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Bioengineering

एक प्रवाह के माध्यम से microreactor साथ एमएस का पता लगाने के लिए प्रोटीन की तेजी एंजाइमी प्रसंस्करण

Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53564
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences, Virginia Tech

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के विशाल बहुमत के आधार पर प्रोटीन विश्लेषण के तरीकों एक enzymatic पाचन कदम का पता लगाने के लिए पहले, आम तौर पर trypsin के साथ शामिल है। यह कदम मेगावाट <3,000-4,000 दा, कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन के प्रभावी सीमा स्कैन के भीतर गिर के साथ छोटे आणविक भार पेप्टाइड्स की पीढ़ी के लिए आवश्यक है, आम तौर पर। पारंपरिक प्रोटोकॉल 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन enzymatic पाचन शामिल है। हाल के अग्रिमों रणनीतियों की एक किस्म है, आम तौर पर स्थिर एंजाइमों के साथ या पूरक शारीरिक प्रक्रियाओं है कि समय प्रोटिओलिटिक पाचन के लिए आवश्यक कुछ ही मिनट के लिए कम (की एक श्रृंखला के जैसे, माइक्रोवेव या उच्च एक microreactor के प्रयोग को शामिल के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है दबाव)। इस काम में, हम एक सरल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण एक प्रोटीन की तेजी enzymatic पाचन प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है कि वर्णन है। प्रोटीन (या प्रोटीन मिश्रण) C18 बंधुआ उलट चरण उच्च perf पर adsorbed हैतरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) सिलिका के कण एक केशिका स्तंभ में पहले से लोड ormance, और जलीय बफर में trypsin समय की एक छोटी अवधि के लिए कणों पर संचार होता है। ऑन-लाइन एमएस का पता लगाने को सक्षम करने के tryptic पेप्टाइड्स एमएस आयन स्रोत में सीधे वृद्धि हुई कार्बनिक सामग्री के साथ एक विलायक प्रणाली के साथ eluted हैं। यह दृष्टिकोण उच्च कीमत स्थिर एंजाइम कणों के प्रयोग से बचा जाता है और इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए किसी भी सहायता की जरूरत नहीं है। प्रोटीन के पाचन और पूर्ण नमूना विश्लेषण और क्रमश: ~ कम से कम 3 मिनट में पूरा किया जा सकता ~ 30 मिनट।

Introduction

पहचान और शुद्ध प्रोटीन के लक्षण वर्णन अक्सर एमएस तकनीक का उपयोग करके हासिल की है। प्रोटीन एक एंजाइम से पच जाता है और उसके आगे पेप्टाइड्स एक सरल अर्क प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके एमएस द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। प्रोटिओलिटिक पाचन छोटे पेप्टाइड टुकड़े कि ज्यादातर एमएस एनालाइजर की उपयोगी जन रेंज में गिरावट पैदा करने के लिए आवश्यक है, और है कि आसानी से अमीनो एसिड अनुक्रम जानकारी उत्पन्न करने के लिए कम ऊर्जा की टक्कर प्रेरित पृथक्करण के माध्यम से खंडित किया जा सकता है। पृथक प्रोटीन या सरल प्रोटीन मिश्रण के लिए, एमएस का पता लगाने के लिए पहले पेप्टाइड्स के chromatographic जुदाई के लिए आगे कोई जरूरत नहीं है। 25-50 पेप्टाइड्स का एक मिश्रण आसानी से एक सिरिंज एमएस आयन स्रोत में सीधे पंप के साथ नमूना infusing द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।

मास स्पेक्ट्रोमीटर विश्लेषण करते हैं और एक कम समय-सीमा के भीतर एक प्रोटीन के अनुक्रम पुष्टि कर सकते हैं। आधुनिक डाटा अधिग्रहण तरीकों के साथ, इस प्रक्रिया को पूरा किया जा सकता wकुछ मिनट या यहां तक ​​कि सेकंड Ithin। थोड़े समय के पैमाने पर पूरी प्रक्रिया को पूरा करने में सीमित कारक प्रोटिओलिटिक पाचन कदम है। सामान्यतया, यह (या हे / एन) में कुछ घंटे से अधिक किया जाता है, समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर, सब्सट्रेट का उपयोग: (50-100) के एंजाइम अनुपातों: 1। मिनट या सेकंड, स्थिर एंजाइम microreactors को enzymatic पाचन समय, microfluidic रिएक्टरों या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कारतूस, वर्णित किया गया है के रूप में आम तौर पर कम करने के लिए। 1-6, एंजाइम सहसंयोजक, गैर सहसंयोजक / शारीरिक सोखना, जटिल से स्थिर है बड़े सतह करने वाली मात्रा और एंजाइम करने वाली सब्सट्रेट अनुपात के गठन या encapsulation, enzymatic प्रक्रिया के 3,6 बढ़ाया दक्षता से सक्षम किया जा रहा। स्थिर रिएक्टरों के अतिरिक्त लाभ एमएस विश्लेषण में एंजाइम से autolysis और हस्तक्षेप कम हो, एंजाइम स्थिरता और reusability में सुधार शामिल हैं। दृष्टिकोण, कांच का उपयोग कर या बहुलक microfabricated उपकरणों की एक किस्म का वर्णन किया गया है,एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत से चुंबकीय मोती पर स्थिर एंजाइमों का उपयोग कर, 7,8 वैकल्पिक रूप से सोने nanoparticle नेटवर्क में फँस, 9 टाइटेनिया एल्यूमिना प-जैल 10 और nanozeolites, 11 में समझाया या नी NTA या उनकी टैग जटिल गठन के माध्यम से कब्जा कर लिया। 6 , स्थिर एंजाइमों के साथ खुले ट्यूबलर केशिकाओं विकसित किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से। 12 इसके अलावा, बढ़ाया प्रोटिओलिटिक दरार 30-120 की प्रतिक्रिया समय को कम करने के लिए नियंत्रित माइक्रोवेव विकिरण 13 या दबाव की मदद से या दबाव साइकिल चालन प्रौद्योगिकी (पीसीटी) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है मि। 14

