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Chemistry

विघटन गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण एनएमआर द्वारा वास्तविक समय enzymatic प्रतिक्रिया दर माप के लिए उपकरण

Published: February 23, 2016 doi: 10.3791/53548
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1LCBPT - UMR8601, Institut de Chimie, Université Paris Descartes, 2Institute of Physics of Biological Systems, EPFL, 3PARCC - INSERM U970, Université Paris Descartes

Abstract

एनएमआर आधारित जांच का मुख्य सीमा कम संवेदनशीलता है। यह लंबे समय के अधिग्रहण के लिए संकेत देता है, इस प्रकार चयापचय परिवर्तनों के वास्तविक समय एनएमआर माप को रोकने। DNP विघटन के माध्यम से hyperpolarization संवेदनशीलता का हिस्सा बड़े आउट-ऑफ-संतुलन परमाणु आकर्षण संस्कार इलेक्ट्रॉन नाभिक के लिए स्पिन ध्रुवीकरण हस्तांतरण से उत्पन्न करने के लिए धन्यवाद मुद्दों में गतिरोध उत्पन्न। प्राप्त उच्च एनएमआर संकेत वास्तविक समय में रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Hyperpolarized एनएमआर के नकारात्मक पक्ष यह संकेत अधिग्रहण, जो परमाणु स्पिन अनुदैर्ध्य विश्राम का समय निरंतर, टी 1, या के आदेश पर आम तौर पर है, अनुकूल मामलों में के लिए उपलब्ध सीमित समय खिड़की में रहता है, विश्राम का समय के साथ जुड़े निरंतर के आदेश पर मिलकर नाभिक के स्वेटर राज्य, टी LLS। अंतर्जात अणुओं और चयापचय दर के सेलुलर तेज ट्यूमर के विकास और दवा प्रतिक्रिया पर आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। परमाणुmerous पिछले hyperpolarized एनएमआर अध्ययनों विवो में enzymatic गतिविधि की निगरानी के लिए एक चयापचय सब्सट्रेट के रूप में पाइरूवेट की प्रासंगिकता का प्रदर्शन किया है। इस काम लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) की उपस्थिति में पाइरूवेट करने वाली लैक्टेट रूपांतरण दर, hyperpolarized एनएमआर द्वारा विशेष रूप से, प्रयोगात्मक सेटअप और तरीकों एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन के लिए आवश्यक का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है।

Introduction

गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (DNP), 1,2 एक तकनीक परमाणु स्पिन ध्रुवीकरण, यानी, 'अप' और 'नीचे' स्पिन आबादी (पी = के बीच असंतुलन बढ़ाने के लिए डिज़ाइन [एन ↑ - एन ↓] / [एन ↑ + N ↓]), पहली बार 1950 में पेश किया गया था। इस तरह के 13 सी के रूप में परमाणु Spins, अनुकूल परिस्थितियों में पी -1 = 10 अप करने के ध्रुवीकरण किया जा सकता आम तौर पर 1 कश्मीर के आदेश पर एक के तापमान पर और टी 3,4 ३.३५७ की एक चुंबकीय क्षेत्र जैविक अनुप्रयोगों के लिए एक सफलता में आया जल्दी अतितापित पानी में जमे हुए ध्रुवीकृत नमूने भंग जबकि कम तापमान पर प्राप्त उच्च स्तर को बनाए रखने में परमाणु ध्रुवीकरण होते हैं जो विघटन DNP के विकास के साथ 2000 के। 5 तरल राज्य एनएमआर संकेत बढ़ाया है एक पहलू से 10 3 -10 4 की तुलना में सामान्यthermally ध्रुवीकरण आरटी एनएमआर की स्थिति। यह भी बहुत कम मात्रा में analytes पता लगाने के लिए संभव हो गया 10 11 - विघटन DNP इसलिए एक तरह से वास्तविक समय में बगल में गैर invasively उपाय के जैव रासायनिक प्रतिक्रिया दरों में, 1 सेकंड या उससे कम की एक अस्थायी समाधान के साथ एनएमआर द्वारा निगरानी की गतिशीलता की अनुमति देता है प्रदान करता है 6।।

गैर इनवेसिव आणविक इमेजिंग तौर तरीकों के बीच, hyperpolarized एनएमआर केवल तकनीक है कि एक साथ एक सब्सट्रेट और वास्तविक समय में अपने चयापचय उत्पादों को मापने की अनुमति देता है। विघटन DNP विभिन्न वैज्ञानिक इन विट्रो एनएमआर से नैदानिक ​​एमआरआई 12 और सबसे होनहार आवेदन को लेकर क्षेत्रों में उत्साह के साथ स्वागत चयापचय के बगल में निगरानी से संबंधित हैं की गई थी। 13,14 विघटन DNP की मुख्य सीमा यह है कि, एक समय के बाद पांच बार अनुदैर्ध्य विश्राम का समय निरंतर टी 1 के आदेश, ध्रुवीय बढ़ायाization खो दिया है। इसलिए यह असर अपेक्षाकृत लंबे टी 1 का प्रदर्शन करते परमाणु स्पिन अणुओं का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। ध्रुवीकरण बढ़ाने की समय अवधि का विस्तार करने के लिए, धीरे-आराम परमाणु स्पिन राज्यों, लंबे समय रहते राज्यों (LLS) के रूप में जाना जाता है, का इस्तेमाल किया जा सकता है 15 -। 17 LLS तो उनके, इंट्रा-जोड़ी द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय बातचीत करने के लिए असंवेदनशील हैं विशेषता विश्राम का समय निरंतर, टी LLS, मिनट के दसियों की एक संस्कार जीवन भर टी 1 से ज्यादा लंबे समय तक हो सकता है। 18 और 1 घंटा अप करने के लिए इसलिए प्राप्त किया जा सकता है, 19,20 और LLS दोनों चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रस्तावित किया गया है (श्रीमती) और एमआरआई। 21

मुख्य बिंदुओं को ध्यान से hyperpolarized एनएमआर द्वारा enzymatic प्रतिक्रिया दरों के अध्ययन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है कि कर रहे हैं: (i) ठोस राज्य के ध्रुवीकरण को अधिकतम और (ii) से hyperpolarized समाधान के स्थानांतरण के दौरान ध्रुवीकरण नुकसान को कमएनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए polarizer। यह लेख एक कस्टम बनाया विघटन DNP तंत्र और इंजेक्शन प्रणाली के अनुकूलन का वर्णन एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। विशेषताओं और सेटअप के प्रदर्शन को अच्छी तरह से जाना जाता है और व्यापक रूप से इस्तेमाल hyperpolarized सब्सट्रेट [1- 13 सी] पाइरूवेट साथ प्रदर्शन किया जाएगा। जो कई मिनट के दौरान निगरानी प्रतिक्रियाओं की अनुमति देता है, और, दूसरी, में अपनी केंद्रीय भूमिका इस चुनाव के लिए मुख्य कारण हैं, पहला, अपने स्वाभाविक रूप में लंबे समय के 13 सी अनुदैर्ध्य विश्राम का समय (उच्च चुंबकीय क्षेत्र और 293 कश्मीर से ऊपर तापमान पर टी 1> 50 सेकंड) कैंसर चयापचय। 13,14 विघटन DNP एनएमआर और एक कस्टम विकसित इंजेक्शन प्रणाली, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) द्वारा उत्प्रेरित पाइरूवेट के ऑक्सीकरण का उपयोग unlabelled लैक्टेट 9,22 के एक प्रारंभिक पूल या कोई लेबल नहीं किया गया लैक्टेट के साथ जोड़ा उपस्थिति में नजर रखी जा सकती है यहाँ के रूप में दिखाया गया है। यह दिखाया गया है कि [1- 13 सी] लैक्टेट संकेत छठी में मापा जाता हैVO (कोशिकाओं में सहित) hyperpolarized [1- 13 सी] पाइरूवेट के इंजेक्शन के बाद मुख्य रूप से पाइरूवेट और लैक्टेट के बीच बजाय लैक्टेट उत्पादन करने के लिए एक तेजी से लेबल विनिमय की वजह से है। 6

