Abstract
NMRベースの調査の主な制限は、低感度です。これにより、代謝変換のリアルタイムNMR測定を防止し、長い取得時間を入力するよう求められます。溶解DNPを介した過分極は、電子・ツー・核スピン分極移動に起因する大規模なアウトオブ平衡核磁化のおかげで感度の問題の一部を回避します。得られた高NMR信号は、リアルタイムでの化学反応をモニターするために使用することができます。過分極NMRの欠点は、関連付けられた緩和時間定数のオーダーで、好ましい場合において、核スピン縦緩和時間定数、T 1、または程度で通常の信号取得のための限られた時間ウィンドウ内に常駐結合された核の一重項状態、T LLS。内因性分子および代謝速度の細胞取り込みは、腫瘍の発生と薬剤応答に不可欠な情報を提供することができます。ニューmerous以前の過分極NMR研究は、 インビボでの酵素活性をモニタリングするための代謝基質としてピルビン酸の関連性を実証しました。この作品は、特に、過分極NMRによる乳酸脱水素酵素（LDH）の存在下でピルビン酸対乳酸の変換率を、酵素反応の研究に必要な実験装置と方法の詳細な説明を提供します。
Introduction
動的核分極（DNP）、1,2-核スピン分極を強化するために設計された技術、 すなわち 、「アップ」および「ダウン」のスピン集団（P =との間の不均衡[N↑ - N↓] / [N↑+ N ↓]）、1950年代に最初に導入されました。このような13 Cのような核スピンは、一般的に1 K程度の温度で、かつ生物学的用途のための突破口が入って来た3.357の磁場T. 3,4に、有利な条件でP = 10 -1までに偏光することができます低温で得られた高核分極レベルを保持しながら、過熱水で凍結分極サンプルを溶解することからなる溶解DNPの開発2000年代初頭。5液体状態のNMR信号はと比較して10倍3 -10 4により増強されます一般的な熱偏RT NMR条件。解散DNPは、したがって、非侵襲的に1秒以下の時間分解能とNMRにより監視ダイナミクスを可能にする、リアルタイムでその場で生化学反応速度を測定する方法を提供します6 - 。10それはまた、非常に低濃度で分析物を検出することが可能となった11。
非侵襲的分子イメージングモダリティの中で、過分極NMRは、同時にリアルタイムで基板及びその代謝産物を測定することができる唯一の技術です。溶解DNPは、代謝のその場での監視に関連する臨床MRI 12と最も有望なアプリケーションにインビトロ NMRに至るまで、様々な科学分野で熱意をもって受け取られた。13,14溶解DNPの主な制限があり、その上に時間後5倍の縦緩和時間定数T 1の順序は、極性の強化します化は失われます。比較的長いT 1を示す核スピンを有する分子を使用することが必要です。分極増強の時間期間を延長するために、長寿命状態（LLS）として知られているゆっくりと緩和核スピン状態は、使用することができる15 - 17 LLSがイントラペア双極子-双極子相互作用に非感受性であるので、それらのT LLS特性緩和時間定数は、T 1よりもはるかに長い数十分の磁化寿命18とすることができ、1時間まで、従って得られた、19,20、およびLLSは、磁気共鳴分光法の両方のために提案されている（MRS）そしてMRI。21
慎重に過分極NMRによる酵素反応速度を研究するために最適化する必要がある主なポイントは以下のとおりです。（i）は、固体分極を最大化すると、（ii）からの過分極の溶液の移送中に偏光損失を最小限に抑えますNMR分光計の偏光板。この記事では、カスタムメイドの溶解DNP装置および酵素反応を研究するための噴射システムの適応を説明します。特性とセットアップの性能はよく知られており、広く使用されている過分極基質[1- 13 C]ピルビン酸で実証されます。この選択の主な理由は、その中心的な役割、第1、第2、数分の間に監視反応を可能にし、その自然に長い13 C縦緩和時間（293 K以上の高磁場および温度でのT 1> 50秒）です癌代謝。13,14溶解DNP NMRおよびカスタム開発注入システムを使用して、乳酸脱水素酵素（LDH）によって触媒されるピルビン酸の酸化は、非標識乳酸9,22の最初のプールの存在下で、または添加しない非標識乳酸塩で監視することができ、ここに示されているように。 [1- 13 C]乳酸塩信号はviの中で測定されたことが示されています過分極[1- 13 C]ピルビン酸の注射後に（細胞内で含む）Voが原因でピルビン酸と乳酸の間ではなく、乳酸産生への高速ラベル交換に主である。6
私たちは、ここでLDHが、最初は乳酸を含むNMRチューブに注入し、超偏極[1- 13 C]ピルビン酸からの[1- 13 C]乳酸のリアルタイムの生産を提示します。
システムの説明
DNPの偏光子とNMR分光計：溶解DNPのセットアップで2つの主要な部分（ 図1）があります。 DNP偏光子の主な要素は、ポンピングヘリウム浴に約1 Kにサンプルを冷却するクライオスタットです。クライオスタット3.35 T超電導マグネットに挿入された磁石のアイソセンタ（ 図1）の偏光サンプルを有することを保証する形状を有しています。クライオスタットの内部に、試料（A）は、偏光bを測定するために、NMRコイル（B）に囲まれていますuildup、オーバーモードマイクロ波キャビティ（C）に含まれます。全サンプルは、ポンプヘリウム槽（d）の中で低温に保持し、導波管を介してマイクロ波を照射します。システム全体は、カスタムメイドのソフトウェア（ 図2D）によって管理されています。
