Oppløsning Dynamic Nuclear Polarisering Instrumentering for Real-time enzymatiske reaksjonen rate målinger av NMR

Abstract

Den største begrensningen av NMR-baserte undersøkelser er lav følsomhet. Dette får for lange innhentingstider, og dermed hindre sanntids NMR-målinger av metabolske transformasjoner. Hyperpolarisering via oppløsnings DNP omgår del av følsomheten utsteder takket være den store ut-av-likevekt kjernemagnetiseringen som stammer fra den elektron-til-kjerne sentrifuge polarisering overføring. Den høye NMR-signalet som oppnås kan anvendes for å overvåke kjemiske reaksjoner i sanntid. Ulempen med hyperpolarized NMR ligger i den begrensede tiden vindu tilgjengelig for signal oppkjøpet, som vanligvis er i størrelsesorden kjernespinnlangsgående avslapping tidskonstant, T _1, eller, i gunstige tilfeller, på rekkefølgen av avslapping tid konstant forbundet med singlet-staten kombinert kjerner, T _LLS. Cellulært opptak av endogene molekyler og stoffskifte kan gi viktig informasjon om tumorutvikling og narkotika respons. Numerous tidligere Hyperpolariserte NMR studier har vist relevansen av pyruvat som et metabolsk substrat for overvåking av enzymatisk aktivitet in vivo. Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av det eksperimentelle oppsettet og fremgangsmåter som kreves for studiet av enzymatiske reaksjoner, særlig pyruvat til laktat konverteringsraten i nærvær av laktat-dehydrogenase (LDH), av hyperpolariserte NMR.

Introduction

Dynamisk atom polarisering ^(DNP), 1,2 en teknikk utviklet for å forbedre kjernespinn polarisering, dvs. ubalansen mellom "opp" og "ned" spin populasjoner (P = [N _{↑ -} N _↓] / [N _↑ + N _↓]), ble først introdusert i 1950. Nukleære spinn som ¹³ C kan polariseres opp til P = 10 ^-1 i gunstige forhold, typisk ved en temperatur i størrelsesorden av 1 K og i et magnetisk felt av 3,357 T. ^3,4 Et gjennombrudd for biologiske anvendelser kom i begynnelsen av 2000-tallet med utviklingen av oppløsnings DNP som består i å oppløse frosne polariserte prøver i overhetet vann og samtidig beholde den høye nukleær polarisering nivå oppnådd ved lav temperatur. ⁵ det væske-tilstand NMR-signalet blir forsterket med en faktor 10 ³ -10 ⁴ sammenlignet fellestermisk-polarisert RT NMR forhold. Oppløsnings DNP gir derfor en måte til ikke-invasiv måle biokjemiske reaksjonshastigheter in situ i sanntid, slik at overvåknings dynamikk ved NMR med en tidsmessig oppløsning på 1 sekund eller ^{mindre. 6 - 10} Det ble også mulig å påvise analytter i meget lave konsentrasjoner ^11.

Blant de ikke-invasive molekylbildediagnostikk, er hyperpolariserte NMR den eneste teknikk som gjør det mulig samtidig å måle et substrat og dets metabolske produkter i sanntid. Oppløsning DNP ble mottatt med entusiasme i forskjellige vitenskapelige områder som spenner fra in vitro NMR til klinisk MR ^{12 og} de ​​mest lovende programmene er knyttet til in situ overvåkning av stoffskiftet. ^13,14 Den største begrensningen for oppløsning DNP er at etter en tid på i størrelsesorden fem ganger den langsgående relaksasjonstid konstant T _1, den forbedrede polarevisualisering er tapt. Det er derfor nødvendig å bruke molekyler som bærer kjernespinn stiller relativt lang T _1. For å forlenge tidsspenn på polarisering ekstrautstyr, sakte-avslappende atomspinntilstander, kjent som varige tilstander (LLS), kan brukes ^{15 -. 17} LLS er ufølsomme for intra-pair dipol-dipol interaksjon, slik at deres karakteristiske relaksasjonstid konstant, T _LLS, kan være mye lengre enn T _1. ¹⁸ En magnetiser levetid på flere titalls minutter og opp til en time kan derfor oppnås, ^19,20 og LLS er blitt foreslått både for magnetisk resonansspektroskopi (MRS) og MR. ²¹

De viktigste punktene som må nøye optimalisert for å studere enzymatiske reaksjonshastigheter ved hyperpolarized NMR er: (i) maksimere solid-state polarisering og (ii) redusere polarisering tap under overføringen av hyperpolarized løsning frapolarisator til NMR-spektrometer. Denne artikkelen beskriver tilpasning av en skreddersydd oppløsning DNP apparater og innsprøytingssystem for å studere enzymatiske reaksjoner. Egenskaper og ytelse av oppsettet vil bli demonstrert med den velkjente og mye brukte hyperpolarized substrat [1- ¹³ C] pyruvat. De viktigste årsakene til dette valget er for det første sin naturlig lang ^13C langsgående avslapping tid (T _1> 50 sek ved høye magnetfelt og temperaturer over 293 K) som tillater overvåking reaksjoner i løpet av noen minutter, og andre, sin sentrale rolle i kreft metabolisme. ^13,14 ved hjelp av oppløsnings DNP NMR og en spesialutviklet injeksjon system, oksydasjon av pyruvat katalysert av laktat-dehydrogenase (LDH) kan overvåkes i nærvær av en innledende pool av umerket laktat ^9,22 eller uten umerket laktat tilsettes som vist her. Det har vist seg at [1- ^13C] laktat-signalet målt i vivo (inkludert i celler) etter injeksjon av hyperpolariserte [1- ^13C] pyruvat er hovedsakelig på grunn av en rask etikett utveksling mellom pyruvat og laktat i stedet for til laktatproduksjon. ⁶

