Protocol
1. במבחנה Deacetylation Assay
- טיהור SIRT2
- הכינו צלחת תרבות 10 ס"מ של תאים HEK 293T בתרבית DMEM 8 מ"ל עם 10% FBS ו אנטיביוטיקה הגדלים בתרבית רקמה החממה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 להיות כ -70% ומחוברות למחרת.
- למחרת, שיתוף transfect 4 מיקרוגרם pCDH-פורו-GFP-SIRT2-דגל (lentivector שנעשו במעבדה שלנו), 4 מיקרוגרם pCMV- dR8.2 dvpr (וקטור אריזה) ו -0.5 מיקרוגרם pCMV-VSV-G (וקטור המעטפה) 18 באמצעות polyethylenimine (PEI) לפי יחס של 3 μl DNA PEI / מיקרוגרם.
- שינוי התקשורת לאחר 12 שעות.
- איסוף supernatant לאחר 36-48 שעות.
- סור פסול על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
- לאחר סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסננים, לעשות 1 מ"ל aliquots של lentivirus SIRT2 ולשמור ב -80 מעלות צלזיוס.
- lentivirus SIRT2 להפשיר על הקרח (חשוב לאחסן את הווירוס ב -80 מעלות צלזיוס כאשר הנגיף אינו משמש).
- להדביק צלחת 6-גם של תאים 293T HEK ומחוברות 80-90% עם 1 מ"ל של lentivirus בנוכחות polybrene 8 מיקרוגרם / מ"ל.
- מניח תאים נגועים בנגיף בתוך 37 ° C חממה עד למחרת (24 שעות).
- חלף בינוני לאחר 24 שעות.
- 48 שעות לאחר ההדבקה, לבדוק יעילות זיהום על ידי איתור GFP תאים חיוביים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- אם יעילות זיהום הוא טוב (לפחות 40-50% תאים נגועים), להחליף בינוני עם בינוני תרבות המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל puromycin לבחור עבור SIRT2 יציב לאורך לבטא בתאי.
הערה: זה לוקח בערך 2 שבועות, והמדיום מוחלף מדי 3-4 ימים. תאים שאינם נגועים למות על פני תקופת הברירה טבעית תאים נגועים רק עם lentivirus SIRT2 לגדול. - לנתח ביטוי SIRT2 מתויג הדגל ידי מערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי דגל (1: 1,000 דילול) אחרי ריצת 40 מיקרוגרם של חלבון הכולל על ג'ל 10% SDS-PAGE לפני תחילת התחנותתהליך ication (מומלץ) 19,20.
- כדי לטהר SIRT2 הפעיל, תאי פילוג 1: 3 יחס ידי trypsinization כדי שתהיינה מנות מספיקות של תאי HEK 293T overexpressing ביציבות הדגל-SIRT2 (עשר 10 סנטימטרי מנות תאפשרנה טיהור של חלבון מספיק ניסויים מאוחרים יותר).
- כדי trypsinize התאים, להסיר בינוני התרבות ולחסל בסרום שיורית על ידי שטיפת תאים עם DPBS סטרילית. לאט להוסיף 2.5 מ"ל של פתרון 0.25% טריפסין- EDTA כדי לכסות את monolayer תא, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-45 שניות. לאחר הסרת פתרון טריפסין- EDTA, דגירה על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מתחילים לנתק. ואז להוסיף בינוני התרבות ולהעביר תאי מנות חדשות.
- הסר בינוני תרבות, לשטוף תאים פעמיים PBS ולאסוף את התאים על ידי trypsinization ואחריו צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- Lyse התא גלולה ב 500 μl חיץ תמוגה (20 מ"מ HEPES pH 7.9, 18 KCl מ"מ, 0.2 מ"מ EGTA, 1.5 מ"מ MgCl 2, 20% גליצרול, 0.1%-40 NP) כולל קוקטייל מעכבי פרוטאז ו 1 מיקרומטר TSA למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מתחת רוטציה קבועה.
- צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, והעברת supernatant לצינור חדש.
- בצע immunoprecipitation באמצעות נוגדן אנטי הדגל מצומדות כדי agarose חרוזים כמתואר להלן.
