Protocol
체외 탈 아세틸 분석 1.
- SIRT2의 정제
- 10 % FBS와 항생제 8 ML의 DMEM에서 배양하고 70 % 합류 다음날로 37 ° C, 5 % CO 2 조직 배양 인큐베이터에서 배양하는 HEK 293T 세포를 10㎝ 배양 플레이트를 준비한다.
- 다음 날, 공동 트랜 4 μg의 pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2-국기 (우리의 실험실에서 만든 lentivector), 4 μg의 pCMV- dR8.2 dvpr (포장 벡터) 0.5 μg의을 pCMV-VSV-G (봉투 벡터) 3 μL PEI / μg의 DNA의 비율 18 사용 폴리에틸렌 이민 (PEI).
- 12 시간 후 미디어를 변경합니다.
- 36-48 시간 후 상층 액을 수집합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 이물질을 제거합니다.
- 0.22 μm의 필터를 통해 여과 한 후, SIRT2의 렌티 바이러스 1 ml의 분취 량을 -80 ℃에서 보관하십시오.
- 바이러스를 사용하지 않는 경우에 녹여 얼음 SIRT2 렌티은 (는 -80 ° C에서 바이러스를 저장하는 것이 중요).
- 8 μg의 / ㎖의 폴리 브렌의 존재 렌티 1 ㎖로 80~90% 합류 된 HEK 293T 세포를 6 웰 플레이트를 감염시킨다.
- 다음 날 (24 시간)까지 37 ° C 배양기에서 바이러스에 감염된 세포를 놓습니다.
- 24 시간 후 배지를 교체합니다.
- 감염 후 48 시간은 형광 현미경으로 GFP를 양성 세포를 감지하여 감염의 효율성을 확인합니다.
- 감염 효율이 좋은 경우에 (적어도 40-50% 감염된 세포)은 배양 배지를 세포를 발현하는 안정적인 SIRT2 대한 선택이 μg의 / ml의 퓨로 마이신을 함유하는 배지를 교체한다.
주 :이 약 2 주가 소요 및 배지를 3-4 일마다 변경된다. 비 감염된 세포는 SIRT2의 렌티 바이러스 성장을이 선택 기간에만 감염된 세포를 통해 죽는다. - 을 정제를 시작하기 전에 10 % SDS-PAGE 겔상에서 총 단백질 40 μg의 실행 후 (1000 희석 1) 항 - 플래그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 플래그 - 태그 SIRT2 발현 분석ication 과정 (권장) 19, 20.
- 1 활성 SIRT2, 분할 세포를 정화하려면 안정적으로 국기 - SIRT2를 과발현 HEK 293T 세포의 충분한 요리를하기 위해 트립신 3 비율 (텐 10cm 요리 후속 실험에 대한 충분한 단백질의 정제를 수 있습니다).
- 상기 세포를 Trypsinize 배지를 제거하고 멸균 DPBS로 세포를 세척하여 잔류 혈청을 제거하기 위해. 천천히, 세포 단층을 포함 30 ~ 45 초 동안 상온에서 부화 0.25 % 트립신 - EDTA 용액 2.5 ml를 추가합니다. 세포가 분리 시작할 때까지 트립신 - EDTA 용액을 제거한 후, 37 ° C에서 품어. 그런 문화 매체를 추가하고 새로운 요리에 세포를 전송합니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 트립신 처리하여 세포를 PBS로 두 번 세포를 씻어 수집, 배지를 제거합니다.
- 500 ㎕의 용해 완충액 (20 mM의 HEPES pH가 7.9, 18 mM의 KCl을 0.2 mM의 EGTA, 1.5 밀리미터의 MgCl 2를 Lyse 세포 펠렛, 프로테아제 억제제 칵테일과 일정한 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 1 μM TSA를 포함하여 20 % 글리세롤, 0.1 % NP-40).
- 새로운 튜브 15 4 ° C에서 최소 및 전송 상층 액 14,000 XG에 원심 분리기.
- 후술하는 바와 같이 아가 로스 비드를 결합하는 항 - 플래그 항체를 사용하여 면역 침전 법을 수행한다.