Vi heri presentere sanntids produksjon av [1- ^13C] laktat fra hyperpolarized [1- ^13C] pyruvat injisert i et NMR-rør inneholdende LDH, men i utgangspunktet ikke laktat.

system~~POS=TRUNC
Det er to hoveddeler i en oppløsning DNP oppsett (figur 1): DNP polarisatoren og NMR spektrometer. Hovedelementet i den DNP polarisator er en kryostat for avkjøling av prøven til rundt 1 K i en pumpet heliumbadet. Kryostaten er satt inn i en 3,35 T superledende magnet og har en geometri som garanterer å ha den polariserende prøven ved isomidtpunktet av magneten (figur 1). Inne i kryostaten, prøven (a) er omgitt av en spole NMR (b), for å måle polarisasjonen buildup, inneholdt i en overmoded mikrobølgehulrom (c). Hele prøven ble holdt ved lav temperatur i et bad pumpes helium (d) og bestrålt med mikrobølger gjennom bølgelederen. Hele systemet styres av skreddersydd programvare (figur 2D).

Maskinvaren og kryogenisk utstyr som trengs for å utføre DNP og den påfølgende oppløsningen er fortsatt en teknologisk utfordring. En ny DNP cryostat ^23,24 ble utviklet og testet for å bestemme sin kryogeniske forestillinger og deretter optimalisert for rask nedkjøling, helium hold-tid og samlet minimal helium forbruket under drift.

Kryostaten består av to deler. Den første delen av kryostaten er isolasjons dewar (figur 2A) som kan grovt separert i øvre del (a) halen, eller sample plass (b), og den ytre vakuumkammeret (OVC) holdt under høyvakuum og huset stråling skjermer (c). Den andre delen av kryostaten er hoved iSert (figur 2B) som er lagt inn i isolasjonen Dewar, hvor alle manøvreringsreglementer styres. Den flytende helium som kommer fra den eksterne lagrings dewar via overføringsledningen (a), er i det første trinn kondenseres i separatoren (b), et mellomliggende kammer benyttes både til å holde den øvre del av kryostaten kulde og for å fjerne helium fordampes under overføringen. Separatoren trykket senkes ved pumping gjennom et kapillar (c) pakket rundt den øvre del av kryostaten; strømmen av kald helium i denne kapillær brukes til å kjøle ned på ledeplatene (d) og strålingsskjermer i isolasjonen dewar (OVC). Prøven plasseres og polarisert i prøven plass. Prøven Plassen er koblet til separatoren gjennom en annen kapillar (e), pakket rundt halen av hoved cryostat innsatsen. Dette kapillar kan åpnes eller lukkes gjennom en nåleventil manuelt betjent fra utsiden.

For å oppnå den lave temperatur som brukes under DNP process, behov for flytende helium for å bli samlet i kryostaten prøven plass og trykket senkes til mbar rekkevidde. Operasjonene som trengs for cryostat operasjon utføres gjennom en ganske komplisert pumpesystem med tre sett med pumper, overvåkes og vedlikeholdes i forskjellige punkter med elektroniske og elektromekaniske instrumenter (Figur 2C). Kryostaten OVC trenger å bli pumpet til høyt vakuum ved det første pumpesystemet. Dette systemet består av en turbo-molekylær pumpe støttet opp av en roterende pumpe (a). Den flytende helium blir overført fra lagrings dewar (b) gjennom kryostaten overføringsledning innløpet til kryostaten separatoren. Separatoren har et utløp forbundet med den andre pumpesettet. Dette settet består av en 35 m ^{3 / time} membranpumpe (c). Denne linjen lar fjerne heliumgass kokt under overføringen fra Dewar og under separator kjøling. Den flytende helium oppsamlet i separatoren kan deretter overføres til prøverommet gjennom hettenIllary rør som er beskrevet ovenfor. For å overføre flytende helium fra separatoren til prøven plass og deretter å senke prøven romstrykket til mbar område, et tredje pumpe system bestående av en 250 m ^{3 / time} Roots-pumpe støttet opp av en 65 m ^{3 / time} roterende pumpe (d) er koblet til kryostaten gjennom en manuell spjeldventil (e).

Alle vakuum systemdrift blir styrt og regulert ved hjelp av en elektropneumatisk skreddersydd anordning (f). Denne enheten kontrollerer vakuumledningsforbindelser mellom kryostaten separatoren (g) og utfallsrommet (h) uttak, den andre / tredje pumpesystemer (c, d), en komprimert helium flaske (i) og utsiden. Kommunikasjon mellom (f) og på utsiden går gjennom en enveisventil (j). Den elektro-hydraulisk enhet (f), samt alle systemparametre og oppløsningen maskinvare styres og drives av en skreddersydd elektronisk enhet tilkobles USB med en vanlig PC. Endelig er hele systemet, gjennom det elektroniskeenhet, forvaltes av skreddersydde frittstående programvare (figur 2D) hvor relevante operasjoner er lansert gjennom et grensesnitt ved hjelp av programvare knapper.

For å administrere prøven og måle NMR-signal bygges opp i fast tilstand en rekke innsatser benyttes (figur 3A). For å forberede kryostaten for polarisering, plasserer hovedutvalget innsatsen (a), inn i cryostat. Den viktigste Prøven innsatsen er forsynt med et NMR-spole (b) plassert inne i en overmoded forgylt mikrobølgehulrom. Pre-fryse substratet inneholdende løsningen som skal polarisert (polariserende løsning) ved flytende nitrogen temperatur i et passende prøvebeholder og plassere den ved slutten bunnen av glassfiber prøveholderen (c). Skyv prøveholderen inn i hovedutvalget innsatsen for å nå magneten isomidtpunktet. Sett den gullbelagte bølgeleder (d) i prøveholderen. Bølgelederen tillater mikrobølge som genereres fra en ekstern mikrobølgekilden for å reise med minimalt tap to prøven.

