Upplösning Dynamic Nuclear Polarisering Instrument för Realtids enzymatisk reaktion Rate Mätningar av NMR

Abstract

Den största begränsningen av NMR-baserade undersökningar är låg känslighet. Detta frågar efter långa hämtningstider, vilket förhindrar realtid NMR-mätningar av metabola transformationer. Hyperpolarisation via upplösning DNP kringgår del av den känslighet utfärdar tack vare den stora out-of-jämvikts nukleär magnetisering som härrör från den elektron-till-kärna spinpolarisation överföring. Den höga NMR-signal som erhålls kan användas för att övervaka kemiska reaktioner i realtid. Nackdelen med hyper NMR bosatt i den begränsade tid som finns tillgänglig för signal förvärv, som vanligtvis är i storleksordningen av kärnspinn longitudinella relaxationstidskonstant, T ₁ eller, i gynnsamma fall, på order av relaxationstidskonstant i samband med sing tillstånd av kopplade kärnor, T _LLS. Cellulärt upptag av kroppsegna molekyler och ämnesomsättning kan ge viktig information om tumörutveckling och läkemedelssvar. numerous tidigare hyperpolariserade NMR-studier har visat relevansen av pyruvat som en metabolisk substrat för övervakning av enzymatisk aktivitet in vivo. Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av experimentuppställning och metoder krävs för studier av enzymatiska reaktioner, i synnerhet pyruvat-till-laktat omvandlingsgraden i närvaro av laktatdehydrogenas (LDH), genom hyperpolariserad NMR.

Introduction

Dynamisk kärn polarisering (DNP), ^1,2 en teknik som syftar till att förbättra kärnspinnpolariseringen, det vill säga, obalansen mellan "upp" och "ner" spin populationer (P = [N _↑ - N _↓] / [N _↑ + N _↓]), introducerades för första gången på 1950-talet. Kärnspinn, såsom ¹³ C kan polariseras upp till P = 10 ^-1 i gynnsamma förhållanden, typiskt vid en temperatur av storleksordningen 1 K och i ett magnetiskt fält av 3,357 T. ^3,4 Ett genombrott för biologiska tillämpningar kom i början av 2000-talet med utvecklingen av upplösnings DNP som består i att lösa upp frysta polariserade prover i överhettat vatten under bibehållande av den höga kärnpolariseringsnivån som erhålls vid låg temperatur. ⁵ det vätske state NMR-signal förstärks av en faktor 10 ³ -10 ⁴ i jämförelse med gemensamtermiskt polariserad RT NMR-betingelser. Upplösning DNP tillhandahåller därför ett sätt att icke-invasivt mäta biokemiska reaktionshastigheter in situ i realtid, vilket gör att övervaknings dynamik genom NMR med en temporal upplösning på en sekund eller mindre ^{6 -. 10} Det blev också möjligt att detektera analyter i mycket låga koncentrationer ^11.

Bland de icke-invasiva molekylära avbildningsmetoder, är hyper NMR den enda teknik som möjliggör samtidig mätning av ett substrat och dess metaboliska produkter i realtid. Upplösning DNP mottogs med entusiasm i olika vetenskapliga områden som sträcker sig från in vitro-NMR klinisk MRI ¹² och de mest lovande tillämpningarna är relaterade till övervakning på plats av ämnesomsättningen. ^13,14 Den största begränsningen av upplösning DNP är att efter en tid på i storleksordningen fem gånger den longitudinella relaxationstidskonstanten T _1, den förbättrade polärasering förloras. Det är därför nödvändigt att använda molekyler som bär kärnspinn som uppvisar relativt lång T _1. För att förlänga tidsspann polarisationen förbättring, långsamt avkopplande kärnspinntillstånd, så kallade långlivade stater (LLS), kan användas ^{15 -. 17} LLS är okänsliga för intra-pair dipol-dipol interaktion, så deras karakteristiska relaxationstidskonstant, T _LLS, kan vara mycket längre än T _1. ¹⁸ En magnetiseringskurva livstid av tiotals minuter och upp till en timme kunde därför erhållas, ^19,20 och LLS har föreslagits för både magnetisk resonansspektroskopi (MRS) och MRI. ²¹

De viktigaste punkterna som måste vara noggrant optimerade för att studera enzymatiska reaktionshastigheter genom hyper NMR är följande: (i) maximera solid-state polarisering och (ii) minimera polarisering förlust under överföringen av den hyperpolariserade lösningen frånpolarisatorn till NMR-spektrometern. I den här artikeln beskrivs anpassning av en skräddarsydd upplösning DNP apparat och insprutningssystem för att studera enzymatiska reaktioner. De egenskaper och prestanda av installationen kommer att demonstreras med den välkända och allmänt använd hyper substrat [1- ¹³ C] pyruvat. De främsta orsakerna till detta val är det första dess naturligt lång ^13C longitudinella relaxationstiden (T _1> 50 sekunder vid höga magnetfält och temperaturer över 293 K) som medger övervakning reaktioner under flera minuter, och å andra sidan, dess centrala roll i cancer metabolism. ^13,14 Använda upplösning DNP NMR och en anpassad utvecklat insprutningssystem, oxidation av pyruvat katalyseras av laktatdehydrogenas (LDH) kan övervakas i närvaro av en initial pool av omärkt laktat ^9,22 eller utan omärkt laktat tillsattes , som visas här. Det har visat sig att [1- ¹³ C] laktat signal mätt i VIvo (inklusive celler) efter injektion av hyper [1- ¹³ C] pyruvat beror främst på en snabb etikett utbyte mellan pyruvat och laktat i stället för laktat produktion. ⁶

Vi presenterar häri realtidsproduktion av [1- ¹³ C] laktat från hyperpolariserad [1- ¹³ C] pyruvat injiceras i en NMR-rör innehållande LDH men inledningsvis inget laktat.