हम साथ साथ hyperpolarized [1- 13 सी] पाइरूवेट LDH युक्त एक एनएमआर ट्यूब, लेकिन शुरू में कोई लैक्टेट में इंजेक्शन से [1- 13 सी] लैक्टेट का वास्तविक समय पर उत्पादन उपस्थित थे।

प्रणाली या व्यवस्था विवरण
DNP polarizer और एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर: वहाँ (चित्रा 1) एक विघटन DNP सेटअप में दो मुख्य भागों रहे हैं। DNP polarizer के मुख्य तत्व एक पंप हीलियम स्नान में लगभग 1 कश्मीर के लिए नमूना ठंडा करने के लिए एक cryostat है। Cryostat एक टी 3.35 superconductive चुंबक में डाला जाता है और एक चुंबक ज्यामिति (चित्रा 1) के isocenter पर ध्रुवीकरण नमूना है गारंटी देता है कि है। cryostat के अंदर, नमूना (क) एक एनएमआर का तार (बी) के द्वारा, घिरा हुआ है मापने के लिए ध्रुवीकरण खuildup, एक overmoded माइक्रोवेव गुहा (ग) में निहित। पूरे नमूना एक पंप हीलियम स्नान (घ) में कम तापमान पर रखा और waveguide के माध्यम से माइक्रोवेव के साथ विकिरणित है। पूरी व्यवस्था कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 डी) द्वारा किया जाता है।

हार्डवेयर और क्रायोजेनिक उपकरण DNP प्रदर्शन करने की जरूरत है और इसके बाद के विघटन अभी भी एक तकनीकी चुनौती है। एक नया DNP cryostat 23,24 विकसित और उसके क्रायोजेनिक प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए परीक्षण और उसके बाद तेजी से ठंडा-नीचे, हीलियम पकड़ समय और ऑपरेशन के दौरान कुल मिलाकर कम से कम हीलियम की खपत के लिए अनुकूलित किया गया था।

cryostat दो हिस्से होते हैं। Cryostat के पहले भाग इन्सुलेशन देवर (2A चित्रा) कि मोटे तौर पर शीर्ष भाग में विभाजित किया जा सकता है (एक) पूंछ, या नमूना अंतरिक्ष (ख), और बाहरी निर्वात चैम्बर (OVC) उच्च वैक्यूम और आवास के तहत रखा है विकिरण स्क्रीन (ग)। cryostat के दूसरे भाग में मुख्य हैSert (चित्रा 2 बी), इन्सुलेशन देवर, जहां सभी प्रवाह नियमों में कामयाब रहे हैं में रखा। तरल हीलियम हस्तांतरण लाइन (क) के माध्यम से बाहरी भंडारण देवर से आ रहा है, पहले चरण विभाजक (ख) में सघन में है, एक मध्यवर्ती चैम्बर cryostat ठंड के शीर्ष भाग में रखने के लिए और हीलियम सुखाया दूर करने के लिए दोनों का इस्तेमाल किया स्थानांतरण के दौरान। विभाजक दबाव एक केशिका (ग) cryostat के शीर्ष भाग के चारों ओर लिपटा के माध्यम से पंप से कम है; इस केशिका में ठंड हीलियम के प्रवाह को चकरा (घ) और इन्सुलेशन देवर (OVC) में विकिरण स्क्रीन शांत करने के लिए प्रयोग किया जाता है। नमूना रखा गया है और नमूना अंतरिक्ष में ध्रुवीकृत है। नमूना अंतरिक्ष में एक और केशिका (ई) के माध्यम से विभाजक, मुख्य cryostat डालने की पूंछ के चारों ओर लिपटा से जुड़ा है। इस केशिका खोला जा सकता है या बंद एक सुई वाल्व मैन्युअल बाहर से संचालित के माध्यम से।

कम DNP जनसंपर्क के दौरान इस्तेमाल किया तापमान को प्राप्त करने के लिएocess, तरल हीलियम cryostat नमूना अंतरिक्ष में एकत्र होने की जरूरत है और उसके दबाव मिलीबार श्रृंखला के लिए उतारा। संचालन cryostat संचालन के लिए आवश्यक पंप, निगरानी और इलेक्ट्रॉनिक और विद्युत मैकेनिक उपकरण (चित्रा 2 सी) के साथ विभिन्न बिंदुओं में संचालित की तीन सेट के साथ एक नहीं बल्कि जटिल पम्पिंग प्रणाली के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं। cryostat OVC पहले पम्पिंग प्रणाली द्वारा उच्च वैक्यूम के लिए पंप की जरूरत है। इस प्रणाली के एक टर्बो आणविक पंप एक रोटरी पंप (क) द्वारा समर्थित से बना है। तरल हीलियम भंडारण देवर (ख) cryostat विभाजक के लिए cryostat हस्तांतरण लाइन प्रवेश के माध्यम से स्थानांतरित कर रहा है। विभाजक दूसरी पंपिंग सेट से जुड़ा एक दुकान है। इस सेट में एक 35 मीटर 3 / घंटा झिल्ली पंप (ग) से बना है। इस लाइन हीलियम गैस से देवर और विभाजक ठंडा करने के दौरान स्थानांतरण के दौरान उबला हुआ हटाने की अनुमति देता है। तरल विभाजक में एकत्र हीलियम तो टोपी के माध्यम से नमूना अंतरिक्ष में स्थानांतरित किया जा सकता हैillary ट्यूबों के ऊपर वर्णित है। नमूना अंतरिक्ष के लिए और बाद में कम नमूना अंतरिक्ष दबाव के विभाजक से तरल हीलियम हस्तांतरण करने के लिए सीमा, एक तिहाई पंप एक 250 मीटर 3 / घंटा की रचना की जड़ें प्रणाली एमबार करने के लिए एक 65 मीटर 3 / घंटा रोटरी पंप (घ) द्वारा समर्थित पंप एक मैनुअल तितली वाल्व (ई) के माध्यम से cryostat से जुड़ा है।

सभी वैक्यूम सिस्टम के संचालन को नियंत्रित और एक electropneumatic कस्टम बनाया डिवाइस (एफ) द्वारा विनियमित रहे हैं। इस डिवाइस cryostat विभाजक (G) और नमूना अंतरिक्ष (ज) के आउटलेट, दूसरे / तीसरे पम्पिंग सिस्टम (ग, घ), एक संकुचित हीलियम बोतल (i) और बाहर के बीच वैक्यूम लाइन कनेक्शन को नियंत्रित करता है। (च) और बाहर के बीच संचार एक एक तरह से वाल्व (जे) के माध्यम से गुजरता है। विद्युत वायवीय डिवाइस (च) के साथ-साथ सभी मापदंडों प्रणाली और विघटन हार्डवेयर नियंत्रित और एक आम पीसी के साथ एक कस्टम निर्मित इलेक्ट्रॉनिक डिवाइस interfaced USB द्वारा संचालित कर रहे हैं। अंत में सभी सिस्टम, इलेक्ट्रॉनिक माध्यम सेडिवाइस, कस्टम बनाया स्टैंडअलोन सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 डी) जहां प्रासंगिक संचालन सॉफ्टवेयर बटन का उपयोग कर एक इंटरफेस के माध्यम से शुरू कर रहे हैं द्वारा प्रबंधित किया जाता है।