Den skreddersydde programvare for cryostat ledelse håndterer automatisk, ved å klikke på tilsvarende grensesnitt knappen, forskjellige operasjoner som cooldown (kryostaten temperaturen senkes nær flytende helium temperatur), fylling (kryostaten er fylt med flytende helium til et forhåndsbestemt nivå ), et ytterligere trinn med avkjøling til T ≈ 1 K (den flytende helium bad pumpes for å oppnå lavest mulig temperatur), trykksetting (kryostaten settes under trykk litt over atmosfæretrykk ved P = 10-30 mbar for å tillate kryostat åpning uten risiko av forurensning av kryostaten ved luft) og oppløsning (automatisk fremgangsmåte for å oppløse prøven DNP og overføre den resulterende oppløsning til hyperpolariserte målestedet, dvs. NMR-spektrometer).

Polarisasjonen blir utført bestråle prøven med mikrobølger ved 94 GHz (i et polariserende felt B ₀ t _DNP, hvor T _DNP er polarisasjonen oppbygging tid. T _DNP er av samme størrelsesorden som den langsgående relaksasjonstid av pulskjerner i fast tilstand ved den gitte felt og temperatur. I alle våre eksperimenter prøven ble polarisert i mer enn 5 T _DNP.

Ved slutten av polarisasjonen tid, har til å bli løst opp i en RT-løsning for å bli brukt til måling av enzymatisk aktivitet i prøven. I løpet av oppløsningsprosessen, blir 5 ml av overhetet _D2O fra kjelen av oppløsnings innsatsen (figur 3B) skjøvet av komprimert heliumgass (P = 6-8 bar) til å nå den DNP-forbedret prøven og oppløse det. Den resulterende hyperpolariserte løsning blir skjøvet ut oppløsningen innsatsen ved den komprimerte heliumgass gjennom oppløsningen innsatsen utløp (figur 3C-b 23 tiden som er nødvendig for prøven overføring fra DNP polarisator til NMR spektrometer nettstedet handler om 3 sek.

Oppløsningsprosessen blir utført ved hjelp av et oppløsningsinnsats (figur 3B). Oppløsnings innsatsen består av en elektronisk-pneumatisk sammenstilling (a), en karbonfiber pinne (b) inneholdende forbindelsesrør mellom kjelen i den pneumatiske sammenstillingen og prøvebeholderen oppbevaringsboks (c), som gjør det mulig lekkasjetett kobling med prøven container, og ut igjen til uttaket. Den elektro-pneumatisk sammenstillingen (figur 3C) blir brukt til å fremstille og drive overhetet _D2O gjennom karbonfiber holde seg til prøvebeholderen, og deretter å ekstrahere den hyperpolariserte løsning fra kryostaten. Den elektro pneumatisk forsamlingen består av pneumatiske ventiler (a) som kontrollerer tilkoblingene mellom compressed helium (P = 6-8 bar) linje (b), kjelen (c) hvor D _{2 O} injiseres gjennom ventilen (d), og utløpet (e) gjennom karbonfiber pinnen (f). Systemet er avsluttet av en trykk G, et termometer og en varmemotstandstråd i kjelen (c), en utløser (h) og en koblingsboks (i) benyttet for å forbinde systemet med elektronisk styring enheten.

Den DNP kryostaten og NMR-spektrometeret er forbundet med en overføringsledning, dvs. en PTFE-rør med 2 mm indre diameter inne som den hyperpolariserte oppløsningen blir skjøvet av helium under trykk (P = 6-8 bar) når oppløsningen blir utløst.

Oppløsnings sekvens er sammensatt av følgende operasjoner: i de første 300 millisekunder, overhetet D _{2 O} er presset til prøvebeholderen for å smelte og oppløse den hyperpolariserte frosne løsningen. Deretter blir den hyperpolariserte oppløsning ekstraheres fra kryostaten ved gjennomsnittet av presun- der trykk (P = 6-8 bar) heliumgass og presset gjennom 2 mm indre diameter PTFE-røret (figur 3C-e) til målestedet, hvor injeksjonen er utført med en av de prosedyrer som er beskrevet i trinn 6.2.1 eller 6.2 Trinn 0,2.

Den andre komponenten av oppløsnings DNP NMR oppsettet er det NMR-spektrometer. I oppsettet som er beskrevet her, opererer NMR spektrometer ved et felt B ₀ = 11,7 Tesla. En 5 mm NMR-sonde brukes til å måle den hyperpolariserte signal etter oppløsningen. NMR-spektrometer drives gjennom NMR-konsollen, som brukes til både solid-state og væske-state NMR-målinger, og firmaet levert programvare XWinNMR. En typisk måling er sammensatt av en lav flip vinkel vanskelig puls (enten kalibrert, for liquidstate eller un-kalibrert, for solid-state-målinger) etterfulgt av signal kjøp.

Målinger av den faststoff-varme polarisasjon signal og DNP-avledet signal oppbygging er utført ved hjelp av skreddersydde ^13C polen på stedet av DNP polarisator (figur 3AB) koplet til NMR-spektrometer. I denne spesielle situasjonen NMR-spektrometeret ikke utfører signal låsing. Når faststoff målinger blir utført, for å unngå betydelige forstyrrelser i polarisasjonen, bør tidsforsinkelsen mellom kjøp være lang nok, omtrent mer enn 0,5 T _DNP.

