Protocol
1. In Vitro Deacetylering Assay
- Zuivering van SIRT2
- Bereid een 10 cm kweekschaal van HEK 293T cellen gekweekt in 8 ml DMEM met 10% FBS en antibiotica en gekweekt in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator tot ongeveer 70% confluent de volgende dag.
- De volgende dag, co-transfecteren 4 ug pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector in ons laboratorium), 4 ug pCMV- dR8.2 dvpr (verpakkingsvector) en 0,5 ug pCMV-VSV-G (envelope vector) 18 gebruik polyethyleenimine (PEI) in een verhouding van 3 gl PEI / pg DNA.
- Verander media na 12 uur.
- Verzamel supernatant na 36-48 uur.
- Verwijderen afval door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Na filtreren door 0,22 urn filters, maak 1 ml aliquots SIRT2 lentivirus en laten -80 ° C.
- Dooi SIRT2 lentivirus op ijs (het is belangrijk om het virus op te slaan bij -80 ° C wanneer het virus wordt gebruikt).
- Infect een 6-wells plaat 80-90% confluente HEK 293T cellen met 1 ml lentivirus in de aanwezigheid van 8 ug / ml polybreen.
- Plaats-virus geïnfecteerde cellen bij 37 ° C incubator tot de volgende dag (24 uur).
- Vervang medium na 24 uur.
- 48 uur na infectie, controleert infectie-efficiëntie door het detecteren van GFP positieve cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
- Als infectie efficiëntie goede (ten minste 40-50% geïnfecteerde cellen), vervangen medium met kweekmedium dat 2 ug / ml puromycine aan stabiele SIRT2 selecteren op expressie brengen.
Opmerking: Dit duurt ongeveer 2 weken, en het medium wordt elke 3-4 dagen. Niet-geïnfecteerde cellen sterven in deze selectie periode en alleen geïnfecteerde cellen met de SIRT2 lentivirus groeien. - Analyseren van expressie-Flag tag SIRT2 door western blotting met een anti-FLAG antilichaam (1: 1000 verdunning) na het draaien van 40 ug totaal eiwit op een 10% SDS-PAGE gel alvorens de purificatie proces (aanbevolen) 19,20.
- Actieve SIRT2, splitsen cellen zuiveren in 1: 3 verhouding van trypsinisatie om voldoende gerechten van HEK 293T cellen die stabiel tot overexpressie Flag-SIRT2 hebben (Ten 10 cm gerechten zuivering van voldoende eiwit voor latere experimenten mogelijk).
- Om de cellen te trypsinize, verwijder kweekmedium en te elimineren resterende serum door spoelen cellen met een steriele DPBS. Voeg langzaam 2,5 ml van een 0,25% trypsine-EDTA oplossing betrekking op de cel monolaag, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30-45 sec. Na verwijdering van de trypsine-EDTA oplossing, geïncubeerd bij 37 ° C totdat de cellen beginnen te los. Voeg vervolgens kweekmedium en de overdracht cellen om nieuwe gerechten.
- Verwijderen kweekmedium, wassen cellen tweemaal in PBS en laat cellen door behandeling met trypsine, gevolgd door centrifugatie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Lyse celpellet in 500 ui lysis buffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCI, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) die een proteaseremmers cocktail en 1 uM TSA gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder constante rotatie.
- Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en overdracht supernatant naar een nieuwe buis.
- Voer immunoprecipitatie met een anti-Flag-antilichaam geconjugeerd aan korrels agarose zoals hieronder beschreven.
- Voeg 200-300 ul van anti-Flag antilichaam geconjugeerd aan korrels aan het eiwit lysaat (10-20 mg totaal eiwit) agarose.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C onder constant roeren.
- Verzamel immunoprecipitaten door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Was de pellet 5 maal met 10 ml lysis buffer A bij 1000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na elke wasbeurt, pellet de kralen en vervang het supernatant met buffer A.
- Bereid 1x Vlag peptide-oplossing (met inbegrip van een proteaseremmers cocktail en 1 uM TSA in PBS).
- Voeg 500 ul van 1x Vlag peptide oplossing van het agarose kralen en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder constante rotatie.
- Verzamel supernatant door centrifugatie bij 6000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Herhaal de vorige twee stappen.
- Verwijder supernatant uit kralen met filterbuizen en centrifugatie bij 15.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
- Concentreer geëlueerde monster zo de uiteindelijke eiwitconcentratie 1 ug / ul onder toepassing van een ultrafiltratiemembraan.