- הוסף 200-300 μl של נוגדן anti-Flag מצומדות כדי agarose חרוזים אל lysate חלבון (חלבון הכולל 10-20 מ"ג).
- דגירת הלילה ב 4 ° C עם תסיסה מתמדת.
- אסוף immunoprecipitates על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
- שטפו את הכדור 5 פעמים עם חיץ 10 מ"ל תמוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. לאחר כל שטיפה, גלולת החרוזים ולהחליף את supernatant עם החיץ א
- כן פתרון פפטיד דגל 1x (כולל קוקטייל מעכבי פרוטאזות ו -1 מיקרומטר TSA ב PBS).
- הוסף 500 μl של 1x דגל peptidפתרון e על חרוזי agarose ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מתחת רוטציה קבועה.
- איסוף supernatant על ידי צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
- חזור על שני השלבים הקודמים.
- סר חרוזים מן supernatant באמצעות צינורות לסנן צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C.
- תתרכז מדגם eluted עד ריכוז החלבון הסופי הוא 1 מיקרוגרם / μl באמצעות קרום אולטרה סינון.
- בדוק תהליך טיהור ידי אלקטרופורזה ביצוע באמצעות 1 מיקרוגרם של המדגם eluted.
- ג'ל הכתם עם פתרון מכתים זמינים מסחרית כדי לאשר טיהור SIRT2.
- שמור SIRT2 מטוהרים ב -80 מעלות צלזיוס.
- טיהור acetylated חלבון-המצע
- הכן 10 ס"מ X 10 ס"מ תרבות מנות עם תאים 293T HEK להיות ומחוברות 70% על היום הבא.
- למחרת, תאי transfect שיתוף עם 5 מיקרוגרם של דגל מתויגים expressin וקטור פלסמידg את מצע חלבון וכן 5 מיקרוגרם של אצטיל-transferase הספציפי שיכול acetylate החלבון באמצעות PEI לפי יחס של 3 μl PEI / מיקרוגרם DNA.
הערה: אם אצטיל-transferase ספציפי אינו ידוע, שיתוף transfect בתערובת של-טרנספראז אצטיל היסטון ידוע (כובעים) כגון p300, CBP, GCN5, Tip60 ו PCAF. - שנה בינונית לאחר 12 שעות.
- יום לפני lysing התאים, לטיפול בתאים עם 1 TSA מיקרומטר ו -2 nicotinamide מ"מ (NAM) לילה על ידי החלפת בינוני תרבות עם המדיום המכיל TSA / NAM כדי למקסם את רמות acetylation של המצע-חלבון על ידי עיכוב deacetylases.
- 48 שעות לאחר transfection, להסיר בינוני תרבות, לשטוף תאים פעמיים PBS ולאסוף את התאים על ידי trypsinization ואחריו צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 4 °.
- Lyse התא גלולה ב 500 μl חיץ תמוגה לכל צלחת (20 מ"מ HEPES pH 7.9, 18 mM KCl, 0.2 מ"מ EGTA, 1.5 מ"מ MgCl2, 20% גליצרול, 0.1% NP-40) כולל פרוטאז inhibitors קוקטייל, 1 TSA מיקרומטר ו -2 NAM מ"מ במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מתחת רוטציה קבועה.
- צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, והעברת supernatant לצינור חדש.
- בצע immunoprecipitation באמצעות נוגדן אנטי הדגל מצומדות כדי agarose חרוזים כמתואר להלן.
- הוסף 200-300 μl של נוגדן anti-Flag מצומדות כדי agarose חרוזים אל lysate חלבון (חלבון הכולל 10-20 מ"ג).
- דגירת הלילה ב 4 ° C עם תסיסה מתמדת.
- אסוף immunoprecipitates על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
- שטפו את הכדור 2 פעמים עם חיץ 10 מ"ל תמוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. לאחר כל שטיפה, גלולת החרוזים ולהחליף את supernatant עם חיץ א תמוגה
- שטפו את הכדור 3 פעמים עם חיץ 10 מ"ל תמוגה ללא NAM XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר כל שטיפה, גלולת החרוזים ולהחליף את supernatant עם חיץ א תמוגה זהו importaNT שלא לשאת מעל כל NAM לתגובה deacetylation.
