Abstract
Den stora majoriteten av masspektrometri (MS) -baserade proteinanalysmetoder involverar en enzymatisk digestion steg före detektering, typiskt med trypsin. Detta steg är nödvändigt för genereringen av små molekylvikt peptider, i allmänhet med molekylvikt <3000-4000 Da, som faller inom det effektiva avsökningsintervall av masspektrometri instrumentering. Konventionella protokoll involverar O / N enzymatisk uppslutning vid 37 ° C. Nya framsteg har lett till utvecklingen av en mängd olika strategier, i allmänhet innebär att användningen av en mikroreaktor med immobiliserade enzymer eller en rad kompletterande fysikaliska processer som reducerar den tid som krävs för proteolytisk digestion till några minuter (t.ex. mikrovågsugn eller hög- tryck). I detta arbete, beskriver vi en enkel och kostnadseffektiv metod som kan genomföras i alla laboratorier för att uppnå snabb enzymatisk nedbrytning av ett protein. Proteinet (eller proteinblandning) adsorberas på C18-bunden omvänd fas performance vätskekromatografi (HPLC) kiseldioxidpartiklar förladdade i en kapillärkolonn, och trypsin i vattenhaltig buffert infuseras över partiklarna under en kort tidsperiod. För att möjliggöra on-line MS-detektion, är de tryptiska peptiderna eluerades med ett lösningsmedelssystem med ökad organiskt innehåll direkt i MS-jonkälla. Denna metod undviker användningen av dyra immobiliserade enzympartiklarna och inte kräver något stöd för att slutföra processen. Proteinupptaget och fullständig analysprov kan åstadkommas på mindre än ~ 3 min och ~ 30 minuter, respektive.
Introduction
Identifiering och karakterisering av renade proteiner är ofta uppnås genom att använda MS-tekniker. Proteinet digereras med ett enzym och dess peptider analyseras vidare medelst MS genom användning av en enkel infusionsexperimentuppställning. Proteolytisk nedbrytning är nödvändig för att generera små peptidfragment som faller i den användbara massområdet av de flesta MS analysatorer och som lätt kan splittrad genom lågenergi kollision dissociation att generera aminosyrasekvensinformation. För isolerade proteiner eller enkla proteinblandningar, det finns ingen ytterligare behov av kromatografisk separation av peptider före MS-detektion. En blandning av 25-50 peptider kan lätt analyseras genom infusion av provet med en sprutpump direkt i MS-jonkälla.
Masspektrometern kan utföra analysen och bekräfta sekvensen av ett protein inom en kort tidsram. Med moderna datainsamlingsmetoder, kan denna process utföras wnom några minuter eller till och med sekunder. Den begränsande faktorn för att fullborda hela processen på en kort tidsskala är den proteolytiska digereringssteget. Typiskt utförs detta under några timmar (eller O / N), i lösning, vid 37 ° C, med användning av substrat: enzymförhållanden av (50-100): 1. För att minska den enzymatiska uppslutningstiden till minuter eller sekunder, immobiliserade enzymmikroreaktorer, i form av mikroflödesreaktorer eller kommersiellt tillgängliga patroner, har beskrivits. 1-6 Typiskt är det enzym som immobiliseras genom kovalent, icke-kovalent / fysikalisk adsorption, komplex bildning eller inkapsling, varvid 3,6 den förbättrade effektiviteten av den enzymatiska processen möjliggörs av den stora ytan-till-volym och enzym-till-substrat-förhållanden. Ytterligare fördelar med immobiliserade reaktorer innefattar minskad autolys och störningar från enzymet i MS-analys, förbättrad enzymstabilitet och återanvändbarhet. En mängd olika metoder, med hjälp av glas eller polymera mikrofabricerade anordningar har beskrivits,användning av enzymer immobiliserade på magnetiska pärlorna genom antikropp-antigeninteraktioner, 7,8 innesluten i guld nanopartiklar nätverk, 9 inkapslade i titandioxid-aluminiumoxidsol-geler 10 och nanozeolites, 11 eller fångas genom Ni-NTA eller His-Tag komplexbildning. 