- Raadpleeg zuiveringswerkwijze door het uitvoeren van elektroforese onder toepassing van 1 pg van het geëlueerde monster.
- Vlek gel met een in de handel verkrijgbare kleuroplossing voor SIRT2 zuivering te bevestigen.
- Houd gezuiverd SIRT2 bij -80 ° C.
- Zuivering geacetyleerd eiwit-substraat
- Bereid 10 cm x 10 cm kweekschalen met HEK 293T cellen ongeveer 70% confluent de volgende dag.
- De volgende dag, co-transfecteren cellen met 5 ug van een vlag hebben plasmidevector expressinG eiwit-substraat en 5 ug van het specifieke acetyl-transferase waarin het eiwit via PEI in een verhouding van 3 gl PEI / ug DNA kan acetyleren.
Opmerking: Als de specifieke acetyl-transferase niet bekend, co-transfecteren met een mengsel van bekende histon-acetyl transferasen (HAT) zoals p300, CBP, GCN5, Tip60 en PCAF. - Verander medium na 12 uur.
- De dag voor het lyseren van de cellen, behandelen van de cellen met 1 uM TSA en 2 mM nicotinamide (NAM) gedurende de nacht door vervanging van het kweekmedium met medium dat TSA / NAM acetyleringsgehalten van de eiwit-substraat maximaliseren door remming deacetylasen.
- 48 uur na transfectie, verwijder kweekmedium, wassen cellen tweemaal in PBS en laat cellen door behandeling met trypsine, gevolgd door centrifugatie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Lyse celpellet in 500 ui lysisbuffer A per schaal (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCI, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) die een protease inhibitors cocktail, 1 uM TSA en 2 mM NAM gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder constante rotatie.
- Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en overdracht supernatant naar een nieuwe buis.
- Voer immunoprecipitatie met een anti-Flag-antilichaam geconjugeerd aan korrels agarose zoals hieronder beschreven.
- Voeg 200-300 ul van anti-Flag antilichaam geconjugeerd aan korrels aan het eiwit lysaat (10-20 mg totaal eiwit) agarose.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C onder constant roeren.
- Verzamel immunoprecipitaten door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Was de pellet 2x met 10 ml lysis buffer A bij 1000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na elke wasbeurt, pellet de kralen en vervang de bovenstaande vloeistof met lysisbuffer A.
- Was de pellet 3 maal met 10 ml lysis buffer A zonder NAM bij 1000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na elke wasbeurt, pellet de kralen en vervang de bovenstaande vloeistof met lysisbuffer A. Het is important niet uit te voeren over een NAM aan de deacetylering reactie.
- Bereid 1x Flag peptide oplossing (met proteaseremmers en 1 uM TSA in PBS).
- Voeg 500 pl 1x Flag peptide oplossing voor de agarose kralen en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder constante rotatie.
- Verzamel supernatant door centrifugatie bij 6000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Herhaal de vorige twee stappen.
- Verwijder supernatant uit kralen met filterbuizen en centrifugatie bij 15.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
- Onder toepassing van een ultrafiltratiemembraan, concentreren geëlueerde monster totdat de eiwitconcentratie 1 ug / ul.
- Voeren elektroforese door het uitvoeren van 1 pl van het geëlueerde monster op een 4-12% SDS-PAGE gel.
- Bevestigen acetylering van eiwit-substraat door western blotting met gebruik van antilichamen tegen Ac-K (1: 1000 verdunning) en het eiwit-substraat (verdunning hangt af van de specifieke antilichamen gebruikt).
- Houd purified geacetyleerd eiwit-substraat bij -80 ° C.
- In Vitro deacetyleringsreactie
- Bereid de deacetylering buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 0,5 uM TSA)
- Bereid 3 verschillende reacties in verschillende buizen in 20 pl eindvolume (tabel 1).
- Inclusief extra reacties op deacetylering van het eiwit-substraat te bevestigen door SIRT2 (optioneel). Voeg 2 ug gezuiverd deacetylering null-mutant SIRT2 (dit kan volgens de in 1.1 beschreven protocol na gebruik van een pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y FLAG lentivector) aan de reactie in plaats van deacetylase actieve SIRT2 of voeg 10 mM nicotinamide (NAM ) om de reactie op de activiteit van deacetylering SIRT2 remmen (tabel 1).
- Incubeer reacties gedurende 3 uur bij 30 ° C onder constant roeren.
