Introduction
本文的主要重点是说明使用基因编码荧光蛋白在体外膜电位的变化的光学成像系统。在膜电位成像变化提供学习的神经元回路的活性的令人兴奋的可能性。当改变膜电位结果在荧光强度变化，相机的各像素变为一个替代电极使神经元活动的非侵入式测量。四十多年来，有机电压敏感的染料已经观察膜电位1-4的变动情况。然而，这些染料缺乏蜂窝特异性。此外，某些类型的细胞都难以染色。通过使细胞中专门研究表达荧光电压敏感探测器遗传编码电压指示器（GEVIs）克服这些限制。
有三类GEVIs的。第一类GEVI的使用VOltage感应来自电压传感磷酸酶区带是单一荧光蛋白（FP）5-9或荧光共振能量转移（FRET）对10-12。第二类传感器的使用微生物的视紫红质作为荧光指示剂直接13-15或通过电致变色FRET 16,17。第三类利用两个组件，该遗传成分是膜锚定的FP和第二组分是一种膜结合的淬灭染料18-20。而第二和第三类是用于在体外和切片实验19,20有用，只有第一类传感器是目前用于体内分析6是有用的。
在本报告中，我们将在体外使用第一类GEVIs的（图1）表明膜电位的摄像。该第一类电压传感器的是最简单的转换到体内成像 。由于GEVIsütilizing融合于FP的电压传感域中大约50倍比视紫红质类传感器的更亮，它们可以通过使用弧光灯照明，而不是要求一个非常强大的激光进行成像。亮度的差异的另一个后果是，第一类GEVIs的很容易超过大脑的自体荧光。基于视紫红质探针不能。第三类传感器的只是为第一类是光明，但需要添加化学淬灭剂这是难以在体内的管理。
我们将因此表现出探针与单个FP（Bongwoori）8和由FRET对的探针（纳比2）12采集。该FRET本报告中构建的VSFP-CR（电压敏感荧光蛋白-四叶草mRuby2）的蝴蝶版本11组成的绿色荧光供体，三叶草，和红色荧光受体，mRuby2，名为彩蝶2.242和彩蝶2.244 
图1：在本报告中 （A） 成像基因编码的电压指标（GEVIs）基于GEVI有一个跨膜电压感应域和荧光蛋白单FP 的两种类型 。 （B）基于FRET GEVI由跨膜电压感应域，FRET供体和受体的。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Protocol
伦理声明：动物实验协议在KIST动物协议2014-001批准的机构动物护理和使用委员会。
1.设备安装
- 成像设置
- 放置在隔振台倒置荧光显微镜。使用的高倍率（60X油浸镜头具有1.35数值孔径）的物镜和装有分色镜和过滤器适合用于电压成像的荧光蛋白质的滤波器立方体。
注意：此设置使用倒置显微镜，以采用目标具有较高的NA，但也可以使用直立显微镜。的确，在倒置显微镜仅用于探针的发展，因为更高的数值孔径（NA）的物镜收集一个比具有低的NA从而改善了信号噪声比（SNR更多的光;可以被描述为通过分割的峰值光信号基准的标准差记录的荧光）。对于非开发人员，我们会推荐的应用，如切片或体内记录正置显微镜。 - 制备的光源，例如，氙弧灯，配备有用于高效落射荧光宽视场成像的机械快门。通过光导引导光显微镜安装。光将通过激发滤光片和通过在过滤器立方体第一分色镜反射。对准光线超过来看21场最大化光强均匀地照亮标本。
注意：传统上，75瓦特弧光灯被用于自较高瓦数灯泡创建更大但不亮的照明域。激光器可以使用，但被限制在一个单一的波长。 LED成为明亮，可能确实是所选择的光源提供多个波长并且不需要机械快门。 - 安装两台CCD照相机的fluoresc如在图2D所示 EnCE的显微镜。