- 단백질 분해물 (10 ~ 20 mg의 총 단백질)에 구슬 아가로 오스 복합 안티 - 플래그 항체의 200 ~ 300 μl를 추가합니다.
- 일정한 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 품어.
- 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 immunoprecipitates를 수집합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 펠렛을 10 ml의 용해 버퍼 5 회 반복한다. 각 세척 한 후, 비드 펠렛 및 버퍼 A.으로 뜨는 교체
- (프로테아제 억제제 칵테일 1 PBS에서 μm의 TSA 포함) 1 배 플래그 펩타이드 솔루션을 준비합니다.
- 1 배 플래그 peptid 500 μl를 추가아가로 오스 비즈에 전자 솔루션 및 일정 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
- 4 ℃에서 2 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 상층 액을 수집합니다.
- 앞의 두 단계를 반복합니다.
- 4 ° C에서 1 분 동안 15,000 XG에 필터 튜브와 원심 분리를 이용하여 상층 액에서 구슬을 제거합니다.
- 최종 단백질 농도를 1 μg의 때까지 / 한외 여과막을 사용하여 용출 μL 샘플을 농축시킨다.
- 용출 된 시료의 1 μg의를 사용하여 수행하는 전기 영동으로 정제 과정을 확인합니다.
- 시중에서 판매하는 염색 액에 얼룩 젤 SIRT2 정화를 확인합니다.
- -80 ° C에서 정제 SIRT2을 유지합니다.
- 아세틸 단백질 기판의 정제
- 약 70 %의 합류 다음날로 HEK의 293T 세포를 10 ㎝의 배양 접시를 준비합니다.
- 국기의 5 μg의와 다음 날, 공동 트랜 세포는 플라스미드 벡터 expressin 태그g 단백질 기질뿐만 아니라 3 μL PEI / μg의 DNA의 비율로 PEI를 사용하여 단백질의 아세틸 화 수 특정 아세틸 트랜스퍼 5 μg의.
주 : 특정 아세틸 트랜스퍼 라제는 공지되어 있지 않은 경우, 예컨대 P300, CBP, GCN5, Tip60과 PCAF 공지 히스톤 아세틸 트랜스퍼 (HAT들)의 혼합물로 공동 트랜. - 12 시간 후 매체를 변경합니다.
- 일 세포를 용해시키기 전에, 아세틸 라제를 억제하여 단백질 - 기재의 아세틸 화 수준을 극대화하는 TSA / NAM을 포함하는 배지로 배양액을 대체하여 밤새 1 μM의 TSA 2 mM의 니코 티나 마이드 (NAM)로 세포를 처리한다.
- 48 시간 형질 전환 한 후, 배지를 제거 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 트립신으로 세포를 PBS로 두 번 세포를 씻어 수집합니다.
- 접시 당 500 ㎕의 용해 완충액에 세포를 Lyse 펠릿 (20 mM의 HEPES pH가 7.9, 18 mM의 KCl을 0.2 mM의 EGTA, 1.5 mM의 MgCl2를, 20 % 글리세롤, 0.1 % NP-40) 프로테아제 I을 포함nhibitors 칵테일, 1 μM의 TSA와 일정한 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 2 MM의 NAM.
- 새로운 튜브 15 4 ° C에서 최소 및 전송 상층 액 14,000 XG에 원심 분리기.
- 후술하는 바와 같이 아가 로스 비드를 결합하는 항 - 플래그 항체를 사용하여 면역 침전 법을 수행한다.
- 단백질 분해물 (10 ~ 20 mg의 총 단백질)에 구슬 아가로 오스 복합 안티 - 플래그 항체의 200 ~ 300 μl를 추가합니다.
- 일정한 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 품어.
- 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 immunoprecipitates를 수집합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 펠렛을 10 ml의 용해 버퍼 2 회 반복한다. 각 세척 한 후, 비드 펠렛 및 용해 버퍼 A.으로 뜨는 교체
- 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에서 NAM없이 펠렛을 10 ml의 용해 버퍼 3 회 반복한다. 각 세척 한 후, 비드 펠렛 및 그것은 importa이다 용해 버퍼 A.으로 뜨는 교체NT를 탈 아세틸 화 반응에 대한 NAM를 이월 할 수 없습니다.