- Stop de reactie door toevoeging van 20 pi 2x monsterbuffer en kook de monsters fof 10 min bij 95 ° C.
- Voeren elektroforese door het uitvoeren van het reactiemengsel op een 4-12% SDS-PAGE gel en detecteren acetyleringsstatus van de eiwit-substraat door western blotting met een anti-Ac K antilichaam (1: 1000 verdunning) 19,20.
2. In vivo assay Deacetylering
- SIRT2 overexpressie in gekweekte cellen
- Bereid 10 cm cultuur gerechten met HEK 293T-cellen die stabiel tot overexpressie pCDH-puro-GFP-lege vector, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag en pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y FLAG (zoals beschreven in 1.1) tot ongeveer 70 zijn % confluent.
- Alternatief bereiden 10 cm kweekschalen met cellen ongeveer 70% confluent en uitvoeren transiënte overexpressie middels 5 pg van het bovenstaande gebruik PEI in een verhouding van 3 gl PEI / ug DNA genoemde vectoren.
- Voer western blotting van totale cellulaire extracten met behulp van een anti-Flag-antilichaam (1: 1000 verdunning) overexpressie van Flag-t demonstrerenagged SIRT2 19.
- RNA interferentie te Knockdown SIRT2 in gekweekte cellen
- Bereid een 10 cm kweekschaal van HEK 293T cellen ongeveer 70% confluent de volgende dag.
- De volgende dag, co-transfecteren 4 ug pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 ug pCMV- dR8.2 dvpr (verpakkingsvector) en 0,5 ug pCMV-VSV-G (envelop vector) 18 middels polyethyleenimine (PEI) in een verhouding van 3 gl PEI / pg DNA.
Opmerking: Voor het neerhalen SIRT2, maken we gebruik van eenvoudige haarspeldbocht shRNAs in de pLKO.1 lentivirale vector ontworpen door de RNAi Consortium (TRC). - Volg de procedure zoals beschreven in 1,1 tot shSIRT2 lentivirus produceren en te infecteren doelcellen te knockdown SIRT2.
- Voer western blotting van totale cellulaire extracten met behulp van een anti-SIRT2 antilichaam (1: 1000 verdunning) een doelmatige SIRT2 knockdown tonen na het uitvoeren van 40 ug totaal eiwit op een 10% SDS-PAGE gel.
- Alternatief,bereiden 10 cm kweekschalen met cellen ongeveer 70% confluent en uitvoeren transiënte knockdown van SIRT2 gebruik siRNA volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer western blotting van totale cellulaire extracten met behulp van een anti-SIRT2 antilichaam (1: 1000 verdunning) een doelmatige SIRT2 knockdown tonen na het uitvoeren van 40 ug totaal eiwit op een 10% SDS-PAGE gel.
- Immunoprecipitatie en Immunoblotting te geacetyleerd Levels in gekweekte cellen Detect
- 12 uur voor het verzamelen van celpellets van beide cellen tot overexpressie SIRT2 (zie 2.1) of SIRT2 neergehaald cellen (zie 2.2), voeg 1 micrometer TSA aan het kweekmedium om niet Klasse III histondeacetylase remmen.
- Verwijderen kweekmedium, wassen cellen tweemaal in PBS en laat cellen door behandeling met trypsine, gevolgd door centrifugatie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Voeg 10 ml lysis buffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCI, 0,2 mM EGTA, 1,5mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) die een proteaseremmers cocktail, 1 uM TSA en 2 mM NAM.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten onder voortdurend draaien.
- Verzamel supernatanten door centrifugatie bij 20.000 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Bereken eiwitconcentratie met behulp van een Bradford eiwitbepaling.
- Overdracht 1 mg totaal eiwit nieuwe buizen in een eindvolume van 1 ml middels lysis buffer A. Gebruik tabel 2 als een verwijzing naar eiwitsteekproeven bereiden uit cellen hetzij overexpressie SIRT2 of na SIRT2 knockdown.
- Voer een immunoprecipitatie onder toepassing van een antilichaam tegen het specifieke eiwit-substraat met proteïne A / G (40 pl kraal slurry wordt aanbevolen). U kunt ook gebruik maken van een anti Ac-K antilichaam geconjugeerd aan kralen agar (20 ul kraal slurry is meestal genoeg) om alle geacetyleerde proteïnen immunologisch.
- Incubeer monsters bij 4 ° C onder constant rotatie 's nachts.