नमूना का प्रबंधन और ठोस राज्य सम्मिलित करता है की एक श्रृंखला के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 3 ए) में एनएमआर संकेत बिल्ड-अप को मापने के लिए। ध्रुवीकरण के लिए cryostat तैयार करने के लिए, मुख्य नमूना डालने (क), cryostat में जगह है। मुख्य नमूना सम्मिलित एक एनएमआर का तार (ख) एक overmoded सोना चढ़ाया माइक्रोवेव गुहा के अंदर रखा के साथ प्रदान की जाती है। पूर्व फ्रीज सब्सट्रेट समाधान युक्त एक उपयुक्त नमूना कंटेनर में ध्रुवीकरण किया जा करने के लिए तरल नाइट्रोजन के तापमान पर (ध्रुवीकरण समाधान) और शीसे रेशा नमूना धारक (ग) के अंत तल पर जगह है। मुख्य नमूना डालने में नमूना धारक स्लाइड चुंबक isocenter तक पहुंचने के लिए। नमूना धारक में सोना चढ़ाया waveguide (घ) डालें। waveguide एक बाहरी स्रोत से उत्पन्न माइक्रोवेव माइक्रोवेव कम से कम नुकसान के साथ यात्रा करने की अनुमति देता है टीओ नमूना।

cryostat प्रबंधन के लिए कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से संभालती है, इसी इंटरफेस बटन पर क्लिक करने पर, विभिन्न कार्यों cooldown की तरह (cryostat तापमान करीब तरल हीलियम के तापमान से कम है), भरने (cryostat एक पूर्व निर्धारित स्तर के लिए तरल हीलियम से भरा हुआ है ), (तरल हीलियम स्नान सबसे कम तापमान संभव प्राप्त करने के लिए पंप है) टी ≈ 1 कश्मीर को ठंडा, दबाव के एक अतिरिक्त कदम (cryostat थोड़ा पी पर कमरे के दबाव के ऊपर दबाव है = 10-30 मिलीबार जोखिम के बिना cryostat खोलने की अनुमति देने के ) हवा से cryostat के प्रदूषण और विघटन (DNP नमूना भंग करने और माप साइट है, यानी, एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर) के परिणामस्वरूप hyperpolarized समाधान हस्तांतरण करने के लिए स्वत: प्रक्रिया की।

ध्रुवीकरण एक ध्रुवीकरण क्षेत्र में बी 0 (94 गीगा पर माइक्रोवेव के साथ नमूना irradiating किया जाता है टी DNP, जहां टी DNP ध्रुवीकरण buildup समय है। टी DNP भी क्षेत्र और तापमान पर ठोस राज्य में लक्ष्य नाभिक के अनुदैर्ध्य विश्राम का समय के रूप में एक ही परिमाण के आदेश की है ध्रुवीकरण माना जाता है। हमारे सभी प्रयोगों में नमूना अधिक से अधिक 5 टी DNP के लिए ध्रुवीकरण हो गया।

ध्रुवीकरण समय के अंत में, नमूना के क्रम में एक आर टी समाधान में भंग किए जाने की enzymatic गतिविधि की माप के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। विघटन की प्रक्रिया के दौरान, अतितापित डी 2 विघटन डालने (चित्रा 3 बी) के बायलर से O के 5 मिलीलीटर संकुचित हीलियम गैस (पी = 6-8 बार) से धकेल रहे हैं DNP-बढ़ाया नमूना तक पहुँचने और इसे भंग करने के लिए। जिसके परिणामस्वरूप hyperpolarized समाधान संकुचित हीलियम गैस से विघटन डालने के बाहर धकेल दिया है विघटन डालने के आउटलेट के माध्यम से, (चित्रा -3 सी-बी 23 के बारे में 3 सेकंड है।

विघटन की प्रक्रिया एक विघटन डालने (चित्रा 3 बी) का उपयोग किया जाता है। विघटन सम्मिलित एक इलेक्ट्रॉनिक वायवीय विधानसभा से बना है (एक), एक कार्बन फाइबर छड़ी (ख) वायवीय विधानसभा में बॉयलर और नमूना कंटेनर लॉकर (ग) है, जो नमूने के साथ रिसाव से तंग युग्मन की अनुमति देता है के बीच संबंध नलियों युक्त कंटेनर, और वापस आउटलेट के बाहर। विद्युत वायवीय विधानसभा (चित्रा -3 सी) का उत्पादन और नमूना कंटेनर के लिए कार्बन फाइबर छड़ी के माध्यम से अतितापित डी ओ 2 ड्राइव और फिर cryostat से hyperpolarized समाधान निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है। विद्युत वायवीय विधानसभा साँस का वाल्व (एक) है कि सीओ के बीच कनेक्शन पर नियंत्रण से बना हैmpressed हीलियम (पी = 6-8 बार) लाइन (ख), बॉयलर (ग) जहां डी 2 ओ के माध्यम से वाल्व (घ) इंजेक्ट किया जाता है, और आउटलेट (ई) कार्बन फाइबर छड़ी के माध्यम से (च)। प्रणाली एक दबाव जी, एक थर्मामीटर और बॉयलर (ग) में एक हीटिंग प्रतिरोधक तार, एक ट्रिगर (ज) और एक कनेक्शन बॉक्स (i) इलेक्ट्रॉनिक डिवाइस के साथ प्रबंधन प्रणाली इंटरफेस करने के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ पूरा हुआ।

DNP cryostat और एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर एक हस्तांतरण लाइन, यानी, 2 मिमी भीतरी व्यास जो अंदर hyperpolarized समाधान दबाव हीलियम से धक्का दिया है (पी = 6-8 बार) जब विघटन शुरू हो रहा है की एक PTFE ट्यूब से जुड़े हुए हैं।

, पहले 300 मिसे में अतितापित डी 2 हे आदेश पिघला और hyperpolarized जमे हुए समाधान भंग करने के लिए नमूना कंटेनर के लिए धक्का दिया है: विघटन अनुक्रम निम्नलिखित कार्यों से बना है। बाद में, hyperpolarized समाधान दबाव का मतलब द्वारा cryostat से निकाला जाता हैsurized (पी = 6-8 बार) हीलियम गैस और 2 मिमी भीतरी व्यास PTFE ट्यूब के माध्यम से धक्का दे दिया (चित्रा -3 सी-ए) माप साइट है जहाँ इंजेक्शन प्रक्रियाओं चरण में वर्णित दोनों में से किसी के साथ किया जाता है करने के लिए 6.2.1 या 6.2 कदम .2।

विघटन DNP एनएमआर सेटअप के दूसरे घटक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर है। यहाँ बताया सेटअप में, एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर एक क्षेत्र बी 0 = 11.7 टेस्ला पर चल रही है। एक 5 मिमी एनएमआर जांच विघटन के बाद hyperpolarized संकेत को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर एनएमआर सांत्वना के माध्यम से चलाया जा रहा है, दोनों राज्य के ठोस और तरल राज्य एनएमआर माप के लिए इस्तेमाल किया, और फर्म-प्रदान की सॉफ्टवेयर XWinNMR। एक ठेठ माप एक कम फ्लिप कोण कठिन नाड़ी से बना है संकेत अधिग्रहण के बाद (या तो liquidstate या संयुक्त राष्ट्र calibrated, ठोस राज्य के मापन के लिए के लिए calibrated,)।

ठोस राज्य थर्मल ध्रुवीकरण संकेत और DNP व्युत्पन्न si की मापgnal बिल्ड-अप DNP polarizer (चित्रा 3AB) एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित के स्थल पर कस्टम बनाया 13 सी का तार का उपयोग किया जाता है। इस विशेष स्थिति में एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर संकेत ताला प्रदर्शन नहीं करता है। जब ठोस राज्य माप बाहर किया जाता है, ध्रुवीकरण करने के लिए महत्वपूर्ण perturbations से बचने के लिए, अधिग्रहण के बीच के समय में देरी काफी देर तक होना चाहिए, मोटे तौर पर अब 0.5 टी DNP से।