- (단백질 분해 효소 억제제와 PBS에서 1 μM TSA 포함) 1 배 플래그 펩타이드 솔루션을 준비합니다.
- 아가로 오스 비즈로 1 배 플래그 펩티드 용액 500 μl를 추가하고 일정한 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
- 4 ℃에서 2 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 상층 액을 수집합니다.
- 앞의 두 단계를 반복합니다.
- 4 ° C에서 1 분 동안 15,000 XG에 필터 튜브와 원심 분리를 이용하여 상층 액에서 구슬을 제거합니다.
- 단백질 농도를 1 μg의 / UL 때까지 한외 여과막을 사용하여 용출 샘플을 농축시킨다.
- 4-12 % SDS-PAGE 겔상에서 용출 시료 1 μL를 실행하여 전기 영동을 수행한다.
- (1,000 희석 1) 단백질 기판 (희석 사용되는 특정 항체에 따라 다름) 서부 AC-K에 대한 항체를 사용하여 블로 팅에 의해 단백질 기판의 아세틸 화를 확인합니다.
- 푸리 유지들이었다는 -80 ° C에서 단백질 기판을 아세틸.
- 체외 탈 아세틸 반응
- 탈 아세틸 버퍼 B를 준비 (에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 1 ㎜의 MgCl 2 0.5 μM TSA)
- 20 ㎕의 최종 부피 (표 1)에 서로 다른 튜브에 3 개의 다른 반응을 준비합니다.
- (선택 사항) SIRT2에 의해 단백질 기판의 탈 아세틸를 확인하기 위해 추가 반응을 포함합니다. (NAM 대신 아세틸 라제 활성 SIRT2의 반응 (pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 H187Y -flag의 lentivector 사용 후이 1.1에 기술 된 프로토콜을 사용하여 수행 할 수 있습니다) 정제 탈 아세틸 널 (null) 돌연변이 SIRT2의 2 μg의 추가 또는 10 밀리미터에게 니코틴을 추가 ) SIRT2의 탈 아세틸 화 활성을 억제하는 반응 (표 1).
- 일정하게 교반하면서 30 ℃에서 3 시간 동안 반응을 품어.
- F 배 샘플 완충액 20 μl를 첨가하여 반응을 정지하고, 샘플을 비등또는 95 ℃에서 10 분.
- 4-12 % SDS-PAGE 겔상에서 반응 혼합물을 실행하여 전기 영동을 수행하고 항 AC-K 항체 (1 : 1000 희석)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 단백질 기판의 아세틸 화 상태를 검출 19,20한다.
생체 탈 아세틸 분석 2.
- 배양 된 세포에서 과발현 SIRT2
- HEK의 293T 세포와 10cm 배양 접시 안정적으로 pCDH - 순수하지 않아-GFP-빈 벡터를 과발현을 준비 pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 - 플래그 및 pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 H187Y -flag는 (1.1에서 설명) 70 일합니다 %의 합류.
- 대안 적으로, 세포를 약 70 % 합류로 10cm 배양 접시를 준비하고, 3 μL PEI / μg의 DNA의 비율로 PEI를 사용하여 상기 언급 한 벡터 5㎍을 사용하여 일시적 과발현을 수행한다.
- 국기-t의 과발현을 입증 (1,000 희석 1) 안티 - 플래그 항체를 이용하여 총 세포 추출물의 서쪽 블로 팅을 수행SIRT2 19 agged.
- 배양 된 세포의 최저 SIRT2에 RNA 간섭
- 약 70 % 합류 다음날으로 HEK 293T 세포에의 10㎝ 배양 플레이트를 준비한다.
- 다음 날, 공동 트랜 4 μg의 pLKO1 - 순수하지 않아 - 쉬 SIRT2 (lentivector) 19, 4 μg의 pCMV- dR8.2 dvpr (포장 벡터) 0.5 μg의을 pCMV-VSV-G (봉투 벡터) 18 사용 폴리에틸렌 이민 (PEI) 3 μL PEI / μg의 DNA가 비율.