ハードウェアとDNPを実行するために必要な極低温機器とその後の溶解はまだ技術的な課題です。新しいDNPクライオスタット23,24が開発され、その極低温性能を測定するために試験した後、運転中の高速クールダウン、ヘリウム保持時間および全体的な最低限のヘリウム消費のために最適化しました。
クライオスタットは、2つの部分から構成されています。クライオスタットの最初の部分は概ね上部に分離することができる絶縁デュワー（ 図2A）は、（A）尾部、または試料空間（B）と、外側真空容器（OVC）は、高真空とハウジング下に維持されます放射スクリーン（C）。クライオスタットの第二部は、メインでありますSERT（ 図2B）、すべてのフロー規制が管理されている断熱デュワー、中に入れました。移送ライン（A）を介して外部記憶デュワーから液体ヘリウムは、（b）は分離器で凝縮第一段階であり、中間室は、クライオスタットコールドの頂部を保持し、蒸発したヘリウムを除去するための両方に使用されます転送中。分離器圧力は、クライオスタットの上部に巻き付け毛細管（C）を介してポンプで低下します。この毛細管における冷ヘリウムの流れは、バッフル（D）と絶縁デュワー（OVC）の放射スクリーンを冷却するために使用されます。サンプルは、サンプル空間に配置し、偏光されます。サンプル空間は、主クライオスタットインサートの尾部に巻き付け別の毛細管（E）を介して分離器に接続されています。この毛細管は、手動で外部から操作ニードル弁を介して開閉することができます。
DNP PR中に使用される低温を達成するためにocess、液体ヘリウムクライオスタット試料空間に収集することができる必要があり、その圧力はミリバールの範囲に下げ。クライオスタットの操作に必要な操作は、電子および電気機械的機器（ 図2C）と異なる点で監視し、動作ポンプ3組ではなく、複雑なポンプシステムを介して実行されます。クライオスタットOVCは、第1ポンピング・システムによって高真空にポンピングする必要があります。このシステムは、ロータリーポンプ（A）によってバックアップターボ分子ポンプで構成されています。液体ヘリウムクライオスタットセパレータクライオスタット移送ラインの入口を介してストレージデュワー（B）から転送されます。セパレータは、第2ポンピング・セットに接続された出口を有します。このセットは、35 m 3の/時の膜ポンプ（C）で構成されています。この行はデュワーからとセパレータの冷却中転送中にゆでたヘリウムガスを除去することができます。セパレーターに収集された液体ヘリウムは、その後、キャップを介してサンプル空間に転送することができますillary管は、上記。サンプル空間に分離器から液体ヘリウムを転送するには、その後範囲をミリバールにサンプル空間の圧力を下げるために、時間ルーツは65メートル3 / hrでロータリーポンプ（d）でバックアップされたポンプ250メートル3 /からなる第3ポンプシステム手動バタフライバルブ（E）を介してクライオスタットに接続されています。
すべての真空システムの動作を制御し、電カスタムメイドのデバイス（F）によって調節されます。この装置は、クライオスタット分離器（g）及びサンプル空間（H）の出口、第二/第三ポンプシステム（C、D）、圧縮されたヘリウムボトル（i）と外部との間の真空ライン接続を制御します。 （F）と外部との間の通信は、一方向弁（j）を通過します。電気空気圧装置（F）と同様に、すべてのシステム・パラメータおよび溶解ハードウェアは共通のPCとUSBインターフェースカスタムメイドの電子デバイスによって制御され、運営されています。電子を通して最後に、すべてのシステム、デバイスは、関連する操作は、ソフトウェアのボタンを使用してインタフェースを介して起動されるカスタムメイドのスタンドアロンのソフトウェア（ 図2D）によって管理されています。
サンプルを管理し、固体状態で挿入一連のNMRシグナルの蓄積を測定する（ 図3A）に使用されます。偏光用のクライオスタットを準備するには、クライオスタットへの主要サンプルインサート（A）を、置きます。メインサンプルインサートはオーバーモード金メッキマイクロ波空洞の内部に配置NMRコイル（B）とを備えています。前凍結溶液を含む基板は、適切なサンプル容器に液体窒素温度（偏溶液）を偏光し、ガラス繊維試料ホルダー（C）の端下部にそれを配置することができます。磁石のアイソセンタに到達するために、メインサンプルインサート内に試料ホルダーをスライドさせます。サンプルホルダーに金メッキ導波路（d）を挿入します。導波路は、外部のマイクロ波源から発生したマイクロ波は、最小限の損失トンと一緒に旅行することができますサンプルO。
クライオスタット管理のためのカスタムメイドのソフトウェアは、（クライオスタットは、予め決定されたレベルに液体ヘリウムが充填されている充填、対応するインターフェースボタン、クールダウンのような異なる動作を（クライオスタット温度が近い液体ヘリウム温度に低下する）をクリックすると、自動的に処理し）、T≈1 K（液体ヘリウム槽が可能な最低温度を達成するためにポンピングされる）に冷却する追加のステップは、加圧（クライオスタットはリスクなしクライオスタットの開口部を可能にするために、わずかにPの室内圧力= 10から30ミリバールの上に加圧され、 ）航空でクライオスタットの汚染の）および溶解（DNPのサンプルを溶解し、測定部位に生じた過分極ソリューションを転送するための自動処理、 すなわち 、NMR分光計。