注意：第一CCD照相机具有较高的空间分辨率，并用于表达GEVI质膜一个小区的识别，以进行测试。对于膜电位影像学改变，确保第二CCD相机具有高帧速率每秒（fps）的速度，如1000架。使用双端口摄像机适配器（图2D-（3））来切换两台CCD照相机之间的成像通道。在此设置中，一demagnifier用于从物镜使图像适应在第二CCD摄象机CCD芯片。 - 为基于FRET GEVI成像安装第一（慢）和第二（快速）CCD摄像机之间的图像分离器。插入具有分色镜（560纳米）和两个发射滤光片的立方体（520纳米/ 40 645纳米/ 75）中的图像分离器。这将导致的视图的两个字段，一个用于供体荧光，另一个代表受主荧光。删除这个S成像的Econd过滤多维数据集时一个GEVI用一个FP。
注意：此方法检测单FP基于GEVI是Bongwoori它使用FP，超级黄道pHluorin A227D（SE A227D）。根据它的激发和发射光谱5被选择的激励滤光器（472纳米/ 30），发射滤波器（497纳米/长传）和分色镜（495纳米）。一般地，激发和发射滤光片应与荧光团的每个光谱的最大重叠以获得明亮的图象，同时通过发射滤波器发射的分色镜块任何激发光。的过滤器和分色镜的FRET对11基于GEVI记录的选择遵循相同的原理，除了它就必须在对供体和受体荧光的并发观察图像分离器的第二过滤器立方体。第一滤波器立方体置于显微镜过滤盒需要具有三叶草激发滤光器（475纳米/ 23）。然后发射˚F从两个的FP luorescence将通过第一分色镜（495纳米）被发送到第二滤波器立方体。第二滤波器立方体具有分色镜（560纳米），并为每个FP从而分离从两个不同的FP荧光2发射滤波器（520纳米/ 40为三叶草和mRuby2 645纳米/ 75）。
- 放置在隔振台倒置荧光显微镜。使用的高倍率（60X油浸镜头具有1.35数值孔径）的物镜和装有分色镜和过滤器适合用于电压成像的荧光蛋白质的滤波器立方体。
| 单一的基于FP GEVI （Bongwoori） | 基于FRET对GEVI （彩蝶2.42和2.44彩蝶） | ||
| 首先滤光块放置在显微镜 | 激发滤光片 | 472纳米/ 30 | 475纳米/ 23 |
| 分色镜 | 495纳米 | 495纳米 | |
| 发射滤光片 | 为497nm /长传 | - | |
| 第二滤波器立方体置于分束器 | 分色镜 | - | |
| 排放过滤器1 | - | 520纳米/ 40 | |
| 发射滤光片2 | - | 645纳米/ 75 |
表1.两种不同的过滤设置用于单一的基于FP GEVI和基于FRET GEVI录音
- 隔振
- 请不要在隔振台运动部件安装的任何设备。确保附加到非隔离设备的电缆松散，以避免样品的振动。
- 膜片钳室
- 密封所述膜片钳室的底部用薄＃0护罩玻璃由于物镜的工作距离相对较小。这是在倒置显微镜设置的缺点。
注意：作为具有高NA物镜的折衷，工作距离减小。为了放置SPECIM在很短的工作距离内的连接，盖玻璃和盖玻片（步骤2）必须尽可能地薄。
- 密封所述膜片钳室的底部用薄＃0护罩玻璃由于物镜的工作距离相对较小。这是在倒置显微镜设置的缺点。
- 温度控制
- 确保浴溶液流经一个温度控制器，以围绕保持修补细胞33℃下在整个实验。
- 设备的连接
- 连接膜片钳放大器和光源到高速CCD照相机的刺刀尼尔-Concelman（BNC）命令框的机械快门。这将使成像软件控制放大器，摄像头，同时光源。
注意：电气和成像部件需要以提供用于电活动的同时进行电气和光学记录进行同步。
- 连接膜片钳放大器和光源到高速CCD照相机的刺刀尼尔-Concelman（BNC）命令框的机械快门。这将使成像软件控制放大器，摄像头，同时光源。