स्थिर एंजाइम रिएक्टरों के कई फायदे के बावजूद, वाणिज्यिक कारतूस की लागत अधिक है, नियमित प्रयोग के लिए microfluidic उपकरणों की उपलब्धता सीमित है, और अतिरिक्त उपकरण के लिए जरूरत होती माइक्रोवेव या पीसीटी प्रौद्योगिकियों के परिणाम का उपयोग करें। इस काम के लक्ष्य के लिए एक तरीका है कि circumve विकसित किया गया थाइन नुकसान एनटीएस, और है कि आसानी मिनट के भीतर एमएस विश्लेषण के लिए तैयार करने में प्रोटीन के enzymatic दरार प्रदर्शन के लिए एक सरल और प्रभावी दृष्टिकोण के साथ शोधकर्ताओं को सशक्त बनाने के लिए हर प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है। दृष्टिकोण हाइड्रोफोबिक, C18-कणों जो एक केशिका या microfluidic युक्ति में पहले से भरी हुई हैं के उपयोग पर निर्भर करता है, और अधिक से अधिक एंजाइम के अर्क के दौरान इन कणों enzymatic पाचन द्वारा पीछा किया पर ब्याज की प्रोटीन (एस) के सोखना खचाखच भरे बिस्तर और कब्जा कर लिया प्रोटीन (s)। इस दृष्टिकोण में, सब्सट्रेट गैर सहसंयोजक बातचीत के माध्यम से स्थिर है, और एंजाइम स्थिर प्रोटीन भर में संचार होता है। प्रोटिओलिटिक पाचन क्षमता, बड़े कण सतह क्षेत्रों है कि एंजाइमी प्रसंस्करण, कम दूरी और करने के लिए और कणों की सतह से प्रसार समय के लिए प्रोटीन का पर्दाफाश की वृद्धि हुई है बड़े पैमाने पर स्थानांतरण, कोई सहसंयोजक लगाव है कि एंजाइम की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है, की क्षमता में सुधार करने के लिए जल्दी evaluatविभिन्न एंजाइमों, disposability, और बहुसंकेतन के ई संयोजन प्रक्रिया एक microfluidic प्रारूप में मार डाला जाता है। यह दृष्टिकोण मानक प्रोटीन और trypsin-प्रोटिओलिटिक पाचन ईएसआई-एमएस का पता लगाने के लिए पूर्व के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइम का एक मिश्रण के उपयोग के साथ प्रदर्शन किया है। बड़े पैमाने पर इस अध्ययन में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोमीटर एक रेखीय जाल quadrupole (LTQ) साधन था।