分極は、分極磁場B 0に（94 GHzのマイクロ波を試料に照射が行われますT DNPは、偏光蓄積時間である3 T DNP、後に完全に偏光考えられる。T DNPは、固体指定されたフィールドの状態と温度の目標核の縦緩和時間と同じオーダーの大きさです。すべての実験において、サンプルは、5つ以上のT DNPのために分極させました。
分極時間の終わりに、試料は、酵素活性の測定に使用するためのRT溶液に溶解されなければなりません。溶解プロセス中、溶解インサート（ 図3B）のボイラからの過熱D 2 O 5mlをDNP増強試料に達し、それを溶解するために圧縮ヘリウムガス（P = 6~8バール）に押されています。得られた過分極溶液は溶解挿入口から、圧縮されたヘリウムガスにより溶解インサートを押し出される（ 図3C-B 。23 NMR分光計サイトへDNP偏光子からサ ンプル移送に必要な時間は約3秒です。
溶解プロセスは、溶解インサート（ 図3B）を用いて行われます。溶解インサートは、電子空気式アセンブリで構成されている（a）は、サンプルと漏れのない連結を可能にする空気圧アセンブリボイラーと試料容器ロッカー（C）との間の接続管を含む炭素繊維棒（B）コンテナ、およびコンセントにバックアウト。電空アセンブリ（ 図3C）を生成し、試料容器に炭素繊維棒を介して過熱D 2 Oを駆動した後、クライオスタットから過分極溶液を抽出するために使用されます。電空アセンブリは、同時の接続を制御する空気弁（A）で構成されていますmpressedヘリウム（P = 6~8バール）のライン（b）に示すように、炭素繊維棒を介してD 2 Oは、バルブ（D）を介して注入されるボイラー（c）は、出口（E）（F）。システムは、圧力G、温度計及びボイラー（C）における加熱抵抗ワイヤ、トリガー（H）と接続ボックス（I）の電子管理装置とシステムをインタフェースするために使用することによって完成します。
DNPクライオスタットとNMR分光計は、移送ライン、 すなわち、溶解がトリガされた過分極溶液は加圧されたヘリウムによって押された2mm内側の内径（P = 6~8バール）のPTFEチューブで接続されています。
溶解シーケンスは、以下の操作で構成されています。最初の300ミリ秒で、過熱D 2 Oは、過分極凍結溶液を融解し、溶解させるために試料容器にプッシュされます。その後、過分極溶液はPRESの平均値によってクライオスタットから抽出されます圧し（P = 6-8バー）注射は工程に記載された手順のいずれかを用いて行われる測定部位にヘリウムガスと2ミリメートル、内径のPTFEチューブを通して押され（ 図3C-E）6.2.1または6.2ステップ0.2。
溶解DNP NMRセットアップの第二の成分は、NMR分光計です。本明細書中に記載のセットアップでは、NMR分光計は、 磁場 B 0 = 11.7テスラで動作します。 、5mmのNMRプローブは、溶解後過分極信号を測定するために使用されます。 NMR分光計は、固体状態と液体状態の両方NMR測定のために使用されるNMRコンソール、および会社が提供するソフトウェアXWINNMR介して操作されます。典型的な測定は、信号の取得に続いて（固体測定のために、liquidstateまたは未較正のために、キャリブレーションのいずれか）、低フリップ角ハードパルスで構成されています。
固体熱偏波信号とDNP由来のsiの測定gnalビルドアップNMR分光計に結合されたDNPの偏光子（ 図3AB）の部位でのカスタムメイドの13 Cのコイルを使用して実行されます。この特定の状況ではNMR分光計は、信号のロックを実行しません。固体の測定が行われた場合に、偏光に著しい摂動を回避するために、取得の間の時間遅延は、大きく長い0.5 T DNPより、十分な長さであるべきです。
固体増強は以下のように定義されます
どこ
（ステップ3.3）で得られた過分極信号であり、 
（ステップ3.2でくみ上げられた液体ヘリウム温度での熱平衡状態で得られた）固体状態信号（ 図4A）です 。このパラメータd過分極溶液の転送中に不可避の損失の前にNMR実験のために利用可能な最大の偏光を、efines。測定は、未較正の低フリップ角パルスを用いる単パルス取得シーケンスを用いて行われます。パルスキャリブレーションは、一般的にsolidstate測定のためにスキップされます。
同様の手順は、液体状態の過分極シグナル増強を決定することができます。この場合には、注入前に分析管に入れた試料（ステップ6.2）D 2 O、500μlので構成されています溶解および注入後、監視するための2つの重要なパラメータがあります。最初は、NMR分光計サイトで過分極拡張機能です
（ 図4B）、 
ちょうどハイパーの注入後の信号であります （ステップ7.1）で得られた偏光液と
（ステップ7.2）で得られた熱偏波信号です。第二は、基材と（ステップ7.1で得られた指数関数フィッティング信号により得られた）各代謝産物と関連する縦緩和時間T 1（ 図4B、挿入図）、です。これら2つのパラメータは、十分な信号対雑音比（SNR）および代謝変換の測定のために利用可能な時間窓を得るために必要な最低限の基質濃度を規定します。固体分極の比
そして、liquidstate偏光
過分極溶液移送時の緩和に起因する偏光損失の推定を与えます。値ation12 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "幅=" 80 "/>リラクゼーション損失の非存在下で観察されるべきです。