图2.装备彪设置用于电压成像与GEVIs以下的光路的工作流中 ，（A）75W氙弧灯，（B）从电弧灯的激发光被激励的过滤器过滤，然后反射由第一分色镜到达之前检体阶段，在右上角的插图显示了全细胞结构，（C）慢速CCD照相机被用来帮助一个小区和膜片钳的两个选择，（D）的图像采集部分; （1）高速CCD照相机，（2）将图像分离器为FRET对和单声道的FP GEVIs，（3）demagnifier以使图像适应到CCD芯片在高速CCD照相机，（4）双端口摄像机适配器来切换成像途径和（5）的速度慢CCD照相机以高空间分辨率进行识别的小区到补丁，（E和F）的图像采集与基于单一-FP GEVI（E）和一个基于FRET的GEVI（F）。 请点击此处查看该图的放大版本。
2. GEVIs的表达
- 在人胚肾293细胞
- 培养人胚肾293（HEK 293）细胞用Dulbecco 在 CO 2培养箱（5％CO 2）中于37℃下在补充有10％胎牛血清改良的Eagle培养基（DMEM）。使用具有直径100毫米和20毫米的高度组织培养皿。用2×10 3开始培养- 6×10 3细胞 / cm 2的孵育，直到达到用于随后转染80-90％汇合。
- 在转染当天，吸出细胞培养基，并轻轻地用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水洗一次。驱散HEK 293细胞用0.25％胰蛋白酶EDTA溶液1-2分钟，吸出解决方案，并轻轻拍打的菜端分离的C厄尔。添加新鲜的DMEM（10％FBS）和通过吸液解离成群细胞。通过使用血球确定细胞浓度。
- 放置0.08 - 0.13毫米厚，10毫米直径的盖玻片预先涂覆有在24孔组织培养板的聚-L-赖氨酸。种子在盖玻片上的HEK 293细胞以1×10 5细胞/ cm 2的细胞密度。
注意：由于HEK 293细胞能够相互形成间隙连接，种子数目需要得到分离的细胞。 - 瞬时转染的细胞通过使用脂转染试剂制造商的指令之后的编码GEVI一个合适的基因构建体。
注意：用于此步骤中使用的pcDNA3.1（Bongwoori）和pUB2.1（纳比2.242），为骨架的载体的基因构建体。的DNA所用的量为100纳克每个盖玻片;然而，转染条件需要根据经验确定每个GEVI进行测试。
- 在分离的小鼠臀部pocampal初级神经元
- 解剖从胚胎17天C57BL6 / N小鼠海马然后分离海马神经元如前所述22,23。
- 板中的解离的神经元上的聚-D-赖氨酸涂覆的0.08-0.13毫米厚，以1×10 5细胞/ ml的细胞密度10毫米直径的盖玻片。在37℃下将细胞在CO 2培养箱 （5％CO 2）。
- 瞬时转染的分离的神经元，6 - 7日在体外 （DIV）通过如先前所述24使用磷酸钙转染试剂编码GEVI的基因构建体。
注意：用于此步骤中使用的pcDNA3.1（Bongwoori）和pUB2.1（纳比2.244），为骨架的载体的基因构建体。的DNA的使用量为1微克每个盖玻片。再次，转染条件需要是对于测试的每种GEVI凭经验确定。
- 检查电压IMA前的表达水平更改
- 从CO 2培养箱取组织培养板和落射荧光显微镜下观察，从转染的细胞的荧光。
- 确认从膜的荧光之后，在第3盖玻片转移到修补室用于电压成像。
注：电压成像进行了16 - 24小时后转染。然而，由于不同的荧光蛋白质具有不同的成熟时间，一些GEVIs需要在转染后更多的时间。例如，含有mRuby2在这个协议的FRET对可能需要更长的时间来表达，因为mRuby2的成熟比四叶草11需要显著更长的时间。供体和受体的荧光应该检查。
