Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Деацетилирование Assays распутать Interplay между Sirtuins (SIRT2) и специфического белка-субстратов

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53563

⸱

27 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory for Molecular Cancer Biology, Department of Radiation Oncology, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Radiation Oncology, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает необходимые шаги для выполнения анализов деацетилирования in vitro и in vivo с целью установления роли белков в качестве специфических субстратов деацетилирования для сиртуинов и дальнейшего изучения роли обратимого - ацетилирования лизина в качестве посттрансляционной модификации.

Аннотация

Ацетилирование стало важной посттрансляционной модификацией (ПТМ), регулирующей множество клеточных процессов и функций. Это также подтверждается недавними открытиями протеомики на основе масс-спектрометрии с высоким разрешением, показывающими, что многие новые белки и сайты в этих белках могут быть ацетилированы. Тем не менее, идентичность ферментов, регулирующих эти белки и сайты, часто неизвестна. Среди этих ферментов большой интерес вызывают сиртуины, которые относятся к гистон-лизиндеацетилазам III класса, как ферменты, регулирующие работу ацетилома в различных физиологических или патофизиологических условиях. Здесь мы описываем методы связывания SIRT2, цитоплазматического сиртуина, с его субстратами, включая анализы деацетилирования in vitro и in vivo. Эти анализы могут быть применены в исследованиях, сосредоточенных на других членах семейства сиртуинов, чтобы раскрыть специфическую роль сиртуинов и необходимы для установления регуляторного взаимодействия специфических деацетилаз с их субстратами в качестве первого шага к лучшему пониманию роли ацетилирования белка. Кроме того, такие анализы могут быть использованы для отличия сайтов функционального ацетилирования на белке от того, что может быть нерегуляторными ацетилированными лизинами, а также для изучения взаимодействия между деацетилазой и ее субстратом в физиологическом контексте.

Введение

Посттрансляционные модификации (PTM) регулируют клеточные сигнальные сети, позволяя клеткам быстро реагировать на внутренние и внешние сигналы. За последние несколько десятилетий было выявлено множество различных ПТМ, играющих ключевую роль в различных процессах, но только некоторые из них были тщательно изучены, такие как фосфорилирование, ацетилирование и убиквитинация 1-3. Сосредоточившись на ацетилировании, Оллфри и др. были первыми, кто предложил роль ацетилирования гистонов в регуляции транскрипции генов около 50 лет назад. Исследования в этой области показали, что ацетилирование гистона лизина модулирует конденсацию хроматина и считается эпигенетической меткой в составе гистонового кода 5. Несмотря на то, что потребовалось много времени до открытия тубулина в качестве первой мишени для ацетилирования негистонов6, в настоящее время хорошо известно, что сотни эукариотических белков за пределами гистонов могут быть ацетилированы, а ацетилирование лизина было признано широко распространенным ПТМ, которое может соперничать по своей распространенности с фосфорилированием и убиквитинированием 7-9. Интересно, что негистонированные ацетилированные белки могут быть сигнальными молекулами в цитоплазме, факторами транскрипции в ядре и метаболическими ферментами в митохондриях, что подчеркивает важность ацетилирования в регулировании множества клеточных процессов.