- Verzamel immunoprecipitaten door centrifugatie bij 1000 g gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Wassen kralen 5 maal met 1 ml buffer A bij 1000 g gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer kralen in 40 ul 2x monsterbuffer.
- Kook monsters gedurende 10 min bij 95 ° C.
- Voeren elektroforese door uitvoering van de geëlueerde monsters (40 ul van stap 2.3.12) op een 4-12% SDS-PAGE gel zonder korrels storen tijdens het overbrengen van het geëlueerde monsters.
- Detecteren geacetyleerde niveaus van het eiwit-substraat door Western blotting met een anti-Ac-K-antilichaam (1: 1000 verdunning) als een eiwit-substraat specifiek antilichaam werd gebruikt voor immunoprecipitatie of een specifiek antilichaam tegen het eiwit-substraat (de aanbevelingen voor het specifieke antilichaam over verdunning) als anti-Ac K korrels werden gebruikt voor immunoprecipitatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een eiwit als legitiem deacetylering doelwit voor elk enzym met deacetylering activiteit te hebben, zowel in vitro als in vivo assays deacetylering moeten worden uitgevoerd om de wisselwerking tussen de deacetylase en zijn substraat vast. Voor de in vitro assay deacetylase, is de zuivering van zowel de deacetylase en de geacetyleerde eiwitsubstraat vereist voordat de assay kan worden uitgevoerd. Hier gebruiken we het cytoplasma sirtuin SIRT2 de specifieke deacetylase te bestuderen. SIRT2 is deacetylase-enzym en het gebruik van een mutant die de deacetylase-activiteit mist wordt sterk aanbevolen als een negatieve controle voor de assay deacetylering. Met de zuiveringswerkwijze in 1,1 beschreven, kunnen zowel SIRT2 en SIRT2 H187Y succes worden gezuiverd in een eindconcentratie van 1 ug / ul. Dit kan worden bevestigd na het uitvoeren van de gezuiverde eiwitten op een gel gevolgd door kleuring(Figuur 1A, boven) en na Western blotting met een anti-Flag-antilichaam aangezien zowel SIRT2 en SIRT2 H187Y worden gelabeld met een Flag-peptide (figuur 2A, onder). Dezelfde zuiveringsprocedure kan worden gevolgd voor de zuivering van het eiwit substraat met enkele wijzigingen. Het eiwit moet worden geacetyleerd voordat het kan worden gebruikt voor de bepaling deacetylering waardoor het moet worden gezuiverd overexpressie de specifieke acetyltransferase of een mengsel van HATs kunnen de eiwitten acetyleren. Met de zuiveringswerkwijze in 1,2 beschreven kan de geacetyleerde eiwit worden gezuiverd (Figuur 1B, boven). Om te bevestigen dat het eiwit inderdaad geacetyleerd en kan worden gebruikt voor de in vitro deacetylering assay, western blotting met een anti Ac-K antilichaam nodig zijn om verhoogde geacetyleerde niveaus van het gezuiverde eiwit in overexpressie acetyl-transferasen (Figuur 1B, Lower).
Na een succesvolle eiwitzuivering, kan het in vitro deacetylering test worden uitgevoerd. Sirtuins, waaronder SIRT2, zijn klasse III histon-lysine deacetylases die onderscheiden van andere deacetylases zijn zoals ze vereisen NAD + voor hun enzymatische functie. In overeenstemming hiermee kan geen deacetylering worden gedetecteerd door western blotting met een anti-Ac K antilichaam in de afwezigheid van NAD +, ongeacht de aanwezigheid van katalytisch actieve SIRT2 (figuur 2, laan 2 vs 1). Integendeel, geacetyleerde verlaagde niveaus van het eiwit wanneer zowel geacetyleerde SIRT2 en NAD + in de reactie zijn suggereren dat het eiwit kan worden beschouwd als een doelwit voor SIRT2 deacetylering. Om deze resultaten te verifiëren, kunnen verschillende negatieve controles gebruikt. Bijvoorbeeld geen verschil in de deacetylering niveaus van het eiwit kan worden gedetecteerd wanneer een deacetylering deficiënte SIRT2 (SIRT2 H187Y) wordt gebruikt in plaats van de katalytisch actieve wildtype SIRT2 (figuur 2, laan 5 vs 4). Vergelijkbaar effect kan worden gezien als een gevestigde sirtuin inhibitor, NAM, wordt toegevoegd aan het reactiemengsel, wat impliceert dat de daling van de geacetyleerde niveaus van het eiwit wordt gemedieerd door de activiteit van deacetylase SIRT2.