3.电压成像协议
- 选择具有良好膜表达健康细胞
- 使用显微镜，找到一个健康的细胞（图4B），显示强膜本地化的荧光相比，内部的荧光。尽量不要打补丁圆形细胞。圆形细胞或者分裂或垂死和难以打补丁。在持续应用的5.0 mV的测试脉冲振幅和5.0毫秒，以帮助后续膜片钳实验。
- 准备电压成像单元
- 选择修补细胞后，将细胞上方的膜片钳吸管。把移液管，直到它轻轻触及细胞膜。在这一步中，观察到1MΩ - 2MΩ上升膜电阻的膜片钳软件25。
注：有时，可以通过触摸细胞膜只是发生了良好的千兆欧姆密封。只要千兆欧姆密封是稳定的，应该没问题。 - 通过吸管轻轻施加负压建立一个千兆欧姆密封。定在所希望的保持电位移液器潜力。
- 在保持千兆欧姆密封，图像日与高速CCD照相机Ë细胞，并将其聚焦到膜面积。
- 通过口施加吸力的脉冲破裂细胞膜或注射器轻轻使一个全细胞构造26。
- 图像补丁根据实验设计全细胞钳配置下夹紧单元通过使用成像软件
- 启动成像软件。点击[ACQUIRE] - [SciMeasure相机]菜单中打开“CCD ACQUIRE”页面。
- 创建一个新的数据文件保存图像。
- 点击[模拟输出]，然后按[读取一个ASCII]开辟一个脉冲协议文件进行成像。如果需要对数据进行平均点击的平均内部重复“。然后关闭“模拟输出”页面。
注意：此脉冲协议需要设计并根据每个实验的目的在此之前步骤保存为“.TXT”文件。 - 具体的设置acquis从“CCD ACQUIRE页面银行足球比赛的参数。输入关于'为采集帧的数“和”试验数“的具体值。
注意：帧的数量是由获取的速度和脉冲协议的定时来确定。例如，如果成像在1kHz，1000帧等于记录时间1秒。 - 点击[获取数据（光学+ BNC）]按钮开始录制。而该电压成像正在发生，观看从膜片钳软件示波器窗口，以确保在整个记录稳定的全细胞构型。
注意：要测试GEVI的响应电压范围宽，ΔF/ F值或整个生理电压范围时间分辨率信号的大小，进行全细胞膜片钳实验已经踩到一个脉冲协议电压脉冲范围从-170 mV到130毫伏。为了确定在解决动作电位的GEVI的表现从培养初步诱发RY神经元图像的全细胞电流钳配置下的单元格。
- 选择修补细胞后，将细胞上方的膜片钳吸管。把移液管，直到它轻轻触及细胞膜。在这一步中，观察到1MΩ - 2MΩ上升膜电阻的膜片钳软件25。
4.数据采集
- 的ΔF/˚F计算
- 启动成像软件。单击[文件] - [读取数据文件]打开数据文件进行分析。观察的右侧在其静息光强（RLI）的细胞图像
注意：软件平均值的前5帧，以确定记录的RLI。 - 点击“显示BNC接头”，使测量屏幕上的电流和电压值。
- 从更改“RLI框架”的页面模式，以“框减法”利用帧减法功能标识与响应光信号的像素。这是成像的真正威力，因为每个像素可以检查荧光潜在变化。
- 选择减法两个时间点（F 0和F 1）。识别该信元的面积是显示响应信号，以膜电位变化。
注意：对于帧相减图像的信噪比可以通过选择多个帧的每个时间点在时间上平均的信号得到改善。该软件减去选定的帧所需的平均光强，并计算在F 1 -F 0值（ΔF）。通常一个人选择在在刺激期采取的控股潜力和另一个时间点收购的时间点。 - 候需要通过拖动或点击与计算机鼠标的每个像素被分析的像素。从所选择的像素观察上的软件窗口的左侧的平均荧光强度的图形表示;图4B＆5B示出了从帧减法分析代表性图像。
- 由RLI（F 0）除以减去像素。点击[按RLIs的分割]收购ΔF/˚F值
- 启动成像软件。单击[文件] - [读取数据文件]打开数据文件进行分析。观察的右侧在其静息光强（RLI）的细胞图像
- 出口数据
