconnaissons financement de Paris Sorbonne Cité (RMN @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, la Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708), et l'Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Notre équipe fait partie des programmes Equipex Paris-en résonance et CACSICE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNP polarizer Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) /// Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components Edwards vacuum (France) Various

- turbomolecular pumping setup

- membrane pumping setup

- high capacity roots pumping system

- vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer Bruker (France)
Origin 8.0 OriginLab (US) Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C Sigma Aldrich (France) 490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D Sigma Aldrich (France) 186414
 4-Hydroxy-TEMPO 97% Sigma Aldrich (France) 176141
Deuterium oxide Sigma Aldrich (France) 151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0 Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in  Sigma Aldrich (France) L-2500
bovine serum albumin, BSA Sigma Aldrich (France)

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References

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Chimie Numéro 108 lactate déshydrogénase (LDH) pyruvate lactate du métabolisme Hyperpolarisation.
Dissolution Polarisation Dynamique Nucléaire Instrumentation pour en temps réel la vitesse de réaction enzymatique mesures par RMN
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Balzan, R., Fernandes, L., Comment,… More

Balzan, R., Fernandes, L., Comment, A., Pidial, L., Tavitian, B., Vasos, P. R. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J. Vis. Exp. (108), e53548, doi:10.3791/53548 (2016).

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