Afwijkende deacetylering is betrokken bij diverse cellulaire processen en leeftijd gerelateerde ziekten. Dus een cruciale stap in de verdieping van onze kennis over de wisselwerking tussen een deacetylase en zijn substraat deze koppeling in cellen waarin dit verschijnsel een fysiologisch effect kan beïnvloeden. Bovendien controleren deacetylering in celkweek systemen in vivo maakt het onderzoek mogelijk van de deacetylering gebeurtenis in een cel- of weefselspecifieke context die gemakkelijker kunnen worden aangesloten op een bepaald fenotype of uitkomst. Dit sluit de mogelijkheid dat de waargenomen in vitro Deacetylation activiteit kunstmatig door de aanwezigheid van zowel de deacetylase en zijn substraat in de buis tegelijkertijd, dat nooit onder normale fysiologische omstandigheden in cellen kan gebeuren. Voor de in vivo assay deacetylering kan overexpressie zowel SIRT2 en SIRT2 H187Y en het eiwit substraat worden gebruikt volgens de in 2.1 en 2.2 beschreven procedures. Celextracten bereid uit deze cellen kunnen worden bevestigd SIRT2, SIRT2 H187Y expressie en het eiwit substraat door western blotting met specifieke antilichamen. In de hier beschreven test alle exogeen uitgedrukt eiwitten worden gelabeld voor het gemak van de uitgevoerde experimenten (Figuur 3, onderste paneel op te sporen HA-tag SIRT2 / SIRT2 H187Y en middelste paneel op te sporen Flag-gemerkt eiwit substraat). Om te bepalen of het doelwit eiwit is een deacetylering substraat van SIRT2, wordt immunoprecipitatie uitgevoerd met behulp van een anti-Flag antilichaam afbreken het doelwit eiwit followed door western blotting met een anti-Ac K antilichaam. Daling van de geacetyleerde niveaus van het eiwit in cellen die SIRT2 (figuur 3 bovenste panel, rij 3 vs 2) en niet-geacetyleerd niveaus in cellen beïnvloeden expressie de deacetylase deficiënte SIRT2 mutant (Figuur 3 bovenpaneel, laan 4 vs 3) blijkt dat de geacetyleerde eiwit kan deacetylering doelwit de specifieke deacetylase in vivo. Dit kan verder worden bevestigd wanneer SIRT2-gemedieerde deacetylering wordt geremd na het behandelen van cellen met NAM (Figuur 3 bovenste paneel, baan 5 vs 3) tot vaststelling van specifieke deacetylase-substraat as in de bestudeerde cellen.
Figuur 1: Zuivering van zowel de deacetylase en geacetyleerde eiwit-substraat wordt gebruikt voor de in vitro assay deacetylering. (A) 1 ug zowel SIRT2 en SIRT2 H187Y (deacetylering defecte mutant) werden uitgevoerd op een gel na de zuivering protocol zoals beschreven in 1.1. De gel werd gekleurd met een commercieel verkrijgbare kleuroplossing na ontkleuring, zowel gezuiverde eiwitten kunnen worden gedetecteerd (boven). Eiwitten worden gedetecteerd na het overbrengen op PVDF membraan en western blotting met een anti-Flag-antilichaam (onder). (B) 1 ug eiwit substraat en hyper geacetyleerd eiwitsubstraat (alfa-enolase werd gebruikt als een substraat SIRT2 basis van massaspectrometrie ongepubliceerde gegevens die in ons laboratorium) werden op een gel na zuivering protocol zoals beschreven in 1.2. De gel werd gekleurd met een commercieel verkrijgbare kleuroplossing na ontkleuring, kan het gezuiverde eiwit substraat worden gedetecteerd (boven). Acetylatie kunnen worden gedetecteerd na het overbrengen op PVDF membraan en western blotting met een anti-Ac-K antilichaam (middelste). Totaal p roteins kan worden gedetecteerd met behulp van een anti-Flag antilichaam (lager). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. In vitro assay deacetylering Gezuiverd eiwit geacetyleerd substraat (alfa-enolase) is geïncubeerd met SIRT2 of SIRT2 H187Y (deacetylering mutant) in aanwezigheid van NAD + (lanen 4 en 5). Geacetyleerde verlaagde niveaus worden gedetecteerd door western blotting met een anti-Ac K antilichaam in aanwezigheid van SIRT2 maar niet in aanwezigheid van SIRT2 H187Y (laan 4 versus 5). Deacetylering geen activiteit wordt waargenomen wanneer NAD + niet is opgenomen in het reactiemengsel (laan 2 vs 4) of wanneer NAM wordt toegevoegd aan het reactiemengsel (laan 6 vs. 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. In vivo assay deacetylering HEK293T cellen die stabiel tot overexpressie hetzij SIRT2 of SIRT2 H187Y werden gecotransfecteerd met het eiwit substraat (alfa-enolase) en HATs de geacetyleerde niveaus van het eiwit (laan 2 vs 1) verhogen. Deacetylering werd gecontroleerd in vivo na immunoprecipitatie met behulp van een anti-Flag antilichaam afbreken van het eiwit substraat en western blotting gebruik van een anti Ac-K antilichaam. Acetylering significant verminderd bij SIRT2 overexpressie cellen in vergelijking met de SIRT2 H187Y overexpressie cellen (laan 3 vs 4). Het SIRT2 gemedieerde deacetyleringvan het eiwit substraat wordt geremd wanneer cellen worden behandeld met NAM (laan 5 vs 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| reacties | 1 | 2 | 3 | 4 (optioneel) | 5 (optioneel) |