참고 : SIRT2을 쓰러 뜨린를 들어, 우리가 RNAi의 컨소시엄 (TRC)가 설계 한 pLKO.1의 렌티 바이러스 벡터에 간단한 머리핀 shRNA를 사용합니다. - shSIRT2의 렌티 바이러스를 생산하고 SIRT2를 넉다운하는 표적 세포를 감염 1.1에 설명 된대로 절차를 따르십시오.
- 10 % SDS-PAGE 겔에 총 단백질의 40 μg의를 실행 한 후 효율적인 SIRT2 최저를 보여 (1,000 희석 1) 항 SIRT2 항체를 이용하여 총 세포 추출물의 웨스턴 블로 팅을 수행합니다.
- 또한,세포를 약 70 %의 합류로 10cm 문화 요리를 준비하고 제조업체의 지침에 따라 siRNA를를 사용 SIRT2의 과도 최저를 수행합니다.
- 10 % SDS-PAGE 겔에 총 단백질의 40 μg의를 실행 한 후 효율적인 SIRT2 최저를 보여 (1,000 희석 1) 항 SIRT2 항체를 이용하여 총 세포 추출물의 웨스턴 블로 팅을 수행합니다.
- 면역 및 면역 블 롯팅은 배양 세포에서 아세틸 레벨을 감지하는
- 12 시간 SIRT2를 과발현하거나 세포에서 세포 펠렛을 수집하기 전에 비 클래스 III 히스톤 아세틸 라제를 억제하는 배양 배지에 1 ㎛ TSA를 추가, (위의 2.1 참조) SIRT2 세포 (위 2.2 참조)를 무너 뜨렸다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 트립신 처리하여 세포를 PBS로 두 번 세포를 씻어 수집, 배지를 제거합니다.
- 10 ml의 용해 완충액 (20 mM의 HEPES pH가 7.9, 18 mM의 KCl을 0.2 mM의 EGTA, 1.5 추가밀리미터의 MgCl 2, 20 % 글리세롤, 프로테아제 억제제 칵테일, 1 μM의 TSA 2 MM의 NAM을 포함하여 0.1 % NP-40).
- 일정한 회전에서 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 4 ℃에서 15 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 상층 액을 수집합니다.
- 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 계산한다.
- 참고로 용해 완충액 A를 사용하여 표 2를 사용하여 1 ㎖의 최종 부피에서 새로운 전송 튜브 전체 단백질 1 mg의 하나 또는 과발현 SIRT2 SIRT2 최저 후의 세포로부터 단백질 샘플을 제조 하였다.
- 단백질 A / G와 함께 특정 단백질 기판에 대한 항체를 사용하여 면역 침전을 수행합니다 (40 μl의 비드 슬러리 권장). 또한, 모든 아세틸 화 단백질을 면역 침전에 구슬을 아가로 오스 복합 항 AC-K 항체 (20 μl의 비드 슬러리는 일반적으로 충분하다)를 사용합니다.
- 정전류 회로에서 4 ° C에서 샘플을 품어NT를 회전 하룻밤.
- 4 ℃에서 2 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 immunoprecipitates를 수집합니다.
- 4 ° C에서 2 분 동안 1,000 XG에 구슬 1 ml의 버퍼와 5 회 반복한다.
- 배 샘플 버퍼의 40 μL에 재현 탁 구슬.
- 95 ° C에서 10 분 동안 삶아 샘플.
- 용출 샘플을 전송하는 동안 구슬을 방해하지 않고 4-12 % SDS-PAGE 겔에 용출 된 샘플 (단계 2.3.12에서 40 μl를) 실행하여 전기 영동을 수행합니다.
- 단백질 기질에 특이적인 항체는 면역에 사용 된 경우 (1000 희석 1), 또는 단백질이 기판에 대해 특정 항체 (위한 권장 사항을 방지 AC-K 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 단백질 기판의 아세틸 화 수준을 감지 안티 AC-K 비드 면역에 사용 된 경우에 대하여 특이 적 항체 희석).