Systembeskrivning
Det finns två huvuddelar i en upplösnings DNP setup (Figur 1): DNP polarisator och NMR-spektrometer. Det viktigaste inslaget i DNP polarisator är en kryostat att kyla provet till ca 1 K i en pump helium bad. Kryostaten sätts in i en 3,35 T supraledande magnet och har en geometri som garanterar att ha polariserande provet vid isocentret av magneten (Figur 1). Inne i kryostaten provet (a) är omgiven av en NMR-spole (b), för att mäta polarisationen Buildup, innesluten i en overmoded mikrovågsutrymmet (c). Hela provet hålls vid låg temperatur i ett pumpheliumbadet (d) och bestrålades med mikrovågor genom vågledaren. Hela systemet hanteras av skräddarsydd mjukvara (Figur 2D).

Hårdvaran och frysutrustning som behövs för att utföra DNP och efterföljande upplösning är fortfarande en teknisk utmaning. En ny DNP kryostat ^23,24 utvecklades och testades för att bestämma dess kryogeniska föreställningar och optimerad för snabb nedkylning, helium hold-tid och övergripande minimal heliumkonsumtion under drift.

Kryostaten består av två delar. Den första delen av kryostaten är isoleringen dewar (figur 2A) som kan grovt separeras i övre delen (a) den svans, eller provutrymme (b), och den yttre vakuumkammaren (OVC) hölls under högt vakuum och som inrymmer den strålningsskärmar (c). Den andra delen av kryostaten är den viktigaste isert (figur 2B), placeras i isolerings Dewar, där alla flödes regler de hanteras. Det flytande helium som kommer från den externa lagrings dewar genom överföringsledningen (a), är i det första steget kondenseras i avskiljaren (b), en mellanliggande kammare används både för att hålla den övre delen av kryostaten kyla och för att avlägsna helium indunstades under överföringen. Separatorn trycket sänks genom pumpning genom en kapillär (c) lindad runt den övre delen av kryostaten; flödet av kallt helium i denna kapillär används för att kyla ner, att skärmarna (d) och de strålningsskärmar i isoleringen dewar (OVC). Provet placeras och polariserad i provutrymmet. Provutrymmet är ansluten till separatorn via en annan kapillär (e), lindade runt svansen av huvud kryostat insatsen. Denna kapillär kan öppnas eller stängas genom en nålventil manuellt manövreras från utsidan.

För att uppnå den låga temperaturen som används under DNP process måste flytande helium som skall samlas i kryostat utfallsrummet och dess tryck sänks till mbar intervallet. De operationer som behövs för kryostat operation utförs genom ett ganska komplext pumpsystem med tre uppsättningar av pumpar, övervakas och drivs i olika punkter med elektroniska och elektromekanisk instrument (Figur 2C). Kryostaten OVC behöver pumpas till högt vakuum genom den första pumpsystemet. Detta system består av en turbomolekylär pump backas upp av en rotationspump (a). Den flytande helium överförs från lagrings dewar (b) till den kryostat överföringsledningsinlopp till kryostaten separatorn. Separatorn har ett utlopp anslutet till den andra pumpuppsättningen. Denna uppsättning består av en 35 m ³ / timme membranpumpen (c). Denna linje gör att ta bort heliumgas kokas under överföringen från Dewar och under separator kylning. Den flytande helium samlas i separatorn kan sedan överföras till provutrymmet genom locketIllary rör som beskrivits ovan. För att överföra flytande helium från separatorn till provutrymmet och därefter lägre utfallsrummet tryck för att mbar intervall, en tredje pumpsystem består av en 250 m ³ / tim Roots pump backas upp av en / h roterande pump (d) 65 m ³ är ansluten till kryostaten genom en manuell spjällventil (e).

Alla vakuumsystemet verksamhet styrs och regleras av en elektrospecialanpassad produkt (f). Denna anordning styr vakuumledningsanslutningar mellan kryostat separatorn (g) och provutrymmet (h) uttag, de andra / tredje pumpsystem (c, d), ett komprimerat helium flaska (i) och utsidan. Kommunikation mellan (f) och utsidan passerar genom en en-vägsventil (j). Den elektro pneumatisk anordning (f) samt alla systemparametrar och upplösningen hårdvara styrs och drivs av en skräddarsydd elektronisk anordning gränssnitt USB med en gemensam dator. Slutligen alla systemet genom det elektroniskaenhet, hanteras av skräddarsydda fristående programvara (Figur 2D) i förekommande fall verksamheten lanseras via ett gränssnitt med hjälp av mjukvaruknapparna.

För att hantera och mäta provets NMR-signal uppbyggnad i fast tillstånd en serie skär används (figur 3A). För att förbereda kryostat för polarisering, placera huvudprovinsatsen (a), i kryostaten. Huvudprovet insatsen är försedd med en NMR-spole (b) placeras inuti en overmoded guldpläterade mikrovågshålrummet. Pre-frysa underlaget lösningen att polariserad (polariserande lösning) vid temperaturen för flytande kväve i en lämplig provbehållare och placera den i slutet botten av glasfiberprovhållaren (c). Skjut in provhållaren i huvudprovinsats för att nå magnet isocentrum. Sätt in guldpläterade vågledare (d) i provhållaren. Vågledaren tillåter mikrovågsugn genereras från en extern mikrovågskälla att resa med minimala förluster to provet.