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Protocol

1. केशिका microreactor की तैयारी

  1. कट 100 माइक्रोन आंतरिक व्यास (आईडी) x 360 माइक्रोन बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) 7-8 सेमी की लंबाई के लिए केशिका, और 20 माइक्रोन आईडी गिलास केशिका क्लीवर के साथ 3-5 सेमी एक्स 90 माइक्रोन आयुध डिपो केशिका; माइक्रोस्कोप है कि दोनों सिरों केशिका एक साफ, सीधे कटौती के तहत सत्यापित करें, किसी भी फैला हुआ burrs बिना।
  2. ~ 6 मिमी की लंबाई के लिए, 100 माइक्रोन आईडी x 360 माइक्रोन आयुध डिपो केशिका के एक छोर में 20 माइक्रोन आईडी x 90 माइक्रोन आयुध डिपो केशिका डालें; जरूरत के मामले में, एक खुर्दबीन के नीचे इस आपरेशन निरीक्षण करते हैं।
  3. 90 माइक्रोन आयुध डिपो / 100 एक क्यू की नोक के अंत के साथ माइक्रोन आईडी केशिकाओं के जंक्शन के आसपास गोंद E6000 का एक छोटा सा छोटी बूंद लागू करें, और आरटी पर गोंद इलाज हे / एन करते हैं।
  4. की ~ 10-15 मिमी लंबाई करने के लिए डाला 20 माइक्रोन आईडी x 90 माइक्रोन आयुध डिपो केशिका कट; इस electrospray आयनीकरण emitter होगा।
  5. पूर्व में कटौती 1/32 "आयुध डिपो तिरछी, 1/16" आयुध डिपो तिरछी और 1/16 "आयुध डिपो PTFE टबलंबाई में 4-5 सेमी के टुकड़ों में आईएनजी; इनमें से एक रिसाव से मुक्त कनेक्शन उपलब्ध कराने के लिए केशिका यूनियनों में इस्तेमाल आस्तीन होगा।
  6. एक तिरछी नज़र संघ के लिए 100 माइक्रोन आईडी x 360 माइक्रोन आयुध डिपो केशिका के विपरीत छोर से कनेक्ट; एक रिसाव से मुक्त कनेक्शन उपलब्ध कराने के लिए एक 1/32 "तिरछी आस्तीन का उपयोग करें।
  7. सम्मिलित / संघ के विपरीत अंत में ~ के 5 सेमी लंबी 1/16 "PTFE ट्यूबिंग एक टुकड़ा कस लें।
  8. में एक पूर्व साफ / सूखे 2 मिलीलीटर कांच की शीशी वजन C18 (5 माइक्रोन) कणों की ~ 4 मिलीग्राम; 0.5 मिलीलीटर isopropanol जोड़ने के लिए, शीशी को बंद करने और ultrasonicator स्नान में गारा फैलाने के।
  9. , एक 250 μl सिरिंज लगभग 200 μl घोल के साथ वापस ले लें 1/16 "तिरछी संघ के PTFE ट्यूबिंग में सिरिंज सुई डालें, और धीरे-धीरे 100 माइक्रोन आईडी x 360 माइक्रोन आयुध डिपो केशिका में घोल बांटना, के रूप में माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण (चित्रा 1) इस microreactor होगी 20 μ; केशिका 2-3 मिमी पैकिंग की लंबाई हासिल की है, जब तक कणों के साथ भरता है।एम आईडी केशिका एक कीस्टोन प्रभाव के माध्यम से microreactor में कणों को बरकरार रखे। 15
  10. ~ साथ एच 2 ओ / CH 3 सीएन 50:50 वी / वी के 50 μl समाधान microreactor कुल्ला, और फिर ~ एच 2 ओ / CH 3 सीएन 98 के 50 μl समाधान के साथ: 2 v / v।

2. नमूना समाधान की तैयारी

नोट: संचालन है कि कार्बनिक सॉल्वैंट्स और एसिड और समाधान तैयारी की हैंडलिंग शामिल एक धूआं हुड में प्रदर्शन हो रहे हैं। काले चश्मे, दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़े पहनें।

  1. साथ सीएच 3 OH कुल्ला और कुछ कांच की शीशियों (4 एमएल) और polypropylene ट्यूब (15 एमएल) सूखी।
  2. के एच 2 ओ / CH 3 सीएन एक समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी (98: 2 वी / वी) एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में 200 μl सीएच 3 सीएन साथ 9.8 मिलीलीटर एच 2 ओ के मिश्रण से; sonication द्वारा मिश्रण।
  3. की एक समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी एच 2 ओ / CH 3 चीन (50:50 वी / वी) एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में 5 मिलीलीटर एच 2 के मिश्रण से </ उप> हे के साथ 5 मिलीलीटर सीएच 3 सीएन; sonication द्वारा मिश्रण।
  4. एच 2 ओ / CH 3 सीएन 4 मिलीलीटर करने के लिए 4 μl टीएफए (10%) जोड़कर एक acidified जलीय घोल (टीएफए 0.01% वी / वी) के 4 मिलीलीटर तैयार: एक 4 मिलीलीटर कांच की शीशी में (98 2 वी / वी); sonication द्वारा मिश्रण।
  5. 4 मिलीलीटर एच 2 ओ / CH 3 चीन (50:50 v / v) में एक 4 मिलीलीटर कांच की शीशी के लिए 4 μl टीएफए (10%) जोड़कर एक acidified जैविक समाधान (टीएफए 0.01% वी / वी) के 4 मिलीलीटर की तैयारी; sonication द्वारा मिश्रण।
  6. 16 मिलीग्राम एनएच 4 HCO 3 वजन एक 4 मिलीलीटर कांच की शीशी में एक विश्लेषणात्मक Microbalance के साथ; (: 2 वी / वी 98) समाधान और sonication द्वारा फैलाने, एच के 4 मिलीलीटर जोड़ने 2 हे / CH 3 सीएन इस जलीय बफर में एनएच 4 HCO 3 (पीएच ~ 7.8) के एक 50 मिमी समाधान में परिणाम है।
  7. एक मानक प्रोटीन की 5 मिलीग्राम वजन (जैसे, गोजातीय सीरम albumin, हीमोग्लोबिन α / β, साइटोक्रोम सी, कार्बोनिक anhydrase, α-2-एच एस ग्लाइकोप्रोटीन, आदि) एक 4 मिलीलीटर कांच की शीशी में एक विश्लेषणात्मक Microbalance के साथ; 4 मिलीलीटर डि wate जोड़नेआर और sonication द्वारा फैलाने; यह आमतौर पर एक उच्च माइक्रोन स्तर एकाग्रता समाधान में यह परिणाम है।
  8. एनएच 4 HCO 3 (50 मिमी) जलीय बफर का एक उचित मात्रा के साथ उच्च माइक्रोन स्तर एकाग्रता समाधान गिराए द्वारा 1 मिलीलीटर प्रोटीन समाधान (1-2 माइक्रोन) के तैयार करें; sonication द्वारा मिश्रण।
  9. जलीय बफर 170 μl में 20 माइक्रोग्राम अनुक्रमण ग्रेड trypsin भंग एनएच 4 HCO 3 (50 मिमी) द्वारा trypsin समाधान (5 माइक्रोन) के तैयार करें; sonication द्वारा फैलाने के।