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Representative Results
단백질을 위해 시험 관내 및 생체 내 탈 아세틸 분석 모두에서 탈 아세틸 화 활성을 갖는 임의의 효소를 탈 아세틸 적법한 대상으로서 취급 할 아세틸 라제 및 기판 사이의 상호 작용을 확립하기 위해 수행 될 필요가있다. 분석이 완료되기 전에 시험 관내 아세틸 라제 분석을 위해, 아세틸 라제 및 아세틸 단백질 기질 모두의 정제가 필요하다. 여기에서 우리는 특정 아세틸 라제 공부 할로 세포질 시르 투 SIRT2를 사용합니다. SIRT2 고도로 아세틸 화 분석을위한 음성 대조구로 추천 아세틸 라제 효소 및 아세틸 라제 활성이 결여 변이주의 사용이다. 1.1에 기재된 정제 과정을 사용하여, SIRT2 및 SIRT2 H187Y 모두 성공적 1 μg의 / μL의 최종 농도로 정제 할 수있다. 이는 염색 하였다 겔상에서 정제 된 단백질을 실행 한 후에 확인할 수있다뿐만 아니라 SIRT2와 SIRT2 H187Y 모두 플래그 펩타이드 (그림 2A, 낮은) 태그 때문에 서쪽 블로 팅 후 안티 - 플래그 항체를 이용하여 (위 그림 1A). 같은 정제 과정을 일부 수정을 단백질 기질의 정제 하였다 될 수있다. 단백질이 그것이 특정 아세틸 트랜스퍼 또는 단백질 아세틸 수 모자 혼합물을 과발현하는 세포를 정제 할 필요가 있다는 것을 의미 탈 아세틸 화 분석에 사용될 수 있기 전에 아세틸 화 될 필요가있다. 1.2에 기재된 정제 방법을 사용하여 아세틸 화 단백질 (상부도 1b)로 정제 할 수있다. 단백질이 실제로 아세틸 및 체외 탈 아세틸 화 분석에 사용될 수 있음을 확인하기 위해, 항 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블 롯팅은 아세틸 트랜스퍼 (도 1b를 과발현하는 세포의 정제 된 단백질의 증가 된 아세틸 화 수준을 표시 할 필요가 있고, 로우아르 자형).
성공적인 단백질 정제 후, 탈 아세틸 화 시험 관내 분석을 수행 할 수있다. SIRT2 포함 시르 투 인은, 그들이 효소 기능을 위해 NAD +를 필요로 다른 아세틸 라제 구별되는 클래스 III 히스톤 라이신 아세틸 라제입니다. 이와 일관되게, 더 탈 아세틸 화는, NAD +의 부재 하에서 안티 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출 할 수없는 관계없이 촉매 활성 SIRT2의 존재 (도 2 대, 2 레인 1). 반대로 SIRT2 및 NAD + 모두 반응에 존재 단백질 SIRT2위한 탈 아세틸 타겟으로 간주 될 수 있다는 제안 아세틸 단백질의 아세틸 화 수준을 감소시켰다. 이러한 결과를 검증하기 위하여, 다른 음성 대조군이 이용 될 수있다. 예를 들어 단백질의 아세틸 화 수준에 차이가 검출되지 않을 때 탈 아세틸 결핍 SIRT2 (SIRT2 H187Y))은 4 대 대신에 촉매 활성 야생형 SIRT2 (도 2, 레인 5 사용된다. 노포 시르 투 억제제 NAM은 단백질의 아세틸 화 수준의 감소가 SIRT2 아세틸 라제의 활성에 의해 매개되는 것을 암시 반응 혼합물에 첨가시 동일한 효과를 볼 수있다.