Skräddarsydd mjukvara för kryostat hantering hanterar automatiskt när du klickar gränssnittet knapp som motsvarar olika operationer som cooldown (kryostat temperatur sänks nära till flytande helium temperatur), fyllning (kryostaten är fylld med flytande helium till en förutbestämd nivå ), ett ytterligare steg för kylning till T ≈ 1 K (den flytande helium badet pumpas att uppnå lägsta möjliga temperatur), trycksättning (kryostaten trycksätts något över rumstryck vid P = 10-30 mbar för att tillåta kryostat öppning utan risker för kontaminering av kryostaten med flyg) och upplösning (automatiskt förfarande för att lösa upp DNP provet och överföra den resulterande hyperpolariserade lösningen till mätstället, dvs NMR-spektrometern).

Polariseringen utförs bestråla provet med mikrovågor vid 94 GHz (i ett polariserande fält B ₀ T _DNP, där T _DNP är polariseringen uppbyggd tiden. T _DNP är av samma storleksordning som den longitudinella relaxationstiden för målet kärnorna i fast form vid ett visst område och temperatur. I alla våra experiment provet polarise för mer än fem T _DNP.

Vid slutet av polariserings tiden har det prov som skall upplösas i en RT-lösning för att användas för mätning av enzymatisk aktivitet. Under upplösningsprocessen, är 5 ml av överhettad _D2O från pannan av upplösnings insatsen (figur 3B) trycks av komprimerad helium gas (P = 6-8 bar) för att nå DNP-förstärkt prov och lösa upp den. Den resulterande hyper lösning trycks ut upplösnings insatsen genom den komprimerade heliumgas, genom att upplösa insatsen utlopp (Figur 3C-b 23 Den tid som behövs för provöverföringen från DNP polarisatorn till NMR-spektrometer webbplatsen handlar om tre sekunder.

Upplösningsprocessen utförs med användning av ett upplösnings insert (figur 3B). Upplösningsinsatsen är sammansatt av en elektronisk-pneumatisk aggregatet (a), en kolfiber pinne (b) som innehåller anslutningsrören mellan pannan i den pneumatiska montering och provbehållaren locker (c), som möjliggör läcktät koppling med provet behållaren, och tillbaka ut till utloppet. Den elektropneumatiska aggregatet (figur 3C) används för att producera och driva överhettad _D2O genom kolfiber stick till provbehållaren och sedan för att extrahera den hyperpolariserade lösningen från kryostaten. Det elektropneumatiska aggregatet är sammansatt av pneumatiska ventiler (a) som styr anslutningarna mellan compressed helium (P = 6-8 bar) linjen (b), pannan (c) om den _D2O injiceras genom ventilen (d), och utloppet (e) genom kolfiber pinne (f). Systemet avslutas med en tryck G, en termometer och en värmemotståndskraftiga tråden i kokaren (c), en avtryckare (h) och en kopplingsdosa (i) används för att koppla systemet med den elektroniska förvaltningsanordningen.

DNP kryostat och NMR-spektrometern är förbundna genom en överföringsledning, dvs en PTFE-rör av 2 mm innerdiameter inuti vilken den hyperpolariserade lösningen ämnet förs med trycksatt helium (P = 6-8 bar) när upplösningen utlöses.

Upplösningssekvens består av följande åtgärder: i de första 300 ms, överhettad _D2O skjuts till provbehållaren för att smälta och lösa den hyperpolariserade frysta lösningen. Efteråt är den hyperpolariserade lösningen extraheras från kryostaten genom medelvärdet av pressatt (P = 6-8 bar) heliumgas och trycks genom 2 mm innerdiameter PTFE-rör (Figur 3C-e) till mätplatsen där injektionen sker med något av de förfaranden som beskrivs i steg 6.2.1 eller steg 6,2 0,2.

Den andra komponenten i den upplösnings DNP NMR setup är den NMR-spektrometer. I installationen som beskrivs häri, fungerar NMR-spektrometer vid en fält B ₀ = 11,7 Tesla. En 5 mm NMR-sond används för att mäta den hyperpolariserade signalen efter upplösningen. NMR-spektrometer drivs genom NMR-konsolen, som används för både solid-state och vätske state NMR-mätningar, och företaget-medföljande programvaran XWinNMR. En typisk mätning består av en låg flip-vinkel hård puls (antingen kalibrerad för liquidstate eller okalibrerade, för solid-state mätningar) följt av signal förvärv.

Mätningar av solid state termiska polariseringssignalen och DNP-derived signal uppbyggnad utförs med hjälp av specialtillverkade ¹³ C spole vid stället för DNP polarisatorn (Figur 3AB) kopplad till NMR-spektrometern. I denna speciella situation NMR-spektrometer inte utföra signallåsning. När halvledar mätningar utförs, för att undvika betydande störningar till polarisering, bör tidsfördröjningen mellan förvärv vara tillräckligt lång, ungefär längre än 0,5 T _DNP.