- 通过unclicking“显示BNC接头”菜单中删除的电流和电压的曲线图。转到[OUTPUT] - [保存痕迹中显示（ASCII）的荧光跟踪导出采用标准的绘图软件曲线拟合分析的ASCII文件格式。
5.数据分析
- 在GEVI电压传感特性
- 通过在数据分析程序绘制的ΔF/˚F值与电压绘制荧光变化相对电压曲线图（IV）。拟合曲线以波尔兹曼函数（表2）通过点击，以确定光信号的电压范围[分析] - [接头] - [S形拟合] - [打开对话框]，然后选择波尔兹曼功能。
注意：拟合到一个功能使得possiblE要表征不同的电压探头的电压传感特性，或者他们的表演在不同的细胞进行比较。玻尔兹曼功能可用于在本文中测试的探针，因为来自这些探测器的FV曲线表明S形图案。 - 通过使用初始值和最终值由函数计算的（A 1和A 2）正常化每ΔF/ F值。
注：在波尔兹曼方程，最小为A 1，最大值为A 2。对于标准化，使用电子表格应用软件通过定义1零和 A 2为一体，以调整ΔF/˚F值。平均的归一化ΔF/˚F值计算标准差进行统计分析。 - 重制的归一化ΔF/先前在5.1.1节记载的F-值与电压）。
- 通过在数据分析程序绘制的ΔF/˚F值与电压绘制荧光变化相对电压曲线图（IV）。拟合曲线以波尔兹曼函数（表2）通过点击，以确定光信号的电压范围[分析] - [接头] - [S形拟合] - [打开对话框]，然后选择波尔兹曼功能。
- 光学响应速度
- 有数据分析中打开）从步骤4.2.2取得的ASCII文件程序并绘制ΔF/˚F跟踪随时间的变化。
- 点击在数据分析软件“数据选择器”，并选择对应于一个阶梯电压脉冲的开始和当光信号已经达到稳定状态的第二时间点一个时间点。通过点击适合这个范围内提供单，双指数衰减函数[分析] - [配件] - [指数拟合] - [打开对话框]，然后选择一个指数衰减函数。报告更合适。
注：通过拟合的单或双指数衰减函数，由τ为代表的量化时间常数可以被收购。这将有助于实验者比较他们的测量结果与不同的电压指标完成的动力学。荧光跟踪可能显示可以与双指数衰减函数来描述快速和慢速分量。在这种情况下，计算将导致具有不同的振幅两个时间常数。 - 第计算È加权τ常数比较呈现两种时间分量到探针与单个组分的探针的动力学。
注意：加权tau蛋白被计算为τ1乘以相对幅度的总和中 ，A 1，加τ2乘以相对幅度，A 2由下式所定义的;
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Representative Results
瞬时转染细胞可以表现出在荧光强度和显著变异质膜表达的程度。即使在同一盖玻片一些细胞将具有内部荧光的不同级别。这很可能是由于转染试剂的被细胞吸收的量。有时候，太多的表达导致细胞经历导致细胞凋亡27未折叠蛋白反应（明亮，圆润的细胞，具有高内荧光）。因此，实验者提醒用尽可能少的内部荧光尽可能测试两个明亮的细胞和细胞暗淡内部以来表达创建降低了信噪比（SNR），无响应的荧光。
另一个考虑是发色团的成熟率，图3示出了在受体chromoph的荧光视差矿（mRuby2），其中有一个更长的成熟时间比捐助生色团（四叶草）。
图3. HEK 293细胞的共聚焦图像与基于一个FRET GEVI，瞬时转染Nabi2.242。（A）一种HEK细胞的共聚焦图像表示从FRET供体和受体膜局部荧光，（B）中示出的潜在后果共聚焦图像mRuby2缓慢成熟。所有四个细胞表现出四叶草荧光，而只有两个展览mRuby2荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
