Protocol
1. In Vitro дезацетилирования Пробирной
- Очистка SIRT2
- Приготовьте 10 см культуры блюдо из НЕК 293Т клеток , культивированных в 8 мл DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотиков и выращивали в 37 ° C, 5% СО 2 культуральную инкубаторе тканевых составляет около 70% сплошности на следующий день.
- На следующий день, со-трансфекции 4 мкг PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector сделано в нашей лаборатории), 4 мкг pCMV- dR8.2 dvpr (упаковка вектор) и 0,5 мкг PCMV-VSV-G (конверт вектор) 18 с использованием полиэтиленимина (ПЭИ) в соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
- Изменение средств массовой информации после 12 часов.
- Соберите супернатант после 36-48 ч.
- Удалите мусор центрифугированием при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- После фильтрации через 0,22 мкм фильтры, составляют 1 мл аликвоты SIRT2 лентивирусов и держать при температуре -80 ° С.
- Оттепели SIRT2 лентивирусов на льду (важно хранить вирус при -80 ° С, когда вирус не используется).
- Инфицировать 6-луночный планшет 80-90% сплошности НЕК 293Т с 1 мл лентивирусов в присутствии 8 мкг / мл полибрена.
- Поместите инфицированные вирусом клетки в 37 ° C инкубаторе до следующего дня (24 ч).
- Заменить среду после 24 часов.
- 48 ч после заражения, проверьте эффективность инфекции путем обнаружения GFP-положительных клеток под флуоресцентным микроскопом.
- Если эффективность инфекции хорошо ( по крайней мере , на 40-50% инфицированных клеток), заменить среду с культуральной средой , содержащей 2 мкг / мл пуромицин , чтобы выбрать для стабильного SIRT2 над экспрессирующих клеток.
Примечание: Это занимает около 2-х недель, а среда меняется каждые 3-4 дня. Неинфицированных клетки умирают за этот период селекции и только инфицированных клеток с SIRT2 лентивирусов растут. - Анализ экспрессии Flag-меченый SIRT2 с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Flag (1: 1000 разведение) после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE перед запуском Purification процесс (рекомендуется) 19,20.
- Для очистки активного SIRT2, расщепленных клеток в соотношении 1: 3 по трипсином, чтобы иметь достаточное количество блюд клеток НЕК 293Т стабильно с гиперэкспрессией Flag-SIRT2 (Десять 10 см блюд позволит очистку достаточное количество белка для последующих экспериментов).
- Для Trypsinize клеток, удаления культуральной среды и ликвидации остатков сыворотки путем промывки клеток стерильной ДЗФР. Медленно добавляют 2,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клеточный монослой, инкубировать при комнатной температуре в течение 30-45 сек. После удаления раствора трипсина-ЭДТА, инкубировали при 37 ° С до тех пор, пока клетки не начнут отделяться. Затем добавляют питательную среду и переносят клетки на новые блюда.
- Удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки обработкой трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Осадок Lyse клеток в 500 мкл лизис буфера А (20 мМ HEPES рН 7,9, 18 мМ KCl, 0,2 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl 2, 20% глицерине, 0,1% NP-40), в том числе коктейль ингибиторов протеазы и 1 мкМ TSA в течение 30 мин при 4 ° С при постоянном вращении.
- Центрифуга при 14000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
- Выполните иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag, конъюгированного с агарозном бисером, как описано ниже.
- Добавить 200-300 мкл анти-Flag антитела, конъюгированного с агарозными гранулами с белком лизатов (10-20 мг белка).
- Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
- Собрать иммуноосажденными центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Вымойте гранул 5 раз с помощью 10 мл лизирующего буфера А при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. После каждой промывки, гранулы бусинки и заменить супернатант буфером А.
- Приготовьте 1х раствор пептида Flag (в том числе коктейль ингибиторов протеазы и 1 мкМ TSA в PBS).
- Добавить 500 мкл 1x флага пептиде решение агарозном бусин и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
- Собирают супернатант центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
- Повторите предыдущие два шага.
- Удалить бусы из надосадочной жидкости при помощи фильтровальной трубки и центрифугирования при 15000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
- Концентрат элюированный образец до конечной концентрации белка равно 1 мкг / мкл с использованием ультрафильтрационной мембраны.