राज्य के ठोस वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है Equation4 कहा पे Equation5 hyperpolarized संकेत (3.3 कदम में प्राप्त) है और Equation6 ठोस राज्य संकेत (3.2 चरण में पंप तरल हीलियम के तापमान पर थर्मल संतुलन पर प्राप्त) (चित्रा 4 ए) है। यह पैरामीटर घअधिक से अधिक ध्रुवीकरण एनएमआर प्रयोगों के लिए उपलब्ध है, hyperpolarized समाधान के स्थानांतरण के दौरान अपरिहार्य घाटा से पहले efines। माप एक साधारण पल्स-अधिग्रहण अनुक्रम एक संयुक्त राष्ट्र calibrated कम फ्लिप कोण नाड़ी का उपयोग कर के साथ किया जाता है। पल्स अंशांकन सामान्यतः solidstate मापन के लिए छोड़ दिया है।

एक अनुरूप प्रक्रिया तरल अवस्था में hyperpolarized संकेत वृद्धि निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, नमूना इंजेक्शन से पहले स्पेक्ट्रोमीटर ट्यूब में रखा (6.2 कदम) डी 2 ओ के 500 μl से बना है विघटन और इंजेक्शन के बाद, वहाँ की निगरानी के लिए दो महत्वपूर्ण मानकों हैं। पहला, एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर स्थल पर hyperpolarized वृद्धि है Equation7 (चित्रा 4 बी), जहां Equation8 संकेत सिर्फ हाइपर के इंजेक्शन के बाद है ध्रुवीकृत समाधान (7.1 चरण में प्राप्त) और Equation9 थर्मल ध्रुवीकरण संकेत (7.2 चरण में प्राप्त) है। दूसरी अनुदैर्ध्य विश्राम का समय, टी 1 (चित्रा 4 बी, इनसेट), सब्सट्रेट और प्रत्येक चयापचय उत्पाद (घातीय फिटिंग चरण में 7.1 से प्राप्त संकेतों से प्राप्त) के साथ जुड़े है। इन दो मापदंडों न्यूनतम सब्सट्रेट एकाग्रता एक पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) और चयापचय परिवर्तनों की माप के लिए उपलब्ध समय खिड़की प्राप्त करने के लिए आवश्यक परिभाषित करते हैं। ठोस राज्य के ध्रुवीकरण के बीच का अनुपात Equation10 और liquidstate ध्रुवीकरण Equation11 hyperpolarized समाधान स्थानांतरण के दौरान विश्राम के कारण ध्रुवीकरण घाटे का अनुमान देता है। एक मूल्यation12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "चौड़ाई =" 80 "/> छूट नुकसान के अभाव में मनाया जाना चाहिए।

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Protocol

नोट: सभी डेटा विश्लेषण वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था।

1. ध्रुवीकरण समाधान तैयार

  1. तैयार एक 1.12 एम 13 सी लेबल सोडियम पाइरूवेट के 2 मिलीलीटर (ना + [CH 3 -CO- 13 सीओओ] -, सब्सट्रेट) समाधान TEMPOL कट्टरपंथी का 33 मिमी के साथ डाल दिया गया (4-हाइड्रोक्सी 2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyl, ध्रुवीकरण एजेंट) 4 में 2: 1 डी 2 हे / डी 13 सी टिप्पणियों के लिए 6 -ethanol। चेतावनी: हैंडलिंग सावधानियों डी 6 -ethanol की ज्वलनशील प्रकृति के कारण लिया जाना चाहिए।
  2. सत्यापित करें कि कट्टरपंथी एकाग्रता हासिल ध्रुवीकरण के संदर्भ में इष्टतम है।
    1. थोड़ा बिंदु 1.1 पर समाधान के कट्टरपंथी एकाग्रता बदलें (जैसे, 30 मिमी या 35 मिमी के लिए)।
    2. iteratively निर्धारित बनाने के लिए ठोस राज्य के संवर्धन (चरण 3 देखें) और कट्टरपंथी एकाग्रता है कि अधिक से अधिक वृद्धि करने के लिए सुराग खोजने के लिए।

2. Polarizatआयन

  1. cooldown प्रक्रिया के माध्यम से DNP cryostat तापमान कम करें। Cryostat सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 2 डी) पर 'Cooldown' बटन पर क्लिक करें।
  2. भरने की प्रक्रिया के माध्यम से DNP cryostat में तरल हीलियम लीजिए। Cryostat सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 2 डी) पर 'भरने' बटन पर क्लिक करें।
  3. DNP polarizer के साथ प्रदान की नमूना कंटेनर में 1.1 कदम से अनुकूलित ध्रुवीकरण समाधान के 300 μl रखें। धीरे से एक तरल नाइट्रोजन स्नान में डुबो कर नमूना अंदर के साथ नमूना कंटेनर रुक।
  4. तरल नाइट्रोजन कि ठंड प्रक्रिया (2.3 कदम) तरल नाइट्रोजन स्नान से नमूना कंटेनर निकालने और यह उल्टा घूर्णन द्वारा नमूना के बाद कंटेनर में मौजूद हो सकता है हटा दें।
    नोट: यह कदम नमूना का पूरी तरह से विघटन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है (चरण 5 देखें)।
  5. cryostat में नमूना डालें।
    नोट: यह सेंटईपी, निम्नलिखित उप कदम से बना है, तेजी से किया जाना चाहिए (यानी, कम से कम 10-20 सेकंड में) पिघलने से रोकने के लिए नमूना।
    1. नमूना धारक में नमूना कंटेनर डालें। मुख्य cryostat डालने में नमूना धारक डालें। नमूना धारक में माइक्रोवेव waveguide डालें।
  6. 1 K ठंडा करने की प्रक्रिया शुरू करने से cryostat तापमान कम करें। Cryostat सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 2 डी) पर '1K शीतलक' बटन पर क्लिक करें।
  7. पर माइक्रोवेव स्रोत मुड़ें और नमूना चमकाना। Cryostat सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 2 डी) पर 'मेगावाट पर' बटन पर क्लिक करें।

3. ठोस राज्य एनएमआर माप

  1. 90 डिग्री से कनेक्टर वामावर्त घूर्णन और इसे खींच कर स्पेक्ट्रोमीटर तार से एनएमआर सांत्वना पता लगाने चैनल के समाक्षीय केबल डिस्कनेक्ट। cryostat के समाक्षीय संबंधक करने के लिए पता लगाने के चैनल के समाक्षीय केबल प्लगएनएमआर का तार। cryostat एनएमआर कुंडली के महिला कनेक्टर में एनएमआर सांत्वना केबल के पुरुष कनेक्टर डालें, अभिविन्यास पिन की ओर ध्यान दे; मजबूती से धक्का और 90 डिग्री से कनेक्टर दक्षिणावर्त बारी बारी से।
  2. Cryostat स्थल पर ठोस राज्य में एनएमआर थर्मल संकेत संयुक्त राष्ट्र के calibrated कम फ्लिप कोण टी = 5 मिनट के अंतराल पर दोहराया दालों के साथ एक सरल पल्स-अधिग्रहण अनुक्रम का उपयोग उपाय। माप की स्थापना के बाद, सॉफ्टवेयर 'ZG' के कमांड लाइन में लिख सकते हैं और 'Enter' कुंजीपटल कुंजी दबाएँ। स्पेक्ट्रोमीटर संचालन और माप स्थापना पर अधिक जानकारी के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर आपरेशन मैनुअल को देखें।
  3. उपाय DNP-बढ़ाया एनएमआर संकेत। DNP प्रक्रिया की शुरुआत की धारा 2 में वर्णित के रूप में के बाद 3.2 कदम का संचालन दोहराएँ।
  4. 90 डिग्री से कनेक्टर वामावर्त घूर्णन और इसे खींच कर cryostat एनएमआर तार से एनएमआर सांत्वना पता लगाने चैनल समाक्षीय केबल डिस्कनेक्ट। देते की समाक्षीय केबल प्लगस्पेक्ट्रोमीटर कुंडली के समाक्षीय संबंधक करने के लिए ction चैनल। स्पेक्ट्रोमीटर कुंडली के महिला कनेक्टर में एनएमआर सांत्वना केबल के पुरुष कनेक्टर डालें, अभिविन्यास पिन की ओर ध्यान दे; मजबूती से धक्का और 90 डिग्री से कनेक्टर दक्षिणावर्त बारी बारी से।