- הכן פתרון פפטיד דגל 1x (כולל מעכבי פרוטאז ו 1 מיקרומטר TSA ב PBS).
- הוסף 500 μl של פתרון פפטיד 1x דגל על חרוזי agarose ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מתחת רוטציה קבועה.
- איסוף supernatant על ידי צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
- חזור על שני השלבים הקודמים.
- סר חרוזים מן supernatant באמצעות צינורות לסנן צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C.
- שימוש קרום אולטרה סינון, להתרכז מדגם eluted עד ריכוז החלבון הוא 1 מיקרוגרם / ul.
- בצע אלקטרופורזה על ידי הפעלת 1 μl של המדגם eluted על ג'ל 4-12% SDS-PAGE.
- אשר acetylation של מצע חלבון על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים נגד Ac-K (1: 1,000 דילול) ואת מצע החלבון (דילול תלוי הנוגדן הספציפי בשימוש).
- שמור פורהfied acetylated-מצע חלבון ב -80 ° C.
- במבחנה Deacetylation התגובה
- הכן את B חיץ deacetylation (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl 2 0.5 מיקרומטר TSA)
- הכן 3 תגובות שונות צינורות שונים 20 נפח סופי μl (טבלה 1).
- כולל תגובות נוספות כדי לאשר deacetylation של מצע החלבון ידי SIRT2 (אופציונאלי). הוסף 2 מיקרוגרם של SIRT2 מוטציה null deacetylation מטוהרים (זה יכול להיעשות באמצעות פרוטוקול המתואר 1.1 לאחר שימוש lentivector pCDH-פורו-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) התגובה במקום SIRT2 פעיל deacetylase או להוסיף 10 מ"מ nicotinamide (NAM ) התגובה לעכב את פעילות deacetylation של SIRT2 (טבלה 1).
- דגירת תגובות 3 שעות ב 30 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה מתמדת.
- עצור את התגובה על ידי הוספת 20 μl של חיץ מדגם 2x ומרתיחים דגימות fאו 10 דקות ב 95 מעלות.
- בצע אלקטרופורזה על ידי הפעלת תערובת התגובה על ג'ל 4-12% SDS-PAGE וכדי לזהות את מצב acetylation של המצע-חלבון על ידי המערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי Ac-K (1: 1,000 דילול) 19,20.
2. Vivo Deacetylation Assay
- SIRT2 התבטאות יתר בתאים בתרבית
- הכן 10 מנות ס"מ התרבות עם תאים 293T HEK overexpressing ביציבות וקטור pCDH-פורו-GFP-ריקה, pCDH-פורו-GFP-SIRT2-הדגל pCDH-פורו-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (כמתואר 1.1) כי כ- 70 ומחוברות%.
- לחלופין, להכין 10 מנות תרבות ס"מ עם תאים כ -70% ומחוברות ולבצע ביטוי יתר חולף באמצעות 5 מיקרוגרם של וקטורים הנ"ל באמצעות PEI לפי יחס של 3 μl PEI / מיקרוגרם DNA.
- בצע מערבי סופג של תמציות הסלולר הכוללות באמצעות נוגדן אנטי דגל (1: 1,000 דילול) להפגין ביטוי יתר של הדגל-tagged SIRT2 19.
- התערבות RNA מציאת SIRT2 בתאים בתרבית
- הכינו צלחת תרבות 10 ס"מ של תאים 293T HEK להיות כ -70% ומחוברות למחרת.
- למחרת, שיתוף transfect 4 מיקרוגרם pLKO1-פורו-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 מיקרוגרם pCMV- dR8.2 dvpr (וקטור אריזה) ו -0.5 מיקרוגרם pCMV-VSV-G (וקטור המעטפה) 18 polyethylenimine אלקטרוני (PEI) לפי יחס של DNA 3 μl PEI / מיקרוגרם.