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Protocol
注：すべてのデータ分析は、市販のソフトウェアを用いて行きました。
1.偏光液を調製
- 1.12 M 13 C標識ピルビン酸ナトリウム（のNa + [CH 3 -CO- 13 COO] - 、基板）の2ミリリットル準備ラジカルTEMPOLの33 mMの（でドープされた解決策4 -ヒドロキシ- 2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、偏エージェント）4 2：1、D 2 O / D 13 C観測のための6 -エタノール。注意：使用上の注意点によるD 6 -エタノールの引火性の性質のために注意する必要があります。
- ラジカル濃度が達成分極の面で最適であることを確認します。
- （30 mm以上35 mmで、 例えば ）少しポイント1.1での溶液のラジカル濃度を変更します。
- 反復固体増強を決定する（ステップ3を参照）、最大向上につながるラジカル濃度を見つけます。
2. Polarizatイオン
- クールダウンの手順で、DNPのクライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「クールダウン」ボタンをクリックします。
- 充填手順を通じてDNPのクライオスタット内の液体ヘリウムを収集します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「充填」ボタンをクリックします。
- DNPの偏光板が設けられた試料容器中のステップ1.1から最適化された偏光の溶液300μLを置きます。穏やかに液体窒素浴中に浸漬することによって内部に試料と試料容器を凍結。
- 液体窒素浴から試料容器を抽出し、逆さまに回転させることによって凍結手順（ステップ2.3）後の試料容器中に存在し得る液体窒素を排除します。
注：この手順は（ステップ5を参照）、サンプルの完全な溶解を得ることが重要です。 - クライオスタット内に試料を挿入します。
注：このセントEPは、以下のサブステップから成る、（ すなわち 、未満10から20秒で）融解からサ ンプルを防ぐために迅速に実行する必要があります。- サンプルホルダーに試料容器を挿入します。主クライオスタットインサートに試料ホルダーを挿入します。サンプルホルダーにマイクロ波の導波管を挿入します。
- 1 K冷却手順を開始することにより、クライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「1K冷却」ボタンをクリックします。
- 上のマイクロ波源をオンにして、サンプルを照射します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「MW-ON」ボタンをクリックします。
3.固体NMR測定
- 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、分光器コイルからNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。クライオスタットの同軸コネクタに検出チャンネルの同軸ケーブルを差し込みNMRコイル。オリエンテーションピンに着目し、クライオスタットのNMRコイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。
- T = 5分の間隔で繰り返さ未校正し、低フリップ角パルスでシンプルなパルス取得シーケンスを使用して、クライオスタットサイトで固体状態でNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。
- DNP-強化されたNMR信号を測定します。第2節で説明したように、DNPプロセスを開始した後、ステップ3.2の動作を繰り返します。
- 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、クライオスタットのNMRコイルからのNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。 DETEの同軸ケーブルを差し込み分光器コイルの同軸コネクタにctionチャンネル。オリエンテーションピンに着目し、分光器コイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。
4.メインマグネットフィールド（ 'シミング'）の均一性を最適化
- 分析計内で前の実験（ すなわち 、ステップ6.2の後）で製造された混合物の500μLを含むチューブを置きます。
- 最大値を探索するシミング勾配コイルの電流を変化させることにより、NMR分光計のシミングを行う重水素の信号を「ロックします」。 NMRコンソールに対応するボタンを押すことにより、関連するシミングコイルを選択します。
- ロック信号を増加させ、回転方向を決定するためにNMRコンソール上のノブを回します。信号が最大に達するまで回転し続けます。別のシミングコイルを選択し、最大化解除を繰り返しますすべてのシムコイル用の極大ゴマ発見されました。詳細については、NMR分光計の取扱説明書を参照してください。最後には、ロックに用いたサンプルを削除します。
5.解散