3. प्रायोगिक सेटअप

नोट: LTQ एमएस प्रणाली एक संशोधित ईएसआई स्रोत है कि एक घर में निर्मित XYZ चरण जो मास स्पेक्ट्रोमीटर के विभिन्न नमूना इनपुट दृष्टिकोण के लिए सक्षम बनाता है शामिल interfacing के साथ फिट है।

  1. तिरछी संघ से केशिका microreactor डिस्कनेक्ट और तिरछी टी करने के लिए कनेक्ट।
  2. तिरछी टी की ओर हाथ में एक ~ 2 सेमी लंबी पं तार डालें; एक प्रदान करने के लिए एक 1/32 "तिरछी आस्तीन का उपयोगरिसाव से मुक्त कनेक्शन और पं तार इन्सुलेट के लिए।
  3. एक 50 माइक्रोन आईडी x 360 माइक्रोन आयुध डिपो (~ 0.5 मीटर लंबी) तिरछी टी के विपरीत अंत करने के लिए नमूना हस्तांतरण केशिका कनेक्ट; एक रिसाव से मुक्त कनेक्शन उपलब्ध कराने के लिए एक 1/32 "तिरछी आस्तीन का उपयोग करें।
  4. XYZ-मंच पर तिरछी टी सुरक्षित और मास स्पेक्ट्रोमीटर इनलेट केशिका से दूर स्थिति ईएसआई emitter ~ 2 मिमी।
  5. मास स्पेक्ट्रोमीटर के ईएसआई बिजली की आपूर्ति के स्रोत के लिए पं तार कनेक्ट।
  6. स्टेनलेस स्टील संघ के लिए नमूना हस्तांतरण केशिका के विपरीत छोर से कनेक्ट; एक रिसाव से मुक्त कनेक्शन उपलब्ध कराने के लिए एक 1/16 "तिरछी आस्तीन का उपयोग करें।
  7. स्टेनलेस स्टील संघ के विपरीत अंत करने के लिए एक 4-5 सेमी लंबी 1/16 "PTFE ट्यूबिंग कनेक्ट और PTFE ट्यूबिंग में 250 μl सिरिंज सुई डालने, पंप पर बारी और वांछित मूल्य पर प्रवाह दर निर्धारित (जैसे, 2 μl / मिनट)।
  8. सॉफ्टवेयर पैकेज है कि एमएस साधन एक नियंत्रण में इनपुट मिलकर एमएस डेटा अधिग्रहण पैरामीटरविश्लेषण के प्रदर्शन के लिए तैयार स्थापना के लिए एक विधि फ़ाइल के रूप में सहेजना घ; ± 1.5 मी / z गतिशील बहिष्कार बहिष्कार बड़े पैमाने पर चौड़ाई के साथ 180 सेकंड के लिए सक्षम होना चाहिए; LTQ एमएस प्रणाली के लिए, निम्न डेटा निर्भर विश्लेषण मापदंडों का उपयोग एक एमएस एक ज़ूम के द्वारा पीछा स्कैन और एमएस शीर्ष 5 सबसे तीव्र चोटियों पर 2 स्कैन, ± 5 मी / z चौड़ाई स्कैन ज़ूम; टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के मापदंडों अलगाव चौड़ाई 3 मीटर / z, सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा 35%, सक्रियण क्यू 0.25, और सक्रियण समय 30 मिसे पर निर्धारित किया है।