Solid-state förbättring definieras som var är den hyperpolariserade signalen (erhållen i Steg 3.3) och är den fasta tillståndssignalen (erhållen vid termisk jämvikt vid pumpas flytande helium temperatur i steg 3,2) (Figur 4A). Denna parameter danten definierar den maximala polarisationen för NMR experiment, före oundvikliga förluster under överföring av hyper lösning. Mätningen utförs med en enkel puls-förvärva sekvens med användning av en okalibrerade låg flip-vinkel puls. Puls kalibrering vanligen hoppas för halvledarbaserad mätningar.

Ett analogt förfarande kan användas för att bestämma den hyperpolariserade signalförstärkningen i det flytande-tillståndet. I detta fall, placeras provet i spektrometern röret före injektionen (steg 6,2) bestående av 500 fil av D ₂ O. Efter upplösning och injektion, det finns två viktiga parametrar för att övervaka. Den första är den hyperpolariserade förbättring vid NMR-spektrometern stället, (Figur 4B), där är signalen precis efter injektionen av den hyper polariserad lösning (erhållen i Steg 7,1) och är den termiska polariseringssignalen (erhållen i Steg 7,2). Den andra är den longitudinella relaxationstiden, T ₁ (Figur 4B, inlägg), associerat med substratet och varje metabolisk produkt (erhållen genom exponentiell passande signaler som erhålls i steg 7,1). Dessa två parametrar definierar den minimala substratkoncentration som krävs för att erhålla en tillräcklig signal-brusförhållande (SNR) och den tillgängliga tidsfönstret för mätning av de metaboliska transformationer. Förhållandet mellan solid-state polarisering och liquidstate polarisation ger en uppskattning av de polariseringsförluster på grund av relaxation under den hyperpolariserade överföringslösning. Ett värdeation12 "src =" / filer / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> bör observeras i frånvaro av avkoppling förluster.

Protocol

OBS: Alla dataanalys utfördes med hjälp av kommersiell programvara.

1. Förbered polariserande lösning

1. Förbereda 2 ml av en 1,12 M ¹³ C-märkt natriumpyruvat (Na ⁺ [CH ₃ -CO- ^{13 COO]} -, substrat) lösning dopad med 33 mM TEMPOL radikal (4-hydroxi-2,2,6,6- tetrametylpiperidin-1-oxyl, polariserande medel) ⁴ i 2: 1 d ₂ O / d ₆ -etanol för ^{13 C-observationer.} VARNING: Hantering försiktighetsåtgärder måste vidtas på grund av brandfarliga karaktär d ₆ etanol.
2. Verifiera att radikalkoncentrationen är optimala i fråga om uppnås polarisering.
   1. Ändras något radikalen koncentrationen av lösningen vid punkt 1,1 (t ex, till 30 mM eller 35 mM).
   2. Bestäm iterativt halvledar förbättring (se steg 3) och hitta den radikala koncentration som leder till maximal förstärkning.

2. PolarizatJon

1. Sänk DNP kryostat temperatur genom cooldown förfarande. Klicka på "Cooldown" -knappen på kryostat programvarugränssnittet (figur 2D).
2. Samla flytande helium i DNP kryostaten genom påfyllningsförfarandet. Klicka på "Påfyllning" -knappen på kryostat programvarugränssnittet (figur 2D).
3. Placera 300 pl av optimerad polariserande lösningen från steg 1,1 i provbehållaren försedd med DNP polarisatorn. Frysa provbehållaren med provet inuti genom att försiktigt sänka ned den i ett bad med flytande kväve.
4. Eliminera det flytande kväve som kan vara närvarande i provbehållaren efter frysning procedur (steg 2,3) genom att extrahera provbehållaren från bad med flytande kväve och rotera den upp och ner.
   OBS: Detta steg är avgörande för att få en grundlig upplösning av provet (se steg 5).
5. Sätt provet i kryostaten.
   OBS: Denna Step, som består av följande delsteg, måste utföras snabbt (dvs. på mindre än 10-20 sekunder) för att förhindra att provet smälter.
   1. Sätt i provbehållaren i provhållaren. Sätt provhållaren i huvud kryostaten insatsen. För in mikrovågor vågledaren i provhållaren.
6. Sänk kryostat temperatur genom att starta en K kylning förfarande. Klicka på "1K Cooling" -knappen på kryostat programvarugränssnittet (figur 2D).
7. Vrid mikrovågskällan på och bestråla provet. Klicka på MW-ON "-knappen på kryostat programvarugränssnittet (figur 2D).

3. Halvledar NMR-mätningar

1. Koppla koaxialkabeln av NMR-konsolen detekteringskanalen från spektrometern polen genom att vrida kontakten moturs med 90 ° och dra. Anslut koaxialkabeln av detekteringskanal till koaxialkontakten på kryostatenNMR-spolen. Sätt den manliga kontakten på NMR konsolkabeln i honkontakten kryostatens NMR-spole, uppmärksamma orienteringsstiftet; Tryck fast och rotera kontakten medurs 90 °.
2. Mäta NMR termisk signal i fast tillstånd vid kryostat webbplats med hjälp av en enkel puls-förvärva sekvens med okalibrerade låga flip-vinkel-pulser upprepas vid ett intervall på T = 5 min. Efter att ha ställt upp mätningen skriva på kommandoraden av programvaran "zg" och tryck på "Enter" tangent. Se NMR-spektrometer bruksanvisning för ytterligare information om spektrometer drift och mätning setup.
3. Mät DNP-förstärkt NMR-signalen. Upprepa momenten i steg 3,2 efter påbörjad DNP process som beskrivs i avsnitt 2.
4. Koppla NMR konsolen detekteringskanalen koaxialkabel från kryostaten NMR-spolen genom att vrida kontakten moturs med 90 ° och dra. Anslut koaxialkabeln av DETEInsatser kanal till koaxialkopplingsdonet spektrometerns spolen. Sätt den manliga kontakten på NMR konsolkabeln i honkontakten spektrometerns spole, uppmärksamma orienteringsstiftet; Tryck fast och rotera kontakten medurs 90 °.