הערה: דריסת SIRT2, אנו משתמשים shRNAs סיכת הראש פשוט וקטור lentiviral pLKO.1 שתוכנן על ידי קונסורציום RNAi (TRC). - בצע את ההליך כמתואר 1.1 לייצר shSIRT2 lentivirus להדביק תאי יעד מציאת SIRT2.
- בצע מערבי סופג של תמציות הסלולר הכוללות באמצעות נוגדן אנטי SIRT2 (1: 1,000 דילול) להפגין מציאת SIRT2 יעילה אחרי ריצת 40 מיקרוגרם של חלבון הכולל על ג'ל 10% SDS-PAGE.
- לחלופין,להכין 10 מנות תרבות סנטימטר עם תאים כ -70% ומחוברות ולבצע מציאה חולפת של SIRT2 באמצעות siRNAs הבא הוראות היצרן.
- בצע מערבי סופג של תמציות הסלולר הכוללות באמצעות נוגדן אנטי SIRT2 (1: 1,000 דילול) להפגין מציאת SIRT2 יעילה אחרי ריצת 40 מיקרוגרם של חלבון הכולל על ג'ל 10% SDS-PAGE.
- Immunoprecipitation ו Immunoblotting לזהות רמות acetylated בתאים בתרבית
- 12 שעות לפני איסוף כדורי תא מתאי או overexpressing SIRT2 (ראה 2.1 לעיל) או SIRT2 הפילו תאים (ראה 2.2 לעיל), להוסיף 1 מיקרומטר TSA עד בינוני התרבות לעכב deacetylases היסטון הלא Class III.
- הסר בינוני תרבות, לשטוף תאים פעמיים PBS ולאסוף את התאים על ידי trypsinization ואחריו צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- הוסף 10 מ"ל חיץ תמוגה (20 מ"מ HEPES 7.9 pH, 18 KCl מ"מ, 0.2 מ"מ EGTA, 1.5מ"מ MgCl 2, 20% גליצרול, 0.1%-40 NP) כולל קוקטייל מעכבי פרוטאז, 1 TSA מיקרומטר ו 2 מ"מ NAM.
- דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת רוטציה קבועה.
- לאסוף supernatants ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- חישוב ריכוז חלבון באמצעות שיטה ברדפורד.
- העברת 1 מ"ג חלבון הכולל צינורות חדשים בנפח סופי של 1 מיליליטר באמצעות שימוש חיץ א תמוגה טבל 2 כהתייחסות להכין דגימות חלבון מתאי או overexpressing SIRT2 או לאחר מציאת SIRT2.
- בצעו immunoprecipitation באמצעות נוגדן נגד המצע-חלבון מסוים יחד עם חלבון / G (slurry חרוז 40 μl מומלץ). לחלופין, להשתמש נוגדן Ac-K אנטי מצומדות כדי agarose חרוזים (20 μl slurry חרוז הוא בדרך כלל מספיק) כדי immunoprecipitate כל החלבונים acetylated.
- דגירה דגימות ב 4 מעלות צלזיוס מתחת constaלילה סיבוב NT.
- אסוף immunoprecipitates על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 2 דקות ב 4 ° C..
- לשטוף חרוזים 5 פעמים עם חיץ 1 מ"ל XG ב 1000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.
- חרוזים Resuspend ב 40 μl של חיץ מדגם 2x.
- מרתיחים הדגימות למשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
- בצע אלקטרופורזה על ידי הפעלת דגימות eluted (40 μl משלב 2.3.12) על ג'ל 4-12% SDS-PAGE מבלי להפריע חרוזים תוך העברת דגימות eluted.