SSD-ekstrautstyr er definert som hvor er den hyperpolariserte signal (oppnådd i trinn 3.3) og er den faste tilstandssignal (oppnådd ved termisk likevekt ved pumpede flytende helium temperatur i trinn 3.2) (figur 4A). Denne parameteren defines den maksimale polarisasjonen tilgjengelig for NMR eksperimenter, før uunngåelige tap i løpet av overføringen av den hyperpolariserte oppløsning. Målingen er utført med en enkel puls erverve sekvens ved hjelp av en FN-kalibrert lav flip vinkel puls. Pulse kalibrering er ofte hoppet for SOLID målinger.

En analog fremgangsmåte kan benyttes til å bestemme den hyperpolariserte signalforbedring i væsketilstand. I dette tilfellet, blir prøven plassert i spektrometeret røret før injeksjon (trinn 6.2) som består av 500 pl av _D 2 O. Etter oppløsning og injeksjon, er det to viktige parametre for å overvåke. Den første er hyperpolarized forbedring på NMR spektrometer området, (Figur 4B), der er signalet like etter injeksjonen av hyper polarisert oppløsning (oppnådd i trinn 7.1) og er den termiske polarisasjonen signal (oppnådd i trinn 7.2). Den andre er den langsgående relaksasjonstid, T ₁ (figur 4B, innfelt), forbundet med substratet og hvert metabolsk produkt (oppnådd ved eksponensielle sluttende signaler som oppnås i trinn 7.1). Disse to parametere definerer minimums substratet konsentrasjonen som er nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold (SNR) og den tilgjengelige tidsvinduet for måling av de metabolske transformasjoner. Forholdet mellom solid-state polarisering og liquidstate polarisering gir et estimat av polarisering tap på grunn av avslapping under hyperpolarized løsning overføring. En verdiation12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> skal være observert i fravær av avslapnings tap.

Protocol

MERK: All data analyse ble utført ved hjelp av kommersiell programvare.

1. Klargjør polariserings Solution

1. Forbered 2 ml av en 1,12 M ¹³ C-merket natriumpyruvat (Na ^{+ _[CH3-CO- 13} COO] ^- substrat) oppløsning dopet med 33 mM TEMPOL radikal (4-hydroksy-2,2,6,6- tetrametylpiperidin-1-oksyl, polariserende middel) ⁴ i 2: 1 _D2O / _d6-etanol ^til 13 C-observasjoner. FORSIKTIG: Håndtering forholdsregler må tas på grunn av brannfarlig natur d ₆ etanol.
2. Kontroller at den radikale konsentrasjonen er optimal i forhold til oppnådde polarisering.
   1. Endres noe radikalet Konsentrasjonen av oppløsningen ved punkt 1,1 (for eksempel til 30 mM eller 35 mM).
   2. Bestemme iterativt faststoff forbedring (se trinn 3) og en rest-konsentrasjon som fører til maksimal forbedring.

2. Polarization

1. Senk DNP kryostaten temperatur gjennom cooldown prosedyren. Klikk "Avkjøling" -knappen på cryostat programvaregrensesnitt (figur 2D).
2. Samle flytende helium i DNP kryostaten gjennom fylleprosedyren. Klikk "Fylling" -knappen på cryostat programvaregrensesnitt (figur 2D).
3. Plasser 300 ul av det optimaliserte polariserende løsning fra trinn 1,1 i prøvebeholderen er forsynt med DNP polarisator. Fryse prøvebeholderen med prøven inne ved forsiktig å senke den ned i et flytende nitrogenbad.
4. Eliminere den flytende nitrogen som kan være tilstede i prøvebeholderen etter fryse fremgangsmåte (trinn 2.3) ved å trekke prøvebeholderen fra den flytende nitrogenbad og rotere den opp ned.
   MERK: Dette trinnet er avgjørende for å oppnå en grundig oppløsning av prøven (se trinn 5).
5. Sett prøven i kryostaten.
   MERK: Dette Step, sammensatt av de følgende undertrinn, må utføres hurtig (dvs. i løpet av mindre enn 10 til 20 sek) for å forhindre at prøven fra smelting.
   1. Sett prøvebeholderen i prøveholderen. Sett prøveholderen i hoved cryostat innsatsen. Sett mikrobølger bølgeleder i prøveholderen.
6. Senk temperaturen kryostaten ved å starte en K kjøleprosedyre. Klikk "1K Cooling" -knappen på cryostat programvaregrensesnitt (figur 2D).
7. Slå mikrobølgekilden på og strålebehandling prøven. Klikk "MW-ON-knappen på cryostat programvaregrensesnitt (figur 2D).

3. Solid-state NMR-målinger

1. Koble koaksialkabelen av NMR konsollen deteksjon kanal fra spektrometeret spolen ved å dreie kontakten mot klokken med 90 ° og trekke den. Plugg koaksialkabel av deteksjons kanal til den koaksiale kontakten kryostatenNMR coil. Sett hannkoplingen av NMR konsollen kabelen i den kvinnelige kontakten kryostaten NMR coil, betaler oppmerksomhet til orientering pin; trykk bestemt og roter kontakten med klokken 90 °.
2. Måle NMR-varmesignalet i fast tilstand ved kryostaten området ved hjelp av en enkel puls-erverve sekvens med un-kalibrert lav flip-vinkel pulsene gjentas ved et intervall på T = 5 min. Etter å ha satt opp målingen, skriver i kommandolinjen av programvaren 'zg' og trykk på Enter-tast på tastaturet. Se i NMR spektrometer bruksanvisningen for mer informasjon om spektrometer drift og måleoppsettet.
3. Mål DNP forbedret NMR signal. Gjenta operasjonene fra trinn 3.2 etter initiering DNP prosessen som beskrevet i punkt 2.
4. Koble NMR konsollen gjenkjenning kanal koaksialkabel fra kryostaten NMR spolen ved å dreie kontakten mot klokken med 90 ° og trekke den. Plugg koaksialkabel av DeteDette skjer kanal til den koaksiale kontakt i spektrometeret spolen. Sett hannkoplingen av NMR konsollen kabelen i den kvinnelige kontakten spektrometeret coil, betaler oppmerksomhet til orientering pin; trykk bestemt og roter kontakten med klokken 90 °.