4. Optimera homogenitet huvud magnetfältet (kompensations)

1. Placera i spektrometern ett rör innehållande 500 ul av blandningen som produceras i tidigare experiment (dvs efter steg 6,2).
2. Utför NMR-spektrometer mellanlägg genom att variera strömmen i mellanlägg gradientspolarna söker efter den maximala "låsa" signal deuterium. Välj relevant mellanlägg polen genom att trycka på motsvarande knapp på NMR-konsolen.
   1. Vrid ratten på NMR-konsolen för att bestämma rotationsriktningen som ökar låssignal. Fortsätta att rotera tills signalen når ett maximum. Välj ett annat mellanlägg pole och upprepa maxime until ett lokalt maximum för alla kompensationsspolar påträffas. Se NMR-spektrometer bruksanvisning för ytterligare information. Vid slutet, ta bort provet används för låsning.

5. Upplösning

1. Sätt 5 ml _D2O i upplösningsinsatsen pannan. Trycksätta och värma _D2O med hjälp av den resistiva tråden tills T ≈ 180-200 ° C uppnås. Klicka på "Förbered Heater" -knappen på kryostat programvarugränssnittet (figur 2D).
2. Efter fullbordande av provet polariseringsförfarande (t.ex., efter 3 T _DNP), trycksätta kryostaten något över rumstryck. Klicka på "SS Rörelsens knappen på kryostat programvarugränssnittet (figur 2D). Avlägsna mikrovågsugn guide från upplösnings insatsen.
3. Skjut upplösningsinsatsen (figur 3B) ned i provhållaren (Figur 3A-c). Upplösningsinsatsen har för att nå botten av provhållaren och måste tryckas fast ordentligt för att göra en tät förbindelse med provbehållaren för att undvika _D2O läckage i kryostaten.
4. Tryck på hårdvaran avtryckaren (fig 3C-H) för att börja upplösningssekvens, en förutbestämd tidsinställd sekvens av pneumatiska ventiler operationer.

6. Injektion

1. Innan upplösning plats en 5 mm NMR-rör innehållande 500 ul prov (t.ex. D ₂ O för mätning i steg 7 eller LDH lösningen från steg 8 för enzymatiska aktivitetsmätningar i steg 9), i isocentret av 11,74 T NMR-spektrometer (se steg 4).
2. Strax efter upplösningen (steg 5), blanda 500 | il av hyperpolariserad lösning med provet placeras i NMR-spektrometer i steg 6,1.
   1. Manuell Injektion: samla hyperlösning vid slutet av en 2,5 m lång överföringsröret i en glasbägare placerad nära NMR-spektrometern magneten. injicera manuellt 500 pl hyper lösning i NMR-provröret genom en skräddarsydd kapillärsystem.
   2. Automatisk injektions: före upplösningsprocessen, anslut överföringsröret till en automatiserad skräddarsydd injektionsanordning som separerar den hyperpolariserade lösningen från heliumgas som används för överföring. Anordningen levererar automatiskt 500 pl hyperpolariserad lösning i provröret.

7. Vätske state NMR Mätning

1. Efter upplösningen, mäta NMR hyperpolariserade signalen från provet i spektrometern genom en serie av 10 ° flip-vinkel puls förvärvar sekvenser åtskilda av 1,5 sek för att följa framskridandet av magnetiseringen av substratet (A) och produkten (B). Efter att ha ställt upp mätningen skriva på kommandoraden av programvaran "zg" och tryck på & #39, Enter "tangent. Se NMR-spektrometer bruksanvisning för ytterligare information om spektrometer drift och mätning setup.
2. När magnetiseringen är helt avslappnad (dvs. efter T = 10 T _1), mäta NMR termisk signal genom en serie av 90 ° flip-vinkel puls förvärva sekvenser åtskilda av T = 3 T ₁ ≈ 3 min. Efter att ha ställt upp mätningen skriva på kommandoraden av programvaran "zg" och tryck på "Enter" tangent. Se NMR-spektrometer bruksanvisning för ytterligare information om spektrometer drift och mätning setup.

8. Framställning av enzymhaltiga Prover (specifika för Pyruvat till laktat Transformation)

1. Bered reaktionsbuffert med följande recept: 50 mM reducerad nikotinamidadenindinukleotid (NADH), 1 mM etylen-diamintetraättiksyra (EDTA), 0,1 mM ditiotreitol (DTT) i 0,1 M fosfatbuffert, pH =7,0.
2. Förbered en kaninmuskel LDH lösning 1 U / ml beredas i reaktionsbuffert med 20 mikrogram / ml bovinserumalbumin, BSA.
3. Blanda 478 pl reaktionsbuffert (steg 8,1), till 20 pl _D2O möjliggöra spektrometer fält stabilisering ( "låsning") och 2 pl LDH-lösning (steg 7,2).
4. Placera 500 pl lösning volym som framställts i steg 8,3 i en 5 mm NMR-rör och placera röret i 500 MHz NMR-spektrometer.