- Проверка процесса очистки с помощью электрофореза с использованием 1 мкг элюированного образца.
- Пятно гель с коммерчески доступным красящим раствором, чтобы подтвердить очистку SIRT2.
- Хранить очищенный SIRT2 при -80 ° С.
- Очистка ацетилированный белок-субстрат
- Подготовьте 10 см х блюд культуры 10 см с НЕК 293Т составляет около 70% вырожденная на следующий день.
- На следующий день, со-трансфекции клеток с 5 мкг флага помечено плазмиды вектор expressinг белок-субстрат, а также 5 мкг специфического ацетил-трансферазы, который может ацетилировать белка с использованием PEI при соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
Примечание: Если конкретный ацетил-трансферазы не известно, со-трансфекции смеси известным гистонов ацетил-трансферазы (HATS), таких как р300, ОШП GCN5, Tip60 и PCAF. - Изменение среды после 12 часов.
- За день до лизиса клеток, лечить клетки с 1 мкМ TSA и 2 мМ никотинамида (NAM) в течение ночи путем замены культуральной среды на среду, содержащую TSA / NAM, чтобы максимизировать уровни ацетилирование белка-субстрата путем ингибирования дезацетилазами.
- 48 ч после трансфекции, удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки путем обработки трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Лизируйте осадок клеток в 500 мкл буфера для лизиса А на чашку (20 мМ HEPES, рН 7,9, 18 мМ КСl, 0,2 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl2, 20% глицерина, 0,1% NP-40), в том числе протеаза Inhibitors коктейль, 1 мкМ АСП и 2 мМ NAM в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
- Центрифуга при 14000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
- Выполните иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag, конъюгированного с агарозном бисером, как описано ниже.
- Добавить 200-300 мкл анти-Flag антитела, конъюгированного с агарозными гранулами с белком лизатов (10-20 мг белка).
- Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
- Собрать иммуноосажденными центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Вымойте гранул 2 раза с помощью 10 мл лизирующего буфера А при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. После каждой промывки, гранулы бусинки и заменить супернатант с лизис буфером А.
- Вымойте гранул 3 раза с помощью 10 мл лизирующего буфера А без NAM при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. После каждого мытья, гранулы шарики и заменить супернатант с лизис буфера А. Это IMPORTAнт не переносить любой NAM к реакции деацетилирования.
- Приготовьте 1х раствора пептида Flag (в том числе ингибиторы протеазы и 1 мкМ TSA в PBS).
- Добавьте 500 мкл раствора пептида 1 x флага на агарозном бусин и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
- Собирают супернатант центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
- Повторите предыдущие два шага.
- Удалить бусы из надосадочной жидкости при помощи фильтровальной трубки и центрифугирования при 15000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
- С использованием ультрафильтрационной мембраны, концентрат, элюированный образец до тех пор, концентрация белка не является 1 мкг / мкл.
- Выполните электрофорез, выполнив 1 мкл элюированной пробы на 4-12% геле SDS-PAGE.
- Подтверждение ацетилирование белка-субстрата с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител против Ac-K (1: 1000 разведение) и белка-субстрата (разбавление зависит от конкретного используемого антитела).
- Держите пуриFied ацетилированный белок-субстрат при температуре -80 ° С.
- In Vitro дезацетилирования реакции
- Подготовьте деацетилирования буфера В (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 , 0,5 мкМ АСП)
- Подготовьте 3 различные реакции в различных пробирках в 20 мкл конечного объема (таблица 1).
- Включите дополнительные реакции для подтверждения деацетилирование белка-субстрата с помощью SIRT2 ( по желанию). Добавить 2 мкг очищенного дезацетилирования нулевого мутантного SIRT2 (это может быть сделано с использованием протокола , описанного в пункте 1.1 после использования lentivector PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) по отношению к реакции вместо деацетилаз активного SIRT2 или добавить 10 мМ никотинамида (NAM ) по отношению к реакции , чтобы ингибировать дезацетилирование активность SIRT2 (Таблица 1).
- Инкубируйте реакции в течение 3 ч при 30 ° С при постоянном перемешивании.