- 溶解挿入ボイラーでD 2 Oの5ミリリットルを挿入します。加圧するとT≈180〜200゜Cに達するまで抵抗ワイヤによってD 2 Oを加熱します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「ヒーターの準備」ボタンをクリックします。
- サンプル偏光手順の完了後（ 例えば 、3 T DNP後）は、室内圧力よりわずかにクライオスタットを加圧します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「SSオペレーション」ボタンをクリックします。溶解インサートからのマイクロ波ガイドを削除します。
- サンプルホルダーにダウン溶解インサート（ 図3B）をスライドさせ（ 図3A-C）。溶解インサートは、サンプルホルダーの底に達する必要があり、クライオスタットでD 2 O漏れを回避するために、試料容器との漏れ止め接続を行うためにしっかりと押さなければなりません。
- 溶解シーケンス、空気弁の操作の予め定めタイミングシーケンスを開始するために、ハードウェア・トリガ（ 図3C-h）を押してください。
6.インジェクション
- 解散場所の前に5ミリメートルのNMRチューブ、500μlのサンプルを含む（ 例えば 、D 2 Oのために
11.74 T NMR分光計のアイソセンタのステップ9での酵素活性の測定のためのステップ8からステップ7またはLDH溶液中で測定）、（ステップ4を参照）。 - ただ、解散（ステップ5）した後、ステップ6.1にNMR分光器に置かれた試料に過分極溶液500μlを混合します。
- マニュアルインジェクション：過分極を収集NMR分光器の磁石の近くに配置されたガラスビーカー中で2.5メートルの長い移送管の終わりにソリューションを提供します。手動でカスタムメイドのキャピラリシステムを介してNMR試料管に過分極溶液500μlを注入。
- 自動注入：溶解工程の前に、転送に使用されるヘリウムガスから過分極ソリューションを分離する自動化されたカスタムメイドの噴射装置へ移送管を接続します。デバイスは自動的にサンプル管に過分極溶液500μlを実現します。
7.液体状態NMR測定
- 溶解後、基板（A）の磁化の進行及び製品（B）に追従するために1.5秒だけ離れた10°のフリップ角パルス取得一連のシーケンスにより分光器のサンプルからのNMR、超偏極信号を測定。測定を設定した後、ソフトウェアのコマンドラインで「ZG」を書いて、キーを押します＆＃39; 'キーボードのキーを入力してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。
- 磁化が完全に緩和すると（ すなわち 、T = 10、T 1の後）、90°のフリップ角パルス-取得T = 3 T 1≈3分だけ離れた配列を一連のNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。
（ピルビン酸から乳酸の変換のための具体的な）酵素含有試料の8準備
- 以下のレシピとの反応緩衝液を調製：50mMの0.1 Mリン酸緩衝液中でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、1mMのエチレン - ジアミン四酢酸（EDTA）、0.1mMのジチオスレイトール（DTT）を低減し、pH値=7.0。
- ウサギ筋肉LDH溶液を20μg/ mlのウシ血清アルブミン、BSAとの反応緩衝液中で新たに調製した1 U / mlで調製します。
- 20μlのD 2 Oは、分光器の磁場安定化（ 'ロック'）を可能にし、2μlのLDH溶液（ステップ7.2）するために、478μlの反応バッファー（ステップ8.1）を混ぜます。
- 5ミリメートルのNMRチューブにステップ8.3で調製した500μlの溶液量を置き、500 MHzのNMR分光計にチューブを置きます。
9.完全な酵素反応速度測定手順
- 偏光の試料（ステップ1）を準備し、（ステップ2）それを偏光。
- 分光計（ステップ4）にシミング実行し、酵素サンプル（ステップ8）を準備します。
- 溶解（ステップ5）、注射（ステップ6）を実行します。
- 1.5秒（ステップ7）離れた10°のフリップ角パルス買収に過分極サンプルからの一連の信号を測定します。このステップでは、過分極を測定することができます信号減衰および代謝産物の信号の蓄積。
10.フィッティング
- ステップ9.4において取得された各スペクトルについて、それぞれ（A）及び生成物（B）が、基板と、それらを統合するために対応するピークを同定する（ピークの面積を決定します）。ピークの積分は、磁化の経時変化を信号（M（A、B）（t）は、式2を参照）を得ました。
- 方程式の解を使用すると、（2）、F =（R A + K EFFの値を決定します ）ステップ10.1に統合された基板の信号の単純な指数関数フィットから。
- 値F =（R の A + K effはを使用して、 ）ステップ10.2において判定式を積分した機能を持つ製品信号Mの B（t）の適合からのk effは及びR Bを決定する（2）。代表的な結果セクション（Enzymatを参照してください。反応モデリング、フィッティングおよびRF補正の詳細については、ICの活動と代謝の測定値）。
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Representative Results
溶解DNPを使用して、NMR信号ゲイン