9. Komplett enzymatisk reaktion pulsmätning ordningen

1. Förbered polariserande provet (steg 1) och polarisera det (steg 2).
2. Utför mellanlägg på spektrometern (Steg 4) och förbereda prov enzymatiska (steg 8).
3. Utföra upplösningen (steg 5) och insprutnings (steg 6).
4. Mäta en serie av signaler från den hyperpolariserade provet med 10 ° flip-vinkel pulser förvärv åtskilda med 1,5 sek (steg 7). Detta steg gör det möjligt att mäta hypersignalsönderfallet och signalen ackumulering av metaboliter.

10. Montering

1. För varje spektrum förvärvats i steg 9,4, identifiera de toppar som motsvarar till substrat (A) och produkten (B) respektive och integrera dem (bestämma området för topparna). Topparna integraler ger kurssignaler magnetiseringen tid (M _{(A, B)} (t), se ekvation 2).
2. Användning av lösningen av ekvation (2), bestämma värdet på F = (R _A + k _eff ) Från en enkel exponentiell anpassning av substratsignalen integreras i steg 10.1.
3. Med hjälp av värdet F = (R _A + k _eff ) Bestämd i steg 10,2, bestämma k _eff och R _B från ett anfall av produktsignalen M _B (t) med funktionen erhålles genom integrering av ekvation (2). Se representativa resultat avsnittet (Enzymatic aktivitet och metaboliska mätningar) för mer information om reaktions modellering, montering och rf korrigering.

Representative Results

NMR-signal vinster med hjälp av upplösnings DNP
DNP effekten består i överföringen av den höga polarisering av oparade elektron snurrar, typiskt från stabila radikala molekyler, till NMR-aktiva kärnor, under mikrovågsbestrålning av provet. De mest använda fria radikaler är TAM (OXO63) och TEMPOL. ⁴ Polarisering förfaranden med användning av TEMPOL kan optimeras genom "cross-polarisering. ²⁵

Optimera koncentrationen av den stabila radikalen i syfte att erhålla den maximala kärnpolariseringen i det fasta tillståndet är avgörande för framgången hos tekniken. Den optimala TEMPOL Koncentrationen befanns vara 33 mm i de experimentella villkoren i denna studie. Denna polarisering av det valda substratet är tillräcklig för att följa dess enzymatiska omvandling i realtid.

Magnetfältet hos den Polarizer installerad vid Paris Descartes är B ₀ = 3,35 T och komponenterna i detta system har beskrivits ovan (figurerna 1 - 3). Kryostat konstruktion garanterar att den slutliga provposition sammanfaller med magnet isocentrum. Magnetfältet hos polarisatorn var ramped och shimsas användning av endast de supraledande mellanläggs spolar, med kryostaten på plats. Den slutliga protonlinjebredd av en 1 x 0,5 x 0,5 cm vattenprovet var 23 kHz. vi bedömde och för [1 ¹³ C] pyruvat. För att göra detta, är det nödvändigt att först bestämma ¹³ C DNP-förstärkt signal i fast tillstånd vid polarisatorn plats innan upplösningen (Figur 4A). Efter upplösning, mätte vi [1-13 C] pyruvat hyperpolariserad signal och dess sönderfall vid spektrometer stället. Flytande tillstånd signalen mättes på en provupplösnings användning av 500 | il av _D2O som provet i NMR-spektrometer. Detta tillät oss att bestämma solid-state DNP-förstärkningen (Figur 4B, infälld), vätsketillstånd NMR polariseringsnivån (Figur 4B) och polariseringsförluster under överföringen. Förhållandet mellan signalerna mätt i steg 3,3 och steg 3,2 definierar solid-state förbättring, . Förhållandet mellan den första signalen som uppmätts i steg 7,1 och signalen från steg 7,2 definierar vätskeformiga hyperpolariserad förbättring, .

Data från steg 3, summarized i figur 4A och figur 4A (infälld), visar att den teknik medger att polarisera ¹³ C i [1- ¹³ C] pyruvat upp till = 22 ± 5, motsvarande en ¹³ C polarisation = 1,5 ± 0,3%.

Denna polarisering nivå är mer än tusen gånger kolet värme polarisering i vanliga MRS tillstånd (t ex 11,74 T och 300 K). Data från steg 7, som sammanfattas i figur 4B och figur 4B (infälld), medger bestämning av vätskeformiga ¹³ C hyperpolarisering av [1- ¹³ C] pyruvat, = 1 ± 0,2%. Förbättringen som erhölls i fast tillstånd för pyruvat vartillräckligt för ändamålet med experimentet, fastän högre förbättringar har visats med användning av olika radikaler. ⁵ Tidskursdata passa från steg 7,1 ger ett mått på relaxationstidskonstanten. Pyruvatet longitudinella relaxationstiden i den blandning som består av 500 | j, l DNP förbättrad lösning och 500 | il _D2O, var T ₁ = 75 ± 5 s efter rf korrigering (se ekvation (3)).