- זיהוי רמות acetylated של מצע החלבון על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי Ac-K (1: 1,000 דילול) אם נוגדן ספציפי חלבון-מצע שמש immunoprecipitation, או נוגדן ספציפי נגד-מצע החלבון (אחרי המלצות הדילול הספציפי בנוגע הנוגדן) אם חרוזי Ac-K אנטי שמשו immunoprecipitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת חלבון להיחשב כמטרה deacetylation לגיטימי כל אנזים עם פעילות deacetylation, הן במבחנה מבחני deacetylation vivo צריך להתבצע כדי לקבוע את יחסי הגומלין בין deacetylase ואת המצע שלה. עבור assay deacetylase חוץ גופייה, הטיהור היא deacetylase ואת מצע חלבון acetylated נדרשה לפני assay יכול להיעשות. כאן אנו משתמשים SIRT2 הסירטואינים ציטופלסמית כמו deacetylase הספציפי כדי להיחקר. SIRT2 הוא אנזים deacetylase ושימוש מוטציה אשר חסרה את פעילות deacetylase מומלץ מאוד כביקורת שלילית עבור assay deacetylation. באמצעות הליך הטיהור מתואר 1.1, הן SIRT2 ו SIRT2 H187Y יכולים להיטהר בהצלחה בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl. זה יכול להיות מאושר לאחר הפעלת החלבונים מטוהרים על ג'ל ואחריו מכתים(איור 1A, העליון) וכן לאחר המערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי הדגל מאז הן SIRT2 ו SIRT2 H187Y מתויגים עם פפטיד דגל (איור 2 א, נמוך). הליך הטיהור אותו ניתן בעקבות לטיהור מצע החלבון עם כמה שינויים. החלבון צריך להיות acetylated לפני שניתן יהיה להשתמש בו עבור assay deacetylation מה שאומר שזה צריך להיות מטוהר בתאי overexpressing transferase אצטיל הספציפי או תערובת של כובעים מסוגלים acetylate החלבון. באמצעות הליך הטיהור מתואר 1.2, חלבון acetylated יכול להיות מטוהר (האיור 1B, העליון). כדי לאשר כי החלבון הוא acetylated אכן יכול לשמש עבור assay deacetylation במבחנה, המערבי סופג באמצעות נוגדן Ac-K אנטי יש צורך להראות רמות acetylated מוגברת של חלבון מטוהרים בתאי overexpressing אצטיל-טרנספראז (איור 1B, lower).
לאחר טיהור חלבונים מוצלחת, assay deacetylation במבחנה יכול להתבצע. סירטואינים, כולל SIRT2, הם deacetylases ליזין היסטון בכיתה III אשר נבדלים deacetylases אחרים כפי שהם דורשים NAD + לתפקוד האנזימטית שלהם. בקנה אחד עם זו, אין deacetylation יכול להיות מזוהה על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדן Ac-K אנטי בהעדר NAD +, ללא קשר לנוכחות של SIRT2 הפעיל קטליטית (איור 2, מסלול 2 vs 1). להיפך, ירד רמות acetylated של חלבון acetylated כאשר הן SIRT2 לבין NAD + נוכחי התגובה מראה כי החלבון יכול להיחשב כמטרת deacetylation עבור SIRT2. כדי לאמת את התוצאות הללו, שולט שליליים שונים יכול לשמש. לדוגמה הבדל ברמות deacetylation של החלבון ניתן לאתר כאשר SIRT2 לקוי deacetylation (SIRT2 H187Y) משמש במקום SIRT2 wild-type פעיל קטליטית (איור 2, מסלול 5 לעומת 4). אפקט דומה ניתן לראות כאשר מעכב הסירטואינים ומבוססת, NAM, מתווסף לתערובת התגובה, רומז כי הירידה ברמות acetylated של חלבון מתווך על ידי פעילות deacetylase של SIRT2.