DNPの効果は、サンプルのマイクロ波照射下、NMR活性核に、典型的には安定したラジカル分子から、不対電子スピンの高い偏光の伝達にあります。最も頻繁に使用されるフリーラジカルは、TAM（OXO63）およびTEMPOLある。TEMPOLを用いて4偏光手順は「交差偏光」によって最適化することができる。25
固体状態での最大の核分極を得るために、安定したラジカルの濃度を最適化する技術の成功に重要です。最適TEMPOL濃度は、この研究の実験条件で33ミリモルであることが見出されました。選択されたこの基板の偏光は、リアルタイムでその酵素変換をたどるのに十分です。
polariの磁場ZERパリデカルトに設置されたB 0 = 3.35 Tであり、このシステムの構成要素は、（ 図1から3）上記に記載されています。クライオスタットの設計は、最終サンプル位置は、磁石アイソセンタと一致することを保証します。偏光子の磁場は、傾斜したと代わりにクライオスタットで、唯一の超伝導シムコイルを使用してシム。 1×0.5×0.5センチ水サンプルの最終的な陽子線幅は23キロヘルツでした。私たちは、評価しました
そして
[1 13 C]ピルビン酸のために。そのためには、13 C DNP強調信号を決定することが必要です溶解（ 図4A）の前に、偏光子サイトで固体インチ溶解後、我々は[1-測定しました13 C]ピルビン酸過分極信号そして、分光器サイトでその崩壊。液体状態信号は、NMR分光計において試料としてD 2 Oの500μLを用いて、試験溶解を測定しました。これは、私たちは、固体DNPエンハンスメント（ 図4B、挿入図）、液体状態のNMR偏光レベル（ 図4B）および転送中の偏光損失を決定することができました。信号間の比率は、ステップ3.3で測定し、3.2は、固体エンハンスメントを定めるステップ 。ステップ7.1において測定された第一の信号と、ステップ7.2からの信号との間の比率は、液状過分極増強を定義します 。
ステップ3、sのデータ図4Aおよび 図4A（挿入図）でummarized、技術は[1- 13 C]ピルビン酸までに13 Cを分極することを可能にすることを示しています 13 Cの分極に対応する±5 = 22、 = 1.5±0.3％。
この分極レベルは、一般的なMRS 条件 （例えば、11.74 Tおよび300 K）以上の千倍の炭素熱偏光です。 図4B及び図4B（挿入図）にまとめてステップ7からのデータは、[1- 13 C]ピルビン酸の液体状態の13 Cの過分極を決定できるように、 = 1±0.2％。ピルビン酸のために、固体状態で得られた強化がありました実験の目的のために十分な、より高い拡張機能が異なる基を使用して実証されているものの5のステップ7.1からの時間経過データのフィットを緩和時定数の測定値を与えます。 500μlのDNP強化ソリューションと500μlのD 2 Oからなる混合物中のピルビン酸縦緩和時間は、T RF補正後の1 = 75±5秒（式（3）を参照）でした。
酵素活性および代謝の測定
13 C標識基質（A）の溶解DNP NMR検出は、リアルタイム酵素的変換のダイナミクスに従って、生成物（B）の形成を観察するために使用することができます。
直ちに過分極基材（A）の注射後、製品（B）の信号はnullです。その後、酵素的変換は、（1）（B）を生成し始めます。 13 C核の磁化は、異なる化学シフト、および分子の化学変化に影響されません。それにもかかわらず、新しい環境は、製品の信号の時間経過を定性的3段階で分離することができるB. 13 Cに対して異なる縦緩和速度をもたらし得る：最初に、Bに変換する酵素的変換は、B信号の増加を生成します。一定時間後に、実験条件に依存して、原因緩和への磁化損失は、この増加とBの信号をバランスさが最大に達しました。最終的に、より長い時間で、Bの信号は、縦緩和による減衰します。酵素飽和の仮説では、逆変換を無視し、アカウント磁気緩和を考慮して、酵素的変換中に2分子種（A及びB）の磁化はCOUによって記述することができますPLED微分方程式系：22
M（A、B）（t）が分子種AおよびBの磁化である場合、それぞれ、K effは 、酵素反応によって信号伝達のための効果的な変換速度定数であり、R（A、B）は、見かけの縦緩和速度定数であります分子種AとBで観測された核の、それぞれ純粋な縦磁化緩和と高周波パルス化の効果の両方のためのR（A、B）のアカウント。：
T 1、（A、B）は、縦緩和でありますそれぞれの分子種AとBの局所分子環境における核の時定数、。θ、τ は 、RFフリップ角と、それぞれ2つの信号の取得、間の遅延です。
本研究では、基板Aと製品Bは、それぞれ[1- 13 C]ピルビン酸および[1- 13 C]乳酸であった、との目的はありません（同位体の条件でLDHにより[1- 13 C]乳酸産生を測定することでした非標識）乳酸は、実験の開始時に溶液中に存在しました。測定は、T = 21℃での簡単なpulseacquire系列で記録された13 Cスペクトルのシリーズで構成されています。較正10°フリップ角パルスを順次励起する（ステップ9）のために使用しました。 2つの連続するパルス間の遅延は、τ= 1.5秒でした。 NMR取得シーケンスは、数十秒の超偏極solut前に開始しました。イオン注入。注入後、サンプルチューブ内のピルビン酸基質濃度は25〜35 mmでした。ステップ10 -3 U / mlでのLDH濃度でピルビン酸の変換速度の乳酸を測定しました。乳酸およびピルビン酸から記録された信号だけでなく、式中のモデル（2）（ 図5の点線）と歩留まりのk effのに合わせ = 0.9±0.1×10 -3 秒 -1（ 図5）。この値は、比[ラック] / [Pyrで]時間0秒で（ 図5、挿入図）によって決定された初期反応速度と一致します。