- Остановить реакцию добавлением 20 мкл 2х буфера для образцов и кипятите образцов Fили 10 мин при 95 ° С.
- Выполните электрофорез путем запуска реакционной смеси на 4-12% геле SDS-PAGE и определить статус ацетилирования белка-субстрата с помощью Вестерн - блоттинга с использованием анти Ac-K - антитела (1: 1000 разведение) 19,20.
2. В Vivo дезацетилирования анализе
- SIRT2 Гиперэкспрессия в культивируемых клетках
- Приготовьте 10 см культуры блюд с НЕК 293Т клеток , стабильно с гиперэкспрессией PCDH-Puro-GFP-пустой вектор, PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag и PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (как описано в пункте 1.1) составляет около 70 % сплошности.
- В качестве альтернативы, подготовить 10 см чашки для культивирования с клетками около 70% сплошности и выполняют переходную избыточную экспрессию с использованием 5 мкг векторов, упомянутых выше, с использованием PEI при соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
- Выполнение вестерн-блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием антитела анти-Flag (1: 1000 разведение), чтобы продемонстрировать избыточную экспрессию Flag-тagged SIRT2 19.
- Интерференция РНК в нокдаун SIRT2 в культивируемых клетках
- Приготовьте 10 см культуры блюдо из клеток 293Т НЕК составляет около 70% вырожденная на следующий день.
- На следующий день, со-трансфекции 4 мкг pLKO1-Puro-ш SIRT2 (lentivector) 19, 4 мкг pCMV- dR8.2 dvpr (упаковка вектор) и 0,5 мкг PCMV-VSV-G (конверт вектор) 18 с использованием полиэтиленимина (PEI) в соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
Примечание: Для сбивания SIRT2, мы используем простые шпилька shRNAs в векторе pLKO.1 лентивирусов, построенный по проекту RNAi Consortium (TRC). - Следуйте процедуре, описанной в пункте 1.1 для получения shSIRT2 лентивирус и инфицировать клетки - мишени в нокдаун SIRT2.
- Выполнение вестерн - блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием анти-SIRT2 антитела (1: 1000 разведение) , чтобы продемонстрировать эффективное SIRT2 нокдаун после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE.
- В качестве альтернативы,подготовить 10 см чашки для культивирования клеток с около 70% сплошности и выполнять переходные нокдаун SIRT2 использованием миРНК следующие инструкции производителя.
- Выполнение вестерн - блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием анти-SIRT2 антитела (1: 1000 разведение) , чтобы продемонстрировать эффективное SIRT2 нокдаун после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE.
- Иммунопреципитации и иммуноблоттинга для обнаружения ацетилированный уровней в культивируемых клетках
- 12 ч до сбора клеток гранул либо из клеток с гиперэкспрессией SIRT2 (см 2.1 выше) или SIRT2 нокдауне клетки (см 2.2 выше), добавьте 1 мкм АСП к культуральной среде для ингибирования не являющиеся III класса гистондезацетилазы.
- Удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки обработкой трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Добавляют 10 мл лизирующего буфера А (20 мМ HEPES, рН 7,9, 18 мМ КСl, 0,2 мМ EGTA, 1,5мМ MgCl 2, 20% глицерине, 0,1% NP-40) , в том числе коктейль ингибиторов протеазы, 1 мкМ TSA и 2 мМ NAM.
- Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин при постоянном вращении.
- Собирают супернатанты центрифугированием при 20000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Рассчитать концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
- Передача 1 мг общего белка в новые пробирки в конечном объеме 1 мл с использованием буфера для лизиса A. Использование таблицу 2 в качестве эталона для подготовки образцов белка из клеток , либо с гиперэкспрессией SIRT2 или после SIRT2 нокдаун.
- Выполнить иммунопреципитации с использованием антитела против специфического белка-субстрата вместе с белком A / G (40 мкл шарик суспензии рекомендуется). В качестве альтернативы, используйте анти Ac-K антитела, конъюгированного в агарозном бусин (20 мкл суспензии шарик как правило, достаточно), чтобы иммунопреципитации все ацетилированные белки.
- Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С при Констант вращение в течение ночи.