Статус ацетилирования белка зависит от скоординированной и противоположной функции лизинацетилтрансфераз (KATs) и лизиндеацетилаз (KDAC), которые добавляют и удаляют ацетильные группы из белков. Обратимое ацетилирование лизина, которое включает нейтрализацию положительного заряда 10, изменяет структуру белка и, весьма вероятно, также изменяет ферментативную функцию в некоторых случаях 11-13. Сосредоточившись на KDAC, в геномах человека и мыши было идентифицировано 18 белков 14-16. Среди них сиртуины млекопитающих (также называемые гистон-лизиндеацетилазами III класса), которые отличаются от других представителей тем, что для их ферментативной функции требуется NAD+, вызвали большой интерес в этой области исследований 16. У млекопитающих было идентифицировано семь сиртуинов (SIRT1-7), каждый из которых имеет общий консервативный каталитический домен из 275 аминокислот, которые в основном классифицируются в соответствии с их субклеточной локализацией в ядре (SIRT1, 6 и 7), митохондриях (SIRT3, 4 и 5) или цитоплазме (SIRT2). SIRT1-3 обладают высокой активностью деацетилирования, в то время как SIRT4, как сообщается, проявляет активность АДФ-рибозилтрансферазы, SIRT5 может функционировать как белки десукцинилазы и демалонилазы, а SIRT6 и SIRT7 проявляют слабую активность деацетилазы, но участвуют в других типах ацилирования. В соответствии со значением ацетилирования как регуляторной модификации ПТМ, участвующей в нескольких клеточных функциях, сиртуины также участвуют в широком спектре процессов. После первых прорывных исследований, устанавливающих роль сиртуинов в увеличении продолжительности жизни, было показано, что они участвуют в различных клеточных функциях, включая репарацию ДНК, поддержание нестабильности генома, апоптоз, реакцию на стресс и воспаление, контроль энергетической эффективности, циркадных часов и метаболизма, а также способствуют инициации и/или прогрессированию возрастных заболеваний, таких как рак. нейродегенерация и сахарный диабет 2 типа 15,16.

Несмотря на значительный прогресс в области биологии сиртуинов, предстоит еще много работы, чтобы разгадать неоткрытые роли и функции через идентификацию новых субстратов. Об этом более убедительно свидетельствуют последние достижения в области протеомики с высоким разрешением, основанной на масс-спектрометрии (МС), которая значительно увеличила количество белков, обнаруженных в ацетилировании, но, что наиболее важно, идентифицировала несколько различных ацетилированных лизинов в каждом белке, утверждая, что ацетилирование может быть столь же широко распространено, как и другие ПТМ, такие как фосфорилирование 7,8,17. Учитывая, что специфические деацетилазы еще не идентифицированы для большинства этих ацетилированных белков-субстратов, разумно предположить, что для подтверждения и установления ацетилированного белка в качестве легитимного субстрата специфической деацетилазы необходимы анализы деацетилирования как in vitro, так и in vivo. В экспериментальных протоколах, описанных ниже, будет подробно рассказано о том, как проводить анализы деацетилирования in vitro и in vivo с использованием SIRT2 в качестве специфической деацетилазы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. In Vitro дезацетилирования Пробирной