deacetylation Aberrant מעורב בכמה תהליכים תאיים ומחלות הקשורות לגיל. לפיכך, צעד מכריע העמקת הידע שלנו לגבי יחסי הגומלין בין deacetylase ואת המצע שלה הוא להקים חיבור זה בתאים שבהם תופעה זו עשויה להיות השפעה פיזיולוגית. יתר על כן, בדיקת deacetylation במערכות תרבית תאי in vivo מאפשרת הלימוד של אירוע deacetylation בהקשר מסוים תא או רקמה אשר ניתן לחבר בקלות רבה יותר כדי פנוטיפ או תוצאה מסוים. זה אינו כולל את האפשרות כי זוהתה במבחנת deacפעילות etylation היא מלאכותית בשל נוכחותם של שני deacetylase ואת המצע שלה בצינור בעת ובעונה אחת, אשר לא יכול לקרות בתנאים פיזיולוגיים נורמליים בתאים. עבור assay deacetylation in vivo, תאים overexpressing היא SIRT2 ו SIRT2 H187Y וכן מצע החלבון יכולים לשמש בעקבות ההליכים מתוארים 2.1 ו -2.2. תמציות תא שהוכנו תאים אלה ניתן לאשר להביע SIRT2, SIRT2 H187Y, ואת מצע החלבון על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים ספציפיים. ב assay המתואר כאן, כל חלבונים הביעו אקסוגני מתויגים על מנת להקל על הניסויים שבוצעו (איור 3, פנל תחתון כדי לזהות SIRT2 HA-tagged / SIRT2 H187Y ו פנל באמצע לזהות מצע חלבון הדגל-tagged). כדי לקבוע אם חלבון המטרה הוא מצע deacetylation של SIRT2, immunoprecipitation מתבצע באמצעות נוגדן אנטי דגל כדי לנתץ את f חלבון המטרהollowed ידי המערבי סופג באמצעות נוגדן Ac-K אנטי. ירידה ברמות acetylated של החלבון בתאים המבטאים SIRT2 (איור 3 הפאנל העליון, מסלול 3 vs 2) וכישלון משפיע על רמות acetylated בתאים המבטאים מוטציה SIRT2 לקוי deacetylase (איור 3 הפאנל העליון, מסלול 4 לעומת 3) מראים כי חלבון acetylated יכול להיות מטרת deacetylation של deacetylase הספציפי in vivo. זה יכול להיות אישור נוסף כאשר deacetylation בתיווך SIRT2 מעוכב לאחר טיפול בתאים עם NAM (איור 3 פנל עליון, מסלול 5 לעומת 3) הקמת הציר-מצע deacetylase הספציפי בתאים למדו.
איור 1: טיהור הן deacetylase ואת החלבון-המצע acetylated לשמש עבור assay deacetylation חוץ גופית. (א) 1 מיקרוגרם של שני SIRT2 ו SIRT2 H187Y (מוטציה פגומה deacetylation) נוהל על ג'ל בעקבות פרוטוקול הטיהור כמתואר 1.1. הג'ל היה מוכתם פתרון מכתים זמין מסחרי ואחרי destaining, שני חלבונים מטוהרים ניתן לאתר (עליון). חלבונים ניתן לאתר לאחר העברת קרום PVDF ו מערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי דגל (נמוך). (ב) 1 מיקרוגרם של מצע החלבון ו- Hyper מצע חלבון acetylated (אלפא-אנולאז שמש מצע SIRT2 מבוסס על נתונים שלא פורסמו ספקטרומטריית מסה שנוצרו במעבדה שלנו) נוהלו על ג'ל בעקבות פרוטוקול הטיהור כמתוארת 1.2. הג'ל היה מוכתם פתרון מכתים זמין מסחרי ואחרי destaining, מצע החלבון המטוהר ניתן לאתר (עליון). Acetylation ניתן לאתר לאחר העברת קרום PVDF ו המערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי Ac-K (באמצע). p סה"כ roteins ניתן לאתר באמצעות נוגדן אנטי דגל (נמוך). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ב assay deacetylation במבחנת מצע חלבון acetylated המטוהר (אלפא-אנולאז) הוא מודגרות עם SIRT2 או SIRT2 H187Y (מוטציה פגומה deacetylation) בנוכחות של NAD + (נתיבי 4 ו -5). רמות acetylated מתחלש מזוהים על ידי המערבי סופג באמצעות נוגדן Ac-K אנטי בנוכחות SIRT2 אבל לא בנוכחות SIRT2 H187Y (מסלול 4 vs 5). אין פעילות deacetylation הוא ציין כאשר NAD + אינו נכלל לתערובת התגובה (מסלול 2 לעומת 4) או כאשר NAM מתווסף לתערובת התגובה (מסלול 6 לעומת 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. ב assay deacetylation vivo תאים HEK293T ביציבות overexpressing או SIRT2 או SIRT2 H187Y היו שיתוף transfected עם המצע חלבון (אלפא-אנולאז) וכובעים כדי להגדיל את רמות acetylated של החלבון (מסלול 2 vs 1). Deacetylation נבדקה in vivo לאחר immunoprecipitation באמצעות נוגדן אנטי הדגל כדי לנתץ את המצע חלבון המערבי סופג באמצעות נוגדן Ac-K אנטי. Acetylation הוא ירד באופן משמעותי בתאים overexpressing SIRT2 לעומת H187Y SIRT2 overexpressing תאים (מסלול 3 vs 4). Deacetylation SIRT2 בתיווךשל מצע החלבון מעוכב כאשר תאי מטופלים עם NAM (מסלול 5 לעומת 3). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תגובות | 1 | 2 | 3 | 4 (אופציונלי) | 5 (אופציונלי) |
| חלבון-מצע acetylated מטוהר (10 מיקרוגרם) | + | + | + | + | + |
| חיץ B | + | + | + | + | + |
| SIRT2 המטוהר (2 מיקרוגרם) | - | + | + | - | + |
| NAD + (1 mΜ) | - | - | + | + | + |
| H187Y SIRT2 המטוהר (2 מיקרוגרם) | - | - | - | + | - |
| NAM (10 מ"מ) | - | - | - | - | + |
טבלת 1: מרכיבי תגובה.