4. मुख्य चुंबक क्षेत्र ( 'shimming') की एकरूपता का अनुकूलन

  1. स्पेक्ट्रोमीटर में एक ट्यूब पिछले प्रयोगों (यानी, 6.2 कदम के बाद) में उत्पादित मिश्रण के 500 μl युक्त रखें।
  2. shimming ढाल अधिकतम के लिए खोज कुंडलियों में वर्तमान अलग से एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर shimming प्रदर्शन करना ड्यूटेरियम का संकेत 'लॉक'। एनएमआर कंसोल पर इसी बटन धक्का द्वारा प्रासंगिक shimming कुंडली का चयन करें।
    1. एनएमआर कंसोल पर घुंडी बारी बारी से रोटेशन दिशा निर्धारित करने के लिए कि ताला संकेत बढ़ जाती है। जब तक संकेत एक अधिकतम तक पहुँच बारी बारी से करने के लिए आगे बढ़ें। एक और shimming कुंडली का चयन करें और अधिकतम संयुक्त राष्ट्र दोहरानेतिल सभी shimming कॉयल के लिए एक स्थानीय अधिकतम पाया जाता है। अधिक जानकारी के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर आपरेशन मैनुअल को देखें। अंत में, लॉकिंग के लिए इस्तेमाल किया नमूना हटा दें।

5. विघटन

  1. विघटन डालने के बायलर में डी ओ 2 के 5 मिलीलीटर डालें। दबाव और प्रतिरोधक तार के माध्यम से डी 2 हे गर्मी जब तक टी ≈ 180-200 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है। Cryostat सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 2 डी) पर 'हीटर तैयार करें' बटन पर क्लिक करें।
  2. नमूना ध्रुवीकरण की प्रक्रिया के पूरा होने के बाद (जैसे, 3 टी DNP के बाद), कमरे के दबाव से थोड़ा ऊपर cryostat दबाव। Cryostat सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 2 डी) पर 'एसएस संचालन' बटन पर क्लिक करें। विघटन डालने से माइक्रोवेव गाइड निकालें।
  3. (चित्रा 3 ए-सी नमूना धारक में विघटन डालने (चित्रा 3 बी) स्लाइड नीचे)। विघटन डालने नमूना धारक के नीचे तक पहुंच गया है और आदेश cryostat में डी 2 हे लीक से बचने के लिए नमूना कंटेनर के साथ एक leaktight संबंध बनाने के लिए मजबूती से धक्का दे दिया जाना चाहिए।
  4. विघटन अनुक्रम, साँस का वाल्व आपरेशन के एक पूर्व निर्धारित समय अनुक्रम शुरू करने के लिए हार्डवेयर ट्रिगर (चित्रा -3 सी-एच) दबाएँ।

6. इंजेक्शन

  1. विघटन जगह एक 5 मिमी एनएमआर ट्यूब, 500 μl नमूना युक्त (जैसे, डी ओ 2 के लिए इससे पहले Equation13 चरण 9 में enzymatic गतिविधि के मापन के लिए 8 कदम से कदम 7 या LDH समाधान), 11.74 टी एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के isocenter में माप (चरण 4 देखें)।
  2. बस विघटन (चरण 5) के बाद, नमूना चरण में 6.1 एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में रखा के साथ hyperpolarized समाधान के 500 μl मिश्रण।
    1. मैनुअल इंजेक्शन: hyperpolarized इकट्ठाएक गिलास बीकर एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर चुंबक के करीब रखा में 2.5 मीटर लंबी हस्तांतरण ट्यूब के अंत में समाधान। मैन्युअल रूप से एक कस्टम बनाया केशिका प्रणाली के माध्यम से एनएमआर नमूना ट्यूब में hyperpolarized समाधान के 500 μl इंजेक्षन।
    2. स्वत: इंजेक्शन: विघटन की प्रक्रिया से पहले, एक स्वचालित कस्टम मेड इंजेक्शन युक्ति है कि हीलियम गैस से स्थानांतरण के लिए इस्तेमाल hyperpolarized समाधान को अलग करने के लिए स्थानांतरण ट्यूब कनेक्ट। डिवाइस स्वचालित रूप से नमूना ट्यूब में hyperpolarized समाधान के 500 μl बचाता है।

7. तरल राज्य एनएमआर मापन

  1. विघटन के बाद, 10 डिग्री फ्लिप कोण पल्स-अधिग्रहण 1.5 सेकंड से स्थान दिया गया है सब्सट्रेट (ए) के आकर्षण संस्कार की प्रगति और उत्पाद (बी) का पालन करने के लिए दृश्यों की एक श्रृंखला के द्वारा स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना से एनएमआर hyperpolarized संकेत उपाय। माप की स्थापना के बाद, सॉफ्टवेयर 'ZG' के कमांड लाइन में लिख सकते हैं और & # प्रेस39, 'कुंजीपटल कुंजी दर्ज करें। स्पेक्ट्रोमीटर संचालन और माप स्थापना पर अधिक जानकारी के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर आपरेशन मैनुअल को देखें।
  2. एक बार जब संस्कार 90 डिग्री फ्लिप कोण पल्स-अधिग्रहण टी = 3 टी 1 ≈ 3 मिनट से स्थान दिया गया है दृश्यों की एक श्रृंखला के द्वारा पूरी तरह से आराम (यानी, के बाद टी = 10 टी 1), एनएमआर थर्मल संकेत को मापने है। माप की स्थापना के बाद, सॉफ्टवेयर 'ZG' के कमांड लाइन में लिख सकते हैं और 'Enter' कुंजीपटल कुंजी दबाएँ। स्पेक्ट्रोमीटर संचालन और माप स्थापना पर अधिक जानकारी के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर आपरेशन मैनुअल को देखें।

8. एंजाइम युक्त नमूनों की तैयारी (पाइरूवेट करने वाली लैक्टेट परिवर्तन के लिए विशिष्ट)

  1. निम्नलिखित नुस्खा के साथ प्रतिक्रिया बफर तैयार: 50 मिमी 0.1 एम फॉस्फेट बफर में निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NADH), 1 मिमी एथिलीन-diaminetetraacetic एसिड (EDTA), 0.1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) कम हो, पीएच =7.0।
  2. एक खरगोश पेशी LDH समाधान 1 यू / 20 माइक्रोग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin, बीएसए के साथ प्रतिक्रिया बफर में हौसले से तैयार मिलीलीटर की तैयारी।
  3. 478 μl प्रतिक्रिया बफर (चरण 8.1) मिक्स, 20 μl डी 2 हे स्पेक्ट्रोमीटर क्षेत्र स्थिरीकरण ( 'ताला') और 2 μl LDH समाधान (चरण 7.2) के लिए अनुमति देने के लिए।
  4. 500 μl समाधान कदम 8.3 में तैयार की मात्रा एक 5 मिमी एनएमआर ट्यूब में रखें और 500 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में ट्यूब की स्थिति।

9. पूरा enzymatic प्रतिक्रिया दर माप प्रक्रिया

  1. ध्रुवीकरण नमूना (चरण 1) तैयार है और इसे (चरण 2) फूट डालना।
  2. स्पेक्ट्रोमीटर (4 चरण) पर shimming प्रदर्शन और एंजाइमी नमूना (चरण 8) तैयार करें।
  3. विघटन (चरण 5) और इंजेक्शन (चरण 6) को पूरा करें।
  4. 10 डिग्री फ्लिप कोण दालों 1.5 सेकंड (चरण 7) द्वारा स्थान दिया अधिग्रहण के साथ hyperpolarized नमूना से संकेत की एक श्रृंखला के उपाय। यह कदम hyperpolarized को मापने के लिए अनुमति देता हैसंकेत क्षय और चयापचयों का संकेत buildup।