Enzymatisk aktivitet och metaboliska mätningar
Upplösning DNP NMR detektion av ¹³ C-märkt substrat (A) kan användas för att följa i realtid enzymatisk omvandling dynamik och observera bildandet av produkt (B):

Omedelbart efter injektion av hyperpolariserad substrat (A),signalen av produkt (B) är null. Då, den enzymatiska omvandlingen (1) börjar producera (B). Magnetiseringen ^av de 13 C-kärnorna påverkas inte av de olika kemiska skiften och den kemisk förändring av molekylerna. Icke desto mindre kan den nya miljön leda till olika longitudinella relaxationshastigheter för ¹³ C i B. produktsignal tidsförloppet Den kan kvalitativt separeras i tre steg: i början, den enzymatiska omvandlingen omvandla A in B ger en ökning av B-signalen; efter en viss tid, beroende av de experimentella betingelserna, magnetiseringen förluster på grund av relaxation, balansera denna ökning och signalen av B når ett maximum; Slutligen vid längre tider, signalen B avtar på grund av längsgående avkoppling. I hypotesen av enzymmättnad, försumma tillbaka konvertering och med hänsyn till magnetisk avkoppling kan magnetiseringen av de två molekylslag (A och B) under den enzymatiska omvandlingen beskrivas med ett paPLED differentialekvationssystem: ²²

där M _{(A, B)} (t) är magnetiseringar av molekylslag A och B, respektive, är k _eff den effektiva omvandlingshastighetskonstanten för signalöverföring genom den enzymatiska reaktionen _och R _{(A, B)} är de skenbara longitudinella relaxahastighetskonstanter observerade kärnor i molekyl arterna A och B, respektive R _{(A, B)} står för både den rena longitudinella magnetiseringen avkoppling och effekten av rf pulserande.:

där T _{1, (A, B)} är den longitudinella relaxatidskonstant av kärnan i den lokala molekylära omgivningen av molekylslag A och B, respektive. θ och τ är rf-flip-vinkel och fördröjningen mellan två signalförvärv, respektive.

I denna studie var substrat A och produkt B [1- ¹³ C] pyruvat och [1- ¹³ C] laktat, respektive, och syftet var att mäta [1- ¹³ C] laktat produktion av LDH under förhållanden där ingen (isotop omärkt) laktat var närvarande i lösningen i början av experimentet. Mätningen består i en serie av ¹³ C-spektra registrerades med en enkel pulseacquire sekvens vid T = 21 ° C. En kalibrerad 10 ° flip-vinkel pulsen användes för de sekventiella excitationer (steg 9). Fördröjningen mellan två på varandra följande pulser var τ = 1,5 sek. NMR-insamlingssekvensen startades några tiotal sekunder innan den hyperpolariserade solutjoninjicering. Pyruvat substratkoncentrationen i provröret efter injektionen var 25-35 mM. I steg 10 laktat till pyruvat omvandlingen fart på en LDH koncentration av 10 ^-3 U / ml mättes. Den inspelade signalen från laktat och pyruvat passar väl modellen i ekvation (2) (streckad linje i figur 5) och ger k _eff = 0,9 ± 0,1 x 10 ^-3 sek ^-1 (Figur 5). Detta värde överensstämmer med den initiala reaktionshastigheten bestäms av förhållandet [Lac] / [Pyr] vid tiden 0 sek (fig 5, infällning).

Figur 1. Schema för den experimentella apparaten. Polarisatorn (vänster) består av en mikrovågskavitet (c) belägna inuti en kryostat (d) placeras i en bred borrning 3,35 T supraledande magnet. En skräddarsydd NMR-spole (b) som omger than prov (a) används för övervakning av kärnspinnpolariseringen in situ. Helium badtemperaturen hålles vid 1,12 ± 0,03 K medan provet bestrålas vid mikrovågsfrekvensen ν _mw = 94 GHz. Systemet tillåter för NMR mätningar görs på solid-state-provet under polarisation. Den polariserade Provet löses i överhettat vatten och sköt med komprimerad heliumgas genom överföringsledningen till provröret som tidigare placerats inuti en intilliggande NMR-spektrometer (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Kryostat och vakuumsystem scheman. (A) kryostat isolering dewar; (B) rop ÖSTAT huvudinsatsen; (C) vakuumsystemanslutningar; (D) skärmdump av programvara gränssnitt med knappar används för att utföra specifika operationer som beskrivs i steg 2 och steg 5 i protokollet avsnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Exempel på hantering och upplösning. (A) provhanteringsinsatser; (B) upplösning insats; (C) detalj av elektro pneumatiska anslutningar upplösnings insats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