| דגימות | ביטוי יתר | למוטט |
| 1 | pCDH-פורו-GFP-ריק וקטור | וקטור ריק pLKO1 או CTR סי |
| 2 | pCDH-פורו-GFP-SIRT2-Flag | SIRT2 SIRT2 1 או סי sh pLKO1 1 |
| 3 | pCDH-פורו-GFP-SIRT2 H187Y -Flag | SIRT2 SIRT2 2 או סי sh pLKO1 2 |
טבלה 2: דגימות חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט המתואר כאן נתמך על ידי מענק מ- NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) וכן על ידי מקיף במרכז לחקר הסרטן ע"ש רוברט ה לוריא - פרס מחקר Lefkofsky הקרן המשפחתי / ליז ואריק Lefkofsky חדשנות AV ברצוננו להודות לחברי מעבדה (קרול O'Callaghan ואליזבת אן ויין) לקריאה ביקורתית ועריכת כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture dishes | Denville Scientific Inc. | T1110 and T1115 | |
| pCDH-puro-GFP lentiviral vector | System Biosciences | CD513B-1 | |
| pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) | Addgene | 8455 | |
| pCMV-VSV-G (envelope vector) | Addgene | 8454 | |
| polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 24885 | other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells |
| 0.22 μm filters | Denville Scientific Inc. | F5512 | |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| fluorescent microscope | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | Axiovert 200 | |
| puromycin | Invivogen | A11138-03 | |
| PBS | Corning | 21-031-CM | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F3165 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| EGTA | Sigma | 34596 | |
| protease inhibitors coctail 100x | Biotool | B14001 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | T8552 | selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins) |
| anti-Flag agarose beads | Sigma | A2220 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| rotator | Thermo Scientific | 415220Q | |
| filter tubes | Millipore | UFC30HV00 | |
| Flag peptide | Sigma | F3290 | |
| Vivaspin Centrifugal Concentrator | Sartorius Stedim Biotech S.A. | VS0102 | |
| SimplyBlue SafeStain solution | Invitrogen | LC6060 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Techologies | NP0007 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | T5941 | |
| NAD+ | Sigma | N0632 | required cofactor for sirtuins |
| nicotinamide (NAM) | Sigma | 72340 | selective inhibitor class III HDACs (sirtuins) |
| pLKO.1 lentiviral vector | Addgene | 8453 | |
| SIRT2 si RNA | Qiagen | GS22933 | |
| anti-SIRT2 antibody | Proteintech | 15345-1-AP | |
| Bradford protein assay | BIO-RAD | 500-0006 | |
| anti Ac-K agarose beads | Immunechem | ICP0388 |
References
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
- Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
- Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
- Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
- L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
- Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
- Smith, K. T., Workman, J. L.
- Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D.
- Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
- Anderson, K. A., Hirschey, M. D.
- Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
- Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
- Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
- Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
- Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
- Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
- Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
- Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e51682 (2014).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).