10 फिटिंग

  1. प्रत्येक चरण स्पेक्ट्रम 9.4 में अधिग्रहण के लिए, चोटियों क्रमश सब्सट्रेट (ए) और (बी) के उत्पाद और उन्हें एकीकृत करने के लिए इसी की पहचान (चोटियों के क्षेत्र का निर्धारण)। चोटियों integrals (2 समीकरण देखते एम (ए, बी) (टी)) संस्कार के समय पाठ्यक्रम का संकेत देते हैं।
  2. समीकरण के समाधान का उपयोग करना (2), एफ = (आर ए + K eff के मूल्य का निर्धारण ) सब्सट्रेट चरण 10.1 में एकीकृत संकेत के एक सरल घातीय फिट से।
  3. मूल्य एफ = (आर ए + K eff का प्रयोग ) चरण में निर्धारित 10.2, कश्मीर EFF और आर बी निर्धारित समारोह के साथ उत्पाद संकेत एम बी (टी) के एक फिट समीकरण को एकीकृत करके प्राप्त से (2)। (Enzymat प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग का संदर्भ लेंप्रतिक्रिया मॉडलिंग, फिटिंग और आरएफ सुधार पर जानकारी के लिए आईसी गतिविधि और चयापचय माप)।

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Representative Results

विघटन DNP का उपयोग कर एनएमआर संकेत लाभ
DNP प्रभाव है, आम तौर पर स्थिर कट्टरपंथी अणुओं से, एनएमआर सक्रिय नाभिक को, unpaired इलेक्ट्रॉन स्पिन के उच्च ध्रुवीकरण के हस्तांतरण का नमूना माइक्रोवेव विकिरण के तहत में होते हैं। सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मुक्त कण टैम (OXO63) और TEMPOL हैं। TEMPOL का उपयोग कर 4 ध्रुवीकरण प्रक्रियाओं 'पार ध्रुवीकरण' से अनुकूलित किया जा सकता है। 25

आदेश में ठोस राज्य में अधिकतम परमाणु ध्रुवीकरण प्राप्त करने के लिए स्थिर कट्टरपंथी की एकाग्रता का अनुकूलन तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। इष्टतम TEMPOL एकाग्रता इस अध्ययन के प्रयोगात्मक शर्तों में 33 मिमी होना पाया गया। चुने सब्सट्रेट के इस ध्रुवीकरण वास्तविक समय में अपने enzymatic रूपांतरण का पालन करने के लिए पर्याप्त है।

Polari के चुंबकीय क्षेत्रZer पेरिस डेसकार्टेस पर स्थापित बी 0 = 3.35 टी है और इस प्रणाली के घटकों (आंकड़े 1 - 3) ऊपर वर्णित किया गया। cryostat डिजाइन की गारंटी अंतिम नमूना स्थिति चुंबक isocenter के साथ मेल खाता है। polarizer के चुंबकीय क्षेत्र ramped था और केवल superconductive शिम कॉयल का उपयोग कर, जगह में cryostat के साथ shimmed। एक 1 x 0.5 x 0.5 सेमी पानी के नमूने की अंतिम पंक्ति प्रोटॉन-चौड़ाई 23 किलोहर्ट्ज था। हम मूल्यांकन Equation14 तथा Equation13 [1 13 सी] पाइरूवेट के लिए। ऐसा करने के लिए, यह 13 सी DNP-बढ़ाया संकेत निर्धारित करने के लिए आवश्यक पहला है Equation5 विघटन (चित्रा -4 ए) से पहले polarizer साइट पर ठोस राज्य में। विघटन के बाद, हम मापा [1-13 सी] पाइरूवेट hyperpolarized संकेत Equation8 और स्पेक्ट्रोमीटर स्थल पर अपनी क्षय। तरल अवस्था संकेत एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में नमूने के रूप में डी ओ 2 के 500 μl का उपयोग करते हुए एक परीक्षण विघटन पर मापा गया था। यह हमें ठोस राज्य DNP वृद्धि (चित्रा 4 बी, इनसेट), तरल राज्य एनएमआर ध्रुवीकरण स्तर (चित्रा 4 बी) और हस्तांतरण के दौरान ध्रुवीकरण घाटा निर्धारित करने के लिए अनुमति दी। संकेतों के बीच का अनुपात 3.3 कदम में मापा जाता है और 3.2 ठोस राज्य वृद्धि को परिभाषित कदम, Equation14 । पहला संकेत चरण में 7.1 मापा और कदम 7.2 से संकेत के बीच का अनुपात तरल राज्य hyperpolarized वृद्धि को परिभाषित करता है, Equation13 ।

चरण 3 से डाटा, एसचित्रा -4 ए और चित्रा 4 ए (इनसेट) में ummarized बताते हैं कि तकनीक [1- 13 सी] पाइरूवेट अप करने के लिए 13 सी में फूट डालना करने की अनुमति देता है Equation14 = 22 ± 5, एक 13 सी ध्रुवीकरण करने के लिए इसी Equation10 = 1.5 ± 0.3%।

इस ध्रुवीकरण स्तर आम मिसेज शर्तों (जैसे, 11.74 टी और 300 कश्मीर) में एक हजार से अधिक बार कार्बन थर्मल ध्रुवीकरण है। चरण 7 से डाटा, चित्रा 4 बी और चित्रा 4 बी (इनसेट) में संक्षेप, [1- 13 सी] पाइरूवेट के तरल-राज्य 13 सी का निर्धारण करने की अनुमति hyperpolarization, Equation11 = 1 ± 0.2%। वृद्धि पाइरूवेट के लिए ठोस राज्य में प्राप्त हुई थीप्रयोग के उद्देश्य के लिए पर्याप्त है, हालांकि उच्च संवर्द्धन अलग कण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है। 5 समय बेशक डेटा चरण 7.1 से फिट विश्राम का समय निरंतर का एक उपाय देता है। मिश्रण में पाइरूवेट अनुदैर्ध्य विश्राम का समय 500 μl DNP बढ़ाया समाधान और 500 μl डी 2 ओ की रचना की, टी 1 = था के बाद 75 ± 5 सेकंड आरएफ सुधार (समीकरण (3) देखें)।

Enzymatic गतिविधि और चयापचय मापन
विघटन DNP एनएमआर 13 सी लेबल सब्सट्रेट (ए) का पता लगाने के वास्तविक समय enzymatic रूपांतरण गतिशीलता में पालन और उत्पाद के गठन (बी) के निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:

Equation1

इसके तत्काल बाद hyperpolarized सब्सट्रेट (ए) के इंजेक्शन के बाद,उत्पाद (बी) के संकेत रिक्त है। फिर, enzymatic रूपांतरण (1) (बी) के उत्पादन के लिए शुरू होता है। 13 सी नाभिक के आकर्षण संस्कार विभिन्न रासायनिक परिवर्तन और अणुओं के रासायनिक परिवर्तन से प्रभावित नहीं है। फिर भी, नए माहौल में बी 13 सी उत्पाद संकेत समय के पाठ्यक्रम के गुणात्मक रूप से तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है के लिए अलग अलग अनुदैर्ध्य छूट दरों को जन्म दे सकती: शुरुआत में, एंजाइमी बदलने बी में एक बी संकेत में वृद्धि का उत्पादन रूपांतरण; एक निश्चित समय के बाद, प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर है, विश्राम के कारण आकर्षण संस्कार घाटा, इस वृद्धि और बी के संकेत संतुलन एक अधिकतम तक पहुँच जाता है; अंत में, अब समय पर, बी के संकेत अनुदैर्ध्य छूट के कारण decays। एंजाइम संतृप्ति की परिकल्पना में, रूपांतरण वापस उपेक्षा और खाते चुंबकीय विश्राम में ले रही है, enzymatic रूपांतरण के दौरान दो आणविक प्रजातियों (ए और बी) के आकर्षण संस्कार एक cou द्वारा वर्णित किया जा सकता हैPLED अंतर समीकरण प्रणाली: 22