- Сбор иммуноосажденными центрифугированием при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
- Промыть бусин 5 раз с 1 мл буфера А при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют бусины в 40 мкл буфера 2х образца.
- Образцы кипятить в течение 10 мин при 95 ° С.
- Выполните электрофорез, запустив элюированный образцы (40 мкл из стадии 2.3.12) на 4-12% геле SDS-PAGE, не нарушая бусинки при передаче элюированной пробы.
- Обнаружение ацетилированные уровни белка-субстрата с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-Ac-K-антитела (1: 1000 разведение), если белок-субстрат специфическое антитело использовали для иммунопреципитации, или специфическое антитело против белка-субстрата (следуют рекомендации специфическое антитело в отношении разбавления), если анти-Ac-K гранулы использовали для иммунопреципитации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того , чтобы белок , следует рассматривать в качестве законной цели дезацетилирования для любого фермента с дезацетилирования активностью, как в пробирке и в естественных деацетилировании анализов должны быть выполнены , чтобы установить взаимосвязь между деацетилаз и его субстратом. Для экстракорпоральное деацетилаз анализа, очищение как деацетилаз и ацетилированного белкового субстрата требуется до того , как анализ может быть сделано. При этом мы используем цитоплазматический Sirtuin SIRT2 как специфическая деацетилаза для изучения. SIRT2 является деацетилаза ферментом и использование мутанта, который испытывает недостаток в дезацетилазы активность настоятельно рекомендуется в качестве отрицательного контроля для анализа дезацетилирования. С помощью процедуры очистки , описанной в 1.1, как SIRT2 и SIRT2 H187Y могут быть успешно очищены при конечной концентрации 1 мкг / мкл. Это может быть подтверждено после запуска очищенных белков на геле с последующим окрашиванием(Фигура 1А, верхняя), а также после того, как вестерн - блоттинга с использованием антитела анти-Flag , так как SIRT2 и SIRT2 H187Y помечены флажком пептида (Фигура 2А, ниже). Та же процедура очистки может следовать для очистки белкового субстрата с некоторыми изменениями. Белок должен быть ацетилированный, прежде чем он может быть использован для анализа деацетилирования, что означает, что он должен быть очищен в клетках с гиперэкспрессией специфическую ацетилтрансферазы или смесь шляп, способных ацетилировани белок. С помощью процедуры очистки , описанной в разделе 1.2, ацетилированный белок может быть очищен (Фиг.1В, верхний). Для того, чтобы подтвердить , что белок действительно ацетилированный и могут быть использованы для анализа дезацетилирования в пробирке, Вестерн - блоттинга с использованием анти антитела Ас-K необходимо показать увеличенные ацетилированные уровни очищенного белка в клетках с гиперэкспрессией ацетил-трансферазы (Фигура 1В, лоур).
После очистки успешного белка, анализ деацетилирования в пробирке может быть выполнена. Сиртуины, в том числе SIRT2, относятся к классу III деацетилазы гистонов лизина , которые отличаются от других деацетилазами , поскольку они требуют NAD + для их ферментативной функции. В соответствии с этим, ни одна деацетилирования не может быть обнаружено с помощью Вестерн - блоттинга с использованием антитела анти Ас-K в отсутствие НАД +, независимо от присутствия каталитически активного SIRT2 (рисунок 2, полоса 2 против 1). Напротив, снижение ацетилированные уровни ацетилированного белка , когда оба SIRT2 и NAD + , присутствующие в реакции позволяют предположить , что белок может рассматриваться в качестве мишени для деацетилирования SIRT2. Для проверки этих результатов, могут быть использованы различные негативные контроли. Например никакой разницы в уровнях дезацетилирования белка не может быть обнаружен , когда деацетилирования дефицитных SIRT2 (SIRT2 H187Y) используется вместо каталитически активного дикого типа SIRT2 (рисунок 2, дорожка 5 против 4). Подобный эффект можно наблюдать, когда хорошо установленный ингибитор Sirtuin, NAM, добавляют к реакционной смеси, что предполагает, что снижение ацетилированный уровни белка опосредована деацетилаз активностью SIRT2.