4. Optimal homogenitet hoved Magnet Field ( 'Trimmingplater')

1. Sett i spektrometeret et rør som inneholder 500 mL av blandingen produsert i tidligere forsøk (dvs. etter trinn 6.2).
2. Utfør NMR-spektrometer shimsingen ved å variere strømmen i shimsingen gradient spoler søker etter det maksimale "låse" signal av deuterium. Velg aktuelt shimsingen polen ved å trykke på tilsvarende knapp på NMR konsollen.
   1. Vri knotten på NMR-konsollen til å bestemme rotasjonsretning som øker låsesignalet. Fortsett å rotere før signalet når et maksimum. Velg en annen shimsingen coil og gjenta maksimering until et lokalt maksimum for alle mellomlegg spoler er funnet. Se i NMR spektrometer bruksanvisningen for mer informasjon. På slutten fjernes prøven som brukes for låsing.

5. Oppløsning

1. Sett 5 ml D _{2 O} i oppløsnings innsatsen kjelen. Under trykk og varme D _{2 O} ved hjelp av motstandstråd til T ≈ 180-200 ° C er nådd. Klikk på Rydd Heater "-knappen på cryostat programvaregrensesnitt (figur 2D).
2. Etter fullførelse av prøven polarisasjonen prosedyre (for eksempel etter tre T _DNP), trykksette kryostaten litt over atmosfæretrykk. Klikk på "SS Operations 'knappen på cryostat programvaregrensesnitt (figur 2D). Fjern mikrobolgelederen fra oppløsningen innsatsen.
3. Skyv oppløsningsinnsatsen (figur 3B) ned i prøveholderen (figur 3A-c). Oppløsnings innsatsen har til å nå bunnen av prøveholderen og må presses hardt for å foreta en lekkasjetett forbindelse med prøvebeholderen for å unngå _D2O lekker i kryostaten.
4. Trykk på maskinvaren avtrekkeren (figur 3C-h) for å starte oppløsningen sekvens, et forutbestemt tidsbestemt sekvens av pneumatiske ventiler operasjoner.

6. Injeksjon

1. Før oppløsning sted en 5 mm NMR rør, som inneholder 500 mL prøve (for eksempel D _{2 O} for måling i trinn 7 eller LDH oppløsning fra trinn 8 for enzymatisk aktivitetsmålinger i trinn 9), i den isomidtpunktet av 11,74 T-NMR-spektrometer (se trinn 4).
2. Like etter oppløsningen (trinn 5), blande 500 ul av hyperpolariserte oppløsning med prøven plassert i NMR-spektrometer i trinn 6.1.
   1. Manuell Injeksjon: samle hyperpolarizedoppløsning ved slutten av en 2,5 m lang overføringsrøret i et begerglass plasseres i nærheten av NMR-spektrometer magnet. injisere manuelt 500 mL av hyperpolarized løsning i NMR prøverøret gjennom en skreddersydde kapillær system.
   2. Automatisk injeksjon: før oppløsningsprosessen, kobler overføringsrøret til en automatisert skreddersydde injeksjonsanordning som skiller den hyperpolariserte løsning fra heliumgassen som brukes for overføring. Anordningen leverer automatisk 500 mL av hyperpolariserte oppløsning inn i prøverøret.

7. Væske-state NMR måling

1. Etter oppløsningen, måle NMR-hyperpolariserte signal fra prøven i spektrometeret ved en serie på 10 ° flip vinkel puls-erverve sekvensene adskilte ved 1,5 sek for å følge progresjonen av magnetiseringen av underlaget (A), og produktet (B). Etter å ha satt opp målingen, skriver i kommandolinjen av programvaren 'zg' og trykk på & #39; Enter tast på tastaturet. Se i NMR spektrometer bruksanvisningen for mer informasjon om spektrometer drift og måleoppsettet.
2. Når magnetiseringen er fullstendig avslappet (dvs. etter T = 10 T _1), måle NMR-termiske signal ved en serie på 90 ° flip vinkel puls-sekvenser skaffe adskilte ved T = 3 T ₁ ≈ 3 min. Etter å ha satt opp målingen, skriver i kommandolinjen av programvaren 'zg' og trykk på Enter-tast på tastaturet. Se i NMR spektrometer bruksanvisningen for mer informasjon om spektrometer drift og måleoppsettet.

8. Fremstilling av enzym-inneholdende prøver (spesifikk for Pyruvat-til-laktat Transformation)

1. Klargjør reaksjonsbuffer med følgende oppskrift: 50 mM redusert nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,1 mM ditiotreitol (DTT) i 0,1 M fosfatbuffer, pH =7.0.
2. Fremstille en kanin muskel LDH oppløsning 1 U / ml fremstilt ferskt i reaksjonsbuffer med 20 ug / ml bovint serumalbumin, BSA.
3. Bland 478 ul reaksjonsbuffer (trinn 8,1), 20 ul _D2O tillate spektrometer felt stabilisering ( "låsing") og 2 ul LDH oppløsning (trinn 7.2).
4. Sett 500 ul løsning volum fremstilt i trinn 8,3 i en 5 mm NMR-rør og plassere røret i 500 MHz NMR-spektrometer.

9. Komplett enzymatisk reaksjon måler Prosedyre

1. Forbered polariserings prøven (trinn 1) og polariserer det (trinn 2).
2. Utføre shimsingen på spektrometeret (trinn 4), og fremstille den enzymatiske prøven (trinn 8).
3. Utføre oppløsningen (trinn 5) og injeksjons (trinn 6).
4. Måle en serie av signaler fra den hyperpolariserte prøven med 10 ° flip-vinkler pulser kjøp adskilte ved 1,5 sek (trinn 7). Dette trinnet kan måle hyperpolarizedsignal forråtnelse og signalet oppbygging av metabolitter.

10. Montering

1. For hvert spektrum ervervet i trinn 9.4, identifisere topper tilsvarende substrat (A) og produkt (B) henholdsvis og integrere dem (bestemme arealet av toppene). Toppene integraler gi Ettermagnetiseringstid kurssignaler _{(M (A, B)} (t), se likning 2).
2. Ved hjelp av løsningen av ligning (2), bestemme verdien av F = (R + _A k _eff ) Fra en enkel eksponensiell tilpasning av substratet signal integreres i trinn 10,1.
3. Ved hjelp av verdien F = (R + _A k _eff ) Bestemt i trinn 10,2, bestemme k _eff og R _{B fra en} tilpasning av produktet signal M _B (t) med funksjonen oppnås ved å integrere ligning (2). Slå opp Representant resultater seksjon (Enzymatic aktivitet og metabolske målinger) for detaljer om reaksjonen modellering, montering og rf korreksjon.

Representative Results

NMR-signal gevinster ved bruk av oppløsnings DNP
Den DNP effekt består i overføring av den høye polariseringen av uparede elektronspinn, typisk fra stabile radikaler, NMR-aktive kjerner under mikrobølgebestråling av prøven. De oftest brukte frie radikaler er TAM (OXO63) og TEMPOL. ⁴ Polarisering prosedyrer ved hjelp TEMPOL kan optimaliseres av "cross-polarisering". ²⁵

Å optimalisere konsentrasjonen av stabile radikaler for å oppnå den maksimale kjerne polarisasjonen i fast tilstand er avgjørende for suksess av teknikken. Den optimale TEMPOL-konsentrasjonen ble funnet å være 33 mM i forsøksbetingelsene i denne studien. Denne polarisering av det valgte substratet er tilstrekkelig til å følge sin enzymatiske omdannelse i sanntid.

Det magnetiske feltet i Polarizer installert på Paris Descartes er B ₀ = 3,35 T og komponentene i dette systemet ble beskrevet ovenfor (figur 1 - 3). Kryostaten utformingen garanterer at den endelige prøven posisjon sammenfaller med magnet isomidtpunktet. Det magnetiske felt av polarisatoren ble trappet og shimmed ved hjelp av de superledende avstands spolene bare, med kryostaten på plass. Den endelige proton linjebredden av en 1 x 0,5 x 0,5 cm vannprøven var 23 KHz. Vi vurderte og for [en ¹³ C] pyruvat. For å gjøre dette, er det nødvendig først å bestemme ^13C DNP-forsterket signal i fast tilstand ved polarisatoren området før oppløsnings (figur 4A). Etter oppløsning, målte vi [1-13 C] pyruvat hyperpolarized signal og dens forfall på spektrometeret nettstedet. Den flytende tilstand signalet ble målt på et prøveoppløsnings ved hjelp av 500 ul av D _{2 O} som prøven i NMR-spektrometer. Dette tillot oss å bestemme faststoff DNP forsterkning (figur 4B, innfelt), væske-tilstand NMR polarisasjon nivå (figur 4B) og polariserings tap i løpet av overføringen. Forholdet mellom signaler målt i trinn 3,3 og Trinn 3,2 definere solid-state ekstrautstyr, . Forholdet mellom det første signalet som måles i trinn 7.1, og signalet fra Trinn 7.2 definerer væsketilstand hyperpolariserte forbedring, .

Data fra trinn 3, summarized i figur 4A og figur 4A (innfelt), viser at den teknikk som gjør det mulig å polar ¹³ C i [1- ^13C] pyruvat opptil = 22 ± 5, svarende til en ¹³ C polarisasjon = 1,5 ± 0,3%.

Denne polariseringen nivået er mer enn tusen ganger karbon termisk polarisering i felles MRS forhold (for eksempel 11,74 T og 300 K). Data fra Trinn 7, oppsummert i figur 4B og figur 4B (innfelt), gjør det mulig å bestemme den væsketilstand ^13C hyperpolarisering av [1- ^13C] pyruvat = 1 ± 0,2%. Forbindelsen oppnådd i fast tilstand for pyruvat forbedring vartilstrekkelig for formålet av eksperimentet, selv om høyere forbedringer har blitt demonstrert ved hjelp av forskjellige radikaler. ⁵ tidsforløpet data passer fra trinn 7.1 gir et mål på relaksasjonstiden konstant. Den pyruvat langsgående relaksasjonstid i en blanding bestående av 500 mL DNP forbedret oppløsning og 500 ul _D2O, var T ₁ = 75 ± 5 sekunder etter rf korreksjon (se ligning (3)).