4. Microfluidic सेटअप

  1. कांच या बहुलक substrates से एक microfluidic डिवाइस तैयार करें; एक microreactor से मिलकर 16-18 डिवाइस के लेआउट चित्रा 2A में प्रदान की जाती है, (1) (0.13 मिमी चौड़ाई x 2 मिमी लंबाई x 50 माइक्रोन गहरी) एक इनलेट से जुड़ा (2 ), आउटलेट (3) और एक पक्ष बंदरगाह (4); fluidic जोड़तोड़ के लिए परस्पर चैनल हैं ~110 माइक्रोन चौड़ा और ~ 50 माइक्रोन गहरी; एक मल्टीचैनल संरचना (5), से मिलकर ~ 1.5-2 माइक्रोन गहरी x 10 माइक्रोन चौड़ा x 100 माइक्रोन लंबे microchannels रखा 25 माइक्रोन के अलावा, microreactor में कणों को बनाए रखने के लिए एक फिल्टर के रूप में कार्य करेगा।
  2. इनलेट बंदरगाहों के लिए विशेष कनेक्टर्स gluing द्वारा चिप के लिए तरल पदार्थ वितरण कनेक्शन सक्षम है, या एक बहुलक खड़ा है कि तरल पदार्थ वितरण (चित्रा 2 बी) के लिए फिटिंग accommodates तैयार करने से। 16
  3. C18 कणों (5 माइक्रोन) कदम 1.8 में वर्णित के रूप में की एक घोल तैयार करें; 1/16 "PTFE चिप पक्ष बंदरगाह से जुड़ा ट्यूबिंग का उपयोग करके एक सिरिंज के साथ microreactor को घोल देने (4); सील epoxy गोंद और 90 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में 1 घंटे के लिए इलाज के साथ कण लदान के बाद बंदरगाह 16।
  4. आउटलेट बंदरगाह में एक केशिका (20 माइक्रोन आईडी x 90 माइक्रोन आयुध डिपो x 10 मिमी लंबाई) डालें, E6000 गोंद के साथ सील, दो और इलाज हे / एन; इस ईएसआई emitter हो जाएगा (
  5. एक 50 माइक्रोन आईडी x 360 माइक्रोन आयुध डिपो कनेक्ट (~ 0.5 मीटर लंबी) चिप इनलेट बंदरगाह के लिए नमूना हस्तांतरण केशिका (2); 3.6-3.7 में वर्णित के रूप में, एक 250 μl सिरिंज और सिरिंज पंप करने के लिए केशिका के विपरीत छोर से कनेक्ट।
  6. नमूना हस्तांतरण लाइन बस इनलेट पोर्ट से पहले पर एक हल्के वजन तिरछी टी कनेक्टर प्लेस (2) और टी की ओर हाथ पर एक पंडित तार डालने, 3.2 में वर्णित के रूप में; इस ईएसआई इलेक्ट्रोड होगा।
  7. ईएसआई emitter मास स्पेक्ट्रोमीटर इनलेट केशिका से ~ 2 मिमी दूर तैनात साथ XYZ मंच पर microfluidic युक्ति सुरक्षित; 3.8 में वर्णित के रूप में विश्लेषण के लिए एमएस तैयार करते हैं।

5. नमूना लोड हो रहा है, Proteolytic पाचन और क्षालन एमएस विश्लेषण के लिए

नोट: सभी समाधान / नमूना हस्तांतरण कदम एक सिरिंज पंप की सहायता से प्रदर्शन कर रहे हैं और पूरा करने के लिए, मृत volum के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कुछ अतिरिक्त मिनट के लिए अनुमति चाहिएऔर microreactor से स्थानांतरण लाइनों के साथ जुड़े तों; आवश्यक समय के प्रवाह में शामिल दरों पर निर्भर करेगा।

  1. Microreactor कुल्ला और एक जलीय एच में एनएच 4 का समाधान HCO 3 (50 मिमी) 2 हे / CH 3 सीएन infusing द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार: 5 मिनट के लिए 2 μl में (98 2 वी / वी) / मिनट; एक 250 μl सिरिंज का उपयोग करें।
  2. 2 μl में नमूना समाधान infusing द्वारा microreactor पर प्रोटीन नमूना (1 माइक्रोन) लोड / 5 मिनट के लिए मिनट; एक 250 μl सिरिंज का उपयोग करें।
  3. 1-3 मिनट के लिए मिनट 2 μl पर microreactor पर trypsin समाधान (5 माइक्रोन) के adsorbed प्रोटीन के ऊपर दिखे /।
  4. TFA के एक acidified जलीय समाधान के साथ microreactor rinsing द्वारा प्रोटिओलिटिक पाचन प्रक्रिया बुझाना (0.01% वी / वी) एच 2 ओ / CH 3 सीएन में (98: 2 वी / वी) 2 μl पर / मिनट 5 मिनट के लिए; एक 250 μl सिरिंज का उपयोग करें।
  5. एल्यूटिंग प्रोटीन TFA के एक acidified जैविक समाधान infusing द्वारा microreactor से पचा शुरू (0.01%वी / वी) एच 2 ओ / CH 3 सीएन में (50:50 वी / वी) 300 nl / मिनट पर।
  6. एमएस डाटा अधिग्रहण की प्रक्रिया और ईएसआई वोल्टेज (~ 2,000 वी) पर बारी; 3.8 चरण में उपलब्ध कराए गए आंकड़ों अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग एमएस डेटा प्राप्त; tryptic पेप्टाइड्स के क्षालन निरीक्षण करते हैं।

6. डाटा प्रोसेसिंग

  1. कच्चे एमएस डेटा स्वरूप के साथ संगत एक खोज इंजन के साथ मिलकर एमएस डेटा की प्रक्रिया।
    1. LTQ एमएस कच्चे एक जीव विशिष्ट न्यूनतम बेमानी प्रोटीन डेटाबेस का उपयोग करके फ़ाइलें प्रक्रिया; खोज इंजन में कच्चे डेटा अपलोड करें, क्रमश: 2 और 1 दा के लिए माता पिता और टुकड़ा आयन मास tolerances सेट, और साथ दो खोज के लिए याद किया चोली केवल पूरी तरह से tryptic टुकड़े का उपयोग करें; posttranslational संशोधन के लिए अनुमति नहीं है; 1% और 3%, करने के लिए उच्च और मध्यम आत्मविश्वास झूठे खोज दर (एफडीआर) सेट क्रमशः, और posttranslational संशोधन के लिए अनुमति नहीं है।
  2. केवल उच्च आत्मविश्वास का चयन करने के लिए डेटा फ़िल्टरपेप्टाइड डेटाबेस में प्रोटीन के लिए मेल खाता है; प्रोटीन और पेप्टाइड स्तर के परिणामों का मूल्यांकन।