Ненормальная деацетилирования участвует в ряде клеточных процессов и заболеваний, связанных с возрастом. Таким образом, важным шагом в углублении наших знаний о взаимосвязи между деацетилаз и его субстратом является установление эту взаимосвязь в клетках, где это явление может иметь физиологическое воздействие. Кроме того, проверка дезацетилирование в системах клеточных культур в естественных условиях позволяет исследовать события дезацетилирования в конкретной ячейке или тканевой контекст , который может быть более легко подключены к определенному фенотипу или результата. Это исключает возможность того, что обнаруженный в пробирке DEACetylation активность искусственно из-за присутствия обоих деацетилаз и его субстрата в трубе в то же самое время, которое может никогда не произойти в нормальных физиологических условиях в клетках. Для анализа дезацетилирования в естественных условиях, клетки , избыточно экспрессирующие как SIRT2 и SIRT2 H187Y, а также белковый субстрат может быть использован в соответствии с процедурами , описанными в разделе 2.1 и 2.2. Клеточные экстракты , полученные из этих клеток , может быть подтверждено , чтобы выразить SIRT2, SIRT2 H187Y, и белковый субстрат с помощью Вестерн - блоттинга с использованием специфических антител. В исследовании , описанном здесь, все экзогенно выраженные белки помечены для простоты проведенных экспериментов (рис 3, нижняя панель для обнаружения HA-меченый SIRT2 / SIRT2 H187Y и средняя панель для обнаружения Flag-меченый субстрат белка). Для того, чтобы определить, белок-мишень, является ли деацетилирования субстрат SIRT2, иммунопреципитация проводится с использованием антитела анти-Flag рушить целевого белка Followed с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти Ас-K. Снижение ацетилированный уровней белка в клетках , экспрессирующих SIRT2 (рис 3 верхняя панель, полоса 3 против 2) и неспособность влиять на ацетилированные уровни в клетки , экспрессирующие дезацетилазы дефицитный SIRT2 мутант (рис 3 верхняя панель, полоса 4 против 3) свидетельствуют о том , что ацетилированный белок может быть мишенью деацетилирования специфического деацетилаз в естественных условиях. Это может быть подтверждено дополнительно , когда SIRT2 опосредованной деацетилирования тормозится после обработки клеток с NAM (рисунок 3 верхней панели, дорожка 5 против 3) , устанавливающего конкретные оси деацетилаза-подложки в исследованных клетках.
Рисунок 1: Очистка как деацетилаз и ацетилированного белка-субстрата , которые будут использоваться для экстракорпорального дезацетилирования пробирного. (A) 1 мкг как SIRT2 и SIRT2 H187Y (деацетилирования дефектным мутантным) проводили на геле следующий протокол очистки , как описано в пункте 1.1. Гель окрашивали с помощью коммерчески доступного красящим раствором и после того, как Обесцвечивание, как очищенные белки могут быть обнаружены (верхний). Белки могут быть обнаружены после переноса в PVDF мембрану и вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Flag (ниже). (В) 1 мкг белкового субстрата и гипер ацетилированный белкового субстрата (альфа-энолаза использовали в качестве субстрата SIRT2 на основе масс - спектрометрии неопубликованные данные , полученные в нашей лаборатории) были выполнены на геле следующий протокол очистки , как описано в разделе 1.2. Гель окрашивали с помощью коммерчески доступного красящим раствором и после того, как Обесцвечивание, очищенный белковый субстрат может быть обнаружен (верхний). Ацетилирование может быть обнаружен после переноса в PVDF мембрану и вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Ac-K (средний). Общая р roteins могут быть обнаружены с помощью анти-Flag антитела (ниже). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. В пробирке пробирного дезацетилирования Очищенная ацетилированный белок субстрат (альфа-энолаза) инкубируют с SIRT2 или SIRT2 H187Y (деацетилирования дефектным мутантным) в присутствии NAD + (дорожки 4 и 5). Уменьшенные ацетилированные уровни обнаруживаются с помощью Вестерн - блоттинга с использованием антитела анти Ас-K в присутствии SIRT2 но не в присутствии SIRT2 H187Y (дорожка 4 против 5). Не наблюдали деацетилирования активность при NAD + , не входит в реакционной смеси (дорожка 2 против 4) , или когда NAM добавляют к реакционной смеси (дорожка 6 против 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. In vivo на клетках HEK293T деацетилирования анализ стабильно избыточно экспрессирующих либо SIRT2 или SIRT2 H187Y котрансфицируют с белковым субстратом (альфа-энолазы) и шапочек увеличить ацетилированный уровни белка (дорожка 2 против 1). Деацетилирование была проверена в естественных условиях после иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag , чтобы спустить субстрат белка и Вестерн - блоттинга с использованием анти антитела Ac-K. Ацетилирование значительно уменьшилась в клетках с гиперэкспрессией SIRT2 по сравнению с SIRT2 H187Y гиперэкспрессией клеток (дорожка 3 VS 4). SIRT2-опосредованной деацетилированиясубстрата белка тормозится , когда клетки обрабатывают NAM (дорожка 5 против 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Реакции | 1 | 2 | 3 | 4 ( по желанию) | 5 ( по желанию) |