  1. Очистка SIRT2
    1. Приготовьте 10 см культуры блюдо из НЕК 293Т клеток , культивированных в 8 мл DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотиков и выращивали в 37 ° C, 5% СО 2 культуральную инкубаторе тканевых составляет около 70% сплошности на следующий день.
    2. На следующий день, со-трансфекции 4 мкг PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector сделано в нашей лаборатории), 4 мкг pCMV- dR8.2 dvpr (упаковка вектор) и 0,5 мкг PCMV-VSV-G (конверт вектор) 18 с использованием полиэтиленимина (ПЭИ) в соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
    3. Изменение средств массовой информации после 12 часов.
    4. Соберите супернатант после 36-48 ч.
    5. Удалите мусор центрифугированием при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    6. После фильтрации через 0,22 мкм фильтры, составляют 1 мл аликвоты SIRT2 лентивирусов и держать при температуре -80 ° С.
    7. Оттепели SIRT2 лентивирусов на льду (важно хранить вирус при -80 ° С, когда вирус не используется).
    8. Инфицировать 6-луночный планшет 80-90% сплошности НЕК 293Т с 1 мл лентивирусов в присутствии 8 мкг / мл полибрена.
    9. Поместите инфицированные вирусом клетки в 37 ° C инкубаторе до следующего дня (24 ч).
    10. Заменить среду после 24 часов.
    11. 48 ч после заражения, проверьте эффективность инфекции путем обнаружения GFP-положительных клеток под флуоресцентным микроскопом.
    12. Если эффективность инфекции хорошо ( по крайней мере , на 40-50% инфицированных клеток), заменить среду с культуральной средой , содержащей 2 мкг / мл пуромицин , чтобы выбрать для стабильного SIRT2 над экспрессирующих клеток.
      Примечание: Это занимает около 2-х недель, а среда меняется каждые 3-4 дня. Неинфицированных клетки умирают за этот период селекции и только инфицированных клеток с SIRT2 лентивирусов растут.
    13. Анализ экспрессии Flag-меченый SIRT2 с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Flag (1: 1000 разведение) после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE перед запуском Purification процесс (рекомендуется) 19,20.
    14. Для очистки активного SIRT2, расщепленных клеток в соотношении 1: 3 по трипсином, чтобы иметь достаточное количество блюд клеток НЕК 293Т стабильно с гиперэкспрессией Flag-SIRT2 (Десять 10 см блюд позволит очистку достаточное количество белка для последующих экспериментов).
      1. Для Trypsinize клеток, удаления культуральной среды и ликвидации остатков сыворотки путем промывки клеток стерильной ДЗФР. Медленно добавляют 2,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клеточный монослой, инкубировать при комнатной температуре в течение 30-45 сек. После удаления раствора трипсина-ЭДТА, инкубировали при 37 ° С до тех пор, пока клетки не начнут отделяться. Затем добавляют питательную среду и переносят клетки на новые блюда.
    15. Удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки обработкой трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
    16. Осадок Lyse клеток в 500 мкл лизис буфера А (20 мМ HEPES рН 7,9, 18 мМ KCl, 0,2 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl 2, 20% глицерине, 0,1% NP-40), в том числе коктейль ингибиторов протеазы и 1 мкМ TSA в течение 30 мин при 4 ° С при постоянном вращении.
    17. Центрифуга при 14000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
    18. Выполните иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag, конъюгированного с агарозном бисером, как описано ниже.
      1. Добавить 200-300 мкл анти-Flag антитела, конъюгированного с агарозными гранулами с белком лизатов (10-20 мг белка).
      2. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
      3. Собрать иммуноосажденными центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
      4. Вымойте гранул 5 раз с помощью 10 мл лизирующего буфера А при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. После каждой промывки, гранулы бусинки и заменить супернатант буфером А.
    19. Приготовьте 1х раствор пептида Flag (в том числе коктейль ингибиторов протеазы и 1 мкМ TSA в PBS).
    20. Добавить 500 мкл 1x флага пептиде решение агарозном бусин и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
    21. Собирают супернатант центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    22. Повторите предыдущие два шага.
    23. Удалить бусы из надосадочной жидкости при помощи фильтровальной трубки и центрифугирования при 15000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
    24. Концентрат элюированный образец до конечной концентрации белка равно 1 мкг / мкл с использованием ультрафильтрационной мембраны.
    25. Проверка процесса очистки с помощью электрофореза с использованием 1 мкг элюированного образца.