비정상적인 탈 아세틸 화는 여러 세포 프로세스 및 노화 관련 질병에 참여하고있다. 따라서, 아세틸 라제 및 기판 사이의 상호 작용에 관한 우리 지식을 심화 중요한 단계는 이러한 현상이 생리적 영향을 미칠 수있다 셀이 상호 접속을 확립하는 것이다. 또한, 생체 내에서 세포 배양 시스템에서의 탈 아세틸 화를 확인하기 쉽게 특정 표현형 결과에 연결될 수있다 세포 또는 조직에 특정 콘텍스트 탈 아세틸 이벤트의 조사를 허용한다. 이 시험 관내에서 검출 딕 가능성을 배제etylation 활동으로 인한 정상 세포의 생리 학적 조건하에 발생하지 않을 수있다 아세틸 라제 동시에 튜브 기질 모두의 존재 인공이다. 생체 내 탈 아세틸 분석 들어 SIRT2 및 SIRT2 H187Y뿐만 아니라 단백질 기질 모두 과발현 세포를 2.1 및 2.2에 기술 된 절차에 따라 사용될 수있다. 이들 세포로부터 제조 된 세포 추출물을 SIRT2, SIRT2 H187Y 표현 확인 될 수 있고, 웨스턴 블 롯팅에 의해 단백질 기질은 특이 적 항체를 사용. 여기에 설명 된 분석에서 모든 외생 발현 된 단백질은 (HA-태그 SIRT2가 / SIRT2 H187Y 및 중간 패널의 국기 태그가 단백질 기판을 감지하는 감지하는 그림 3, 낮은 패널)의 실험의 편의를 위해 태그가 지정됩니다. 표적 단백질의 탈 아세틸 SIRT2 기판인지를 결정하기 위해 면역 대상 단백질 (F)를 풀다운 방지 플래그 항체를 사용하여 수행안티 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 ollowed. SIRT2를 발현하는 세포에서의 단백질의 아세틸 화 수준을 감소하는 것이 제안 (3 대도 3 상판, 레인 4) (도 3 상판, 레인 3 대 2) 세포에서 아세틸 화 수준에 영향을 미치는 고장 아세틸 라제 결손 SIRT2 변이체를 발현 아세틸 화 단백질은 생체 내에서 특정의 탈 아세틸 라제의 대상이 될 수있다. SIRT2 매개 탈 아세틸이 연구 셀 (도 3 상판 레인 5 대 3)과 NAM 특정 아세틸 라제 기판 축을 설정을 처리 한 후 세포를 저해 때 더 확인할 수있다.
도 1 및 아세틸 라제 단백질 기질 모두 정제 관내 탈 아세틸 화 분석에 사용될. (A) 및 SIRT2 SIRT2 H187Y (탈 아세틸 결함 돌연변이) 모두 1 μg의 1.1에 기재된 바와 같이 정제 프로토콜 다음 겔상에서 실행 하였다. 겔 시판 염색 액으로 탈색 및 염색 한 후, 정제 된 단백질 양 (위)를 검출 할 수있다. 단백질은 항 - 플래그 항체 (저급)를 사용하여 PVDF 막 및 웨스턴 블롯에 전사 한 후 검출 될 수있다. (B) 단백질 기판 하이퍼 아세틸 화 된 단백질 기질 1 μg의 1.2에 기재된 바와 같이 정제 프로토콜 다음 겔상에서 실행 하였다 (알파 -에 놀라 우리 실험실에서 생성 된 질량 분석 미발표 데이터에 기초 SIRT2 기판으로 사용 하였다). 겔 시판 염색 액으로 염색하고, 탈색 후 정제 된 단백질 기판 (위)를 검출 할 수있다. 아세틸 화는 안티 AC-K 항체 (중간)을 사용하여 PVDF 막 및 웨스턴 블롯에 전사 한 후 검출 될 수있다. 총 페이지 roteins이 방지 플래그 항체 (아래)를 사용하여 검출 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 탈 아세틸 관내 분석에서 정제 된 단백질의 아세틸 화 된 기판 (알파 -에 놀라 제)를 NAD +의 존재 또는 SIRT2 SIRT2 H187Y (탈 아세틸 결함 돌연변이)로 배양된다 (레인 4 및 5). 감소 아세틸 레벨 SIRT2의 존재하지만 SIRT2 H187Y의 존재 (레인 4 대 5)에 반 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블 롯팅에 의해 검출된다. NAD +는 반응 혼합물에 포함되어 있지 않은 경우 어떠한 탈 아세틸 화 활성이 관찰되지 않는다 (레인 2 대 4) 또는 NAM을 반응 혼합물에 첨가되는 경우 (레인 6 대 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. 안정적 SIRT2 또는 SIRT2 H187Y를 과발현하는 생체 탈 아세틸 분석 HEK293T 세포 단백질 (레인 2 대 1)의 아세틸 화 수준을 증가시키는 단백질, 기판 (알파 -에 놀라 제)와 모자와 공동 형질 감염시켰다. 탈 아세틸 화는 안티 AC-K 항체를 이용하여 단백질 기판과 서쪽 블로 팅을 끌어 방지 플래그 항체를 이용하여 면역 침전 후 생체 내에서 조사 하였다. 아세틸 상당히 과발현 세포 SIRT2 H187Y에 비해 SIRT2 과발현 세포에서 감소된다 (레인 3 대 4). SIRT2 매개 탈 아세틸 화세포 NAM. (3 대 레인 5)로 처리하면 단백질 기판이 억제된다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 반응 | 1 | (2) | 삼 | 4 (선택 사항) | 5 (선택 사항) |
| 정제 된 아세틸 화 단백질 기판 (10 μg의) | + | + | + | + | + |
| 버퍼 B | + | + | + | + | + |
| 정제 SIRT2 (2 μg의) | - | + | + | - | + |
| NAD + (1 mΜ) | - | - | + | + | + |