| очищенный ацетилированный белок-субстрат (10 мкг) | + | + | + | + | + |
| буфер В | + | + | + | + | + |
| Очищенный SIRT2 (2 мкг) | - | + | + | - | + |
| NAD + (1 mΜ) | - | - | + | + | + |
| Очищенный SIRT2 H187Y (2 мкг) | - | - | - | + | - |
| NAM (10 мМ) | - | - | - | - | + |
Таблица 1: Реакционные ингредиенты.
| образцы | избыточная экспрессия | сбить |
| 1 | PCDH-Puro-GFP-пустой вектор | pLKO1 пустой вектор или си СУУ |
| 2 | PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag | pLKO1 Ш. SIRT2 1 или си SIRT2 1 |
| 3 | PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag | pLKO1 Ш. SIRT2 2 или си SIRT2 2 |
Таблица 2: Белковые образцы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Описанный здесь проект был поддержан грантом NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), а также Роберт Х. Лурье Comprehensive Cancer Center - Lefkofsky Family Foundation / Лиз и премии Эрик Lefkofsky инновационных исследований А. В. Мы хотели поблагодарить сотрудников лаборатории (Кэрол o'Callaghan и Элизабет Энн Wayne) для критического чтения и редактирования рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture dishes | Denville Scientific Inc. | T1110 and T1115 | |
| pCDH-puro-GFP lentiviral vector | System Biosciences | CD513B-1 | |
| pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) | Addgene | 8455 | |
| pCMV-VSV-G (envelope vector) | Addgene | 8454 | |
| polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 24885 | other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells |
| 0.22 μm filters | Denville Scientific Inc. | F5512 | |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| fluorescent microscope | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | Axiovert 200 | |
| puromycin | Invivogen | A11138-03 | |
| PBS | Corning | 21-031-CM | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F3165 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| EGTA | Sigma | 34596 | |
| protease inhibitors coctail 100x | Biotool | B14001 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | T8552 | selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins) |
| anti-Flag agarose beads | Sigma | A2220 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| rotator | Thermo Scientific | 415220Q | |
| filter tubes | Millipore | UFC30HV00 | |
| Flag peptide | Sigma | F3290 | |
| Vivaspin Centrifugal Concentrator | Sartorius Stedim Biotech S.A. | VS0102 | |
| SimplyBlue SafeStain solution | Invitrogen | LC6060 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Techologies | NP0007 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | T5941 | |
| NAD+ | Sigma | N0632 | required cofactor for sirtuins |
| nicotinamide (NAM) | Sigma | 72340 | selective inhibitor class III HDACs (sirtuins) |
| pLKO.1 lentiviral vector | Addgene | 8453 | |
| SIRT2 si RNA | Qiagen | GS22933 | |
| anti-SIRT2 antibody | Proteintech | 15345-1-AP | |
| Bradford protein assay | BIO-RAD | 500-0006 | |
| anti Ac-K agarose beads | Immunechem | ICP0388 |
References
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
- Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
- Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
- Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
- L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
- Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
- Smith, K. T., Workman, J. L.
- Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D.
- Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
- Anderson, K. A., Hirschey, M. D.
- Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
- Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
- Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
- Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
- Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
- Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
- Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
- Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e51682 (2014).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).