    26. Пятно гель с коммерчески доступным красящим раствором, чтобы подтвердить очистку SIRT2.
    27. Хранить очищенный SIRT2 при -80 ° С.
  2. Очистка ацетилированный белок-субстрат
    1. Подготовьте 10 см х блюд культуры 10 см с НЕК 293Т составляет около 70% вырожденная на следующий день.
    2. На следующий день, со-трансфекции клеток с 5 мкг флага помечено плазмиды вектор expressinг белок-субстрат, а также 5 мкг специфического ацетил-трансферазы, который может ацетилировать белка с использованием PEI при соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
      Примечание: Если конкретный ацетил-трансферазы не известно, со-трансфекции смеси известным гистонов ацетил-трансферазы (HATS), таких как р300, ОШП GCN5, Tip60 и PCAF.
    3. Изменение среды после 12 часов.
    4. За день до лизиса клеток, лечить клетки с 1 мкМ TSA и 2 мМ никотинамида (NAM) в течение ночи путем замены культуральной среды на среду, содержащую TSA / NAM, чтобы максимизировать уровни ацетилирование белка-субстрата путем ингибирования дезацетилазами.
    5. 48 ч после трансфекции, удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки путем обработки трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
    6. Лизируйте осадок клеток в 500 мкл буфера для лизиса А на чашку (20 мМ HEPES, рН 7,9, 18 мМ КСl, 0,2 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl2, 20% глицерина, 0,1% NP-40), в том числе протеаза Inhibitors коктейль, 1 мкМ АСП и 2 мМ NAM в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
    7. Центрифуга при 14000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
    8. Выполните иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag, конъюгированного с агарозном бисером, как описано ниже.
      1. Добавить 200-300 мкл анти-Flag антитела, конъюгированного с агарозными гранулами с белком лизатов (10-20 мг белка).
      2. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
      3. Собрать иммуноосажденными центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
      4. Вымойте гранул 2 раза с помощью 10 мл лизирующего буфера А при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. После каждой промывки, гранулы бусинки и заменить супернатант с лизис буфером А.
      5. Вымойте гранул 3 раза с помощью 10 мл лизирующего буфера А без NAM при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. После каждого мытья, гранулы шарики и заменить супернатант с лизис буфера А. Это IMPORTAнт не переносить любой NAM к реакции деацетилирования.
    9. Приготовьте 1х раствора пептида Flag (в том числе ингибиторы протеазы и 1 мкМ TSA в PBS).
    10. Добавьте 500 мкл раствора пептида 1 x флага на агарозном бусин и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
    11. Собирают супернатант центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    12. Повторите предыдущие два шага.
    13. Удалить бусы из надосадочной жидкости при помощи фильтровальной трубки и центрифугирования при 15000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
    14. С использованием ультрафильтрационной мембраны, концентрат, элюированный образец до тех пор, концентрация белка не является 1 мкг / мкл.
    15. Выполните электрофорез, выполнив 1 мкл элюированной пробы на 4-12% геле SDS-PAGE.
    16. Подтверждение ацетилирование белка-субстрата с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител против Ac-K (1: 1000 разведение) и белка-субстрата (разбавление зависит от конкретного используемого антитела).
    17. Держите пуриFied ацетилированный белок-субстрат при температуре -80 ° С.
  3. In Vitro дезацетилирования реакции
    1. Подготовьте деацетилирования буфера В (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 , 0,5 мкМ АСП)
    2. Подготовьте 3 различные реакции в различных пробирках в 20 мкл конечного объема (таблица 1).
    3. Включите дополнительные реакции для подтверждения деацетилирование белка-субстрата с помощью SIRT2 ( по желанию). Добавить 2 мкг очищенного дезацетилирования нулевого мутантного SIRT2 (это может быть сделано с использованием протокола , описанного в пункте 1.1 после использования lentivector PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) по отношению к реакции вместо деацетилаз активного SIRT2 или добавить 10 мМ никотинамида (NAM ) по отношению к реакции , чтобы ингибировать дезацетилирование активность SIRT2 (Таблица 1).
    4. Инкубируйте реакции в течение 3 ч при 30 ° С при постоянном перемешивании.
    5. Остановить реакцию добавлением 20 мкл 2х буфера для образцов и кипятите образцов Fили 10 мин при 95 ° С.
    6. Выполните электрофорез путем запуска реакционной смеси на 4-12% геле SDS-PAGE и определить статус ацетилирования белка-субстрата с помощью Вестерн - блоттинга с использованием анти Ac-K - антитела (1: 1000 разведение) 19,20.

