Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging membranpotensialet med to typer genetisk kodet Fluorescent Spenning Sensorer

Published: February 4, 2016 doi: 10.3791/53566
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2,3, 2, 1,4, 2
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

Introduction

De viktigste fokus for denne artikkelen er å vise den optiske bilde av endringer i membranpotensialer in vitro ved bruk av genetisk kodet fluorescerende proteiner. Imaging endringer i membranpotensiale tilbyr spennende mulighet til å studere aktiviteten til nevrale kretser. Når forandringer i membranpotensialet resulterer i en fluorescens-intensitet endring, blir hver piksel i kameraet et surrogat elektrode som gjør det mulig nonintrusive målinger av neuronal aktivitet. I over førti år har organiske spenningsfølsomme fargestoffer vært nyttig for å observere endringer i membranpotensialet 1-4. Men disse fargestoffer mangler cellulær spesifisitet. I tillegg er noen celletyper er vanskelige å farge. Genetisk kodede spenningsindikatorer (GEVIs) overvinne disse begrensningene ved at cellene som skal studeres spesifikt uttrykker det fluorescerende spenningsfølsom sonde.

Det er tre klasser av GEVIs. Den første klassen av Gevi bruker voltage-sensing domenet fra spenningsføler fosfatase med enten en enkel fluorescerende protein (FP) 5-9 eller en Förster resonans energi overføring (FRET) pair 10-12. Den andre klasse av sensorer benytter mikrobiell rhodopsin som en fluorescerende indikator direkte 13-15 eller via elektrokromatiske FRET 16,17. Den tredje klasse utnytter to komponenter, den genetiske komponenten være en membran forankret FP og en andre komponent er et membranbundet bråkjøling fargestoff 18-20. Mens den andre og tredje klasser er nyttige for in vitro-forsøk og eksperimenter stykke 19,20, bare den første klasse av sensorer er for tiden nyttige for in vivo-analyser 6.

I denne rapporten vil vi demonstrere avbildning av membranpotensialet ved bruk av første klasse av GEVIs (figur 1) in vitro. Denne første klasse av spenningssensorene er den enkleste å gå over til in vivo imaging. Siden GEVIs utilizing en spenningsføler domene fusert til et FP er omtrent 50-ganger sterkere enn den rhodopsin klasse av sensorer, de kan avbildes ved hjelp av buelampe belysning i stedet for å kreve en ekstremt kraftig laser. En annen konsekvens av den forskjellen i lysstyrke er at den første klassen av GEVIs lett kan overstige auto-fluorescens av hjernen. De Rhodopsin-baserte prober kan ikke. Den tredje klasse av sensoren er like sterk som den første klasse, men krever tilsetning av en kjemisk quencher som er vanskelig å administrere in vivo.

Vi vil derfor demonstrere oppkjøpet av en sonde med en enkelt FP (Bongwoori) 8 og en sonde som består av en FRET par (Nabi 2) 12. Gnage konstruerer i denne rapporten er sommerfugl versjoner av VSFP-CR (spenningssensitive fluorescerende proteiner - Clover-mRuby2) 11 som består av en grønn fluorescerende donor, Clover, og en rød fluorescerende akseptor, mRuby2, oppkalt Nabi 2,242 og Nabi 2,244

Figur 1
Figur 1. To typer genetisk kodet spenningsindikatorer (GEVIs) avbildet i denne rapporten (A) En mono FP basert Gevi ha en trans-membran spenningsføler domene og et fluorescerende protein. (B) En FRET basert Gevi består av en trans-membran spenningsføler domene, en FRET donor og akseptor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: The dyreforsøk protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Kist dyr protokollen 2014-001.