">
Figur 4. Solid-state polariserings uppbyggnad och hyper signal förfall. Upplösning DNP signaler. (A) solid-state NMR polariseringsuppbyggnaden signal med en 1,12 M natrium [1- ¹³ C] pyruvat lösning under en DNP polarisation (kryss, försedd med en exponentiell funktion S (t) = A x exp (-t / T _{b) +} B av tidskonstanten T _{b =} 270 sek) och avkoppling (cirklar, S (t) = A • exp (t / T _{b) +} B, ^Tgg ₁ = 840 sek); (A, infälld) jämförelse mellan DNPenhanced och termiskt polariserade (skalade upp 10 gånger) magnetisering signaler i fast tillstånd (ε _ss = 22 ± 5, vilket motsvarar en solid-state polarisering P _SS = 1,5 ± 0,3%); (B) jämförelse mellan den första spektrumet registreras efter upplösning och averaged spektrum (skalas upp 100 gånger) som erhållits från termiskt polariserade ¹³ C snurrar vid RT med hjälp av 1024 transienter (ε = 1000 ± 200). Upplösningsprocessen tog 3,3 sek och den automatiska injektions ca 2 sek med en uppskattad signalförlust av 40%. För experiment överföra provet genom manuell injektion, har ytterligare förluster på grund av längre injektionsfördröjning uppskattas till 30%; (B, infälld) hyper signal förfall av pyruvat efter upplösning i frånvaro av LDH (T ₁ = 75 ± 5 sek). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. LDH-aktivitet och cancer cellernas ämnesomsättning resultat. Uppbyggnad av [1- ¹³ C] laktat signal på grund av enzymatic omvandling vid en LDH koncentration av 10 ^-3 U / ml följt av signal sönderfall på grund av longitudinella relaxa av ^13C magnetisering. Den röda linjen visar den passform med den modell som beskrivs i ekvation (2), innefattande effekterna av avslappning och enzymatisk omvandling. (Infälld) förhållandet mellan [1- ¹³ C] laktat och [1 ^-13 C] pyruvat koncentration med en extrapolering av reaktionshastigheten vid tiden t = 0 (röd linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De kritiska punkterna i upplösning DNP NMR experiment är: (i) graden av polarisering uppnås för underlaget, som bestämmer den lägsta produkt koncentration som är nödvändig för experiment liksom antalet signal förvärv som kan utföras och (ii) livs av magnetisering, jämfört med varaktigheten för överföringen mellan polarisation och platserna för upptäckt och med hastigheten för substrat transformation. Insprutningssystemet av upplösnings DNP inställnings häri beskrivits möjliggör provöverförings i så lite som 3-4 sek. Även om överföringen var inte lika snabb som i den föreslagna av S. Bowen och C. Hilty metoden var ²⁶ polariseringsförluster för pyruvat begränsad på grund av den måttliga längd avkoppling i det låga området. [1- ¹³ C] pyruvat, med sin långa karboxylsyra nukleär T _1, tillåter mätning av flödet genom LDH vid koncentrationer så låga som 10 ^-3 U / ml.

De hög signal-brusförhållande som erhållits med hjälp av upplösning DNP föreslår att man kan vara känsliga för ännu lägre [1- ¹³ C] pyruvat koncentrationer och lägre enzymatiska omvandlingsfrekvens. Den uppnådda polariseringsnivån ger mer än 200 experiment med en signifikant signal-brusförhållande som skall förvärvas i det flytande-state NMR-spektrometer med användning av en låg flip vinkel a = 10 °. Detta lämnar utrymme för optimering både i fråga om upprepningstider och flip vinklar. För uppbyggnaden av polarisering i solid-state vissa molekyler polariserar väl med några polariserande medel (TEMPO, OXO63) ⁴ och andra inte, av skäl som ännu inte helt klarlagda. Experimentella försök är det enda sättet att fastställa huruvida polariseringssteget är framgångsrik. För att förbättra polariseringsnivån, kan man undersöka användningen av olika radikala arter ⁴ och tillämpning av olika tekniker förlitar sig på "cross-polarisering. ²⁵

INNEHÅLL "> Ytterligare optimering av radikala och substratkoncentrationer såväl som lösningsmedelskompositionen i DNP provet kan försökt att förbättra polarisation. Tekniken är begränsad till molekyler i vilka en kärna eller en grupp av kärnor kunna upprätthålla polarisationen efter upplösning kan vara identifieras. Polarisering kan upprätthållas antingen som en obalans mellan mononukleära egentillstånd i höga magnetfält eller i form av LLS delokaliserad på två eller flera kopplade kärnor. för det första alternativet, har sonden kärna att vara långt från andra kärnor med hög gyromagnetisk kvot, såsom protoner. Om en sådan ställning inte finns naturligt, anrikning i NMR aktiva kärnor på isolerade platser i molekylen eller utbyte av protoner i närheten av aktiva kärnor av deuteroner, för att sänka den magnetiska dipolen styrka är nödvändig . för att erhålla LLS, en teoretisk analys av de magnetiska kopplingarna inom grupper av kärnor kan utföras ^27,28 för att finna optimala medel för att SuppOrt polarisering. Denna strategi har visat sig vara framgångsrik i små molekyler, såsom aminosyror ²⁹ och kan tillämpas på andra molekyler som är involverade i metaboliska cykler av intresse. Att bättre bevara magnetiseringen under experimentet, en kombination av upplösnings DNP med excitation av LLS lovar att förlänga mätningstidsspannet för andra enzymreaktioner. ²⁰

DNP-NMR experiment som beskrivs här är anpassad för mätning av pyruvat ämnesomsättning i cancerceller. ⁶ realtid mätning av enzymatisk aktivitet genom upplösning DNP förbättrad NMR kan hjälpa nuvarande ansträngningarna i cancerdiagnos av DNP-förstärkt MRI, som redan används i klinik. ¹² molekyl~~POS=TRUNC specificitet DNP-förstärkt NMR gör det en metod för val för att skilja mellan molekylära mål och produkter av deras transformationer. Framtida förbättringar kommer att fokusera på bedömningen av andra molekylspårämnen för metaboliska transformationer ³⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNP polarizer	Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)	///	Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components	Edwards vacuum (France)	Various	- turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet	Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker (France)
Origin 8.0	OriginLab (US)		Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C	Sigma Aldrich (France)	490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D	Sigma Aldrich (France)	186414
4-Hydroxy-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (France)	176141
Deuterium oxide	Sigma Aldrich (France)	151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)	Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0	Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in	Sigma Aldrich (France)	L-2500
bovine serum albumin, BSA	Sigma Aldrich (France)