2. В Vivo дезацетилирования анализе

  1. SIRT2 Гиперэкспрессия в культивируемых клетках
    1. Приготовьте 10 см культуры блюд с НЕК 293Т клеток , стабильно с гиперэкспрессией PCDH-Puro-GFP-пустой вектор, PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag и PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (как описано в пункте 1.1) составляет около 70 % сплошности.
    2. В качестве альтернативы, подготовить 10 см чашки для культивирования с клетками около 70% сплошности и выполняют переходную избыточную экспрессию с использованием 5 мкг векторов, упомянутых выше, с использованием PEI при соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
    3. Выполнение вестерн-блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием антитела анти-Flag (1: 1000 разведение), чтобы продемонстрировать избыточную экспрессию Flag-тagged SIRT2 19.
  2. Интерференция РНК в нокдаун SIRT2 в культивируемых клетках
    1. Приготовьте 10 см культуры блюдо из клеток 293Т НЕК составляет около 70% вырожденная на следующий день.
    2. На следующий день, со-трансфекции 4 мкг pLKO1-Puro-ш SIRT2 (lentivector) 19, 4 мкг pCMV- dR8.2 dvpr (упаковка вектор) и 0,5 мкг PCMV-VSV-G (конверт вектор) 18 с использованием полиэтиленимина (PEI) в соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
      Примечание: Для сбивания SIRT2, мы используем простые шпилька shRNAs в векторе pLKO.1 лентивирусов, построенный по проекту RNAi Consortium (TRC).
    3. Следуйте процедуре, описанной в пункте 1.1 для получения shSIRT2 лентивирус и инфицировать клетки - мишени в нокдаун SIRT2.
    4. Выполнение вестерн - блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием анти-SIRT2 антитела (1: 1000 разведение) , чтобы продемонстрировать эффективное SIRT2 нокдаун после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE.
    5. В качестве альтернативы,подготовить 10 см чашки для культивирования клеток с около 70% сплошности и выполнять переходные нокдаун SIRT2 использованием миРНК следующие инструкции производителя.
    6. Выполнение вестерн - блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием анти-SIRT2 антитела (1: 1000 разведение) , чтобы продемонстрировать эффективное SIRT2 нокдаун после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE.
  3. Иммунопреципитации и иммуноблоттинга для обнаружения ацетилированный уровней в культивируемых клетках
    1. 12 ч до сбора клеток гранул либо из клеток с гиперэкспрессией SIRT2 (см 2.1 выше) или SIRT2 нокдауне клетки (см 2.2 выше), добавьте 1 мкм АСП к культуральной среде для ингибирования не являющиеся III класса гистондезацетилазы.
    2. Удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки обработкой трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
    3. Добавляют 10 мл лизирующего буфера А (20 мМ HEPES, рН 7,9, 18 мМ КСl, 0,2 мМ EGTA, 1,5мМ MgCl 2, 20% глицерине, 0,1% NP-40) , в том числе коктейль ингибиторов протеазы, 1 мкМ TSA и 2 мМ NAM.
    4. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин при постоянном вращении.
    5. Собирают супернатанты центрифугированием при 20000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
    6. Рассчитать концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    7. Передача 1 мг общего белка в новые пробирки в конечном объеме 1 мл с использованием буфера для лизиса A. Использование таблицу 2 в качестве эталона для подготовки образцов белка из клеток , либо с гиперэкспрессией SIRT2 или после SIRT2 нокдаун.
    8. Выполнить иммунопреципитации с использованием антитела против специфического белка-субстрата вместе с белком A / G (40 мкл шарик суспензии рекомендуется). В качестве альтернативы, используйте анти Ac-K антитела, конъюгированного в агарозном бусин (20 мкл суспензии шарик как правило, достаточно), чтобы иммунопреципитации все ацетилированные белки.
    9. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С при Констант вращение в течение ночи.
    10. Сбор иммуноосажденными центрифугированием при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    11. Промыть бусин 5 раз с 1 мл буфера А при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    12. Ресуспендируют бусины в 40 мкл буфера 2х образца.
    13. Образцы кипятить в течение 10 мин при 95 ° С.