的图像由一个共聚焦显微镜获得的。用于FRET供体，三叶草，用于激励488 nm激光和发射被上校为具有内部五十零分之五百二十五纳米带通滤波器。的FRET受体，mRuby2，用561 nm激光激发和五十零分之五百九十五纳米的带通滤波器照亮用于发射。对于共焦成像，将样品固定在pH 7.4调整磷酸盐缓冲盐水的4％多聚甲醛/蔗糖溶液中，然后安装用抗褪色试剂。
一旦转染条件的优化，变异的下一源来自确定感兴趣的区域进行分析。使用帧减法来识别具有最高荧光变化的小区的区域经常被用来最大化ΔF/ F值。另一种方法是选择所有从单元接收光的像素。这增加了产生噪音的减少像素的数量，但会降低信号的大小，因为非响应内部荧光是包括在内。这两种方法都很好，只要实验者保持一致。
图4.单FP基于GEVI电压成像表达在HEK 293细胞和海马原代神经元。（A）一个基于FP GEVI，Bongwoori的ΔF/˚F痕迹，呈现出与高速CCD相机记录在1 kHz加大电压脉冲的响应。 （B）一种HEK 293细胞与高速CCD相机成像; （左）休息光照强度表达Bongwoori和（右）帧减法表明其中观察到荧光变化像素图像的细胞（RLI）。 （C）来自表达Bongwoori小鼠海马原代神经元诱导动作电位的光学记录。动作电位下进行全细胞电流钳模式诱发。该ΔF/˚F跟踪从相关的索玛像素选择。 请点击此处查看该图的放大版本。
代表FLUO供体和受体生色团rescence读出如图 5A所示。荧光变化的极性相反的供体和受体使比例分析，以减少相关噪声源，例如，运动。例如，运动相关噪声会表现出在两个供体和受体荧光沿相同方向的荧光的变化。而FRET基于探针能够比率成像，往往不如只分析亮发色团。这是因为调光发色团可以基本上提高记录的噪声。 图5B示出了这种效果。在从亮三叶草图5B帧减法清楚地显示，其中光信号是在细胞中。相比之下，mRuby2荧光框架减的结果显示在整个细胞更高程度的噪音。因此，只有三叶草的捐助信号在网络连接的海马神经元所示古尔5C。
图与基于GEVI一个FRET 5.电压成像HEK 293细胞和海马神经元主要表达。（A） 一个基于FRET GEVI，Nabi2.242，示出在两种波长与一个高速CCD相机记录在1千赫阶梯电压脉冲响应的ΔF/˚F跟踪。 （B）顶部;供体（四叶草RLI，三叶草帧减法）和受体（mRuby2-RLI，mRuby2帧减法）为每个FP， 底部有两个不同的阈值处理的图像;使用相同的阈值这两个供体（三叶草-RLI，三叶草帧减法）和受体（mRuby2-RLI，mRuby2帧减法）图像来说明mRuby2的相对暗淡。所有的图像是从同一的HEK 293细胞中表达Nabi2.242服用。 （C）的520纳米波长TR从小鼠海马神经元主要表达Nabi2.244传感器感应动作电位的王牌。该ΔF/˚F跟踪从相关的索玛像素选择。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.后果不同的光线水平 ΔF和ΔF/˚F 价值 。（A）的HEK 293细胞中表达单一的基于FP GEVI，Bongwoori的形象，在休息的光强显示（RLI），（B）荧光痕迹显示内核平均 ΔF（F 点¯x-F 0）从三个不同的区域，区域1的值：膜区具有良好的本地化荧光信号，区域2：明亮的内部荧光的区域中，D区3区远离光信号，（C），显示内核的荧光痕迹（B）均来自同一地区的ΔF/˚F值。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 概念 | 方程 | 备注 |