| geacetyleerde gezuiverd eiwit-substraat (10 ug) | + | + | + | + | + |
| buffer B | + | + | + | + | + |
| gezuiverd SIRT2 (2 ug) | - | + | + | - | + |
| NAD + (1 mp) | - | - | + | + | + |
| gezuiverd SIRT2 H187Y (2 ug) | - | - | - | + | - |
| NAM (10 mm) | - | - | - | - | + |
Tabel 1: Reactie ingrediënten.
| samples | overexpressie | omver gooien |
| 1 | pCDH-puro-GFP-lege vector | pLKO1 lege vector of si ctr |
| 2 | pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag | pLKO1 sh SIRT2 1 of si SIRT2 1 |
| 3 | pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y FLAG | pLKO1 sh SIRT2 2 of si SIRT2 2 |
Tabel 2: Eiwitmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het hier beschreven project werd ondersteund door een subsidie van NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), alsmede door de Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - De Lefkofsky Family Foundation / Liz en Eric Lefkofsky Innovation Research Award naar AV Wij willen aan de leden van het laboratorium (Carol O'Callaghan en Elizabeth Anne Wayne) voor het kritisch lezen en bewerken van dit manuscript bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture dishes | Denville Scientific Inc. | T1110 and T1115 | |
| pCDH-puro-GFP lentiviral vector | System Biosciences | CD513B-1 | |
| pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) | Addgene | 8455 | |
| pCMV-VSV-G (envelope vector) | Addgene | 8454 | |
| polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 24885 | other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells |
| 0.22 μm filters | Denville Scientific Inc. | F5512 | |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| fluorescent microscope | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | Axiovert 200 | |
| puromycin | Invivogen | A11138-03 | |
| PBS | Corning | 21-031-CM | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F3165 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| EGTA | Sigma | 34596 | |
| protease inhibitors coctail 100x | Biotool | B14001 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | T8552 | selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins) |
| anti-Flag agarose beads | Sigma | A2220 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| rotator | Thermo Scientific | 415220Q | |
| filter tubes | Millipore | UFC30HV00 | |
| Flag peptide | Sigma | F3290 | |
| Vivaspin Centrifugal Concentrator | Sartorius Stedim Biotech S.A. | VS0102 | |
| SimplyBlue SafeStain solution | Invitrogen | LC6060 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Techologies | NP0007 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | T5941 | |
| NAD+ | Sigma | N0632 | required cofactor for sirtuins |
| nicotinamide (NAM) | Sigma | 72340 | selective inhibitor class III HDACs (sirtuins) |
| pLKO.1 lentiviral vector | Addgene | 8453 | |
| SIRT2 si RNA | Qiagen | GS22933 | |
| anti-SIRT2 antibody | Proteintech | 15345-1-AP | |
| Bradford protein assay | BIO-RAD | 500-0006 | |
| anti Ac-K agarose beads | Immunechem | ICP0388 |
References
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
- Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
- Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
- Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
- L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
- Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
- Smith, K. T., Workman, J. L.
- Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D.
- Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
- Anderson, K. A., Hirschey, M. D.
- Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
- Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
- Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
- Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
- Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
- Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
- Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
- Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e51682 (2014).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).