    14. Выполните электрофорез, запустив элюированный образцы (40 мкл из стадии 2.3.12) на 4-12% геле SDS-PAGE, не нарушая бусинки при передаче элюированной пробы.
    15. Обнаружение ацетилированные уровни белка-субстрата с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-Ac-K-антитела (1: 1000 разведение), если белок-субстрат специфическое антитело использовали для иммунопреципитации, или специфическое антитело против белка-субстрата (следуют рекомендации специфическое антитело в отношении разбавления), если анти-Ac-K гранулы использовали для иммунопреципитации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того , чтобы белок , следует рассматривать в качестве законной цели дезацетилирования для любого фермента с дезацетилирования активностью, как в пробирке и в естественных деацетилировании анализов должны быть выполнены , чтобы установить взаимосвязь между деацетилаз и его субстратом. Для экстракорпоральное деацетилаз анализа, очищение как деацетилаз и ацетилированного белкового субстрата требуется до того , как анализ может быть сделано. При этом мы использ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Недавние высокопроизводительные протеомные исследования установили, что ацетилирование широко распространено не только в ядре, но и в цитоплазме и митохондриях 7,8,21-23. Принимая во внимание вероятность того, что гораздо больше ацетилированных белков и сайтов могли не быть обнаружены по нескольким причинам, таким как специфичность используемых антител против Ac-K, низкое содержание ацетилированных белков и переходный характер ПТМ, можно с уверенностью предсказать, что в будущем еще предстоит обнаружить больше...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Описанный здесь проект был поддержан грантом NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), а также Роберт Х. Лурье Comprehensive Cancer Center - Lefkofsky Family Foundation / Лиз и премии Эрик Lefkofsky инновационных исследований А. В. Мы хотели поблагодарить сотрудников лаборатории (Кэрол o'Callaghan и Элизабет Энн Wayne) для критического чтения и редактирования рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Блюда для клеточных культурDenville Scientific Inc.T1110 и T1115
pCDH-puro-GFP лентивирусный векторСистема биологических наукCD513B-1
pCMV-dR8.2 dvpr (упаковочный вектор)Addgene8455
pCMV-VSV-G (вектор оболочки)Addgene8454
полиэтиленимин (PEI) Polysciences Inc.24885Можно использовать и другие реагенты для трансфекции. PEI экономически выгоден и очень эффективен при трансфекции клеток 293T
0,22 мкм; m фильтрыDenville Scientific Inc.F5512
полибреновыйSigmaH9268
Carl Zeiss MicroImaging Inc.Axiovert 200
пуромицинInvivogenA11138-03
PBSCorning21-031-CM
анти-Флаг антителоSigmaF3165
HEPES SigmaH3375
KClSigmaP9541
ГлицеринSigmaG5516
NP-40Sigma74385
MgCl2SigmaM9272
EGTASigma34596
ингибиторы протеазы коктейль 100xBiotoolB14001
Трихостатин А (ТСА)SigmaT8552селективный ингибитор гистондеацетилаз класса I и II (HDACs), но не класса III HDACs (сиртуины)
антифлаговые агарозные шарикиSigmaA2220
центрифугаEppendorf5417R
rotatorThermo Scientific415220Q
фильтрующие трубкиMilliporeUFC30HV00
Пептид флага SigmaF3290
Центробежный концентратор VivaspinSartorius Stedim Biotech S.A.VS0102
SimplyBlue SafeStain решение InvitrogenLC6060
NuPAGE LDS буфер для проб (4x)Life TechologiesNP0007
Tris-HCl pH 7,5SigmaT5941
NAD+SigmaN0632требуется кофактор для сиртуинов
никотинамид (NAM)Sigma72340селективный ингибитор класса III HDACs (сиртуины)
pLKO.1 лентивирусный вектор Addgene8453
SIRT2 si RNA QiagenGS22933
антитело к SIRT2Proteintech15345-1-AP
Bradford protein anasayBIO-RAD500-0006
анти-Ac-K агарозные шарикиImmunechemICP0388
флуоресцентный микроскоп

Ссылки

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48(2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382(2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e51682(2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Анализ деацетилирования SIRT2деацетилирование in vitroдеацетилирование in vivoидентификация субстратов сиртуинованализ ацетилирования белковочистка SIRT2 с FLAG-меткойиммунопреципитация и вестерн-блоттингNAD-зависимое деацетилированиедетектирование ацетил-лизинаскрининг семейства сиртуинов
Деацетилирование Assays распутать Interplay между Sirtuins (SIRT2) и специфического белка-субстратов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.