| 정제 SIRT2의 H187Y (2 μg의) | - | - | - | + | - |
| NAM (10 밀리미터) | - | - | - | - | + |
표 1 : 반응 재료입니다.
| 견본 | 과발현 | 다운 |
| 1 | pCDH - 순수하지 않아-GFP-빈 벡터 | pLKO1 빈 벡터 또는시의 클릭률 (CTR) |
| (2) | pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2-국기 | pLKO1 쉬 SIRT2 1시 SIRT2 1 |
| 삼 | pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 H187Y -flag | pLKO1 쉬 SIRT2 2시 SIRT2 2 |
표 2 : 단백질 샘플.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는하고 싶은 AV로 Lefkofsky 가족 재단 / 리즈와 에릭 Lefkofsky 혁신 연구 상 - 여기에 설명이 프로젝트는 NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1)에서 부여에 의해뿐만 아니라 로버트 H. 루리 종합 암 센터 지원 중요한 읽기와이 원고를 편집하기위한 실험실의 구성원 (캐롤 O'Callaghan와 엘리자베스 앤 웨인) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture dishes | Denville Scientific Inc. | T1110 and T1115 | |
| pCDH-puro-GFP lentiviral vector | System Biosciences | CD513B-1 | |
| pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) | Addgene | 8455 | |
| pCMV-VSV-G (envelope vector) | Addgene | 8454 | |
| polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 24885 | other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells |
| 0.22 μm filters | Denville Scientific Inc. | F5512 | |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| fluorescent microscope | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | Axiovert 200 | |
| puromycin | Invivogen | A11138-03 | |
| PBS | Corning | 21-031-CM | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F3165 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| EGTA | Sigma | 34596 | |
| protease inhibitors coctail 100x | Biotool | B14001 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | T8552 | selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins) |
| anti-Flag agarose beads | Sigma | A2220 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| rotator | Thermo Scientific | 415220Q | |
| filter tubes | Millipore | UFC30HV00 | |
| Flag peptide | Sigma | F3290 | |
| Vivaspin Centrifugal Concentrator | Sartorius Stedim Biotech S.A. | VS0102 | |
| SimplyBlue SafeStain solution | Invitrogen | LC6060 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Techologies | NP0007 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | T5941 | |
| NAD+ | Sigma | N0632 | required cofactor for sirtuins |
| nicotinamide (NAM) | Sigma | 72340 | selective inhibitor class III HDACs (sirtuins) |
| pLKO.1 lentiviral vector | Addgene | 8453 | |
| SIRT2 si RNA | Qiagen | GS22933 | |
| anti-SIRT2 antibody | Proteintech | 15345-1-AP | |
| Bradford protein assay | BIO-RAD | 500-0006 | |
| anti Ac-K agarose beads | Immunechem | ICP0388 |
References
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