Enzymatisk aktivitet og metabolske målinger
Oppløsnings DNP NMR påvisning av ^13C-merket substrat (A) kan brukes til å følge i sanntid enzymatisk konvertering dynamikk og observere dannelsen av produkt (B):

Umiddelbart etter injeksjonen av hyperpolariserte substrat (A),signalet av produkt (B) er null. Da den enzymatiske omdannelsen (1) begynner å produsere (B). Magnetiseringen av ^de 13 C-kjerner ikke påvirkes av de forskjellige kjemiske skift, og kjemisk forandring av molekylene. Likevel kan det nye miljøet fører til forskjellige langsgående avslapping priser for den ¹³ C i B. Produktet signal tidsforløpet kan kvalitativt delt i tre trinn: i begynnelsen, den enzymatiske omdannelsen trans A til B gir en økning i B signal; etter en viss tid, avhengig av de eksperimentelle betingelser, magnetiseringskurvene tap på grunn av avslapning, balansere denne økningen og signalet fra B når et maksimum; til slutt, ved lengre tider, signalet av B desintegrerer på grunn av langsgående relaksasjonstid. I hypotesen enzym metning, forsømmes tilbake konvertering og tar hensyn til magnetisk avslapning, kan magnetiseringen av de to molekyltyper (A og B) i løpet av enzymatisk omdanning beskrives med en couPLED differensialligningssystem: ²²

hvor M _{(A, B)} (t) er magnetiseringer av molekylarter A og B, henholdsvis, er k _eff den effektive konverteringshastighetskonstanten for signaloverføring ved den enzymatiske reaksjon og _{R (A, B)} er den tilsynelatende langsgående avkobling hastighetskonstanter av observerte kjerner i den molekylære arter A og B, henholdsvis _{R (A, B) utgjør} både den rene langsgående magnetisering avslapping og effekten av rF-pulsing.:

hvor T _{1, (A, B)} er den langsgående relaksasjonstidTidskonstanten for kjernen i den lokale molekylære miljø av molekyltyper A og B, respektivt. θ og τ er rf flip vinkel og forsinkelsen mellom to signal kjøp, respektivt.

I denne studien substrat A og produkt B var [1- ^13C] pyruvat og [1- ^13C] laktat, henholdsvis, og hensikten var å måle [1- ^13C] laktatproduksjon av LDH under betingelser der ingen (isotopisk umerket) laktat var til stede i oppløsningen ved begynnelsen av forsøket. Målingen består i en serie av ¹³ C-spektrene tatt opp med et enkelt pulseacquire sekvens ved T = 21 ° C. En kalibrert 10 ° flip-vinkler puls ble anvendt for sekvensielle eksitasjoner (Trinn 9). Forsinkelsen mellom to suksessive pulser var τ = 1,5 sek. NMR akkvisisjonssekvens ble startet noen titalls sekunder før hyperpolarized solution injeksjon. Den pyruvat substratkonsentrasjon i prøverøret etter injeksjonen var 25-35 mM. I trinn 10 av laktat til pyruvat konvertering hastighet ved en LDH konsentrasjon på 10 ^-3 U / ml ble målt. Det registrerte signalet fra laktat og pyruvat passer godt modellen i ligning (2) (stiplet linje i figur 5) og dannelse av k _eff = 0,9 ± 0,1 x 10 ^{-3 sek-1 (figur} 5). Denne verdien stemmer overens med den initiale reaksjonshastighet bestemmes av forholdet [Lac] / [Pyr] ved tiden 0 s (figur 5, innfelt).

Figur 1. Skjematisk av eksperimentell apparatur. Polarisatoren (til venstre) består av en mikrobølgehulrom (c) som befinner seg inne i en kryostat (d) er lagt inn i en vid boring 3,35 T superledende magnet. En skreddersydd NMR spole (b) rundt than prøve (a) blir brukt for å overvåke kjernespinn polarisasjonen in situ. Helium Badtemperaturen holdes på 1,12 ± 0,03 K mens prøven blir bestrålt ved mikrobølgefrekvens ν _mw = 94 GHz. Systemet gjør det mulig for NMR-målinger som skal utføres på faststoffprøven i løpet av polarisasjon. Den polariserte prøven er oppløst i overopphetet vann og presset med komprimert helium gass gjennom overføring linjen inn i prøverøret tidligere plassert inne i et tilstøtende NMR-spektrometer (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Kryostat og vakuum system skjemaer. (A) cryostat isolasjon Dewar; (B) cry ostat hovedinnsats; (C) vakuum tilkoblinger; (D) skjermbilde av programvare grensesnitt med knapper som brukes til å utføre bestemte operasjoner som er beskrevet i trinn 2 og trinn 5 i protokollen delen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Prøvetaking og oppløsning. (A) prøvehåndtering inserts; (B) oppløsning innsats; (C) detalj av elektro pneumatiske tilkoblinger av oppløsning innsats. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