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Representative Results

एक प्रोटिओलिटिक पाचन प्रक्रिया का एक प्रतिनिधि परिणाम ऊपर वर्णित microreactors (आंकड़े 1 या 2), 1 टेबल में प्रदान की जाती है के साथ, प्रोटीन का एक मिश्रण पर एक साथ प्रदर्शन किया। तालिका अद्वितीय पेप्टाइड दृश्यों कि एक विशेष प्रोटीन की पहचान शामिल है, पार सहसंबंध के स्कोर (xcorr) (यानी, एक स्कोर कि इसी मिलकर जन स्पेक्ट्रम के लिए प्रयोगात्मक करने वाली सैद्धांतिक मैच की गुणवत्ता की विशेषता), याद चोली की संख्या, पेप्टाइड प्रभारी राज्य (जेड), और बड़े पैमाने / प्रभारी ( एम / protonated पेप्टाइड्स के z)। प्रोटीन के स्तर पर, मेज प्रोटीन, प्रोटीन स्कोर और प्रोटीन कवरेज के UniProt प्रोटीन आईडी, विवरण (नाम) प्रदान करता है। बाद एक प्रोटिओलिटिक पाचन 90 सेकंड के लिए प्रदर्शन सभी प्रोटीन, कई पेप्टाइड्स से पहचाना जा रहे थे।

समय के लिए आवश्यकसभी पेप्टाइड्स के क्षालन हस्तांतरण केशिका कि 300 nl / मिनट, एक प्रवाह दर नैनो ईएसआई इष्टतम संचालन के साथ संगत पर acidified जैविक समाधान छुड़ाया की लंबाई पर निर्भर था। में केशिका जलीय और जैविक अम्लीय समाधान के मिश्रण में कुछ पेप्टाइड्स के शुरुआती क्षालन में हुई है, लेकिन महान बहुमत केवल जैविक समाधान में कई मिनट से अधिक eluted। पांच प्रोटीन, केशिका microreactor के साथ उत्पन्न के कई पेप्टाइड्स प्रतिनिधि के सह क्षालन प्रदर्शित जन स्पेक्ट्रम, चित्रा 3 में प्रदान की जाती है।

तालिका 1 केशिका microreactor और ओ / एन पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग पांच प्रोटीन के पाचन प्रोटिओलिटिक के माध्यम से उत्पन्न tryptic पेप्टाइड्स की सूची। केवल अद्वितीय दृश्यों, उच्चतम xcorr साथ दिखाया गया है। यहां इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 1. केशिका microreactor। (ए) microreactor के निर्माण के लिए प्रायोगिक स्थापना। (बी) केशिका microreactor एमएस आयन स्रोत में तैनात हैं। Microreactor C18 बंधुआ सिलिका कणों के साथ मैन्युअल रूप से भरी हुई है और एक XYZ-मंच है कि ईएसआई एमएस स्रोत में उचित स्थिति की सुविधा पर रखा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Microfluidic microreactor। (ए) microfluidic रिएक्टर के योजनाबद्ध आरेख। (बी) Microfluidic रिएक्टर एक तिरछी नज़र स्टैंड में सुरक्षित है। microfluidic रिएक्टर एकएन डी हस्तांतरण लाइनों एक गिलास सब्सट्रेट जो XYZ मंच के साथ एमएस स्रोत में आगे स्थिति के लिए खड़े एक घर का बना बहुलक तिरछी में सुरक्षित किया जा सकता है में निर्मित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. मास प्रोटीन मिश्रण microreactor में प्रोटियोलिसिस के अधीन से उत्पन्न tryptic पेप्टाइड्स जिसमें स्पेक्ट्रम। सबसे तीव्र tryptic पेप्टाइड आयनों अमीनो एसिड के अनुक्रम और इसी प्रोटीन पहचानकर्ता के साथ लेबल रहे हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

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Discussion

microreactor इस काम में वर्णित प्रदान करता है एक आसान करने के लिए लागू कम से कम 30 मिनट में एमएस विश्लेषण और पहचान सक्षम करने के लिए प्रोटीन के enzymatic पाचन के प्रदर्शन के लिए प्रयोगात्मक स्थापना। इस प्रणाली, पारंपरिक तरीकों की तुलना में विशिष्ट लाभ, सादगी, गति, कम अभिकर्मक की खपत और कम लागत में शामिल हैं। विशेष रूप से, महंगा स्थिर trypsin माला और कारतूस के लिए कोई जरूरत नहीं है। केशिका microreactor की तैयारी सीधा (चित्रा 1 ए) है, और मानक आपूर्ति, सामान्यतः एक क्रोमैटोग्राफी प्रयोगशाला में पाया से ही मिनटों के भीतर पूरा किया जा सकता है। उलट चरण C18 कणों adsorbed प्रोटीन या पेप्टाइड्स की पूरी तरह हटाने के लिए उच्च कार्बनिक सामग्री विलायक (सीएच 3 सीएन या सीएच 3 OH) के साथ rinsed जा सकता है, और microreactor फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, आसान और लागत प्रभावी निर्माण की प्रक्रिया एकल उपयोग आवेदन के लिए डिस्पोजेबल इकाइयों के निर्माण के लिए आमंत्रित किया हैations। केशिका microreactor के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, या एक मानक वाणिज्यिक आयन स्रोत में डाला जा सकता है एक घर में निर्मित ईएसआई स्रोत में रखा जा सकता है। नमूना कब्जा है और पाचन के लिए कण बिस्तर से अधिक समय होने की जरूरत नहीं है जबकि ~ 1-2 मिमी, बस एमएस द्वारा इष्टतम पता लगाने के लिए पर्याप्त सामग्री पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त है, केशिका खुद की लंबाई किसी विशेष के आकार फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता आयन स्रोत है।

प्रयोगशालाओं है कि microfluidic उपकरणों के निर्माण की क्षमताओं के लिए, एक साधारण डिजाइन (2A चित्रा) है कि एमएस पता लगाने (चित्रा 2 बी) के लिए interfacing की सुविधा के लिए एक स्टैंड में सुरक्षित किया जा सकता प्रदान की जाती है। microreactor और हस्तांतरण चैनलों के आयामों के एक विशेष आवेदन की आवश्यकताओं को समायोजित किया जा सकता है, और डिवाइस एक या मल्टिप्लेक्स प्रारूप के रूप में विकसित किया जा सकता है। सबसे वाणिज्यिक मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए, तथापि, आयन स्रोत संशोधनों वीं की अनुमति की आवश्यकता होगीस्रोत में डिवाइस के ई नियुक्ति। चिप निर्माण के लिए ड्राइंग photomask ऑटोकैड सॉफ्टवेयर के साथ मार डाला गया था और photomask एचटीए Photomask द्वारा तैयार किए गए थे। माइक्रोचिप्स के निर्माण के पहले वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया था: photomask, पराबैंगनी प्रकाश (360 एनएम), विकिरणित photoresist और अंतर्निहित क्रोम परत को हटाने, बफर के साथ चैनलों के गीला रासायनिक नक़्क़ाशी के लिए जोखिम के साथ सब्सट्रेट के 17,18 संरेखण ऑक्साइड खोदना, शेष क्रोम परत को हटाने, पहुँच छेद, सफाई की ड्रिलिंग, माइक्रोचिप सतह की hydrolysis (एनएच 4 OH + एच 2 ओ 2), और 550 डिग्री सेल्सियस के लिए क्रमिक हीटिंग द्वारा कवर प्लेट के लिए सब्सट्रेट के थर्मल संबंध। दोनों सब्सट्रेट और कवर प्लेट etched थे, नमूना के लिए गहरी चैनलों के लिए एक उथले सूक्ष्म चैनल फिल्टर तत्वों (1.5-2 मीटर गहरी) के लिए हैंडलिंग (~ 20-50 माइक्रोन), और अन्य। 16

ऊपर वर्णित मील के साथ उत्पन्न परिणामcroreactor कि सब्सट्रेट के उपयोग से हे / एन, 19 पारंपरिक पाचन प्रोटोकॉल प्राप्त परिणामों के साथ तुलना कर रहे हैं: 1, एमएस पता लगाने के साथ एक पेप्टाइड अर्क प्रयोग (300 nl / मिनट, पेप्टाइड्स एच में भंग के द्वारा पीछा: की (50-100) एंजाइम अनुपातों 2 हे / CH 3 चीन (50:50 वी / वी) के साथ CH 3 COOH अम्लीय, 0.1% वी / वी)। दोनों microreactor और पारंपरिक प्रोटोकॉल कई अद्वितीय पेप्टाइड्स (तालिका 1) द्वारा सभी प्रोटीन की पहचान के सक्षम होना चाहिए। आमतौर पर, प्रोटीन प्रति अद्वितीय पेप्टाइड्स की कुछ हद तक बड़ी संख्या में पारंपरिक सेटअप के साथ तुलना microreactor साथ नमूदार थे। यह कुछ साइटों पर अधूरा एंजाइमी दरार का एक परिणाम था। प्रोटिओलिटिक पाचन के कुछ अतिरिक्त मिनट कम या इस परिणाम का सफाया कर दिया। इसके अलावा, कुछ एंजाइमी microreactor के साथ उत्पन्न पेप्टाइड्स तथ्य यह है कि प्रोटीन C18 कणों अलग अलग साइटों पर adsorbed के लिए एंजाइम टी से अवगत कराया गया, के कारण समाधान में उत्पन्न लोगों से मतभेदसमरूप समाधान में हान। 20 xcorr स्कोर, का प्रदर्शन हालांकि, उस मिलकर बड़े पैमाने पर microreactor के साथ उत्पन्न स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता की थी, और एक पर्याप्त प्रोटीन अनुक्रम कवरेज (11-75%) स्पष्ट प्रोटीन पहचान के लिए प्राप्त है कि ।

तकनीक, के रूप में वर्णित है, बल्कि साधारण प्रोटीन मिश्रण है कि सबसे ~ 25-50 पेप्टाइड्स कि सरल अर्क प्रयोगों द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है और उस तरल chromatographic जुदाई एमएस विश्लेषण करने से पहले की जरूरत नहीं है पर उत्पन्न का विश्लेषण करने के लिए सीमित है। सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, हौसले से thawed और तैयार trypsin समाधान का इस्तेमाल होता है कम या microreactor के परिचालन पीएच पर प्रोटियोलिटिक एंजाइम की गतिविधि को खोना नहीं करने के लिए (यानी, पीएच ~ 8)। इसके अलावा, एक उचित संतुलन अधिकतम प्रवाह दर है कि प्रयोगात्मक स्थापना से सहन किया जा सकता है और कहा कि सक्षम electrospray आयनीकरण के लिए इष्टतम प्रवाह दर (150-300 nl / मिनट) और के बीच पाया जाना चाहिएmicroreactor (2-3 μl / मिनट) से तेज पेप्टाइड क्षालन। इष्टतम ईएसआई प्रवाह दर से अधिक संवेदनशीलता नुकसान और गरीब का पता लगाने सीमा में परिणाम। नतीजतन, हस्तांतरण केशिकाओं की लंबाई समय microreactor से पेप्टाइड्स के क्षालन के लिए आवश्यक कम करने के लिए जब ≤300 nl / मिनट पर परिचालन जितना संभव हो कम बनाए रखा जाना चाहिए। सभी घटक है कि प्रयोगात्मक स्थापना के लिए इस्तेमाल किया गया है कि अन्य निर्माताओं के समान कार्य से घटकों द्वारा बदला जा सकता है। यदि इन घटकों के आयामी विशेषताओं कुछ कदम प्रदर्शन करने के लिए और ईएसआई वोल्टेज की अलग (लंबाई, व्यास, मात्रा), eluent प्रवाह दरों के अनुकूलन, नमूना एकाग्रता, समय इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

एक अनूठा लाभ microfluidic सेटअप से सक्षम स्टैंड-अल सक्रिय करने के लिए क्षमता के आगे एक पम्पिंग प्रणाली, जैसे चिप पर शामिल करने के लिए, एक electroosmotic प्रवाह चालित पंप, 21,22 हैमंच के एक ऑपरेशन और एक अतिरिक्त कदम जुदाई के एकीकरण। क्षमता प्रोटिओलिटिक पाचन के माध्यम से उत्पन्न पेप्टाइड्स पर चिप विभाजन प्रदर्शन करने के लिए सुधार का पता लगाने सीमा में परिणाम होगा, और सेलुलर अर्क से जटिल प्रोटीन मिश्रण के विश्लेषण की सुविधा होगी। यह आगे workflows कि microfabricated प्लेटफार्मों और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उच्च गति एमएस का पता लगाने का उपयोग कर में तकनीक के एकीकरण के लिए सक्षम हो जाएगा। 23

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion trap ESI-MS Thermo Electron LTQ The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage Newport Multiple parts The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope Edmund optics G81-278 The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler VWR 46600-204 The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson VWR 33995-540 The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22 Harvard Apparatus 552222 The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system EMD Millipore ZD5311595  The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) VWR 53513-410 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl) VWR 53513-406 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl) VWR 53513-402 The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP100375 This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) Polymicro Technologies TSP020090 This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) Polymicro Technologies TSP050375 This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver Supelco 23740-U This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue Eclectic Products E6000 Craft This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue Epo-Tek 353NDT This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm) Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18 These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl) Hamilton 81130-1725RN The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) Valco ZRU1.5FPK This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”) Valco ZU1XC The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) Valco MT.5XCPK The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight) Valco C-NTXFPK This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm) VWR 66260-126 The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD) Valco TTF115-10FT The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union 
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) Upchurch Scientific 1565 The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) Valco TPK.515-25 The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter Valco JR-797 This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml) Agilent  HP-5183-2069 The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry 
Amber vial (4 ml) VWR 66011-948 The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml) Fisher 12-565-286D The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml) VWR 24710-463 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml) VWR 24710-441 The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl) VWR 83007-386 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl) VWR 53503-781 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl) VWR 53511-681 The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates Nanofilm B270 white crown, 3” x 3” These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”) Upchurch P203X This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly Upchurch N-122H This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards Sigma Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade Fisher A955
Methanol, HPLC grade Fisher A452
Isopropanol, HPLC grade Sigma 650447
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
Ammonium bicarbonate Aldrich A6141
Trypsin, sequencing grade Promega V5111

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References

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एक प्रवाह के माध्यम से microreactor साथ एमएस का पता लगाने के लिए प्रोटीन की तेजी एंजाइमी प्रसंस्करण
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Lazar, I. M., Deng, J., Smith, N. Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor. J. Vis. Exp. (110), e53564, doi:10.3791/53564 (2016).… More

Lazar, I. M., Deng, J., Smith, N. Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor. J. Vis. Exp. (110), e53564, doi:10.3791/53564 (2016).

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