実験装置の 1 回路図を 図 。偏光子は、（左）、ワイドボア3.35 T超電導磁石に入れクライオスタット（d）の内側に位置するマイクロ波キャビティ（C）からなります。カスタムメイドのNMRコイル（b）の周囲トン彼は、サンプル（A）は、 その場での核スピンの分極を監視するために使用されます。サンプルはマイクロ波周波数νMW = 94 GHzで照射しながらヘリウム浴温度は1.12±0.03 Kに維持されます。 NMR測定は、偏光の間に、固体サンプル上で実行するためのシステムを可能にします。偏サンプルが過熱水に溶解し、以前に隣接NMR分光計（右）の内側に配置された試料管への移送ラインを介して圧縮されたヘリウムガスでプッシュされます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.クライオスタットや真空システム回路図。 （A）クライオスタット断熱デュワー。 （B）の叫びメインインサートostat。 （C）真空システムの接続、 （D）ステップ2およびプロトコルセクションの手順5で説明した特定の操作を実行するために使用されるボタンを持つ管理ソフトウェアインターフェイスのスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.サンプルハンドリングと解散。 （A）サンプル処理インサート。 （B）溶解インサート。 （C）溶解インサートの電空接続の詳細。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. ソリッド・ステート・偏光の蓄積及び過分極信号減衰。溶解DNP信号。 DNP分極（指数関数S（T）を取り付け交雑、= A X EXP（-t / T中の1.12 Mナトリウム[1- 13 C]ピルビン酸溶液（A）固体NMR偏光蓄積信号B）+ = 270秒時定数T bの B）と緩和（円、S（t）は・EXP（トン/ T B）+ B、T SS 1 = 840秒）=; （A、挿入図）固体状態でDNPenhancedと熱的に偏（スケールアップ10倍）磁化信号間の比較（εのSS =固体分極P SS = 1.5±0.3％に相当する22±5）。 （B）の溶解とアベラ後に記録された第1のスペクトルとの比較熱偏13 Cから得られたGEDスペクトル（100回をスケールアップ）が1024トランジェント（ε=千±200）を使用して、室温でスピン。溶解プロセスは、40％の推定信号損失で3.3秒、自動注入は約2秒を要しました。手動注入することによって、試料を移送行った実験のために、長い射出遅延による追加の損失は30％と推定されました。 （B、挿入図）LDHの不在（T 1 = 75±5秒）で溶解した後、ピルビン酸の過分極信号減衰。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. LDH活性と癌細胞の代謝の結果。原因enzymaに[1- 13 C]乳酸塩信号のアップを構築10のLDH濃度でチック変換-3 U / mlの原因13 C磁化の縦緩和に信号減衰が続きます。赤い線は、リラクゼーションと酵素変換の効果を備えた式（2）で説明したモデルとの適合を示しています。 [1- 13 C]乳酸と反応速度の外挿と[1 -13 C]ピルビン酸濃度との間の（挿入図）比時刻 t = 0（赤線）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
溶解DNP NMR実験の重要なポイントがある：（i）実験のために必要な最低の生成物濃度と同様に行わ及び（ii）可能な信号取得回数を決定した基板、のために達成分極レベル寿命偏光と検出サイト間および基板変換率への転送の持続時間に比べて、磁化。本明細書中に記載の溶解DNPセットアップの噴射システムは、わずか3-4として秒のサンプル転送を可能にします。転送はS.ボーエンとC.ヒルティによって提案された方法におけるほど急速ではなかったが、ピルビン酸のための26の偏光損失が低い分野での適度な縦緩和に制限されていました。 [1- 13 C]ピルビン酸、その長いカルボン核T 1で、10 -3 U / mlという低い濃度でLDHを通してフラックスを測定することができます。
ザ高い信号対雑音比は、溶解DNPつより低い[1- 13 C]ピルビン酸濃度に感受性であり得ることを示唆し、そしてより低い酵素変換率を用いて得られました。達成分極レベルは有意な信号対雑音比の200以上の実験は、低フリップ角α= 10°を使用した液体状態のNMR分光計で取得することが得られます。これは、最適化のため、両方の繰り返し回数とフリップ角の点で部屋を出ます。いくつかの分子は、いくつかの偏光エージェント（TEMPO、OXO63）4と他の人とよく分極固体の分極のビルドアップのために、まだ完全には理解されていない理由のために、しないでください。実験的試験は、分極工程が成功したかどうかを判断する唯一の方法です。分極レベルを向上させるためには、異なるラジカル種4と「交差偏光」に依存する異なった技術の適用の使用を探索することができます。25