">
Figur 4. Solid-state polarisering oppbygging og hyperpolarized signal forfall. Oppløsning DNP signaler. (A) fast tilstand NMR-polarisasjons oppbygging signal av en 1,12 M natrium [1- ^13C] pyruvat-løsning i løpet av en DNP polarisasjon (kors, utstyrt med en eksponensiell funksjon S (t) = A x exp (-t / T _b) + B av tidskonstanten T _b = 270 sek) og avslapning (sirkler, S (t) = A • exp (t / T _b) + B, T ^ss ₁ = 840 sek); (A, innfelt) sammenligning mellom DNPenhanced og termisk-polariserte (skalert opp 10 ganger) magnetiseringskurven signaler i fast tilstand (ε _ss = 22 ± 5, svarende til en solid-state polarisasjon P _SS = 1,5 ± 0,3%); (B) sammenligning mellom den første spekteret registreres etter oppløsning og gjenged-spektrum (oppskalert 100 ganger) erholdt fra den termisk polariserte ^13C roterer ved romtemperatur ved bruk av 1024 transienter (ε = 1000 ± 200). Oppløsningsprosessen tok 3,3 sek og den automatiske injeksjons omtrent 2 sekunder med et estimert signal tap på 40%. For forsøkene foregår overføring av prøven ved manuell injeksjon ble ytterligere tap på grunn av lengre injeksjon forsinkelse estimert til 30%; (B, innfelt) hyperpolarized signal nedbrytning av pyruvat etter oppløsning i fravær av LDH (T ₁ = 75 ± 5 sek). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. LDH aktivitet og kreftcelle metabolisme resultater. Oppbygging av [1- ¹³ C] laktat signalet på grunn av enzymatic konvertering ved en LDH konsentrasjon på 10 ^-3 E / ml, etterfulgt av signal nedbrytning på grunn av langsgående relaksasjon av ¹³ C magnetisering. Den røde linje viser den passer sammen med den modell som er beskrevet i ligning (2) omfattende virkningene av avslapning og enzymatisk omdannelse. (Innfelt) forholdet mellom [1- ¹³ C] laktat og [1 ^-13 C] pyruvat konsentrasjon med en fremskrivning av reaksjonshastigheten ved tidspunktet t = 0 (rød linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De kritiske punkter av oppløsnings DNP NMR-eksperiment er: (i) graden av polarisering oppnås for substratet, som bestemmer den laveste produktkonsentrasjon som er nødvendig for eksperimenter, så vel som antallet av signal kjøp som kan utføres og (ii) levetiden av magnetiseringen, sammenlignet med varigheten av overføringen mellom polarisasjonen og deteksjons områder og til frekvensen av substratet transformasjon. Injeksjonen system av oppløsnings DNP oppsettet beskrevet her gjør det mulig for prøveoverføring i så lite som 3-4 sek. Selv om overføringen var ikke så hurtig som i den fremgangsmåten foreslått av S. Bowen og C. Hilty ^ble 26 polariserings tap for pyruvat begrenset på grunn av den moderate langsgående relaksasjonstid i det lave området. [1- ^13C] pyruvat, med sin lange karboksyl atom T _1, gjør det mulig å måle fluksen gjennom LDH, ved konsentrasjoner så lave som 10 ^-3 U / ml.

De høyt signal-til-støy-forhold oppnås ved hjelp av oppløsnings DNP tyder på at man kan være følsomt for enda lavere [1- ^13C] pyruvat konsentrasjoner, og lavere enzymatiske konverteringsfrekvenser. Den oppnådde polarisasjonsnivået gir mer enn 200 eksperimenter med et betydelig signal-til-støy-forhold som skal oppnås i det væske tilstand NMR-spektrometer ved anvendelse av en lav flip vinkel a = 10 °. Dette gir rom for optimalisering både i form av repetisjonstider og flip vinkler. For oppbyggingen av polarisering i solid-state noen molekyler polarisere godt med noen polariserende midler (TEMPO, OXO63) ^{4 og} andre ikke, av grunner som ennå ikke er fullt ut forstått. Eksperimentelle forsøk er den eneste måte å bestemme hvorvidt den polariseringen trinn er vellykket. For å forbedre polarisasjons-nivå, kan en undersøke bruk av forskjellig radikal arter ⁴ og anvendelsen av forskjellige teknikker som baserer seg på "krysspolarisasjon '. ²⁵

ontent "> Videre optimalisering av radikale og substratkonsentrasjoner så vel som løsningsmiddel blandingen i DNP prøven kan bli forsøkt å forbedre polarisering. Teknikken er begrenset til molekyler hvori en kjerne eller en gruppe av kjerner i stand til å opprettholde polarisasjonen etter oppløsning kan bli identifisert. Polarisering kan opprettholdes enten som en ubalanse mellom mono-nukleær eigenstates ved høye magnetfelt eller i form av LLS delocalized på to eller flere koblede kjerner. for det første alternativet, har sonden kjernen å være fjernt fra flere kjerner med høy gyromagnetiske forhold, slik som protoner. ved en slik posisjon ikke finnes naturlig, anrikning i NMR-aktive kjerner i isolerte områder i molekylet eller erstatning av protoner i nærheten av aktive atomkjerner med deuteroner, for å redusere den magnetiske dipol styrke, er nødvendige . for å oppnå LLS, en teoretisk analyse av de magnetiske koplinger innenfor grupper av kjerner kan utføres ^27,28 for å finne optimale midler for å support polarisering. Denne strategien har vist seg vellykket i små molekyler slik som aminosyrer ²⁹ og kan brukes til andre molekyler som er involvert i metabolsk sykluser av interesse. For bedre å bevare magnetiseringen i løpet av forsøket, kombinasjonen av oppløsnings DNP med eksitasjon av LLS lover å forlenge måletidsrommet for andre enzymatiske reaksjoner. ²⁰

Den DNP-NMR-eksperiment som er beskrevet her er tilpasset for måling av pyruvat metabolisme i kreftceller. ⁶ Målingen sanntid av enzymatisk aktivitet ved oppløsning DNP forbedret NMR kan bidra til nåværende innsats i kreftdiagnose av DNP-forsterket MR, som allerede anvendt i klinikken. ¹² den molekylære spesifisiteten av DNP-forbedrede NMR gjør det til en metode for valg for å skille mellom molekylære mål og produkter av deres transformasjoner. Fremtidige forbedringer vil fokusere på vurderingen av andre molekylære markører for metabolske transformasjoner ³⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNP polarizer	Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)	///	Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components	Edwards vacuum (France)	Various	- turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet	Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker (France)
Origin 8.0	OriginLab (US)		Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C	Sigma Aldrich (France)	490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D	Sigma Aldrich (France)	186414
4-Hydroxy-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (France)	176141
Deuterium oxide	Sigma Aldrich (France)	151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)	Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0	Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in	Sigma Aldrich (France)	L-2500
bovine serum albumin, BSA	Sigma Aldrich (France)