6 Alternativt öppen rörformiga kapillärer med immobiliserade enzymer har utvecklats, liksom. 12 Dessutom förbättrad proteolytisk klyvning har visats med hjälp av kontrollerad mikrovågsbestrålning 13 eller tryckassisterad eller tryckcykelteknik (PCT) för att minska reaktionstiderna till 30-120 min. 14
Trots de många fördelarna med immobiliserade enzymreaktorer, kostnaderna för kommersiella patroner är hög, är tillgången på mikroflödessystem enheter för rutinmässig användning begränsad och användningen av mikrovågor eller PCT teknik resulterar i behov av ytterligare instrumentering. Målet med detta arbete var att utveckla en metod som circumveNTS dessa nackdelar, och som enkelt kan implementeras i varje laboratorium för att ge forskare med en enkel och effektiv metod för att utföra enzymatisk klyvning av proteiner i förberedelse för MS-analys inom några minuter. Det tillvägagångssätt förlitar sig på användningen av hydrofoba, C18-partiklar som är förinstallerade i en kapillär eller mikrofluidikanordning, och adsorptionen av protein (er) av intresse på dessa partiklar följt av enzymatisk digerering under infusionen av enzymet över packad bädd och fångade protein (er). I detta tillvägagångssätt är substratet immobiliseras genom icke-kovalenta interaktioner, och enzymet infunderas över immobiliserat protein. Den proteolytiska digere effektivitet ökas av de stora partikel ytareor som exponerar proteinet för enzymatisk behandling, reducerat avstånd och diffusionstider till och från ytan hos partiklar, förbättrad massaöverföring, ingen kovalent vidfästning som kan påverka enzymets aktivitet, förmåga att snabbt evaluate kombinationer av olika enzymer, disposability och multiplexering om processen exekveras i en mikroflödesformat. Detta tillvägagångssätt demonstreras med användning av en blandning av standardproteiner och trypsin-den mest använda enzym för proteolytisk digerering före ESI-MS-detektion. Den masspektrometer som används för detektering i denna studie var en linjär fälla kvadrupol (LTQ) instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Kapillär mikroreaktor
- Skär 100 um innerdiameter (ID) x 360 um ytterdiameter (OD) kapillär till en längd av 7-8 cm och 20 pm ID x 90 um OD kapillär till 3-5 cm med glas kapillär köttyxa; kontrollera i mikroskop att båda kapillära ändar har en ren, rak skärning, utan några utstickande grader.
- Sätt i 20 | j, m ID x 90 ^ m OD kapillär in i en ände av 100 | j, m ID x 360 ^ m OD kapillär, för en längd av ~ 6 mm; vid behov, följa denna operation under ett mikroskop.
- Applicera en liten droppe av lim E6000 runt korsningen av 90 um OD / 100 um ID kapillärer med slutet av en Q-tip, och låt limmet bota O / N vid RT.
- Skär den insatta 20 um ID x 90 um OD kapillär till en längd av ~ 10-15 mm; detta kommer att vara elektrosprayjonisering emitter.
- Pre-klippa 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK och 1/16 "OD PTFE badkaring i bitar på 4-5 cm i längd; dessa kommer att vara ärmarna används i kapillär föreningarna för att tillhandahålla en läckagefri anslutning.
- Anslut den andra änden av den 100 um ID x 360 um OD kapillär till en PEEK union; Använd en 1/32 "PEEK hylsa för att åstadkomma en läckagefri anslutning.
- Infoga / dra en bit av ~ 5 cm lång 1/16 "PTFE slang i den motsatta änden av facket.