ontent ">ラジカルと基板濃度だけでなく、DNP試料中の溶媒組成のさらなる最適化は、偏光を改善しようとしたことができます。技術は、分子に限定されるもので核または溶解がすることができた後、偏光を維持することができ、核のグループ識別された。偏光のいずれか高い磁場中またはLLSの形式は、2つ以上の結合された核の非局在化における単核固有状態との間の不均衡として持続させることができる。最初のオプションのために、プローブ核が高いと、他の核から離れなければなりませんこのような陽子などの磁気回転比、。このような位置は、天然に見出されていない場合は、重陽子による活性核の近傍でのプロトンの分子または交換中に孤立したサイトでのNMR活性核における濃縮は、磁気双極子強度を低下させることが必要であり、 。LLSを得るために、核のグループ内の磁気結合の理論解析は、サップの最適な手段を見つけるために27,28を実施することができますORT分極。この戦略は、29アミノ酸、目的の代謝サイクルに関与する他の分子にも適用することができるような小分子で成功しています。より良い実験中に磁化を保持するには、LLSの励起による溶解DNPの組み合わせは、他の酵素反応のための測定時間スパンを延長することを約束する。20ここで説明DNP-NMR実験は、癌細胞中でピルビン酸代謝の測定に適合されている。溶解DNP増強NMRによる酵素活性のリアルタイム測定はDNP増強MRIにより癌の診断において現在の努力を助けることができる6、既に使用しますクリニック。12 DNP-強化NMRの分子特異性は、分子標的とそれらの変換の製品を区別するための選択の方法になります。将来の改善は、代謝変換の他の分子トレーサーの評価に焦点を当てます30
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言
Acknowledgments
著者は、有益な議論のための機器の選択と組み立てアシストするために博士のJJのファン・デル・クリンク、ならびに博士F.カテブ博士G. Berthoに感謝します。 ACは、スイス国立科学財団（PPOOP2_157547を付与する）によってサポートされていました。私たちは、パリソルボンヌシテ（NMR @コム、DIM解析、ヴィル・ド・パリ、財団デラRECHERCHEMédicale（FRM ING20130526708）、およびParteneriatヒューバートCurienブランクーシ32662QKから融資を認めている。私たちのチームはEquipexプログラムパリ・アン・共振の一部でありますそして、CACSICE。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNP polarizer | Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) | /// | Cryostat and electronic equipment for sample polarization |
| Vacuum system components | Edwards vacuum (France) | Various | - turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components |
| DNP 3.35T Magnet | Bruker (France) | ||
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker (France) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (US) | Data analysis software | |
| Chemicals | |||
| SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C | Sigma Aldrich (France) | 490709 | |
| ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D | Sigma Aldrich (France) | 186414 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO 97% | Sigma Aldrich (France) | 176141 | |
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich (France) | 151882 | |
| reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) | Sigma Aldrich (France) | ||
| ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich (France) | ||
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich (France) | ||
| phosphate buffer, pH = 7.0 | Sigma Aldrich (France) | ||
| LDH enzyme in | Sigma Aldrich (France) | L-2500 | |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma Aldrich (France) |
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