Equation2

जहां एम (ए, बी) (टी) आणविक प्रजातियों ए और बी के magnetizations कर रहे हैं, क्रमशः, कश्मीर eff enzymatic प्रतिक्रिया से संकेत हस्तांतरण और अनुसंधान के लिए प्रभावी रूपांतरण दर स्थिर है (ए, बी) स्पष्ट अनुदैर्ध्य छूट दर स्थिरांक हैं आणविक प्रजातियों ए और बी, क्रमशः में मनाया नाभिक के आर (ए, बी) दोनों शुद्ध अनुदैर्ध्य आकर्षण संस्कार छूट और आरएफ स्पंदन के प्रभाव के लिए खाते।:

Equation3

जहां टी 1, (ए, बी) अनुदैर्ध्य छूट हैआणविक प्रजातियों ए और बी के स्थानीय आणविक वातावरण में नाभिक, क्रमशः के समय लगातार। θ और τ आरएफ फ्लिप कोण और दो ​​संकेत अधिग्रहण के बीच में देरी, क्रमशः रहे हैं।

इस अध्ययन में, सब्सट्रेट एक और उत्पाद बी थे [1- 13 सी] पाइरूवेट और [1- 13 सी] लैक्टेट, क्रमशः, और जहां कोई उद्देश्य (मापने के लिए [1- 13 सी] की शर्तों के तहत LDH द्वारा लैक्टेट उत्पादन isotopically था unlabelled) लैक्टेट प्रयोग की शुरुआत में समाधान में मौजूद था। माप टी = 21 डिग्री सेल्सियस पर एक सरल pulseacquire अनुक्रम के साथ दर्ज की गई 13 सी स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला में होते हैं। एक calibrated 10 डिग्री फ्लिप कोण पल्स अनुक्रमिक excitations (चरण 9) के लिए इस्तेमाल किया गया था। लगातार दो दालों के बीच देरी τ = 1.5 सेकंड था। एनएमआर अधिग्रहण अनुक्रम hyperpolarized solut से पहले सेकंड के कुछ दसियों शुरू किया गया थाआयन इंजेक्शन। इंजेक्शन के बाद नमूना ट्यूब में पाइरूवेट सब्सट्रेट एकाग्रता 25-35 मिमी था। कदम 10 10 -3 यू / मिलीलीटर की एक LDH एकाग्रता में पाइरूवेट रूपांतरण की गति को लैक्टेट में मापा गया था। लैक्टेट और पाइरूवेट से दर्ज संकेत अच्छी तरह से फिट समीकरण (2) (चित्रा 5 में बिंदीदार रेखा) में मॉडल और कश्मीर eff उपज = 0.9 ± 0.1 x 10 -3 सेकंड -1 (चित्रा 5)। यह मान द्वारा अनुपात [लाख] / [Pyr] पर समय 0 सेकंड (चित्रा 5, इनसेट) निर्धारित प्रारंभिक प्रतिक्रिया की दर के साथ सहमत हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रयोगात्मक उपकरण के Schematics। polarizer (बाएं) एक माइक्रोवेव गुहा (ग) के अंदर एक cryostat (घ) स्थित एक में रखा होते विस्तृत बोर 3.35 टी अतिचालक चुंबक। एक कस्टम बनाया एनएमआर का तार (ख) टी आसपासवह नमूना (क) बगल में परमाणु स्पिन ध्रुवीकरण की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है। हीलियम स्नान तापमान 1.12 ± 0.03 कश्मीर पर बनाए रखा, जबकि नमूना माइक्रोवेव आवृत्ति ν मेगावाट = 94 गीगा पर विकिरणित किया जाता है। प्रणाली के लिए एनएमआर माप ध्रुवीकरण के दौरान ठोस राज्य के नमूने पर प्रदर्शन किया जा सकता है। ध्रुवीकृत नमूना अतितापित पानी में भंग कर दिया और पहले से एक बगल एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर (दाएं) के अंदर रखा नमूना ट्यूब में हस्तांतरण लाइन के माध्यम से संकुचित हीलियम गैस से धकेल दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Cryostat और निर्वात प्रणाली schematics। (ए) cryostat इन्सुलेशन देवर; (बी) रोना मुख्य डालने ostat; (सी) निर्वात प्रणाली कनेक्शन; (डी) चरण 2 और प्रोटोकॉल खंड के चरण 5 में वर्णित विशिष्ट कार्रवाई करने के लिए इस्तेमाल किया बटन के साथ प्रबंधन सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का स्क्रीनशॉट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. नमूना हैंडलिंग और विघटन। (ए) नमूना हैंडलिंग सम्मिलित करता है; (बी) के विघटन डालें; (सी) विघटन डालने की विद्युत वायवीय कनेक्शन का विस्तार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"> चित्रा 4
चित्रा 4. ठोस राज्य ध्रुवीकरण buildup और hyperpolarized संकेत क्षय। विघटन DNP का संकेत है। (ए) एक DNP ध्रुवीकरण के दौरान एक 1.12 एम सोडियम [1- 13 सी] पाइरूवेट समाधान के ठोस राज्य एनएमआर ध्रुवीकरण बिल्ड-अप के संकेत (पार, एक घातीय समारोह एस (टी) के साथ लगे = एक एक्स EXP (आयकर / टी ख) + के समय लगातार टी बी = 270 सेकंड) और छूट (हलकों, एस (टी) बी = एक · EXP (टी / टी बी) + बी, टी एस एस 1 = 840 सेकंड); (ए, इनसेट) ठोस राज्य में DNPenhanced और thermally ध्रुवीकरण (ऊपर पहुंचा 10 बार) संस्कार संकेतों के बीच तुलना (ε एस एस = 22 ± 5, एक ठोस राज्य के ध्रुवीकरण पी एसएस = 1.5 ± 0.3% करने के लिए इसी); (बी) के पहले स्पेक्ट्रम विघटन और Avera बाद दर्ज बीच तुलनाGED स्पेक्ट्रम (बढ़ाया 100 बार) का उत्पादन ताप ध्रुवीकृत 13 सी से प्राप्त 1024 यात्रियों का उपयोग कर आरटी पर spins (ε = 1,000 ± 200)। विघटन की प्रक्रिया में 40% की अनुमानित संकेत हानि के साथ 3.3 सेकंड और स्वत: इंजेक्शन के बारे में 2 सेकंड लिया। प्रयोगों के लिए मैनुअल इंजेक्शन द्वारा नमूना के हस्तांतरण प्रदर्शन किया, अब इंजेक्शन देरी के कारण अतिरिक्त घाटा 30% तक अनुमान लगाया गया था; (बी, इनसेट) LDH की अनुपस्थिति (टी 1 = 75 ± 5 सेकंड) में विघटन के बाद पाइरूवेट के hyperpolarized संकेत क्षय। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
Enzyma के कारण [1- 13 सी] लैक्टेट संकेत के चित्रा 5. LDH गतिविधि और कैंसर कोशिका चयापचय का परिणाम है। बिल्ड-अप10 -3 यू / LDH की एक एकाग्रता में टिक रूपांतरण संकेत क्षय द्वारा 13 सी संस्कार के अनुदैर्ध्य छूट के कारण पीछा किया मिलीलीटर। लाल रेखा मॉडल समीकरण (2) में वर्णित के साथ फिट चलता छूट और enzymatic रूपांतरण का प्रभाव शामिल है। (इनसेट) [1- 13 सी] लैक्टेट और [1 -13 सी] समय = 0 टी (लाल रेखा) पर प्रतिक्रिया की गति के साथ एक एक्सट्रपलेशन पाइरूवेट एकाग्रता के बीच का अनुपात। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विघटन DNP एनएमआर प्रयोग के महत्वपूर्ण बिंदु हैं: (i) सब्सट्रेट के लिए प्राप्त ध्रुवीकरण का स्तर है, जो सबसे कम उत्पाद एकाग्रता प्रयोगों के लिए आवश्यक के रूप में अच्छी तरह से संकेत अधिग्रहण किया जा सकता है कि और (ii) जन्मों की संख्या निर्धारित करता है संस्कार की, और ध्रुवीकरण और पता लगाने साइटों के बीच सब्सट्रेट परिवर्तन की दर के लिए स्थानांतरण की अवधि की तुलना में। यहाँ बताया विघटन DNP सेटअप के इंजेक्शन प्रणाली के रूप में छोटे रूप में 3-4 सेकंड में नमूना हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है। हालांकि हस्तांतरण विधि एस बोवेन और सी Hilty द्वारा प्रस्तावित के रूप में के रूप में तेजी से नहीं था, पाइरूवेट के लिए 26 ध्रुवीकरण घाटा कम क्षेत्र में मध्यम अनुदैर्ध्य छूट के कारण सीमित थे। [1- 13 सी] पाइरूवेट, अपने लंबे कार्बोक्जिलिक परमाणु टी 1 के साथ, 10 -3 यू / एमएल के रूप में के रूप में कम मात्रा में LDH के माध्यम से प्रवाह को मापने के लिए अनुमति देता है।

उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात विघटन DNP पता चलता है कि एक भी कम [1- 13 सी] पाइरूवेट सांद्रता, और कम enzymatic रूपांतरण दर के प्रति संवेदनशील हो सकता है का उपयोग कर प्राप्त की। हासिल ध्रुवीकरण स्तर देता है एक महत्वपूर्ण संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ 200 से अधिक प्रयोगों एक कम फ्लिप कोण α = 10 डिग्री का उपयोग कर तरल राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में अधिग्रहण किया जाना है। यह अनुकूलन के लिए दोनों बार पुनरावृत्ति और फ्लिप कोण के मामले में गुंजाइश नहीं है। ठोस राज्य में ध्रुवीकरण का निर्माण हुआ कुछ अणुओं कुछ ध्रुवीकरण एजेंट (टेंपो, OXO63) 4 और दूसरों के साथ अच्छी तरह से ध्रुवीकरण के लिए कारण है कि अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं के लिए, नहीं है। प्रायोगिक परीक्षणों के लिए तय है कि ध्रुवीकरण कदम सफल हुआ ही रास्ता है। ध्रुवीकरण के स्तर में सुधार करने के लिए, एक अलग कट्टरपंथी प्रजातियों 4 और 'पार ध्रुवीकरण' पर भरोसा विभिन्न तकनीकों के आवेदन के इस्तेमाल का पता लगाने कर सकते हैं। 25

ontent "> कट्टरपंथी और सब्सट्रेट सांद्रता के साथ ही DNP नमूने में विलायक रचना के आगे अनुकूलन ध्रुवीकरण में सुधार करने की कोशिश की जा सकती है। अणुओं तकनीक तक सीमित है, जिसमें एक नाभिक या विघटन हो सकता है के बाद ध्रुवीकरण बनाए रखने में सक्षम नाभिक का एक समूह पहचान की। ध्रुवीकरण निरंतर किया जा सकता है या तो उच्च चुंबकीय क्षेत्र में या LLS के रूप में दो या अधिक मिलकर नाभिक पर delocalized में मोनो परमाणु eigenstates के बीच असंतुलन के रूप में। पहला विकल्प के लिए, जांच के नाभिक उच्च के साथ अन्य नाभिक से दूर हो गया है इस तरह के रूप में प्रोटॉन gyromagnetic अनुपात,। इस तरह की स्थिति में स्वाभाविक रूप से नहीं पाया जाता है, तो deuterons द्वारा अणु या सक्रिय नाभिक के आसपास के क्षेत्र में प्रोटॉन के प्रतिस्थापन में अलग स्थलों पर एनएमआर सक्रिय नाभिक में संवर्धन, कम करने के लिए चुंबकीय द्विध्रुव शक्ति, आवश्यक हैं । LLS, नाभिक के समूहों के भीतर चुंबकीय कपलिंग के एक सैद्धांतिक विश्लेषण के क्रम में supp करने के लिए इष्टतम साधन खोजने के लिए बाहर 27,28 किया जा सकता प्राप्त करने के लिएort ध्रुवीकरण। इस रणनीति के छोटे अणुओं में सफल साबित 29 aminoacids और अन्य ब्याज की चयापचय चक्र में शामिल अणुओं को लागू किया जा सकता है जैसे गया है। बेहतर प्रयोग के दौरान आकर्षण संस्कार की रक्षा करने के लिए, LLS की उत्तेजना के साथ विघटन DNP के संयोजन अन्य एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए माप समय अवधि का विस्तार करने का वादा किया। 20

DNP एनएमआर प्रयोग यहाँ वर्णित कैंसर की कोशिकाओं में पाइरूवेट चयापचय की माप के लिए अनुकूलित है। 6 विघटन DNP बढ़ाया एनएमआर द्वारा enzymatic गतिविधि के वास्तविक समय माप DNP बढ़ाकर एमआरआई द्वारा कैंसर के निदान में वर्तमान प्रयासों में मदद कर सकते हैं, पहले से ही में प्रयुक्त क्लिनिक। 12 DNP-बढ़ाया एनएमआर की आणविक विशिष्टता यह आणविक लक्ष्यों और उनके परिवर्तनों के उत्पादों के बीच भेद के लिए पसंद की एक विधि बनाता है। भविष्य में सुधार चयापचय परिवर्तनों के लिए 30 अन्य आणविक ट्रेसर के आकलन पर ध्यान दिया जाएगा

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई वित्तीय हितों की होड़ है

Acknowledgments

लेखकों डॉ जे जे वान डेर Klink चुनाव और उपकरणों की विधानसभा में सहायता के लिए, साथ ही डॉ एफ Kateb और डॉ जी Bertho के रूप में उपयोगी विचार विमर्श के लिए धन्यवाद। एसी स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (PPOOP2_157547 अनुदान) द्वारा समर्थित किया गया। हम पेरिस सोरबोन तलब (एनएमआर @ कॉम, मंद एनालिटिक्स, विल डी पेरिस, Fondation डी ला Recherche MEDICALE (एफ आर ING20130526708), और Parteneriat हुबर्ट Curien Brancusi 32662QK से वित्तपोषण स्वीकार करते हैं। हमारी टीम Equipex कार्यक्रमों पेरिस-एन-प्रतिध्वनि का हिस्सा है और CACSICE।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNP polarizer Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) /// Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components Edwards vacuum (France) Various

- turbomolecular pumping setup

- membrane pumping setup

- high capacity roots pumping system

- vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer Bruker (France)
Origin 8.0 OriginLab (US) Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C Sigma Aldrich (France) 490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D Sigma Aldrich (France) 186414
 4-Hydroxy-TEMPO 97% Sigma Aldrich (France) 176141
Deuterium oxide Sigma Aldrich (France) 151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0 Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in  Sigma Aldrich (France) L-2500
bovine serum albumin, BSA Sigma Aldrich (France)

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References

  1. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
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Balzan, R., Fernandes, L., Comment, A., Pidial, L., Tavitian, B., Vasos, P. R. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J. Vis. Exp. (108), e53548, doi:10.3791/53548 (2016).

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