- Väg ~ 4 mg C18 (5 pm) partiklar i en i förväg rengjord / torkad 2 ml glasflaska; tillsätt 0,5 ml isopropanol, stänga flaskan och sprida slammet i ultraljudbadet.
- Uttag med en spruta 250 l ca 200 l slam in injektionsnålen i 1/16 "PTFE slang av PEEK union, och fördela långsamt slammet till 100 um ID x 360 um OD kapillär, observera i mikroskop som kapillär fylls med partiklar tills en längd av 2-3 mm packning uppnås, vilket kommer att vara mikroreaktorn (Figur 1) 20 μ.m ID kapillär behåller partiklarna i mikroreaktorn genom en Keystone effekt. 15
- Skölj mikroreaktor med ~ 50 | il lösning av H2O / CH3CN 50:50 volym / volym, och sedan med ~ 50 | il lösning av H2O / CH3CN 98: 2 volym / volym.
2. Beredning av provlösningar
Notera: Åtgärder som innebär hantering av organiska lösningsmedel och syror och lösningsberedning ska utföras i ett dragskåp. Skyddsglasögon, handskar och skyddskläder.
- Skölj med CH3OH och torka ett par glasflaskor (4 ml) och polypropenrör (15 ml).
- Förbered 10 ml av en lösning av H2O / CH3CN (98: 2 volym / volym) i ett 15 ml polypropylenrör genom att blanda 9,8 ml H2O med 200 ^ il CH3CN; blanda genom ultraljudsbehandling.
- Förbered 10 ml av en lösning av H2O / CH3CN (50:50 vol / vol) i en 15 ml polypropylen rör genom att blanda 5 ml H 2 </ sub> O med 5 ml CH3CN; blanda genom ultraljudsbehandling.
- Förbereda 4 ml av en surgjord vattenlösning (TFA 0,01% volym / volym) genom att tillsätta 4 | j, l TFA (10%) till 4 ml H2O / CH3CN (98: 2 vol / vol) i en 4 ml glasflaska; blanda genom ultraljudsbehandling.
- Förbereda 4 ml av en surgjord organisk lösning (TFA 0,01% volym / volym) genom att tillsätta 4 | j, l TFA (10%) till 4 ml H2O / CH3CN (50:50 vol / vol) i en 4 ml glasflaska; blanda genom ultraljudsbehandling.
- Väg upp 16 mg NH 4 HCO 3 med en analytisk mikrovåg i en 4 ml glasflaska; tillsätt 4 ml av H2O / CH3CN (98: 2 vol / vol) -lösning och dispergera genom sonikering; detta resulterar i en 50 mM lösning av NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) i vattenhaltig buffert.
- Väg upp 5 mg av ett standardprotein (t.ex. bovint serumalbumin, hemoglobin α / β, cytokrom C, kolsyreanhydras, α-2-HS-glykoprotein, etc) med en analytisk mikrovåg i en 4 ml glasflaska; Tillsätt 4 ml DI water och sprida genom ultraljudsbehandling; Detta resulterar normalt i en koncentration lösning hög iM-nivå.
- Bered en ml proteinlösning (1-2 M) genom att späda koncentrationen lösning hög iM-nivå med en lämplig volym av NH 4 HCO 3 (50 mM) vatten buffert; blanda genom ultraljudsbehandling.
- Bereda trypsinlösning (5 pM) genom att lösa upp 20 jig sekvense-grade trypsin i 170 ^ il NH 4 HCO 3 (50 mM) vattenhaltig buffert; skingra genom ultraljudsbehandling.
3. Experimentell Setup
Obs! LTQ-MS Systemet är utrustat med en modifierad ESI källa som innehåller en hembyggda XYZ-stadiet som möjliggör samverkan av masspektrometern till olika provinmatningsmetoder.
- Koppla bort kapillära mikroreaktor från PEEK union och ansluta till PEEK Tee.
- Sätta i ett ~ 2 cm lång Pt tråd i sidoarm av PEEK utslags; Använd en 1/32 "PEEK hylsa för att tillhandahålla enläckagefri anslutning och för isolering Pt tråd.
- Ansluta en 50 | j, m ID x 360 ^ m OD (~ 0,5 m lång) provöverförings kapillär till den motsatta änden av PEEK utslags; Använd en 1/32 "PEEK hylsa för att åstadkomma en läckagefri anslutning.
- Fäst PEEK utslags på XYZ-scenen och placera ESI emitter ~ 2 mm bort från kapillär spektrometer inlopps massa.
- Anslut Pt tråden till ESI strömförsörjningskälla masspektrometern.
- Anslut den motsatta änden av provöverförings kapillär till förbundet rostfritt stål; Använd en 1/16 "PEEK hylsa för att åstadkomma en läckagefri anslutning.
- Anslut en 4-5 cm lång 1/16 "PTFE slang till den motsatta änden av unionen rostfritt stål och för in 250 pl injektionsnålen i PTFE slang, slå på pumpen och ställ in flödeshastigheten vid det önskade värdet (t.ex. 2 | j, l / min).
- Ingångs tandem MS datainsamling parametrar i det program som styr MS instrumentet end spara som en metod fil till färdig setup för att utföra analysen; för LTQ-MS-systemet använder följande databeroende analysparametrar: dynamisk uteslutning aktiverat för 180 sek med undantag massa bredd ± 1,5 m / z; en MS skanna följt av en zoom och MS 2 skanningar på de översta 5 mest intensiva toppar, zooma scan bredd ± 5 m / z; kollision dissociation (CID) parametrar som vid isolering bredd 3 m / z, normaliserad kollisionsenergi 35%, aktivering Q 0,25, och aktiveringstiden 30 ms.
4. Mikroflödesinställning
- Bered en mikrofluidikanordning av glas eller polymera substrat; 16-18 layouten på anordningen är försedd i figur 2A, som består av en mikroreaktor (1) (0,13 mm bredd x 2 mm längd x 50 | im djup) som är ansluten till ett inlopp (2 ), utlopp (3) och en sidoöppning (4); de sammanbindande kanaler för fluid manipulationer är ~110 um bred och ~ 50 pm djup; en flerkanalig struktur (5), som består av ~ 1,5-2 um djup x 10 um bred x 100 pm långa mikro placerade 25 pm från varandra, kommer att fungera som ett filter för att kvarhålla partiklar i mikroreaktor.
- Aktivera vätskeleverans anslutningar till chipset genom limning specialiserade kontakter till inloppsportarna, eller genom att utveckla en polymer stativ som rymmer beslag för avgivande av vätska (Figur 2B). 16
- Bered en uppslamning av C18-partiklar (5 ^ m) såsom beskrivits i steg 1,8; levererar slammet till mikroreaktor med en spruta med 1/16 "PTFE slang kopplad till chipet sidoöppningen (4), täta porten efter partikelfyllning med epoxilim och botemedel för en timme i en ugn vid 90 ° C 16.
- Sätt en kapillär (20 um ID x 90 um OD x 10 mm längd) i utloppsöppningen, täta med E6000 lim och låt bota O / N; detta kommer att bli ESI emitter (
- Ansluta en 50 | j, m ID x 360 ^ m OD (~ 0,5 m lång) provöverförings kapillär till chipet inloppsport (2); ansluta den motsatta änden av kapillären till en il spruta 250 och sprutpumpen, såsom beskrivs i 3,6-3,7.
- Placera en lätt PEEK Tee kontakten på provöverföringsledningen strax före inloppsöppningen (2) och sätt i en Pt tråd på sido arm Tee, som beskrivs i 3.2; detta kommer att vara ESI elektroden.
- Säkra mikroflödessystem enhet på XYZ scenen med ESI emitter placeras ~ 2 mm bort från massinlopps spektrometer kapillär; förbereda MS för analys som beskrivs i 3.8.
5. Prov laddas, proteolytisk nedbrytning och Eluering för MS-analys
Obs: Alla lösning / provöverföringssteg utförs med hjälp av en sprutpump och bör göra det möjligt för ytterligare några minuter att genomföra, för att kompensera för de döda-volumes i samband med överföringsledningarna till och från mikroreaktor; den nödvändiga tiden kommer att bero på de flödeshastigheter är involverade.
- Skölj mikroreaktor och förbereda den för analys genom att ingjuta en vattenlösning av NH 4 HCO 3 (50 mM) i H2O / CH3CN (98: 2 v / v) vid 2 | j, l / min under 5 min; Använd en spruta 250 l.
- Ladda provet protein (1 ^ M) på mikroreaktor genom infusion provlösningen vid 2 | j, l / min under 5 min; Använd en spruta 250 l.
- Ingjuta trypsinlösning (5 pM) över det adsorberade proteinet på mikroreaktor vid 2 | j, l / min i 1-3 min.
- Släck den proteolytiska rötningsprocessen genom sköljning av mikroreaktor med en surgjord vattenlösning av TFA (0,01% volym / volym) i H2O / CH3CN (98: 2 v / v) vid 2 | j, l / min under 5 min; Använd en spruta 250 l.
- Börja eluera proteinet smälta från mikroreaktor genom infusion en surgjord organisk lösning av TFA (0,01%volym / volym) i H2O / CH3CN (50:50 vol / vol) vid 300 nl / min.
- Slå på MS-data förvärvsprocessen och ESI spänning (~ 2000 V); förvärva MS-data med hjälp av datainsamlings parametrarna i steg 3,8; observera elueringen av de tryptiska peptiderna.
6. Data Processing
- Behandla tandem MS-data med en sökmotor kompatibel med rå MS dataformatet.
- Bearbeta LTQ-MS råfiler med hjälp av en organism specifik minimalt överflödig proteindatabasen; överföra rådata i sökmotorn, ange förälder och fragment jon mass toleranser till två och en Da, respektive, och endast använda helt tryptiska fragment med upp till två missade klyvningar till sökordet; inte tillåter posttranslationella modifieringar; ställa höga och medel förtroende falska upptäckt priser (FDR) till 1% och 3%, respektive, och inte tillåter posttranslationella modifieringar.
- Filtrera data för att välja bara hög förtroendepeptid motsvarar till proteinerna i databasen; utvärdera de protein- och peptid-nivå resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt resultat av en proteolytisk digestion process som utförs samtidigt på en blandning av proteiner, med de ovan beskrivna mikroreaktorer (figurerna 1 eller 2), ges i tabell 1. Tabellen innefattar de unika peptidsekvenser som identifierar ett speciellt protein, korset korrelations poäng (Xcorr) (det vill säga, en poäng som kännetecknar kvaliteten på den experimentella till teoretiska match för motsvarande tandem-masspektrum), antalet missade klyvningar, peptidladdningstillstånd (z), och massa / laddning ( m / z) av de protonerade peptider. På proteinnivå, ger bordet UniProt protein ID, beskrivning (namn) av proteinet, protein poäng och protein täckning. Alla proteiner kunde identifieras genom multipla peptider, efter en proteolytisk digerering utförs för 90 sek.
Den tid som krävs föreluering av alla peptider var beroende av längden av överförings kapillär som levererade den surgjorda organiska lösningen vid 300 Nl / min, en flödeshastighet förenlig med nano-ESI optimal drift. I-kapillär blandning av de vattenhaltiga och organiska surgjorda lösningar resulterade i den tidiga eluering av några peptider, men den stora majoriteten eluerades under flera minuter endast i den organiska lösningen. Ett masspektrum som visar sam-eluering av flera peptider representativa för de fem proteiner, som genereras med den kapillära mikroreaktor, tillhandahålls i figur 3.
Tabell 1. Förteckning över tryptiska peptider som genereras genom proteolytisk nedbrytning av fem proteiner med hjälp av kapillär mikroreaktor och O / N matsmältning protokoll. Endast unika sekvenser, med den högsta Xcorr, visas. Klicka här för att ladda ner filen.
Figur 1. Kapillär mikroreaktor. (A) Experimentuppställning för tillverkning av mikroreaktorn. (B) kapillär mikroreaktorer placerad i MS jonkällan. Den mikroreaktor laddas manuellt med C18-bundna kiseldioxidpartiklar och placerades på en XYZ-scen som underlättar korrekt placering i ESI-MS källa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikroflödesmikroreaktor. (A) Schematisk beskrivning av mikroflödesreaktorn. (B) mikroflödesreaktor fäst i en PEEK monter. Mikroflödesreaktor ennd överföringsledningar tillverkas i ett glassubstrat som kan fästas i en hemmagjord polymer PEEK står för ytterligare positionering i MS källa med XYZ scenen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Masspektrum omfattande tryptiska peptider som genereras från proteinblandningen utsattes för proteolys i mikroreaktor. De mest intensiva tryptiska peptidjoner är märkta med sekvensen av aminosyrorna och motsvarande protein identifierare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroreaktorn som beskrivs i detta arbete ger ett enkelt att implementera experimentuppställning för utförande av enzymatisk nedbrytning av proteiner för att möjliggöra MS-analys och identifiering på mindre än 30 min. De distinkta fördelarna med detta system, i jämförelse med konventionella tillvägagångssätt, innefattar enkelhet, snabbhet, låg reagensförbrukning och låga kostnader. I synnerhet finns det inget behov av dyra immobiliserade trypsin pärlor och patroner. Framställningen av den kapillära mikroreaktor är enkel (Figur 1A), och kan åstadkommas inom några minuter från likartade varor, som vanligen finns i en kromatografi laboratorium. Medan omvänd fas C18-partiklar kan sköljas med hög ekologisk halt lösningsmedel (CH3CN eller CH3OH) för fullständigt avlägsnande av adsorberade proteiner eller peptider, och mikroreaktor kan återanvändas, enkel och kostnadseffektiv tillverkningsprocess inbjuder till tillverkning av engångs enheter för engångs APPLIKheten. Kapillären mikroreaktor kan monteras i ett hem-byggda ESI-källa, såsom visas i figur 1B, eller kan sättas in i en kommersiell standard jonkälla. Medan partikelbädden för prov avskiljning och matsmältning behöver inte vara längre än ~ 1-2 mm, precis tillräckligt för att fånga tillräckligt med material för optimal detektering av MS, kan längden av kapillären själv justeras för att passa storleken på en viss jonkälla.
För laboratorier som har kapacitet att tillverka mikroflödessystem enheter, är en enkel konstruktion (Figur 2A) som kan fästas till ett ställ för att underlätta samverkan med MS-detektion (Figur 2B) tillhandahålls. Dimensionerna hos mikroreaktor och överföringskanaler kan anpassas till kraven för en viss tillämpning, och enheten kan utvecklas till en enda eller multiplex format. För de flesta kommersiella masspektrometrar skulle emellertid jonkällan behöver modifikationer för att medge the placering av anordningen i källan. Fotomask ritning för spån tillverkning utfördes med AutoCAD och fotomasken framställdes genom HTA fotomask. Tillverkningen av mikrochips utfördes i enlighet med protokoll som beskrivs tidigare: 17,18 inriktning av substratet med fotomasken, exponering för UV-ljus (360 nm), avlägsnande av den bestrålade fotoresisten och underliggande kromskiktet, våtkemisk etsning av kanaler med buffert oxidetsning, avlägsnande av den kvarvarande kromskiktet, borrning av accesshålen, rengöring, hydrolys av mikrochip ytan (NH4OH + H2O 2), och termisk bindning av substratet till det täckplattan genom gradvis upphettning till 550 ° C. Både substratet och täckplåt etsades, en för djupa kanaler för provhantering (~ 20-50 pm), och den andra för grunda mikrokanalfilterelement (1,5-2 um djup). 16
De resultat som erhållits med den ovan beskrivna microreactor är jämförbara med de resultat som erhållits från O / N, 19 konventionella uppslutnings protokoll som använder substrat: enzymförhållanden av (50-100): 1, följt av en peptid infusionsexperiment med MS-detektion (300 Nl / min, peptider löstes i H 2 O / CH3CN (50:50 vol / vol) surgjordes med CH3COOH, 0,1% volym / volym). Både mikroreaktor och konventionella protokoll möjliggjorde identifiering av alla proteiner av flera unika peptider (tabell 1). Typiskt en något större antal unika peptider per protein kunde observeras med mikroreaktor än med den konventionella installationen. Detta var ett resultat av ofullständig enzymatisk klyvning vid vissa platser. Några ytterligare minuters proteolytisk nedbrytning minskas eller elimineras detta resultat. Även vissa enzymatiska peptider genereras med mikroreaktor skilde sig från de som genereras i lösning, på grund av det faktum att för de proteiner som adsorberats på de C18-partiklar olika platser exponerades för enzymet tHan i homogena lösningar. 20 Xcorr poängen visar dock att kvaliteten på tandem masspektra genereras med mikroreaktor var av hög kvalitet, och att ett tillräckligt proteinsekvens täckning (11-75%) kan uppnås för entydiga protein identifieringar .
Tekniken, som beskrivs, är begränsad till en analys av ganska enkla proteinblandningar som genererar högst ~ 25-50 peptider som kan analyseras genom enkla infusionsexperiment och som inte nödvändiggör vätskekromatografisk separation före MS-analys. Avgörande för framgång är att använda nyligen tinade och beredda trypsin lösningar, att inte minska eller förlora aktiviteten hos det proteolytiska enzymet på operativ pH av mikroreaktor (dvs pH ~ 8). Dessutom måste man hitta en lämplig balans mellan de optimala flödeshastigheter för elektrosprayjonisering (150-300 nl / min) och maximal flödeshastigheter som kan tolereras av experimentuppställning och som möjliggörsnabb peptid eluering från mikroreaktor (2-3 | j, l / min). Högre än optimala ESI flöden resulterar i känslighet förluster och dåliga detektionsgränser. Som ett resultat, bör bibehållas längden av överförings kapillärerna så korta som möjligt för att minska den tid som krävs för eluering av peptider från mikroreaktor vid drift vid ≤300 nl / min. Alla komponenter som användes för försöksuppställningen kan ersättas med komponenter från andra tillverkare som utför liknande funktioner. Om de dimensionella egenskaperna av dessa komponenter skiljer sig åt (längd, diameter, volym), optimering av elueringssystemet flödeshastigheter, provkoncentration, tid för att utföra vissa steg och ESI spänningen kan vara nödvändigt att erhålla liknande resultat.
En unik fördel möjliggörs genom mikroflödes setup är förmågan att ytterligare inkorporera på chipet ett pumpsystem, t ex, ett elektroosmotiskt flöde driven pump, 21,22 för att möjliggöra för stand-alen drift av plattformen och integrationen av ett ytterligare separationssteg. Förmågan att utföra on-chip separationer av peptiderna som genereras genom proteolytisk nedbrytning kommer att resultera i förbättrade detektionsgränser, och kommer att underlätta analysen av komplexa proteinblandningar från cellextrakt. Detta kommer att ytterligare underlätta integreringen av tekniken i arbetsflöden som utnyttjar mikrofabricerade plattformar och höghastighets MS-detektion för biomedicinska tillämpningar. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H.
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