1. Oppsett Utstyr

  1. Imaging oppsett
    1. Plasser en omvendt fluorescens mikroskop på en vibrasjonsisolering bord. Bruke en høy forstørrelse (60x olje nedsenking linse med 1,35 numerisk apertur) objektiv linse og et filter kube utstyrt med et dikroisk speil og filtre egnet for de fluorescerende proteiner som brukes for spennings avbildning.
      Merk: Dette oppsettet benytter et invertert mikroskop for å ansette mål med høyere NA, men stående mikroskoper kan også anvendes. Faktisk, er den inverterte mikroskop bare for sonde utvikling siden høy numerisk apertur (NA) objektivlinse samler mer lys enn en med en lav NA derved å forbedre signal-til-støy-forhold (SNR, kan beskrives som toppen optiske signalet dividert med den standardavvik av referansefluorescens) av opptaket. For ikke-utviklere, vil vi anbefale en oppreist mikroskop for applikasjoner som skive eller in vivo opptak.
    2. Forbered en lyskilde, f.eks., Xenon arc lampe, utstyrt med en mekanisk lukker for effektiv epifluorescence bredt felt bildebehandling. Dirigere lyset til mikroskopet via en lysleder montere. Lyset vil passere gjennom filteret eksitasjon og reflekteres av den første dikroiske speilet i filteret kuben. Juster lys til å lyse prøven jevnt med maksimal lysintensitet over synsfeltet 21.
      Merk: Tradisjonelt ble en 75 watts arc lampe brukt siden høyere wattstyrke lyspærer skape større, men ikke lysere belysning felt. Lasere kan brukes, men er begrenset til en enkelt bølgelengde. LED blir lysere og kan faktisk være lyskilden av valget å tilby flere bølgelengder og som ikke krever en mekanisk lukker.
    3. Monter de to CCD-kameraer til fluorescerendeence mikroskop som vist i figur 2D.
      Merk: Første CCD-kamera har høy romlig oppløsning og anvendes for identifikasjon av en celle som uttrykker Gevi i plasmamembranen som skal testes. For bildebehandling endringer i membranpotensiale, sørge for at andre CCD-kameraet har en høy bildefrekvens som 1000 bilder per sekund (fps). Bruk en dual port kamera adapter (Figur 2D (3)) for å bytte bilde sti mellom de to CCD-kameraer. I dette oppsettet er en demagnifier brukes til å tilpasse bildet fra objektivet på CCD-brikken i andre CCD-kamera.
    4. Installer et bilde splitter mellom den første (sakte) og andre (rask) CCD-kameraer for avbildning av FRET basert Gevi. Sette inn et filter kube som har et dikroisk speil (560 nm) og to emisjonsfiltre (520 nm / 40 og 645 nm / 75) i bildet splitter. Dette vil resultere i to synsfelt, en for donor fluorescensen og den andre representerer akseptor fluorescens. Fjern denne second filter kube når imaging en Gevi med en enkelt FP.
      Merk: Den eneste FP basert Gevi testet i denne fremgangsmåte er Bongwoori som bruker FP, super ekliptikken pHluorin A227D (SE A227D). Eksitasjon filter (472 nm / 30), utslipp filter (497 nm / langt frem) og det dikroiske speil (495 nm) ble valgt på grunnlag av dens eksitasjon og emisjonsspektra 5. Generelt bør eksitasjon og emisjonsfiltre har det største overlapper med hvert spektrum av fluoroforen å skaffe seg et klart bilde mens dikroiske speil blokkerer enhver eksitasjon lys sendes gjennom utslipp filter. Valg av filtre og dikroiske speil til den FRET paret 11 basert Gevi opptak følger samme prinsipp, bortsett fra at det nødvendiggjør et andre filter kube i bildet splitteren for samtidig observasjon av donor og akseptor fluorescens. Det første filteret kuben plassert i mikroskopet filterboksen må ha en eksitasjon filter (475 nm / 23) for Clover. Deretter slippes fluorescence fra begge fps vil bli overført til det andre filteret kube gjennom den første dikroiske speil (495 nm). Den andre filter kube har en dichroic speil (560 nm) og to emisjonsfiltre (520 nm / 40 for Clover og 645 nm / 75 for mRuby2) for hver FP dermed skille fluorescens fra to forskjellige fps.
Enkelt FP basert Gevi
(Bongwoori) 		FRET par basert Gevi
(Nabi 2.42 og Nabi 2.44)
Første filter kube plassert i mikroskopet eksitasjonsfilteret 472 nm / 30 475 nm / 23
dichroic speil 495 nm 495 nm
utslipp filter 497 nm / lang pasning -
Andre filter kube plassert i strålesplitteren dichroic speil -
utslipp filter 1 - 520 nm / 40
utslipp filter 2 - 645 nm / 75

Tabell 1. To forskjellige filter sett som brukes til en enkelt FP Basert Gevi og en FRET baserte Gevi Recordings

  1. vibrasjons~~POS=TRUNC isolasjon
    1. Ikke monter noe utstyr med bevegelige deler på vibrasjonsisolering bord. Kontroller at kablene som er knyttet til ikke-isolert utstyr er løs for å unngå vibrasjoner av prøven.
  2. Patch klemme kammer
    1. Forsegle bunnen av patch clamp kammer med en tynn # 0 glasset ettersom arbeidsavstanden til målet er relativt liten. Dette er en ulempe av den inverterte mikroskop oppsettet.
      Merk: Som en byttehandel for å ha en høy NA objektiv, reduserer arbeidsavstand. For å plassere specimno innen meget kort arbeidsavstand, dekkglass og dekkglass (trinn 2) må være så tynn som mulig.
  3. temperatur~~POS=TRUNC kontroll~~POS=HEADCOMP
    1. Pass på at badekaret løsningen renner gjennom en temperaturkontroller for å opprettholde de lappet-cellene rundt 33 o C gjennom hele forsøket.
  4. utstyr tilkoblinger
    1. Koble patch clamp forsterker og mekanisk lukker på lyskilden til Bayonet Neill-Concelman (BNC) kommando boks av den høye hastigheten CCD kamera. Dette vil gjøre det mulig bildebehandlingsprogrammer for å styre forsterkeren, kamera, og lyskilden samtidig.
      Merk: De elektriske og bildebehandling komponenter må være synkronisert for å sørge for samtidige elektriske og optiske opptak av elektrisk aktivitet.

Figur 2
Figur 2. Equipment oppsett for spenning Imaging med GEVIs arbeidsflyten følgende lysbanen, (A) 75W Xenon buelampe, (B) eksitasjonslyset fra buelampen filtreres ved eksitasjon filteret og deretter reflekteres av den første dikroiske speil før den når frem til prøvestadiet, en innfelt øverst i høyre hjørne viser hele cellekonfigurasjon, (C) sakte fart CCD kamera brukes til å hjelpe både valg av en celle og patch clamp, (D) bildeinnlastingen del; (1) høyhastighets CCD-kamera, (2) bildet splitter for både gnage pare og mono FP GEVIs, (3) demagnifier å tilpasse bildet på CCD-brikken i høy hastighet CCD-kamera, (4) den doble porten kamera adapter for å bytte bilde sti og (5) sakte fart CCD kamera med høy romlig oppløsning for identifikasjon av cellen til lappen, (E & F) bildeinnlastingen med en single-FP basert Gevi (E) og en FRET basert Gevi(F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Expression of GEVIs

  1. I humane embryonale nyre 293 celler
    1. Kultur humane embryonale nyre 293 (HEK 293) celler med Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en CO2-inkubator (5% CO2). Bruk en vev kultur tallerken med 100 mm diameter og 20 mm høyde. Start kultur med 2 x oktober 3 til 6 x 10 3 celler / cm 2 og inkuberes før de når 80-90% konfluens for etterfølgende transfeksjon.
    2. På dagen for transfeksjon, bortsuging av cellemateriale og forsiktig vaske en gang med Dulbeccos fosfatbufret saltvann. Spre HEK 293 celler med 0,25% trypsin-EDTA løsning for 1-2 min, aspirer løsning og banke forsiktig på siden av fatet for å løsne calen. Legg frisk DMEM (10% FBS) og distansere de klumpet seg celler ved pipettering. Bestemme cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer.
    3. Plasser 0,08 - 0,13 mm tykk, 10 mm diameter dekkforhåndsbelagt med poly-L-lysin i en 24-brønners vevkulturplate. Seed de HEK 293 celler på objektglassene ved 1 x 10 5 celler / cm2 celletetthet.
      Merk: Siden HEK 293-celler som er i stand til å danne gap junctions med hverandre, må frøtallet å gi isolerte celler.
    4. Forbigående transfektere cellene med en passende gen konstruksjon som koder en Gevi ved hjelp av en lipofeksjon reagens etter produsentens anvisninger.
      Merk: genkonstruksjoner brukt for dette trinnet benyttes pcDNA3.1 (Bongwoori) og pUB2.1 (Nabi 2,242) som ryggrad vektorer. Mengden av DNA som ble brukt var 100 ng for hvert dekkglass; imidlertid transfeksjon betingelser må bestemmes empirisk for hver enkelt Gevi som skal testes.
  2. I dissosiert mus hippocampal primære nevroner
    1. Dissekere Hippocampi fra embryoniske dag 17 C57BL6 / N mus og deretter dissosiere hippocampale neuroner som tidligere beskrevet 22,23.
    2. Plate dissosiert nevroner på poly-D-lysin belagte 0.08-0.13 mm tykk, 10 mm diameter Dekk på 1 x 10 5 celler / ml celletetthet. Inkuber cellene ved 37 ° C i CO2-inkubator (5% CO2).
    3. Transfektere dissosiert nevroner forbigående på 6 - 7 dager in vitro (DIV) med en genkonstruksjon som koder for en Gevi ved anvendelse av en kalsiumfosfat-transfeksjon reagens som tidligere beskrevet 24.
      Merk: genkonstruksjoner brukt for dette trinnet benyttes pcDNA3.1 (Bongwoori) og pUB2.1 (Nabi 2,244) som ryggrad vektorer. Mengden av DNA som ble brukt var 1 ug for hver dekkglass. Igjen, transfeksjon betingelser må bestemmes empirisk for hver Gevi testet.
  3. Sjekk uttrykket nivået før spenning imaging
    1. Ta vevskulturplaten fra CO2-inkubator og observere fluorescensen fra de transfekterte celler under en epifluorescens mikroskop.
    2. Etter å ha bekreftet fluorescens fra membranen, overføre dekkglass til patching kammer for spenningen bildebehandling i § 3.
      Merk: Spenningen avbildning utføres 16-24 timer etter transfeksjon. Men som ulike fluorescerende proteiner har ulike modning tider, noen GEVIs trenger mer tid i innlegget transfeksjon. For eksempel kan gnage parene som inneholder mRuby2 i denne protokollen tar lengre tid å uttrykke siden modningen av mRuby2 tar betydelig lenger tid enn Clover 11. Fluorescensen fra både donor og akseptor skal kontrolleres.

3. Spenning Imaging Protocol

  1. Velg en sunn celle med god membran uttrykk
    1. Ved hjelp av mikroskopi, finne en sunn celle (figur 4B) som viser sterkmembran lokalisert fluorescens i forhold til intern fluorescens. Prøv ikke å lappe avrundede celler. Rundskriv cellene er enten dele eller døende og er vanskelige å lappe. Påfør en test pulsen på 5,0 mV i amplitude og 5,0 ms i varighet til hjelp senere patch clamp eksperimenter.
  2. Forbered cellen for spennings bildebehandling
    1. Etter å ha valgt en celle til patch, plasserer plasteret klemme pipette over cellen. Ta pipetten ned til den så vidt berører cellemembranen. På dette trinnet, observere en Megohm - 2 Megohm økning i membran motstand på lappen klemme programvare 25.
      MERK: Noen ganger kan en god giga-ohm forsegling skje ved å berøre cellemembranen. Så lenge den giga-ohm tetning er stabil, bør det være OK.
    2. Etablere en giga-ohm forsegling ved å forsiktig påføre undertrykk gjennom pipette. Still pipetten potensial ved en ønsket holdepotensial.
    3. Samtidig opprettholde den giga-ohm forsegling, bilde the celle med høy hastighet CCD-kamera og fokusere det til membranarealet.
    4. Revne cellemembranen ved å tilføre pulser av sug gjennom munnen eller sprøyte forsiktig for å lage en hel cellekonfigurasjon 26.
    5. Bilde plasteret fastspent celle under en hel celle klemme konfigurasjon i henhold til eksperimentell design ved bruk av en bildebehandling
      1. Start bildebehandlingsprogrammer. Klikk på [Hent] - [SciMeasure Kamera] -menyen for å åpne opp "CCD skaffe" side.
      2. Opprett en ny datafil for å lagre bildene.
      3. Klikk på [analog utgang] og deretter [Les en ASCII] for å åpne opp en pulsprotokoll fil for å utføre bildebehandling. Klikk på "Gjennomsnittlig interne repetisjoner» hvis data må i gjennomsnitt. Deretter lukker 'analog utgang' side.
        Merk: Denne pulsprotokollen må være utformet og lagret som en .txt-fil i henhold til formålet med hvert forsøk før dette trinnet.
      4. Sett bestemt regelverketition parametere fra "CCD skaffe" side. Input spesifikke verdier for 'Antall rammer for erverv "og" Antall forsøk'.
        Merk: Antall rammer bestemmes av hastigheten på oppkjøp og timingen av pulsprotokollen. For eksempel, hvis avbildning ved 1 kHz, 1000 bilder tilsvarer ett sekund av opptakstiden.
      5. Klikk på [TA DATA (Optics + BNC)] for å starte opptaket. Mens spenningen avbildning finner sted, se oscilloskop vinduet fra patch clamp programvare for å sikre stabil hel cellekonfigurasjon gjennom hele opptaket.
        Merk: For å teste Gevi responsive spenningsområde, signalstørrelsen i AF / F verdi eller tidsoppløsning på hele fysiologiske spenningsområde, gjennomføre en hel celle spenning klemme eksperiment med en pulsprotokoll ha trappet spenningsimpulser som spenner fra -170 mV til 130 mV. For å bestemme Gevi ytelse i løse aksjonspotensialer fremkalt fra kultivert primary nevroner, bilde cellen under en hel celle strømtang konfigurasjon.

4. Data Acquisition

  1. Beregning av AF / F
    1. Start bildebehandlingsprogrammer. Klikk på [Fil] - [Les datafil] for å åpne opp en datafil som skal analyseres. Observer celle bilde i hvile lysintensitet (RLI) på høyre side
      Merk: Programvaren gjennomsnitt de første 5 rammer for å bestemme RLI av opptaket.
    2. Klikk på 'Vis BNC-kabler "for å bringe strøm- og spenningsverdier målt til skjermen.
    3. Endre sidemodus fra 'RLI ramme "til" Frame subtraksjon "for å utnytte rammen subtraksjonsfunksjon å identifisere piksler med responsive optiske signaler. Dette er den sanne kraften i bilde siden hver piksel kan bli undersøkt for potensielle endringer i fluorescens.
    4. Velg to tidspunkter (F 0 og F 1) for subtraksjon. Identifisere hvilket område av cellen erviser signaler responsive til membran potensiell endring.
      Merk: SNR for helbilde subtraksjon bildene kan forbedres ved å velge flere rammer for hvert tidspunkt for å midlertidig gjennomsnittlig signalet. Programvaren trekker gjennomsnittlig lysintensitet tatt fra utvalgte rammer og beregner F 1 -F 0 verdier (Af). Vanligvis man velger et tidspunkt kjøpt til holding potensial og et annet tidspunkt tatt under stimuleringsperioden.
    5. Utpeke pikslene som må analyseres ved å dra eller klikke på hver piksel med datamus. Observer grafisk fremstilling av den gjennomsnittlige fluorescensintensitet fra de valgte bildeelementer på venstre side av programvaren vinduet. Figurene 4B og 5B viser representative bilder fra helbilde subtraksjon analyse.
    6. Del trekkes piksler av RLI (F 0). Klikk på [Divide av RLIs] for å skaffe AF / F verdier
  2. Eksporter data Beregn AF / F verdier for hver spenning skritt videre analysere Gevi spenning sensing egenskaper. Bruk disse verdiene til å tegne grafer som AF / F versus spenning for etterfølgende dataanalyser.
  3. Fjern strøm- og spennings grafer ved fjerne markeringen for alternativet "Vis BNC-kabler-menyen. Gå til [OUTPUT] - [Lagre spor som vist (ASCII)] for å eksportere fluorescens spor i en ASCII-fil format for kurvetilpasning analyse av standard grafer programvare.

5. Data Analysis

  1. Spenning sensing eiendommen av Gevi
    1. Tegn fluorescens endring versus spenning graf (FV) ved å plotte de AF / F-verdier versus spenning i en dataanalyseprogram. Monter kurven til en Boltzmann funksjon (tabell 2) for å bestemme spenningsområde av det optiske signalet ved å klikke på [Analyse] - [Fitting] - [sigmoidal fit] - [Open dialog], og velg deretter Boltzmann funksjon.
      Merk: Montering til en funksjon som gjør det possible for å karakterisere spenningsføler egenskapene til ulike spennings prober eller å sammenligne sine opptredener i forskjellige celler. Boltzmann-funksjon kan anvendes for probene som ble testet i dette papir fordi RB-kurvene fra disse probene viser sigmoidal mønster.
    2. Normaliser hver AF / F-verdi ved hjelp av de opprinnelige og endelige verdier (A 1 og A 2) beregnet i funksjonen.
      Merk: I Boltzmann ligningen, er minimum A 1 og maksimum er A 2. For normalisering, bruke regneark programvare for å justere AF / F verdier ved å definere A 1 som null og A 2 som én. Gjennomsnittlig de normalisert AF / F verdier og beregne standard feil for statistisk analyse.
    3. Replot den normaliserte AF / F-verdier versus spenning som tidligere beskrevet i avsnitt 5.1.1).
  2. Hastigheten på optisk respons
    1. Åpne ASCII-fil kjøpt fra trinn 4.2.2) med en dataanalyseprogram og plotte AF / F trase som funksjon av tiden.
    2. Klikk på "datavelgeren 'i dataanalyseprogramvare og velge et tidspunkt som svarer til begynnelsen av en trinnspenningspuls og et andre tidspunkt når den optiske signalet har nådd steady-state. Monter denne serien til både en enkel og dobbel eksponentiell funksjon ved å klikke [Analyse] - [Fitting] - [Eksponentiell fit] - [Open dialog], og velg en eksponentiell. Rapportere bedre passform.
      Merk: Ved å tilpasse til de enkle eller doble eksponentiell funksjoner, kan de tallfestede tidskonstanter representert ved τ bli kjøpt. Dette vil hjelpe forskere sammenligne kinetikken av sine målinger gjort med ulike spenningsindikatorer. Fluorescens spor kan vise raske og langsomme komponenter som kan beskrives med en dobbel eksponentiell. I dette tilfellet vil beregningen resultere i to tidskonstanter med forskjellige amplituder.
    3. Beregn the vektet ź konstanter å sammenligne kinetikk sondene stiller to time komponenter til sonder med en enkelt komponent.
      Merk: En vektet tau beregnes som summen av τ en multiplisert med den relative amplitude, A 1, pluss τ 2 multiplisert med den relative amplitude, A 2, som er definert ved den følgende formel; ligning 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forbigående transfekterte celler kan oppvise betydelige variasjoner i fluorescens intensitet og graden av plasmamembranen uttrykk. Selv på samme dekk noen celler vil ha varierende grad av intern fluorescens. Dette er mest sannsynlig på grunn av mengden av transfeksjon middel absorbert av cellen. Av og til fører til for mye uttrykk cellen til å oppleve den utbrettede protein respons som resulterer i apoptose 27 (lys, avrundet celler med høy indre fluorescens). Experimenter er derfor advares å teste både lyse celler og dim celler med så lite indre fluorescens som mulig, siden indre uttrykk skaper en ikke-responsiv fluorescens som senker signal til støyforholdet (SNR).

En annen vurdering er modning frekvensen av chromophores. Figur 3 viser forskjellen i fluorescens av akseptor chromophmalm (mRuby2) som har en lengre modningstid enn donor kromoforen (kløver).

Figur 3
Figur 3. Confocal bilder fra HEK 293-celler transient transfektert med et FRET-basert Gevi, Nabi2.242. (A) Confocal bilder av en celle som viser HEK membran lokalisert fluorescens fra FRET donor og akseptor, (B) Confocal bilder som viser en mulig konsekvens av langsom modning av mRuby2. Alle fire celler utviser Clover fluorescens mens bare to utstillings mRuby2 fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bildene ble kjøpt opp av et konfokal mikroskop. For FRET donor, Clover, 488 nm laser ble brukt for eksitasjon og utslipp ble captfigurert med 525/50 nm båndpassfilter. Gnage akseptor, mRuby2, ble belyst med 561 nm laser for eksitasjon og 595/50 nm båndpassfilter ble brukt for utslipp. Prøvene for konfokal avbildning ble fiksert med 4% paraformaldehyd / sukrose-løsning i fosfatbufret saltvann justert til pH 7,4 og deretter montert sammen med en anti-fading reagens.

Når transfeksjon betingelser er optimalisert, den neste kilde for variasjon kommer fra bestemme regionen av interesse som skal analyseres. Ved hjelp av helbilde subtraksjon for å identifisere områder av cellen med den høyeste fluorescens endringen blir ofte brukt for å maksimere AF / F-verdi. Et alternativ er å velge alle pikslene som mottar lys fra cellen. Dette øker antallet av bildeelementer som resulterer i reduksjon av støy, men senker signal størrelse siden non-responsive indre fluorescens er inkludert. Begge metodene er greit så lenge eksperimentator forblir konsekvent.

Figur 4A viser det fluorescensmønster endring av en HEK celle som uttrykker et enkelt-FP baserte Gevi, Bongwoori. Dette er et typisk fluorescens endring som respons på avtrappede spenningspulser. Fra disse data kan man plotte spenning følsomheten til Gevi og bestemme og på ź konstanter ved forskjellige spenninger ved montering til en enkelt eller dobbelt eksponentiell funksjon. 16 forsøk er typisk gjennomsnitt når avbildning HEK celler for å forbedre SNR av små spenningstrinn og for å påvise en eventuell bleking under innspillingen. De prober som gir et robust signal i 100 millivolt kan testes i dissosierte hippocampale neuroner (figur 4C). Den fluorescens spor fra hippocampus nevron er en enkelt rettssak.

Figur 4
Figur 4. Spenning Imaging med en enkelt FP Basert Gevi Uttrykti HEK 293-celler og hippocampus Primær nevroner. (A) AF / F spor av en enkelt FP basert Gevi, Bongwoori, som viser respons på avtrappede spenningspulser registrert ved 1 kHz med en høy hastighet CCD-kamera. (B) En HEK 293-celle avbildes med høy hastighet CCD-kamera; (Venstre) Resting lysintensitet (RLI) av en celle som uttrykker Bongwoori & (til høyre) på rammen subtraksjon bilde som viser bildepunktene hvor fluorescens endringen ble observert. (C) Optisk registrering av induserte aksjonspotensialer fra mus hippocampus primære nerveceller uttrykker Bongwoori. De aksjonspotensialer ble fremkalt i henhold helcelle strømtang modus. Den AF / F spor ble valgt fra pikslene korrelerte til soma. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En representant fluorescence avlesning av donor og akseptor kromoforer er vist i figur 5A. Polariteten av fluorescensen endringen er motsatt for den donor og akseptor slik at ratiometrisk analyse for å redusere korrelerte støykilder, f.eks., Bevegelse. For eksempel vil bevegelse korrelert støy oppviser en endring i fluorescens i samme retning for både donor og akseptor fluorescens. Mens FRET basert sonden er i stand til ratiometrisk bildebehandling, er det ofte bedre å bare analysere lysere kromofor. Dette er fordi den dimmeren kromofor kan vesentlig øke støyen for opptaket. Figur 5B viser denne effekt. Rammen subtraksjon i figur 5B fra den lysere Clover viser tydelig hvor det optiske signalet er i cellen. I motsetning til dette helbilde subtraksjon av mRuby2 fluorescens viser høyere grad av støy i hele cellen. Derfor er bare den giver signal av Clover vist i en hippocampus nevron i Figur 5C.

Figur 5
Figur 5. Spenning avbildning med et FRET basert Gevi uttrykt i HEK 293-celle og hippocampus primære neuroner. (A) AF / F spor av et FRET basert Gevi, Nabi2.242 viser responser ved to bølgelengder til avtrappede spenningspulser registrert ved 1 kHz med en høy hastighet CCD-kamera. (B) Top; donor (Clover-RLI, Clover-ramme subtraksjon) og akseptor (mRuby2-RLI, mRuby2-frame subtraksjon) bilder behandlet med to forskjellige terskler for hver FP, Bunn; den samme terskelen ble brukt både donor (Clover-RLI, Clover-ramme subtraksjon) og akseptor (mRuby2-RLI, mRuby2-frame subtraksjon) bilder for å illustrere den relative halvmørket mRuby2. Alle bildene ble tatt fra samme HEK 293 celle uttrykker Nabi2.242. (C) bølgelengde 520 nm tr Deness av induserte aksjonspotensialer fra en mus hippocampus primære nevron uttrykker Nabi2.244 sensor. Den AF / F spor ble valgt fra pikslene korrelerte til soma. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Konsekvenser av varierende lysnivåer for AF og AF / F verdier. (A) Et bilde av en HEK 293 celle som uttrykker et enkelt FP basert Gevi, Bongwoori, vist i Resting lysintensitet (RLI), (B) fluorescens spor viser kjernen i gjennomsnitt AF (F x -F 0) verdier fra tre forskjellige regioner, region 1: membran region med godt lokaliserte fluorescens signal, region 2: en region med lys innvendig fluorescens, end region 3: region fjernt fra optisk signal, (C) fluorescens spor som viser kjernen i gjennomsnitt AF / F verdier fra de samme områdene i (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

konsepter ligninger Bemerke
Delvis fluorescens endring (AF / F) ligning 2 F 1 = lysintensitet målt ved et tidspunkt, F 0 = lysintensitet målt ved å holde potensialet
Boltzmann funksjon ligning 3 y = AF / F, V = membran-potensial i mV, V 1/2 er membranpotensialet i mV ved halv-maksimal AF / F, A 2 = maksimumsverdien, dx = helling
Double eksponentiell y = y 0 + A en e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 ź 1, τ 2 = tidskonstanter, A 1, A 2 = amplituder, t, t 0 = to tidspunkter, y 0 = offset

Tabell 2. ligninger

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nervesystemet benytter spenning på flere forskjellige måter, fører til hemming en svak hyperpolarisering, fører synaptisk inngangs en svak depolarisering og et aksjonspotensial resulterer i en forholdsvis stor spenningsendring. Evnen til å måle endringer i membranpotensial ved GEVIs tilbyr det lovende potensialet til å analysere flere komponenter av nevronale kretser samtidig. I denne rapporten demonstrerer vi en grunnleggende metode for avbildning forandringer i membranpotensialet ved hjelp av GEVIs.

En viktig nøkkel for avbildnings forandringer i spenningen er den effektiv ekspresjon av Gevi i plasmamembranen. Intracellulær ekspresjon skaper en ikke-responsiv fluorescens som reduserer SNR av sonden. Optimalisere transfeksjonsagensene forholdene forbedrer vesentlig konsistensen av optiske målinger. Faktisk, når jeg tester en roman Gevi er det lurt å også teste en kjent sonde for å sikre at forskjeller i optisk aktivitet skyldes i sin helhet new probe og ikke forholdene i cellene.

Figur 6 viser virkningen av indre fluorescens i å redusere følsomheten for spennings avbildning, AF / F verdi. Figur 6B viser AF -verdier en HEK celle som uttrykker den enkelt-FP baserte Gevi, Bongwoori. Spor 2 kommer fra region 2 (blå farge) hvor forholdsvis lyse indre fluorescens blir vist i figur 6A. Denne kurven har lignende nivå av AF verdi som spor 1. Imidlertid, på figur 6C hvor trasene i figur 6B ble dividert med RLI verdier for AF / F-verdiene, dvs. den trasen 2 dråper betydelig på grunn av den lyse indre fluorescens som avtar AF / F verdier. Fluorescens spor 3 har en meget liten, AF, men har også en meget liten RLI verdi (F). Resultatet er en misvisende AF / F-signalet som har en vesentlig økning i lyden av opptaket. Dette eksemplet ble inkludert for å demonstrere den AF er ogsåviktig. En stor endring i AF / F er ikke nyttig hvis F er meget lav til å begynne med.

Bruken av et bilde splitteren muliggjør samtidig måling av to bølgelengder på en enkelt CCD-kamera. Dette hjelper i stor grad måling av FRET avhengige fluorescerende endringer for sonde utvikling og reduserer kostnadene for oppsettet. Men på grunn av kromatisk aberrasjon, vil disse to bildene være litt ute av fokus nødvendiggjør behovet for en Apokromatisk objektiv. Jo mer lys jo bedre SNR, så velger mål med høyest numerisk apertur forbedrer også fluorescens bildebehandling. I tillegg kan man bruke sterkere lyskilder, for eksempel lysemitterende dioder (LED) eller laser for å øke SNR. Lysdioder ikke krever en mekanisk lukker.

I denne rapporten viser vi de optiske signaler fra en enkelt FP Gevi og en FRET basert Gevi. Den største fordelen med et FRET-baserte Gevi er at ratiometrisk avbildning muliggjør reduksjon av korrelert støy due til åndedrett og blodstrøm in vivo. Det motsatte polaritet av de fluorescerende signaler som bekrefter en reell endring i membranpotensialet. Men siden fluorescensstyrkene til de to kromoforene ofte variere betydelig, SNR vil også variere. Dette forundrer ratiometrisk analyse og begrenser nytten sin 28. Det kan også være et FRET-uavhengig signal 29. Det er derfor noen ganger bedre å bruke bare lysere fluorescerende kromoforen når du bruker FRET å analysere endringer i membranpotensialet.

Spenning avbildning er mer utfordrende enn kalsium avbildning på grunn av hastigheten og variasjon av endringer i membranpotensial i forhold til kalsium avbildning som måler kalsium-fluks. Membran potensielle endringer i svært rask tidsskala i forhold til kalsium ion fluks og under terskel hendelser i nevroner kan ikke måles med kalsium bildebehandling 30. Videre må spenningen sonden være i plasmamembranenfor å være effektive som reduserer mengden av sonde er tilgjengelig for optisk rapport forandringer i membranpotensialet. Følgelig er antallet av fotoner som faktisk kan komme på CCD-brikken forholdsvis få. Dette krever behovet for en høy hastighet og lav lese-støy kamera med høy kvanteeffektivitet, og en sonde som utløser en høy SNR ved forandringer i membranpotensialet. Med CCD-celler in vitro, vil forskerne bedre forstå de potensielle fordelene og fallgrubene GEVIs før du prøver in vivo målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted Microscope Olympus IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35) Olympus UPLSAPO 60XO
Excitation filter Semrock  FF02-472/30 For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Semrock FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp CAIRN OptoSource Illuminator LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera Hitachi KP-D20BU
Dual port camera adaptor Olympus U-DPCAD
High speed CCD camera RedShirtImaging, LLC NeuroCCD-SM
Image splitter CAIRN Optosplit 2
Excitation filter Semrock FF01-475/23-25 For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Chroma ET520/40
Dichroic mirror Semrock FF560-FDi01-25X36
Emission filter Chroma ET645/75
Vibration isolation system Kinetic systems 250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber Warner instruments RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) Electron Microscopy Sciences 72198-20
Temperature controller Warner instruments TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip Ted Pella 260366
Lipofection agent Life Technologies 11668-027
Calcium phosphate reagent Clontech - Takara 631312
Patch clamp amplifier HEKA EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software HEKA Patchmaster
Image acquisition and analysis software RedShirtImaging Neuroplex
Spreadsheet application software Microsoft Microsoft Excel 2010
Data analysis software OriginLab OriginPro 8.6.0
Demagnifier Qioptiq LINOS Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope Nikon Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Tags

Neuroscience genetisk kodet spenningsindikator spenning bildebehandling slite bilde splitter fluorescerende protein
Imaging membranpotensialet med to typer genetisk kodet Fluorescent Spenning Sensorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad,… More

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad, M., Jung, A., Sung, U., Song, Y. K., Baker, B. J. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J. Vis. Exp. (108), e53566, doi:10.3791/53566 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter