Introduction
O foco principal deste trabalho é demonstrar a imagem óptica de mudanças no potencial de membrana in vitro utilizando proteínas fluorescentes geneticamente codificados. mudanças de imagem no potencial de membrana oferece a excitante possibilidade de estudar a atividade dos circuitos neuronais. Quando as alterações na membrana potencial resultado em uma mudança de intensidade de fluorescência, cada pixel da câmera torna-se um eletrodo substituto permitindo medições não invasivas da atividade neuronal. Por mais de quarenta anos, corantes orgânicos sensíveis à voltagem ter sido útil para observar as alterações no potencial de membrana 1-4. No entanto, estes corantes não possuem especificidade celular. Além disso, alguns tipos de células são difíceis de manchar. indicadores de tensão geneticamente codificados (GEVIs) ultrapassar estas limitações quando as células a ser estudados especificamente expressar a sonda fluorescente sensível à tensão.
Existem três classes de GEVIs. A primeira classe de GEVI usa o voltage de detecção de domínio a partir da fosfatase com sensor de tensão com uma única proteína fluorescente (PF) 5-9 ou um Förster transferência de energia de ressonância (FRET) par 10-12. A segunda classe de sensores utiliza rodopsina microbiana como um indicador fluorescente directamente ou através de FRET 13-15 electrocrómico 16,17. A terceira classe utiliza dois componentes, o componente genético ser um FP membrana ancorada e um segundo componente ser ligada à membrana corante têmpera 18-20. Enquanto as segunda e terceira categorias são úteis para a fatia in vitro e experiências 19,20, apenas a primeira classe de sensores são actualmente úteis para a análise in vivo 6.
Neste relatório, vamos demonstrar a imagem do potencial de membrana usando a primeira classe de GEVIs (Figura 1) in vitro. Esta primeira classe de sensores de tensão é a mais fácil fazer a transição para imagiologia in vivo. Desde GEVIs utilizing um domínio de detecção de tensão fundido com um PF são cerca de 50 vezes mais brilhante do que a classe de rodopsina de sensores, que pode ser trabalhada usando iluminação da lâmpada de arco em vez de exigir um laser extremamente poderosa. Outra consequência da disparidade em brilho é que a primeira classe de GEVIs pode facilmente exceder o auto-fluorescência do cérebro. As sondas à base de rodopsina não pode. A terceira classe de sensores é tão brilhante como a primeira categoria, mas requer a adição de um inibidor químico que é difícil administrar in vivo.
Vamos, portanto, demonstrar a aquisição de uma sonda com uma única FP (Bongwoori) 8 e uma sonda consistindo de um par de FRET (Nabi 2) 12. A FRET constrói neste relatório são versões borboleta de VSFP-CR (proteínas fluorescentes sensíveis à voltagem - Clover-mRuby2) 11 consistindo de um doador fluorescente verde, trevo, e um aceitador fluorescente vermelha, mRuby2, chamado Nabi 2.242 e 2.244 Nabi 
Figura 1. Dois tipos de indicadores geneticamente codificados tensão (GEVIs) Impressas neste relatório (A) A FP mono base GEVI ter um domínio de detecção de tensão trans-membrana e uma proteína fluorescente. (B) A GEVI base FRET composta por um domínio de detecção de tensão trans-membrana, um doador FRET e receptor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
declaração de ética: O protocolo de experiência com animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na KIST protocolo animais 2014-001.
1. Preparação do Equipamento
- configuração de imagem
- Coloque um microscópio de fluorescência invertido em uma mesa de isolamento de vibrações. Usar uma ampliação elevada (lente de imersão em óleo de 60X com 1,35 abertura numérica) da lente objectiva e um cubo de filtro equipado com um espelho dicróico e filtros adequados para as proteínas fluorescentes utilizados para a imagiologia de tensão.
Nota: Esta configuração utiliza um microscópio invertido com vista a utilizar com maior objectivos NA, mas microscópios verticais, também pode ser usado. Com efeito, o microscópio invertido é apenas para o desenvolvimento de sonda uma vez que mais elevada abertura numérica (NA), lente objectiva recolhe mais luz do que aquele com uma baixa NA melhorando assim a relação sinal-ruído (SNR; pode ser descrito como o sinal óptico de pico dividida pela desvio padrão de linha de basede fluorescência) de a gravação. Para os não-desenvolvedores, nós recomendamos um microscópio vertical para aplicações tais como fatia ou em gravações vivo. - Preparar uma fonte de luz, por exemplo., Lâmpada de arco de xénon, equipado com um obturador mecânico para epifluorescência eficiente de imagens de campo amplo. Direcionar a luz para o microscópio através de um guia de luz montar. A luz vai passar através do filtro de excitação e é reflectido pelo primeiro espelho dicróico no cubo de filtro. Alinhe a luz para iluminar a amostra uniformemente com intensidade de luz maximizada sobre o campo de visão 21.
Nota: Tradicionalmente, uma lâmpada de arco de 75 watts foi usado desde lâmpadas potência superior criar maior, mas não campos de iluminação mais brilhante. Os lasers podem ser utilizados, mas estão limitados a um único comprimento de onda. LEDs estão se tornando mais brilhante e pode de fato ser a fonte de luz de escolha oferecendo múltiplos comprimentos de onda e não exigindo um obturador mecânico. - Montar as duas câmeras CCD para fluorescia microscópio, conforme mostrado na Figura 2D.
Nota: A primeira câmara CCD tem uma elevada resolução espacial e é utilizado para a identificação de uma célula que expressa o GEVI na membrana do plasma a ser testado. Para alterações de imagem no potencial da membrana, garantir que a segunda câmara CCD tem uma alta taxa de quadros como 1.000 quadros por segundo (fps). Use um adaptador de câmera de porta dupla (Figura 2D (3)) para mudar o caminho de imagem entre as duas câmeras CCD. Nesta configuração, a demagnifier é usado para ajustar a imagem da lente objetiva no chip CCD na segunda câmara CCD. - Instale um divisor de imagem entre o primeiro (lento) e câmeras CCD segunda (rápido) para geração de imagens de GEVI base FRET. Inserir um cubo de filtro tendo um espelho dicróico (560 nm) e dois filtros de emissão (520 nm / 40 nm e 645/75) no divisor de imagem. Isto irá resultar em dois campos de visão, um para a fluorescência do dador e a outra representando a fluorescência aceitador. Remover este second filtro de cubo quando a imagem de um GEVI com um único FP.
Nota: A única GEVI baseado FP testados neste método é Bongwoori que utiliza a PF, super-elíptica pHluorin A227D (SE A227D). O filtro de excitação (472 nm / 30), filtro de emissão (497 nm / passe) e o espelho dicróico (495 nm) foram seleccionados com base no seu espectro de excitação e emissão 5. Geralmente, os filtros de excitação e de emissão deve ter a maior sobreposição com cada espectro do fluoróforo para adquirir uma imagem brilhante, enquanto os blocos de espelho dicróico qualquer luz de excitação transmitida através do filtro de emissão. A selecção dos filtros e espelhos dicróicos para a gravação GEVI do par de FRET base 11 segue o mesmo princípio, excepto que ele necessita de um segundo cubo de filtro no divisor de imagem para a observação simultânea de dador e aceitador de fluorescência. O primeiro cubo de filtro colocado na caixa de filtro microscópio precisa de ter um filtro de excitação (475 nm / 23) para o trevo. Em seguida, o f emitidaluorescence de ambos PQ irá ser transmitida a um segundo cubo de filtro através do primeiro espelho dicróico (495 nm). O segundo cubo de filtro tem um espelho dicróico (560 nm) e dois filtros de emissão (520 nm / 40 para Clover e 645 nm / 75 para mRuby2) para cada FP separando assim a fluorescência de dois PQ diferente.
- Coloque um microscópio de fluorescência invertido em uma mesa de isolamento de vibrações. Usar uma ampliação elevada (lente de imersão em óleo de 60X com 1,35 abertura numérica) da lente objectiva e um cubo de filtro equipado com um espelho dicróico e filtros adequados para as proteínas fluorescentes utilizados para a imagiologia de tensão.
| Único GEVI base FP (Bongwoori) | FRET GEVI base pair (Nabi 2,42 & 2,44 Nabi) | ||
| Primeiro cubo de filtro colocadas no microscópio | filtro de excitação | 472 nm / 30 | 475 nm / 23 |
| espelho dicróico | 495 nm | 495 nm | |
| filtro de emissão | 497 nm / passe longo | - | |
| cubo segundo filtro colocado no divisor de feixe | espelho dicróico | - | |
| um filtro de emissão | - | 520 nm / 40 | |
| filtro de emissão de dois | - | 645 nm / 75 |
Tabela 1. Dois conjuntos de filtros diferentes usados para uma GEVI FP Baseado único e um traste Baseadas GEVI Recordings
- isolamento de vibração
- Não montar qualquer equipamento com componentes móveis na mesa de isolamento de vibrações. Certifique-se de que os cabos que estão ligados ao equipamento não-isolados estão soltos para evitar vibrações da amostra.
- câmara de patch clamp
- Fecha-se o fundo da câmara de fixação de membranas com uma fina # 0 vidro de cobertura uma vez que a distância de funcionamento do objectivo é relativamente pequena. Esta é uma desvantagem da configuração do microscópio invertido.
Nota: A uma troca de ter uma elevada NA lente objectiva, a distância de trabalho diminui. A fim de colocar o SPECIMen dentro da distância muito curta de trabalho, a tampa de vidro e as lamelas (passo 2) precisa ser tão fino quanto possível.
- Fecha-se o fundo da câmara de fixação de membranas com uma fina # 0 vidro de cobertura uma vez que a distância de funcionamento do objectivo é relativamente pequena. Esta é uma desvantagem da configuração do microscópio invertido.
- Controle de temperatura
- Assegure-se que a solução de banho flui através de um controlador de temperatura para manter as células corrigidas cerca de 33 ° C ao longo da experiência.
- conexões de equipamentos
- Ligue o amplificador de patch-clamp eo obturador mecânico da fonte de luz para a caixa de comando do Baioneta Neill-Concelman (BNC) da câmera CCD de alta velocidade. Isso permitirá que o software de imagem para controlar o amplificador, câmera e a fonte de luz simultaneamente.
Nota: Os componentes eléctricos e de imagem necessitam de ser sincronizados, a fim de proporcionar para as gravações eléctricas e ópticas simultâneas de actividade eléctrica.
- Ligue o amplificador de patch-clamp eo obturador mecânico da fonte de luz para a caixa de comando do Baioneta Neill-Concelman (BNC) da câmera CCD de alta velocidade. Isso permitirá que o software de imagem para controlar o amplificador, câmera e a fonte de luz simultaneamente.
Figura 2. EquiparConfiguração mento para criação de imagens de tensão com GEVIs O fluxo de trabalho a seguir o caminho da luz, (A) lâmpada de arco 75W Xenon, (B) a luz de excitação da lâmpada de arco é filtrada pelo filtro de excitação e depois reflectido pelo primeiro espelho dicróico antes que ele atinja a o estágio exemplar, um encarte no canto superior direito mostra a configuração toda celular, (C), a câmera CCD de baixa velocidade é utilizada para auxiliar tanto a escolha de uma braçadeira celular e remendo, (D) a parte de aquisição de imagem; (1) a câmara CCD de alta velocidade, (2) o divisor de imagem para tanto do par de FRET e mono FP GEVIs, (3) o demagnifier para ajustar a imagem no chip CCD da câmara CCD de alta velocidade, (4) o duplo porta adaptador câmara para mudar a via de imagem e (5) a câmara CCD de baixa velocidade com alta resolução espacial para a identificação da célula de remendo, (e e F) a aquisição de imagens com um GEVI base single-PF (e) e um GEVI à base de FRET(F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Expressão de GEVIs
- Em células embrionárias humanas de rim 293
- Cultura embrionárias humanas de rim 293 (HEK 293), as células com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO 2). Use um prato de cultura de tecidos com 100 mm de diâmetro e 20 mm de altura. Iniciar a cultura com 2 x outubro 3-6 x 10 3 células / cm 2 e incuba-se até atingirem a confluência de 80-90% para a transfecção subsequente.
- No dia da transfecção, aspirar o meio celular e lavar suavemente uma vez com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. Dispersa-se as células HEK 293 com uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% durante 1-2 min, aspirar a solução e suavemente toque no lado do prato para soltar o Cells. Adicionar DMEM fresco (10% FBS) e dissociar as células aglutinados por pipetagem. Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro.
- Coloque 0,08 - 0,13 milímetro de espessura, 10 mm de diâmetro lamelas pré-revestidos com poli-L-lisina em uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Semear as células HEK 293 em lamelas em 1 x 10 5 células / cm2 densidade celular.
Observação: Uma vez que as células HEK 293 são capazes de formar junções de hiato uns com os outros, o número de sementes precisa para se obter células isoladas. - Transientemente transfectar as células com uma construção de gene que codifica para uma adequada GEVI usando um reagente de lipofecção seguindo as instruções do fabricante.
Nota: As construções de genes usados para este passo utilizado pcDNA3.1 (Bongwoori) e pUB2.1 (Nabi 2,242) como vectores espinha dorsal. A quantidade de ADN utilizada foi de 100 ng para cada lamela; No entanto, as condições de transfecção precisam de ser determinados empiricamente para cada GEVI a ser testado.
- Em hip dissociada do mouseneurônios primários pocampal
- Dissecar hipocampos de dia embrionário 17 ratinhos C57BL6 / N e, em seguida, dissociar os neurônios do hipocampo, como descrito anteriormente 22,23.
- Placa os neurônios dissociados onto-poli-D lisina revestidos 0.08-0.13 mm de espessura, 10 mm de diâmetro lamelas em 1 x 10 5 células / ml de densidade celular. Incubar as células a 37 ° C na incubadora de CO2 (5% de CO 2).
- Transfectar os neurónios dissociados de forma transiente em 6 - 7 dias in vitro (DIV) com uma construção de gene que codifica um GEVI usando um reagente de transfecção com fosfato de cálcio tal como anteriormente descrito 24.
Nota: As construções de genes usados para este passo utilizado pcDNA3.1 (Bongwoori) e pUB2.1 (Nabi 2,244) como vectores espinha dorsal. A quantidade de ADN utilizada foi de 1 mg para cada lamela. Mais uma vez, as condições de transfecção precisam de ser determinados empiricamente para cada GEVI testado.
- Verifique o nível de expressão antes da tensão imaGing
- Aqui a placa de cultura de tecido a partir da incubadora de CO 2 e observar a fluorescência a partir das células transfectadas sob um microscópio de epifluorescência.
- Depois de confirmar a fluorescência da membrana, transferir a lamela para a câmara de patch para a imagem latente de tensão na seção 3.
Nota: A imagiologia de tensão é conduzida 16-24 h após a transfecção. No entanto, como proteínas fluorescentes diferentes têm diferentes tempos de maturação, algumas GEVIs precisam de mais tempo na transfecção post. Por exemplo, os pares FRET contendo mRuby2 neste protocolo pode levar mais tempo para expressar uma vez que a maturação do mRuby2 leva muito mais tempo do que Clover 11. A fluorescência do dador e do receptor deve ser verificado.
3. Tensão Protocolo de imagem
- Escolha uma célula saudável com boa expressão membrana
- Usando a microscopia, encontrar uma célula saudável (Figura 4B), que mostra fortemembrana de fluorescência localizada em relação à fluorescência interna. Tente não para corrigir células arredondadas. As células circulares ou estão dividindo ou morrer e são difíceis de corrigir. Aplicar um pulso de teste de 5,0 mV em ms amplitude e 5.0 de duração para ajudar posteriores experimentos patch clamp.
- Prepare o celular para a imagem latente de tensão
- Depois de escolher uma célula de remendo, colocar a pipeta patch-clamp acima da célula. Traga a pipeta para baixo até que toque levemente na membrana celular. Nesta etapa, observe 1 mohms - 2 mohms aumento da resistência da membrana sobre o patch de software braçadeira 25.
NOTA: Ocasionalmente, uma boa vedação giga-ohm pode ocorrer simplesmente por tocar na membrana celular. Enquanto o selo giga-ohm é estável, deve ser OK. - Estabelecer um selo giga-ohm aplicando suavemente pressão negativa através da pipeta. Definir o potencial pipeta em um potencial de retenção desejado.
- Embora mantendo o selo giga-ohm, imagem the células com a câmara CCD de alta velocidade e concentrá-la para a área da membrana.
- Romper a membrana da célula por aplicação de pulsos de sucção por via oral ou seringa gentilmente para fazer uma configuração de célula inteira 26.
- Imagem do patch apertado célula sob uma configuração de fixação de células inteiras de acordo com o delineamento experimental, usando um software de imagem
- Inicie o software de imagem. Clique [ACQUIRE] - menu [SciMeasure Câmara] para abrir a página 'Acquire CCD ".
- Criar um novo arquivo de dados para guardar as imagens.
- Clique [Saída analógica] e depois [Leia um ASCII] para abrir um arquivo de protocolo de pulso para conduzir a imagem. Clique em "média das repetições internas" se os dados precisam ser calculada a média. Em seguida, feche a página de 'Analogue OUTPUT'.
Nota: Este protocolo de pulso precisa ser projetado e salva como um arquivo ".txt" de acordo com a finalidade de cada experimento antes desta etapa. - Definir acervo específicoparâmetros sição da página em 'adquirir CCD ". Introduza os valores específicos para 'Número de quadros para a aquisição "e" Número de ensaios'.
Nota: O número de quadros é determinada pela velocidade de aquisição e a temporização do protocolo de pulso. Por exemplo, se as imagens a 1 kHz, 1.000 quadros é igual a 1 segundo de tempo de gravação. - Clique [levar os dados (Optics + BNC)] para iniciar a gravação. Enquanto a tensão de imagem está a ter lugar, observar o osciloscópio janela a partir do software de patch clamp para garantir a configuração de célula inteira estável durante a gravação.
Nota: Para testar faixa de tensão responsiva do GEVI, tamanho do sinal em Af valor / F ou resolução temporal em toda a gama de tensão fisiológica, realizar um experimento de fixação de voltagem de células inteiras com pulsos de voltagem de um protocolo de pulso ter pisado que variam de -170 mV a 130 mV. Para determinar o desempenho da GEVI na resolução de potenciais de ação evocados a partir prima cultivadaneurônios ry, a imagem da célula sob uma configuração de pinça de corrente de células inteiras.
- Depois de escolher uma célula de remendo, colocar a pipeta patch-clamp acima da célula. Traga a pipeta para baixo até que toque levemente na membrana celular. Nesta etapa, observe 1 mohms - 2 mohms aumento da resistência da membrana sobre o patch de software braçadeira 25.
4. Aquisição de Dados
- Cálculo de Af / F
- Inicie o software de imagem. Clique [FILE] - [Read Data File] para abrir um arquivo de dados a serem analisados. Observe a imagem de células em sua intensidade de descanso Light (RLI) no lado direito
Nota: As médias de software os primeiros 5 quadros para determinar RLI da gravação. - Clique em 'Mostrar BNCs' para trazer os valores de corrente e tensão medidos para a tela.
- Alterar o modo de página de "RLI frame 'a' subtracção Frame 'para utilizar a função de quadro de subtração para identificar pixels com sinais ópticos responsivos. Este é o verdadeiro poder da imagem uma vez que cada pixel pode ser examinado para potenciais mudanças na fluorescência.
- Selecione dois pontos de tempo (F 0 e F 1) para subtração. Identificar qual a área da célula émostrando sinais que respondem à mudança de membrana potencial.
Nota: A SNR para as imagens de subtracção quadro pode ser melhorada por selecção de vários quadros para cada ponto de tempo para o sinal temporalmente média. O software subtrai à intensidade média tirada de quadros selecionados e calcula os F 1 -F 0 valores (Af). Normalmente, a pessoa escolhe um ponto de tempo adquirida no ponto de potencial e outro tempo segurando tomada durante o período de estimulação. - Designar os pixels que precisam ser analisados, arrastando ou clicando em cada pixel com o mouse do computador. Observar a representação gráfica da intensidade de fluorescência média dos pixels seleccionados no lado esquerdo da janela do software. As Figuras 4B e 5B mostram imagens representativas da análise quadro subtracção.
- Divida os pixels subtraídos pelo RLI (F 0). Clique [Dividir por RLIs] para adquirir valores Af / F
- Inicie o software de imagem. Clique [FILE] - [Read Data File] para abrir um arquivo de dados a serem analisados. Observe a imagem de células em sua intensidade de descanso Light (RLI) no lado direito
- Exportar dados
- Retirar gráficos de corrente e tensão por unclicking menu "Mostrar BNCs '. Vá para [OUTPUT] - [Salvar Traços como exibido (ASCII)] para exportar o rastreamento de fluorescência em um formato de arquivo ASCII para a curva análise encaixe por software gráfico padrão.
Análise 5. Os dados
- Tensão propriedade detecção do GEVI
- Desenhar a mudança de fluorescência em função do gráfico tensão (FV), plotando os valores Af / F contra tensão em um programa de análise de dados. Ajustar a curva para uma função de Boltzmann (Tabela 2) para determinar a gama de tensão do sinal óptico clicando em [Análise] - [Montagem] - [ajuste Sigmoidal] - [de diálogo Abrir], e depois escolher a função de Boltzmann.
Nota: Cabendo a uma função torna possible para caracterizar as propriedades de detecção de tensão de sondas diferentes de tensão ou para comparar os seus desempenhos em diferentes células. A função de Boltzmann pode ser utilizado para as sondas testadas neste trabalho porque as curvas de FV estas sondas mostram padrão sigmoidal. - Normalizar cada valor de Af / F, utilizando os valores iniciais e finais (A 1 e A 2) calculada pela função.
Nota: Na equação de Boltzmann, o mínimo é A 1 eo máximo é A 2. Para a normalização, usar um software aplicativo de planilha para ajustar os valores Af / F, definindo um 1 como zero e A 2 como um. Calcular a média dos valores Af normalizada / F e calcular o erro padrão para análise estatística. - Replot o Af normalizada / valores de F contra tensão como anteriormente descrito no ponto 5.1.1).
- Desenhar a mudança de fluorescência em função do gráfico tensão (FV), plotando os valores Af / F contra tensão em um programa de análise de dados. Ajustar a curva para uma função de Boltzmann (Tabela 2) para determinar a gama de tensão do sinal óptico clicando em [Análise] - [Montagem] - [ajuste Sigmoidal] - [de diálogo Abrir], e depois escolher a função de Boltzmann.
- A velocidade da resposta óptica
- Abra o arquivo ASCII adquirida a partir do passo 4.2.2) com uma análise de dadosprograma e traçar o traço Af / F em função do tempo.
- Clique sobre 'selector de dados "no software de análise de dados e seleccionar um ponto de tempo que corresponde ao início de um impulso de tensão escalonado e um segundo ponto de tempo quando o sinal óptico tenha atingido o estado estacionário. Se encaixam nesse intervalo para tanto uma simples e dupla função de decaimento exponencial clicando em [Análise] - [Montagem] - [ajuste exponencial] - [de diálogo Abrir] e escolha uma função de decaimento exponencial. Relatar o melhor ajuste.
Nota: por encaixe para as funções únicas ou duplas de decaimento exponencial, as constantes de tempo quantificados representados por τ pode ser adquirida. Isso irá ajudá-experimentadores comparar a cinética de suas medições feitas com diferentes indicadores de tensão. O traço de fluorescência pode mostrar componentes lentas e rápidas que podem ser descritos com uma função de decaimento exponencial dupla. Neste caso, o cálculo vai resultar em duas constantes de tempo com amplitudes diferentes. - Calcule the constantes τ ponderada para comparar a cinética de sondas que apresentam dois componentes temporais para sondas com um único componente.
Nota: A tau ponderado é calculado como a soma dos τ um multiplicado pela amplitude relativa, A 1, mais τ 2, multiplicado pela amplitude relativa, a 2, tal como definido pela seguinte fórmula;
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Representative Results
Transientemente células transfectadas podem exibir variação significativa na intensidade de fluorescência e o grau de expressão da membrana plasmática. Mesmo na mesma lamela algumas células terão diferentes níveis de fluorescência interna. Isto é muito provavelmente devido à quantidade de agente de transfecção absorvido pela célula. Ocasionalmente, muito expressão faz com que a célula para experimentar a resposta proteína desdobrada resultando em apoptose 27 (brilhante, células arredondadas, com alta de fluorescência interna). O experimentador é, portanto, alertado para testar ambas as células vivas e células dim com tão pouco de fluorescência interna quanto possível, pois a expressão interna cria uma fluorescência não-responsivos que reduz a relação sinal-ruído (SNR).
Outra consideração é a velocidade de maturação de cromóforos. A Figura 3 mostra disparidade na fluorescência do aceitador chromophminério (mRuby2) que tem um tempo de maturação mais longo do que o cromóforo doador (o trevo).
Figura 3. As imagens confocais de células HEK 293 transf ectadas transitoriamente com um baseada GEVI FRET, Nabi2.242. (A) imagens confocais de uma célula HEK membrana mostrando fluorescência localizada devida a FRET dador e o aceitador, (B) mostram imagens confocais de uma potencial consequência maturação lenta de mRuby2. Todas as quatro células exibem trevo de fluorescência, enquanto apenas duas exposições mRuby2 fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As imagens foram obtidas por um microscópio confocal. Para o doador FRET, Trevo, 488 a laser nm foi usado para a excitação e a emissão foi CAPTurado com 525/50 nm de banda do filtro. O aceitador FRET, mRuby2, foi iluminado com 561 nm de laser para excitação e 595/50 nm de banda do filtro foi utilizado para a emissão. As amostras de imagem confocal foram fixadas com 4% de solução de paraformaldeído / sacarose em solução salina tamponada com fosfato ajustado a pH 7,4 e, em seguida, montado com um reagente anti-desbotamento.
Uma vez que as condições de transfecção são optimizadas, a seguinte fonte de variação vem de determinar a região de interesse para ser analisado. Usando quadro subtracção para identificar as regiões da célula com o maior variação de fluorescência é muitas vezes usado para maximizar o valor de Af / F. Uma alternativa é seleccionar todos os pixels que recebem luz a partir da célula. Isto aumenta o número de pixels, resultando na redução do ruído, mas diminui o tamanho do sinal uma vez que a fluorescência interna não-responsivo está incluído. Ambos os métodos são muito bem contanto que o experimentador permanece consistente.
Figura 4. Imagem de tensão com uma Based GEVI Individual FP Expressoem HEK 293 células e neurônios do hipocampo primária. (A) Af / F traço de uma única base FP GEVI, Bongwoori, mostrando respostas aos pulsos de voltagem escalonadas gravadas em 1 kHz com uma câmera CCD de alta velocidade. (B) Uma célula HEK 293 fotografada com a câmara CCD de alta velocidade; (À esquerda) Intensidade de descanso Light (RLI) de uma célula que expressa (direita) a imagem de subtração quadro indicando os pixels onde foi observada mudança de fluorescência Bongwoori &. (C) A gravação ótica de potenciais de ação induzida a partir do rato neurônios primários do hipocampo expressam Bongwoori. Os potenciais de ação foram evocados sob o modo de pinça de corrente de células inteiras. O traço Af / F foi selecionado entre os pixels correlacionados com a soma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A fluo representanterescência leitura dos cromóforos doador e receptor é mostrada na Figura 5A. A polaridade da mudança de fluorescência é oposta para o dador e o aceitador permitindo a análise raciométrica para reduzir as fontes de ruído correlacionadas, por exemplo., O movimento. Por exemplo, o movimento correlacionado ruído irá apresentar uma alteração da fluorescência na mesma direcção para o dador e o aceitador de fluorescência. Enquanto a sonda baseado FRET é capaz de imagem raciométrica, muitas vezes é melhor para analisar apenas o cromóforo mais brilhante. Isto é porque o cromóforo dimmer pode aumentar substancialmente o ruído da gravação. A Figura 5B mostra o efeito. A subtracção do quadro na Figura 5B do trevo mais brilhante mostra claramente onde o sinal óptico é na célula. Em contraste, a subtracção de quadros de fluorescência mostra mRuby2 graus mais elevados de ruído em toda a célula. Portanto, somente o sinal de doadores de Clover é mostrado em um neurônio hipocampo em Fi5C figura.
Figura de imagem 5. Tensão com um FRET com base GEVI expressa em células 293 HEK e neurônios primários do hipocampo. (A) Af / F traço de um GEVI FRET com base, Nabi2.242, mostrando respostas em dois comprimentos de onda de pulsos de voltagem escalonadas gravadas em 1 kHz com uma câmera CCD de alta velocidade. (B) superior; o doador (o trevo-RLI, Trevo-frame subtração) e receptor (mRuby2-RLI, mRuby2-frame subtração) imagens processadas com dois limites diferentes para cada FP, Inferior; o mesmo limiar foi utilizado tanto para doadores (Clover-RLI, Trevo-frame subtração) e receptor de imagens (mRuby2-RLI, mRuby2-frame subtração) para ilustrar a obscuridade relativa de mRuby2. Todas as imagens foram obtidas a partir da mesma célula HEK 293 que expressam Nabi2.242. (C) O comprimento de onda de 520 nm, trace de potenciais de ação induzida a partir de um rato neurônio primária do hipocampo expressam sensor de Nabi2.244. O traço Af / F foi selecionado entre os pixels correlacionados com a soma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Consequências de diferentes níveis de luz para Af e Af / F valores. (A) Uma imagem de uma célula HEK 293 que expressam uma única base FP GEVI, Bongwoori, mostrado na intensidade de descanso Light (RLI), (B) os traços de fluorescência mostrando núcleo média Af (F x -F 0) valores de três regiões diferentes, região 1: região da membrana com sinal de fluorescência bem localizada, a região 2: uma região com fluorescência interna brilhante, umd região 3: região distante do sinal óptico, (C) os traços de fluorescência mostrando núcleo valores médios Af / F provenientes das mesmas regiões em (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Conceitos | equações | Observação |
| mudança de fluorescência fracionário (Af / F) |  | F 1 = intensidade da luz medido em um ponto do tempo, F 0 = intensidade da luz, medido potencial segurando |
| função de Boltzmann |  | Y = Af / F, V = potencial de membrana em mV, V 1/2 é o potencial de membrana em mV em metade do valor máximo Af / F, A |
| função de decaimento exponencial dupla | y = y 0 + A 1 e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 | τ 1, τ 2 = constantes de tempo, A 1, A 2 = amplitudes, t, t 0 = dois momentos, y 0 = offset |
Tabela 2. Equações
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Discussion
O sistema nervoso utiliza a tensão de várias maneiras diferentes, a inibição provoca uma ligeira hiperpolarização, entrada sináptica provoca uma ligeira despolarização e uma acção potencial resulta numa mudança relativamente grande tensão. A capacidade de medir as mudanças no potencial da membrana por GEVIs oferece o potencial promissor de analisar vários componentes de circuitos neuronais simultaneamente. Neste relatório nós demonstramos um método fundamental para mudanças de imagem no potencial de membrana usando GEVIs.
Uma chave importante para mudanças de imagem em tensão é a expressão eficiente do GEVI na membrana plasmática. a expressão intracelular cria uma fluorescência não responsivos que reduz o SNR da sonda. Optimização das condições de transfecção vastamente melhora a consistência das medições ópticas. Com efeito, quando se testa um romance GEVI é aconselhável também testar uma sonda conhecida, para assegurar que as diferenças na actividade óptica é devida inteiramente à NEW sonda e não as condições das células.
A Figura 6 mostra o efeito de fluorescência interna na diminuição da sensibilidade da imagiologia de tensão, valor de Af / F. A Figura 6B mostra Af valoriza uma célula HEK expressando o GEVI base single-FP, Bongwoori. Traço 2 vem da região 2 (cor azul), onde relativamente brilhante fluorescência interna é visto na Figura 6A. Este rastreio tem nível semelhante de valor Af como traço 1. Contudo, na Figura 6C onde os traços na Figura 6B foram divididos pelos valores de RLI para valores Af / F, o traçado 2 gotas de forma significativa devido à fluorescência brilhante interna que diminui Af / F valores. Fluorescência traço 3 tem uma muito pequena Af, mas também tem um valor muito pequeno RLI (F). O resultado é um sinal Af enganosa / F que tem um aumento substancial do ruído da gravação. Este exemplo foi incluído para demonstrar a Af é igualmenteimportante. Uma grande mudança no Af / F não é útil se F é muito baixo para começar.
O uso de um divisor de imagem permite que a dosagem concomitante de dois comprimentos de onda para uma única câmara CCD. Isso ajuda grandemente a medição de FRET alterações dependentes fluorescentes para o desenvolvimento da sonda e reduz o custo da instalação. No entanto, devido a aberração cromática, essas duas imagens serão ligeiramente fora de foco havendo a necessidade de um objectivo apochromatic. Quanto mais luz, melhor SNR, de modo a escolher objetivos com a maior abertura numérica também melhora a imagem de fluorescência. Além disso, pode-se utilizar fontes de luz fortes, tais como diodos emissores de luz (LED) ou um laser para aumentar a SNR. LEDs não necessitam de um obturador mecânico.
Neste relatório nós mostramos os sinais ópticos de uma única FP GEVI e uma GEVI baseada em FRET. A principal vantagem de um GEVI-FRET base é que a imagem raciométrica permite a redução de ruído correlacionado due a respiração e fluxo de sangue in vivo. A polaridade oposta dos sinais fluorescentes confirma uma verdadeira mudança no potencial da membrana. No entanto, uma vez que as intensidades de fluorescência dos dois cromóforos variam frequentemente de forma significativa, o SNR irá também variar. Isso confunde a análise raciométrica e limita a sua utilidade 28. Há também pode ser um sinal independente de FRET 29. Por conseguinte, é por vezes preferível utilizar apenas o cromóforo fluorescente brilhante quando se utiliza FRET para analisar as modificações no potencial da membrana.
imaging tensão é mais desafiador do que imagem de cálcio devido à velocidade e à variabilidade das mudanças no potencial da membrana em comparação com imagem de cálcio que mede o fluxo de cálcio. A membrana possíveis mudanças em escalas de tempo muito rápido em comparação com o fluxo de iões de cálcio e eventos subliminares em neurônios não pode ser medido com a imagem de cálcio 30. Além disso, a sonda de tensão deve estar na membrana plasmáticapara ser eficaz o que reduz a quantidade de sonda disponível para alterações de relatório opticamente no potencial da membrana. Por conseguinte, o número de fotões que pode realmente chegar ao chip CCD é relativamente pequeno. Isto exige a necessidade de uma alta velocidade e baixo ruído câmara de leitura com alta eficiência quântica e uma sonda que provoca um elevado SNR sobre alterações no potencial de membrana. Por imagem de células in vitro, os pesquisadores irão entender melhor os potenciais benefícios e armadilhas da GEVIs antes de tentar em medições in vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
- Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
- Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
- Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
- St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
- Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
- Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
- Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
- Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
- Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
- Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
- Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
- Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
- Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
- Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
- Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
- Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
- Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).