| 分数荧光变化（ΔF/ F） |  | 在时间点测得的˚F1 =光强度，女0 =光强度在保持电位测定 |
| 玻尔兹曼功能 |  | Y =ΔF/楼以mV V =膜电位，V 1/2是半最大ΔF/ F，A以mV的膜电位 |
| 双指数衰减函数 | Y = Y 0 + A 1 C - （T - T0）/τ1 + A 2ë - （T - T0）/τ2 | τ1，τ2 =时间常数，A 1，A 2 =幅度，T，T 0 =两个时间点，Y = 0偏移 |
表2.方程
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Discussion
神经系统采用几种不同的方式的电压，抑制导致轻微的超极化，突触输入导致轻微的去极化和动作电位产生一个比较大的电压变化。通过GEVIs测量膜电位变化的能力提供了同时分析神经回路中的几个组件的有前途的潜力。在这份报告中，我们展示了使用GEVIs膜电位影像学改变的根本方法。
用于成像的变化电压的主要关键是GEVI在质膜的有效表达。胞内表达创建降低了探头的SNR一个非响应荧光。优化转染条件大大改善了光学测量的一致性。事实上，测试一个新颖GEVI时最好是还测试已知探针，以确保在光活性的差别到NE是由于完全瓦特探头与细胞的不的条件。
图6示出内部荧光的减小电压成像的灵敏度的效果，ΔF/ F值。 图6B示出的ΔF值表示基于单FP GEVI，Bongwoori一个HEK细胞。迹线2来自何处相对亮内部荧光在图6A中看到的区域2（蓝色）。此跟踪具有ΔF值迹线1的水平相近然而 ，在图6C其中图6B的痕迹被RLI值ΔF/˚F值划分，跟踪2滴显著由于从而降低ΔF/ F中的明亮荧光内部值。荧光跟踪3有一个非常小的ΔF也有一个非常小的RLI值（F）。其结果是，具有在记录的噪声大幅度增加一个误导的ΔF/ F信号。被列入这个例子来演示ΔF也重要。如果F是非常低的，开始与ΔF/ F A大的变化是没有帮助的。
使用图像分离器的使两种波长的伴随测量到一个单一的CCD照相机。这大大有助于对探头发展FRET依赖的荧光变化的测量，降低了安装成本。然而，由于色差，这两个图像会稍微失焦因此需要一个复消色差物镜的需要。越轻越好的信噪比，因此选择目标最高的数值孔径也提高了荧光成像。此外，一个可以使用更强的光源，如发光二极管（LED）或激光来增加信噪比。 LED不需要机械快门。
在这份报告中，我们表现出从单一的FP GEVI和基于FRET的GEVI的光信号。一个基于FRET的GEVI的主要优点是，比率成像使相关噪声D的还原UE向体内呼吸和血液流动。荧光信号的极性相反证实在膜电位的真正的变化。然而，由于两个发色团的荧光强度往往显著变化，信噪比也将有所不同。这种混淆的比例分析，限制了它的用处28。还可以有一个FRET的独立的信号29。因此，有时较好使用FRET分析中膜电位的变化时，仅使用更亮的荧光发色团。
电压成像比钙成像更具挑战性，由于速度和相比，其测量钙流钙成像的变化膜电位变性。在非常快的时间尺度相比，钙离子通量中的神经元的膜电位的变化，和亚阈值的事件不能与钙成像30来测量。此外，电压探头必须在质膜是有效的降低可在膜电位光学报告变更探针的量。因此，可在CCD芯片实际到达的光子的数量相对较少。这需要一个高速和低读噪声相机具有高量子效率和引发后膜电位的变化的高SNR的探针的需要。 通过体外细胞成像，研究人员将尝试更好地在体内测量前了解GEVIs的潜在优势和缺陷。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
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