Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging membranpotentialet med to typer af genetisk kodede Fluorescerende Spænding Sensorer

Published: February 4, 2016 doi: 10.3791/53566
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2,3, 2, 1,4, 2
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

Introduction

Den største fokus i dette papir er at demonstrere den optiske billeddannelse af ændringer i membran potentialer in vitro ved hjælp af genetisk kodet fluorescerende proteiner. Imaging ændringer i membranpotentiale giver spændende mulighed for at studere aktiviteten af ​​neuronale kredsløb. Når ændringer i membranpotentialet resultat i en fluorescensintensitet forandring, hver pixel i kameraet bliver et surrogat elektrode muliggør nonintrusive målinger af neuronal aktivitet. For over fyrre år har økologiske spændingsfølsomme farvestoffer været nyttigt til at observere ændringer i membranpotentialet 1-4. Men disse farvestoffer mangler cellulære specificitet. Desuden er nogle celletyper er vanskelige at farve. Genetisk indkodede Spændingsindikatorer (GEVIs) overvinde disse begrænsninger ved at have cellerne, der skal undersøges specifikt udtrykker det fluorescerende spændingsfølsomme probe.

Der er tre klasser af GEVIs. Den første klasse af GEVI bruger voltage-sensing domæne fra den spændingsdrevne sensing phosphatase med enten en enkelt fluorescerende protein (FP) 5-9- eller en Forster resonans (FRET) pair 10-12. Den anden klasse af sensorer anvender mikrobiel rhodopsin som en fluorescerende indikator direkte 13-15 eller via elektrokrome FRET 16,17. Den tredje klasse anvender to komponenter, den genetiske komponent er en membran forankret FP og en anden komponent er en membranbundet quenching farvestof 18-20. Mens den anden og tredje klasser er nyttige til in vitro og skive eksperimenter 19,20, kun den første klasse af sensorer er i øjeblikket anvendelige til in vivo analyser 6.

I denne rapport vil vi demonstrere billeddannelse af membranpotentialet ved hjælp af den første klasse af GEVIs (figur 1) in vitro. Denne første kategori af spændingssensorer er den nemmeste at overgangen til in vivo-afbildning. Da GEVIs utilizing en spænding-sensing domæne fusioneret til et FP er ca. 50 gange lysere end den rhodopsin klasse af sensorer, de kan afbildes ved hjælp af belysning buelampe snarere end at kræve en ekstremt kraftig laser. En anden konsekvens af forskellen i lysstyrke er, at den første klasse af GEVIs let kan overstige autofluorescens af hjernen. De rhodopsin-baserede prober ikke kan. Den tredje klasse af sensoren er lige så lyse som den første klasse, men kræver tilsætning af en kemisk quencher, som er vanskelige at administrere in vivo.

Vi vil derfor demonstrere erhvervelsen af en sonde med en enkelt FP (Bongwoori) 8 og en sonde, der består af et FRET-par (Nabi 2) 12. Den FRET konstruktioner i denne rapport, er sommerfugl versioner af VSFP-CR (spændingsfølsomme fluorescerende proteiner - Clover-mRuby2) 11, der består af et grønt fluorescerende donor, Kløver, og en rød fluorescerende acceptor, mRuby2, opkaldt Nabi 2,242 og Nabi 2,244

Figur 1
Figur 1. To typer af genetisk kodede Spændingsindikatorer (GEVIs) Trykte i denne rapport (A) En mono FP baseret GEVI have en trans-membran spænding-sensing domæne og et fluorescerende protein. (B) En FRET baseret GEVI består af en trans-membran spænding-sensing domæne, et FRET donor og acceptor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: Dyret eksperiment Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på KIST dyr protokol 2014-001.

1. Opsætning Udstyr

  1. setup Imaging
    1. Placer en inverteret fluorescensmikroskop på et vibrationsisolering tabel. Brug en stor forstørrelse (60X nedsænkning olie objektiv med 1,35 numeriske åbning) objektiv og et filter terning udstyret med et dikroisk spejl og filtre er egnede til de fluorescerende proteiner, der anvendes til spænding billeddannelse.
      Bemærk: Denne opsætning anvender et inverteret mikroskop for at anvende mål med højere NA, men opretstående mikroskoper kan også anvendes. Faktisk omvendt mikroskop er kun for probe udvikling siden højere numerisk åbning (NA) objektivlinsen indsamler mere lys end den ene med en lav NA derved forbedre signal-støjforholdet (SNR; kan beskrives som toppen optiske signal divideret med standardafvigelse for baselinefluorescens) af optagelsen. For ikke-udviklere, vil vi anbefale en opretstående mikroskop til applikationer såsom skive eller in vivo optagelser.
    2. Forbered en lyskilde, f.eks., Xenon buelampe, udstyret med en mekanisk lukker til effektiv epifluorescens wide-field billeddannelse. Rette lyset til mikroskopet via en lysleder montere. Lyset vil passere gennem excitation filter og reflekteres af det første dichroic spejl i filteret terning. Juster lys til at belyse prøven jævnt med maksimeret lysintensitet i synsfeltet 21.
      Bemærk: Traditionelt blev en 75 watt bue lygte da højere pærer watt lys skabe større men ikke lysere belysning felter. Lasere kan anvendes, men er begrænset til en enkelt bølgelængde. Lysdioder bliver lysere og kan faktisk være lyskilden valg tilbyder flere bølgelængder og ikke kræver en mekanisk lukker.
    3. Monter de to CCD-kameraer til fluorescerning mikroskop, som vist i figur 2D.
      Bemærk: Den første CCD-kamera har høj rumlig opløsning og anvendes til identifikation af en celle, der udtrykker GEVI i plasmamembranen, der skal testes. For imaging ændringer i membranpotentiale, sikre, at den anden CCD-kameraet har en høj frame rate, såsom 1000 ramme pr sek (fps). Brug en dobbelt port kamera adapter (figur 2D (3)) for at skifte det billeddannende sti mellem de to CCD-kameraer. I denne opsætning er en demagnifier bruges til at tilpasse billedet fra objektivets på CCD-chip i den anden CCD-kamera.
    4. Installere et billede splitter mellem den første (langsom) og anden (hurtig) CCD-kameraer til afbildning af FRET baseret GEVI. Sæt et filter terning har et dikroisk spejl (560 nm) og to emissioner filtre (520 nm / 40 & 645 nm / 75) i billedet splitter. Dette vil resultere i to synsfelter, en for donorfluorescensen og den anden repræsenterer acceptor fluorescens. Fjern denne second filter terning når billeddannelse en GEVI med en enkelt FP.
      Bemærk: Den enkelte FP baseret GEVI afprøvet i denne metode er Bongwoori som bruger FP, super ekliptika pHluorin A227D (SE A227D). Excitationsfiltret (472 nm / 30), emission filter (497 nm / lang pass) og det dikroiske spejl (495 nm) blev udvalgt baseret på dens excitations- og emissionsspektre 5. Generelt bør excitations- og emissionsfiltre har den største overlapning med hvert spektrum af fluoroforen til at erhverve et lyst billede, mens de dikroiske spejl blokerer enhver excitation lys transmitteret gennem emission filter. Udvælgelsen af filtre og dikroiske spejle til FRET-parret 11 baseret GEVI optagelse efter samme princip, bortset fra at det nødvendiggør et andet filter terning i billedet splitter for samtidig observation af donor og acceptor-fluorescens. Det første filter kube placeret i mikroskopet filter boksen skal have en excitationsfilter (475 nm / 23) for kløver. Derefter udsendes fluorescence fra både rammeprogrammer vil blive sendt til det andet filter terning gennem den første dichroic spejl (495 nm). Det andet filter terning har et dikroisk spejl (560 nm) og to emissionsfiltre (520 nm / 40 for Clover og 645 nm / 75 for mRuby2) for hver FP således separere fluorescens fra to forskellige rammeprogrammer.
Enkelt FP baseret GEVI
(Bongwoori) 		FRET-par baseret GEVI
(Nabi 2.42 & Nabi 2.44)
Første filter terning placeret i mikroskopet excitationsfilter 472 nm / 30 475 nm / 23
dichroic spejl 495 nm 495 nm
emissionsfilter 497 nm / lang pasning -
Andet filter terning placeret i stråledeleren dichroic spejl -
emission filter 1 - 520 nm / 40
emission filter 2 - 645 nm / 75

Tabel 1. To forskellige filtersæt anvendes til en enkelt FP Baseret GEVI og en FRET Based GEVI Recordings

  1. vibrationsisolering
    1. Monter ikke noget udstyr med bevægelige komponenter på vibrationsisolering tabellen. Sørg for, at de kabler, der er knyttet til ikke-isoleret udstyr er løse for at undgå vibrationer af prøven.
  2. Patch clamp kammer
    1. Forsegl bunden af ​​patch-clamp-kammer med et tyndt # 0 dækglas siden arbejdsafstand på målet er forholdsvis lille. Dette er en ulempe ved omvendt mikroskop setup.
      Bemærk: Som en afvejning af at have en høj NA objektivlinse, formindsker arbejdsafstand. For at placere specimen inden for meget kort arbejdsafstand, dækglasset og dækglasset (trin 2) skal være så tynd som muligt.
  3. kontrol Temperatur
    1. Sørg for, at badet løsningen strømmer gennem en temperaturregulator at opretholde de lappede-cellerne omkring 33 ° C under hele forsøget.
  4. Udstyr tilslutninger
    1. Forbind patch clamp forstærker og den mekaniske lukker af lyskilden til Bayonet Neill-Concelman (BNC) kommandoen kasse af den høje hastighed CCD-kameraet. Dette vil gøre det muligt for imaging software til at styre forstærkeren, kamera, og lyskilden samtidigt.
      Bemærk: De elektriske og billeddannende komponenter skal synkroniseres for at tilvejebringe samtidige elektriske og optiske optagelser af elektrisk aktivitet.

Figur 2
Figur 2. Equipling Opsætning til Voltage Imaging med GEVIs Arbejdsgangen efter strålegangen, (A) 75W Xenon buelampe, (B) excitationslyset fra lysbuen lampen filtreres af excitation filter og derefter reflekteres af den første dichroic spejlet, før den når til prøvebordet, en indsat i øverste højre hjørne viser helcelle konfiguration, (C) den langsomme CCD-kameraet bruges til at støtte både valget af en celle og patch-clamp, (D) erhvervelse billedet del; (1) den høje hastighed CCD-kamera, (2) det billede fordeler til både FRET-par og mono FP GEVIs, (3) den demagnifier at tilpasse billedet på CCD-chip i den høje hastighed CCD-kamera, (4) den dobbelt port kamera adapter til at skifte imaging vej og (5) den langsomme CCD kamera med høj rumlig opløsning til identifikation af cellen til plaster, (E & F) erhvervelsen billede med en enkelt-FP baserede GEVI (E) og en FRET-baserede GEVI(F). Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Ekspression af GEVIs

  1. I humane embryonale Kidney 293 celler
    1. Kultur human embryonisk nyre 293 (HEK 293) celler med Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en CO2-inkubator (5% CO2). Brug en vævskulturskål med 100 mm diameter og 20 mm højde. Start kultur med 2 x 10 3 - 6 x 10 3 celler / cm2 og inkuberes, indtil de når 80-90% konfluens til efterfølgende transfektion.
    2. På dagen for transfektion, aspireres cellemediet og forsigtigt vaske én gang med Dulbeccos phosphatbufret saltvand. Sprede HEK 293 celler med 0,25% trypsin-EDTA-opløsning for 1-2 min, aspireres løsningen og forsigtigt trykke den side af skålen for at frigøre calen. Tilføj frisk DMEM (10% FBS) og dissociere de klumpet celler ved pipettering. Bestemme koncentrationen celle ved anvendelse af et hæmocytometer.
    3. Placer 0,08 - 0,13 mm tyk, 10 mm diameter dækglas præ-coatet med poly-L-lysin i en 24-brønds vævskulturplade. Seed HEK 293-celler på dækglas ved 1 x 10 5 celler / cm2 celledensitet.
      Bemærk: Da HEK 293 celler er i stand til at danne gap junctions med hinanden, frø tal skal give isolerede celler.
    4. Transient transfektion af cellerne med en passende gen konstruktion, der koder en GEVI ved anvendelse af en lipofektionsreagens følge fabrikantens instruktion.
      Bemærk: De genkonstruktioner anvendes til dette trin udnyttet pcDNA3.1 (Bongwoori) og pUB2.1 (Nabi 2,242) som backbone vektorer. Mængden af ​​DNA anvendte var 100 ng for hver dækglas; dog transfektionsbetingelser behøver at bestemmes empirisk for hver GEVI der skal testes.
  2. I dissocieret mus hoftepocampal primære neuroner
    1. Dissekere hippocampi fra embryonisk dag 17 C57BL6 / N-mus og derefter dissociere hippocampale neuroner som tidligere beskrevet 22,23.
    2. Plade de dissocierede neuroner på poly-D-lysin overtrukne 0.08-0.13 mm tyk, 10 mm diameter dækglas på 1 x 10 5 celler / ml celletæthed. Inkuber cellerne ved 37 ° C i CO2-inkubator (5% CO2).
    3. Transficere dissocierede neuroner transient ved 6 - 7 dage in vitro (DIV) med en genkonstruktion der koder for et GEVI ved anvendelse af en calciumphosphat-transfektionsreagens som tidligere beskrevet 24.
      Bemærk: De genkonstruktioner anvendes til dette trin udnyttet pcDNA3.1 (Bongwoori) og pUB2.1 (Nabi 2,244) som backbone vektorer. Mængden af ​​DNA anvendte var 1 mg for hver dækglas. Igen, transfektion betingelser skal bestemmes empirisk for hver testet GEVI.
  3. Kontroller udtrykket niveauet før spænding imaging
    1. Tag vævskulturpladen fra CO2-inkubator og observere fluorescensen fra de transficerede celler under et epifluorescensmikroskop.
    2. Efter bekræftelse af fluorescens fra membranen, overføre dækglasset til patching kammer til spændingen billeddannelse i afsnit 3.
      Bemærk: Spændingen billeddannelse udføres 16 - 24 timer efter transfektion. Men som forskellige fluorescerende proteiner har forskellige modning gange, nogle GEVIs brug for mere tid i post transfektion. For eksempel kan FRET-par indeholdende mRuby2 i denne protokol tager længere tid at udtrykke da modningen af mRuby2 tager betydeligt længere end Clover 11. Fluorescensen af ​​både donor og acceptor bør kontrolleres.

3. Spænding Imaging Protocol

  1. Vælg en sund celle med god membran udtryk
    1. Brug af mikroskopi, finde en sund celle (figur 4B), der viser stærkmembran lokaliseret fluorescens i forhold til indre fluorescens. Prøv ikke at lappe afrundede celler. Cirkulære celler enten dividere eller døende og er vanskelige at lappe. Påfør en test puls 5,0 mV i amplitude og 5,0 ms varighed at hjælpe efterfølgende patch clamp-forsøg.
  2. Forbered cellen for spænding imaging
    1. Efter at have valgt en celle til plaster, placere patch clamp pipette over cellen. Bring pipette ned, indtil det netop rører cellemembranen. I dette trin observere 1 MW - 2 MOhm stigning i membran modstand på patch-clamp-software 25.
      BEMÆRK: Indimellem kan en god giga-ohm tætning ske blot ved at røre ved cellemembranen. Så længe giga-ohm tætning er stabil, bør det være OK.
    2. Etablere et giga-ohm tætning ved forsigtigt at anvende undertryk gennem pipetten. Indstil pipetten potentiale ved en ønsket holdepotentiale.
    3. Samtidig med at den giga-ohm segl, billede the celle med den høje hastighed CCD kamera og fokusere det til membranen område.
    4. Sprænge cellemembranen ved at anvende pulser af sugning gennem munden eller sprøjten for at få en helcelle konfiguration 26.
    5. Billede plasteret fastspændt celle under en hel celle clamp arrangement ifølge det eksperimentelle design ved hjælp af en billedbehandlingssoftware
      1. Start imaging-softwaren. Klik på [Acquire] - menuen [SciMeasure Kamera] for at åbne op for "CCD Acquire 'side.
      2. Opret en ny datafil at gemme billederne.
      3. Klik på [analog udgang] og derefter [Læs en ASCII] for at åbne op for en puls-protokol-fil til at gennemføre billeddannelse. Klik på 'Beregn gennemsnittet af de interne gentagelser ", hvis data skal beregnes. Luk derefter "analog udgang 'side.
        Bemærk: Denne puls protokol skal være konstrueret og gemmes som en ".txt" fil i henhold til formålet med hvert forsøg forud for dette skridt.
      4. Sæt specifikke regelværkition parametre fra "CCD Acquire 'side. Input særlige værdier for 'Antal rammer for erhvervelse «og» Antal forsøg «.
        Bemærk: Antallet af frames er bestemt af hastigheden af ​​køb og timingen af ​​puls-protokollen. For eksempel, hvis billeddannelse ved 1 kHz, 1.000 frames lig med 1 sek af optagetid.
      5. Klik på [TAGE DATA (Optik + BNC)] for at starte optagelsen. Mens spændingen billeddannelse finder sted, se oscilloskop vinduet fra patch-clamp-software for at sikre stabil helcelle konfiguration hele optagelsen.
        Bemærk: For at teste GEVI s lydhør spændingsområde, signal størrelse i bf / F værdi eller tidsmæssig opløsning hele fysiologiske spændingsområde, gennemføre en hel celle spænding clamp eksperiment med en puls-protokol har aftrappede spændingsimpulser spænder fra -170 mV til 130 mV. For at bestemme GEVI præstation i løsningen af ​​aktionspotentialer fremkaldt fra dyrkede primary neuroner, billede cellen under en hel celle strømtang konfiguration.

4. Data Acquisition

  1. Beregning af bf / F
    1. Start imaging-softwaren. Klik på [FILE] - [Læs datafil] for at åbne op for en datafil, der skal analyseres. Overhold cellen billedet i sin Resting Light Intensity (RLI) på højre side
      Bemærk: Den software gennemsnit de første 5 billeder til at bestemme RLI af optagelsen.
    2. Klik på 'Vis BNCs' for at bringe de nuværende og spænding værdier målt til skærmen.
    3. Skift side mode fra 'RLI ramme' til 'Ramme subtraktion "at udnytte rammen subtraktion funktion til at identificere pixels med responsive optiske signaler. Dette er den sande magt billedbehandling da hver pixel kan undersøges for potentielle ændringer i fluorescens.
    4. Vælg to tidspunkter (F 0 og F 1) til subtraktion. Identificer hvilket område af cellen erviser signaler som reaktion på membranpotentialet forandring.
      Bemærk: SNR for rammen subtraktion billeder kan forbedres ved at udvælge flere rammer for hvert tidspunkt til tidsmæssigt gennemsnit signalet. Softwaren fratrækker den gennemsnitlige lysintensitet taget fra valgte rammer og beregner F 1 -F 0 værdier (bf). Normalt vælger man et tidspunkt erhvervet på bedriften potentiale og et andet tidspunkt taget under stimulering periode.
    5. Udpege de pixels, der skal analyseres ved at trække eller klikke hver pixel med computermus. Observere den grafiske fremstilling af den gennemsnitlige fluorescensintensitet fra de udvalgte pixler på venstre side af softwaren vinduet. Figur 4B & 5B viser repræsentative billeder fra rammen subtraktion analyse.
    6. Opdel trækkes pixels af RLI (F 0). Klik på [Divide af RLIs] at erhverve bf / F-værdier
  2. Eksport af data Beregn bf / F værdier for hver spænding skridt til yderligere at analysere GEVI spænding sensing egenskaber. Brug disse værdier til at tegne grafer såsom bf / F versus spænding for efterfølgende dataanalyser.
  3. Fjern strøm og spænding grafer ved unclicking 'Vis BNCs' i menuen. Gå til [OUTPUT] - [Gem Spor som vist (ASCII)] for at eksportere fluorescens spor i en ASCII-fil format til kurvetilpasning analyse af standard graftegning software.

5. Data Analysis

  1. Spænding sensing ejendom GEVI
    1. Tegn fluorescens forandring versus spænding graf (FV) ved at plotte bf / F-værdier versus spænding i en dataanalyse program. Monter kurven til en Boltzmann-funktion (tabel 2) for at bestemme den af spændingerne det optiske signal ved at klikke på [Analysis] - [Montering] - [S-formet fit] - [dialogboksen Åbn], og vælg derefter Boltzmann-funktion.
      Bemærk: Montering til en funktion gør det possible at karakterisere spænding sensing egenskaber af forskellige spændingsniveauer sonder eller at sammenligne deres præstationer i forskellige celler. Boltzmann-funktionen kan anvendes til de testede i dette papir prober fordi FV Kurverne fra disse prober viser sigmoidal mønster.
    2. Normalisere hver bf / F værdien ved hjælp af første og endelige værdier (A 1 og A 2) beregnet af funktion.
      Bemærk: I Boltzmann ligning, minimum er A 1 og maksimum er A 2. For normalisering, bruge et regneark software til at justere bf / F-værdier ved at definere en 1 som nul og A 2 som én. Gennemsnittet af normaliserede bf / F-værdier og beregne standardafvigelsen for statistisk analyse.
    3. Replot den normaliserede bf / F-værdier versus spænding som tidligere beskrevet i afsnit 5.1.1).
  2. Hastigheden af ​​den optiske respons
    1. Åbn ASCII-filen erhvervet fra trin 4.2.2) med en dataanalyseprogram og plotte bf / F spor mod tiden.
    2. Klikke på "Data selector« i dataanalyse software og vælg en gang punkt, der svarer til begyndelsen af ​​en aftrappet spændingsimpuls og en anden gang punkt, når det optiske signal har nået steady state. Monter dette interval til både en enkelt og dobbelt eksponentiel henfald funktion ved at klikke på [Analysis] - [Montering] - [Eksponentiel fit] - [dialogboksen Open], og vælg en eksponentiel henfald funktion. Rapporter det bedre pasform.
      Bemærk: Ved montering på de enkelte eller dobbelte eksponentielle henfald funktioner, kan de kvantificerede tidskonstanter repræsenteret ved τ erhverves. Dette vil hjælpe eksperimentatorer sammenligne kinetik deres målinger udført med forskellige spændingsniveauer indikatorer. Fluorescensen spor kan vise hurtige og langsomme komponenter, der kan beskrives med en dobbelt eksponentiel henfald funktion. I dette tilfælde vil beregningen resultere i to tidskonstanter med forskellige amplituder.
    3. Beregn the vægtet τ konstanter sammenligning af kinetikken af ​​sonder udviser to temporale komponenter til sonder med en enkelt komponent.
      Bemærk: En vægtet tau beregnes som summen af τ 1 multipliceret med den relative amplitude, A 1, plus τ 2 ganget med den relative amplitude, A 2, som defineret ved følgende formel; ligning 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forbigående transficerede celler kan udvise signifikant variation i fluorescensintensiteten og graden af ​​plasmamembran-ekspression. Selv på den samme dækglas nogle celler vil have varierende niveauer af intern fluorescens. Dette er mest sandsynligt på grund af mængden af ​​transfektion middel absorberes af cellen. Lejlighedsvis, for meget ekspression forårsager cellen at opleve den udfoldede protein respons resulterer i apoptose 27 (lyse, afrundede celler, med stor indre fluorescens). Eksperimentatoren derfor advares om at teste både skarpt celler og dim celler med så lidt indre fluorescens som muligt, da den interne ekspression skaber en ikke-responsiv fluorescens, som sænker signal-støjforholdet (SNR).

En anden overvejelse er modning på kromoforer. Figur 3 viser forskel i fluorescens af acceptor chromophmalm (mRuby2), som har en længere modningstid end donorchromophoren (Clover).

Figur 3
Figur 3. Konfokal Billeder af HEK 293-celler transient transficeret med en FRET Based GEVI, Nabi2.242. (A) Konfokal billeder af en HEK-celle viser membran lokaliseret fluorescens fra FRET donor og acceptor, (B) Konfokal billeder, der viser en mulig konsekvens af langsom modning af mRuby2. Alle fire celler udviser Clover fluorescens mens kun to udviser mRuby2 fluorescens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Billederne blev erhvervet af et konfokalt mikroskop. For FRET donor, Clover, 488 nm laser blev anvendt til excitation og emissionen blev captmåles med 525/50 nm båndpasfilter. Den FRET acceptor, mRuby2 blev belyst med 561 nm laser til excitation og 595/50 nm båndpasfilter blev brugt til emission. Prøverne til konfokal billeddannelse blev fikseret med 4% paraformaldehyd / saccharoseopløsning i phosphatbufret saltvand justeret ved pH 7,4 og derefter monteret med et anti-fade reagens.

Når transfektionsbetingelser optimeres, den næste kilde til variation kommer fra bestemmelse af området af interesse, der skal analyseres. Brug af ramme subtraktion at identificere de regioner i cellen med den højeste fluorescens ændringen anvendes ofte til at maksimere bf / F-værdi. Et alternativ er at vælge alle de pixels, der modtager lys fra cellen. Dette øger antallet af pixel resulterer i reduktionen af ​​støj, men formindsker signalet størrelse eftersom ikke-responsiv indre fluorescens er inkluderet. Begge metoder er fint, så længe eksperimentatoren forbliver foreneligt.

"1"> Figur 4A viser fluorescens ændring af en HEK-celle udtrykker en enkelt-FP baserede GEVI, Bongwoori. Dette er en typisk fluorescens ændring i respons på trindelte spændingspulser. Ud fra disse data kan man plotte spænding følsomheden af ​​GEVI og bestemme den til og fra τ konstanter ved forskellige spændinger ved montering på et enkelt eller dobbelt eksponentiel henfald funktion. 16 forsøg er typisk gennemsnit når billeddannelse HEK celler for at forbedre SNR små spænding trin og at erkende en potentiel blegning under optagelsen. Disse prober, der giver et robust signal ved 100 mV kan testes i dissocierede hippocampale neuroner (figur 4C). Den fluorescens spor fra hippocampus neuron er en enkelt retssag.

Figur 4
Figur 4. Spænding Imaging med en enkelt FP Based GEVI Udtrykti HEK 293 celler og Hippocampal Primary neuroner. (A) bf / F spor af en enkelt FP baseret GEVI, Bongwoori, viser reaktioner på trindelte spændingspulser optaget ved 1 kHz med en høj hastighed CCD-kamera. (B) En HEK 293 celler afbildet med den høje hastighed CCD kamera; (Til venstre) Resting Light Intensity (RLI) af en celle, der udtrykker Bongwoori & (til højre) rammen subtraktion billedet angivelse af pixels, hvor fluorescens ændringen blev observeret. (C) Optisk registrering af inducerede aktionspotentialer fra mus hippocampus primære neuroner udtrykker Bongwoori. De aktionspotentialer blev fremkaldt under hele celle strømtang tilstand. Den bf / F spor blev valgt fra de pixels, korreleret til soma. Klik her for at se en større version af dette tal.

Et repræsentativt fluorescence udlæsning af donor og acceptorchromophorerne er vist i figur 5A. Polariteten af fluorescensen ændring er modsat for donoren og acceptoren muliggør ratiometrisk analyse at reducere korrelerede støjkilder, f.eks., Bevægelse. For eksempel vil bevægelse korreleret støj udvise en ændring i fluorescens i den samme retning for både donor og acceptor fluorescens. Mens FRET baseret probe er i stand til ratiometrisk billeddannelse, er det ofte bedre at kun analysere lysere kromofor. Dette skyldes, at lysdæmper kromofor væsentligt kan øge støjen af optagelsen. 5B viser denne effekt. Rammen subtraktion i figur 5B fra lysere Clover viser klart, hvor det optiske signal er i cellen. I modsætning hertil rammen subtraktion af mRuby2 fluorescens viser højere grader af støj i hele cellen. Derfor er kun donoren signal om Clover vist i en hippocampal neuron i Figur 5C.

Figur 5
Figur 5. Spænding billeddannelse med en FRET baseret GEVI udtrykt i HEK 293 cellen og hippocampale primære neuroner. (A) Bf / F spor af en FRET baseret GEVI, Nabi2.242, viser svarene på to bølgelængder til stepped spændingspulser optaget ved 1 kHz med en høj hastighed CCD-kamera. (B) Top; donor (Clover-RLI, Clover-frame subtraktion) og acceptor (mRuby2-RLI, mRuby2-frame subtraktion) billeder behandlet med to forskellige tærskler for hver FP, Bund; den samme tærskel blev brugt til både donor (Clover-RLI, Clover-frame subtraktion) og acceptor (mRuby2-RLI, mRuby2-frame subtraktion) billeder til at illustrere den relative dimness af mRuby2. Alle billederne blev taget fra den samme HEK 293 celler, der udtrykker Nabi2.242. (C) Den 520 nm bølgelængde tres af inducerede aktionspotentialer fra en mus hippocampus primær neuron udtrykker Nabi2.244 sensor. Den bf / F spor blev valgt fra de pixels, korreleret til soma. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Konsekvenser af varierende lysniveauer for bf og bf / F Værdier. (A) Et billede af en HEK 293 celler, der udtrykker en enkelt FP baseret GEVI, Bongwoori, vist i Resting Light Intensity (RLI), (B) fluorescens spor viser kerne gennemsnit Bf (F x -F 0) værdier fra tre forskellige regioner, region 1: membran region med godt lokaliseret fluorescenssignal, region 2: en region med lyse intern fluorescens, end region 3: region fjernt fra optisk signal, (C) fluorescens spor viser kerne gennemsnit bf / F-værdier fra de samme regioner i (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Begreber ligninger Bemærkning
Fractional fluorescens ændring (bf / F) ligning 2 F 1 = lysintensitet målt til tidspunktet, F 0 = lysintensitet målt ved holdepotentiale
Boltzmann-funktion ligning 3 y = bf / F, V = membranpotentialet i mV, V 1/2 er membranpotentialet i mV ved halvmaksimal bf / F, A A 2 = den maksimale værdi, dx = hældning
Dobbelt eksponentielt henfald funktion y = y 0 + A 1 e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 τ 1, τ 2 = tidskonstanter, A 1, A 2 = amplituder, t, t 0 = to tidspunkter, y 0 = offset

Tabel 2. Ligninger

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nervesystemet anvender spænding på flere forskellige måder, inhibering forårsager en mindre hyperpolarisering, synaptisk input forårsager en mindre depolarisering og et aktionspotentiale resulterer i en relativt stor spændingsændring. Evnen til at måle ændringer i membranpotentiale af GEVIs giver lovende potentiale analysere flere komponenter af neuronale kredsløb samtidigt. I denne rapport demonstrerer vi en grundlæggende metode til billeddannelse ændringer i membranpotentialet hjælp GEVIs.

En vigtig nøgle til billeddannende ændringer i spændingen er den effektive ekspression af GEVI i plasmamembranen. Intracellulær ekspression skaber en ikke-responsiv fluorescens, som reducerer SNR af sonden. Optimering af transfektionsbetingelser markant forbedrer konsistensen af ​​de optiske målinger. Faktisk ved test af en hidtil ukendt GEVI er det tilrådeligt at også teste en kendt probe for at sikre, at forskelle i optisk aktivitet skyldes fuldstændigt til NEw probe og ikke betingelserne for cellerne.

Figur 6 viser virkningen af indre fluorescens i faldende følsomheden af spændingen imaging, bf / F-værdi. Figur 6B viser bf værdier en HEK celle, der udtrykker den enkelt-FP baseret GEVI, Bongwoori. Trace 2 kommer fra region 2 (blå farve) hvor relativt lyse indre fluorescens ses i figur 6A. Dette spor har samme niveau af bf værdi som spor 1. I figur 6C, hvor sporene i figur 6B blev divideret med RLi værdier for bf / F-værdier, spor 2 dråber væsentligt på grund af den lyse interne fluorescens, som nedsætter bf / F værdier. Fluorescens spor 3 har en meget lille bf men har også en meget lille RLI værdi (F). Resultatet er en misvisende bf / F signal, der har en væsentlig stigning i støjen af ​​optagelsen. Dette eksempel blev medtaget for at vise bf er ogsåvigtig. En stor ændring i bf / F ikke nyttigt, hvis F er meget lav til at begynde med.

Anvendelsen af ​​et billede splitter muliggør samtidig måling af to bølgelængder på en enkelt CCD-kamera. Dette i høj grad hjælper måling af FRET afhængige fluorescerende ændringer for sonde udvikling og reducerer omkostningerne til opsætningen. Men på grund af kromatisk aberration, vil disse to billeder være lidt ude af fokus nødvendiggør behovet for en apokromatiske mål. Jo mere lys jo bedre SNR, så vælger mål med den højeste numeriske åbning forbedrer også fluorescens billeddannelse. Desuden kan man anvende stærkere lyskilder såsom lysemitterende dioder (LED) eller laser til at øge SNR. Lysdioder kræver ikke en mekanisk lukker.

I denne rapport viser vi de optiske signaler fra en enkelt FP GEVI og en FRET-baserede GEVI. Den største fordel ved et FRET-baseret GEVI er, at ratiometrisk billeddannelse muliggør reduktion af korreleret støj due til respiration og blodgennemstrømningen in vivo. Det modsatte polaritet fluorescerende signaler bekræfter en reel ændring i membranpotentialet. Men da fluorescensintensiteterne af de to kromoforer ofte variere betydeligt, SNR vil også variere. Dette forvirrer den ratiometrisk analyse og begrænser dets anvendelighed 28. Der kan også være en FRET-uafhængig signal 29. Det er derfor nogle gange bedre til at anvende den lysere fluorescerende kromofor ved brug af FRET til at analysere ændringer i membranpotentialet.

Spænding imaging er mere udfordrende end calcium imaging på grund af hastigheden og variabilitet af ændringerne i membranpotentialet i forhold til calcium imaging der måler calcium flux. Membranpotentialet ændringer i meget hurtige tidsfrister i forhold til calcium-ion flux, og tærskelværdien begivenheder i neuroner kan ikke måles med calcium imaging 30. Endvidere skal spændingsprobe være i plasmamembranenat være effektiv som reducerer mængden af ​​probe til rådighed for optisk rapport ændringer i membranpotentialet. Derved også antallet af fotoner, der rent faktisk kan nå frem til CCD-chip er relativt få. Dette kræver behovet for en høj hastighed og lav udlæsning støj kamera med høj kvanteeffektivitet og en probe, som fremkalder en høj SNR af ændringer i membranpotentiale. Ved billeddannelse celler in vitro, vil forskerne bedre at forstå de potentielle fordele og faldgruber GEVIs inden du forsøger in vivo målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted Microscope Olympus IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35) Olympus UPLSAPO 60XO
Excitation filter Semrock  FF02-472/30 For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Semrock FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp CAIRN OptoSource Illuminator LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera Hitachi KP-D20BU
Dual port camera adaptor Olympus U-DPCAD
High speed CCD camera RedShirtImaging, LLC NeuroCCD-SM
Image splitter CAIRN Optosplit 2
Excitation filter Semrock FF01-475/23-25 For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Chroma ET520/40
Dichroic mirror Semrock FF560-FDi01-25X36
Emission filter Chroma ET645/75
Vibration isolation system Kinetic systems 250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber Warner instruments RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) Electron Microscopy Sciences 72198-20
Temperature controller Warner instruments TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip Ted Pella 260366
Lipofection agent Life Technologies 11668-027
Calcium phosphate reagent Clontech - Takara 631312
Patch clamp amplifier HEKA EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software HEKA Patchmaster
Image acquisition and analysis software RedShirtImaging Neuroplex
Spreadsheet application software Microsoft Microsoft Excel 2010
Data analysis software OriginLab OriginPro 8.6.0
Demagnifier Qioptiq LINOS Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope Nikon Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Tags

Neuroscience Genetisk kodet spænding indikator spænding billedbehandling FRET billede splitter fluorescerende protein
Imaging membranpotentialet med to typer af genetisk kodede Fluorescerende Spænding Sensorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad,… More

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad, M., Jung, A., Sung, U., Song, Y. K., Baker, B. J. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J. Vis. Exp. (108), e53566, doi:10.3791/53566 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter